Methodenartikel

En face Kryosektion der Netzhaut der Maus für die hochdimensionale räumliche molekulare Analyse

DOI:

10.3791/68171

⸱

8. Juli 2025

 , 
1Department of Physiology and Biophysics, University of Colorado Anschutz Medical Center

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Netzhaut weist eine komplexe räumliche Organisation über ihre laminare Struktur auf. Moderne räumliche Transkriptomik- und Sequenzierungstechniken erfordern Gewebeschnitte mit einer Dicke von < 20 μm, was ihre Anwendbarkeit in der Netzhautforschung einschränkt. Diese frisch gefrorene Kryosektionsmethode erzeugt dünne Gesichtsabschnitte der Netzhaut von Mäusen unter Beibehaltung planarer räumlicher Beziehungen und ermöglicht so eine umfassende molekulare Kartierung über Laminae hinweg.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die komplexe laminare Struktur der Netzhaut stellt eine große Herausforderung für eine umfassende räumliche molekulare Kartierung dar. Aktuelle Techniken zur Untersuchung der Gewebearchitektur und molekularer Wechselwirkungen sind durch technische Einschränkungen begrenzt, die räumliche Beziehungen beeinträchtigen oder die molekulare Profilerstellung einschränken. Bestehende Methoden wie Querschnitte, Ganzbettpräparationen, chemische oder mechanische Dissoziationen und dicke Oberflächenschnitte stören entweder die Gewebeintegrität, verlieren den kritischen räumlichen Kontext oder sind meist einfach nicht mit hochdimensionalen räumlichen Sequenzierungsplattformen kompatibel.

In dieser Studie wird eine Kryosektionstechnik vorgestellt, die dünne (<20 μm) Gesichtsschnitte erzeugt und gleichzeitig die räumlichen Beziehungen beibehält, die für die Kartierung der Zellverteilungen der Netzhaut unerlässlich sind. Die Methode behält die RNA-Integrität und die Gewebearchitektur bei und erzeugt gleichzeitig Abschnitte, die mit molekularen Hochdurchsatz-Analyseplattformen kompatibel sind. Die RNA-Integrität bleibt erhalten, da bei dieser Technik frisches gefrorenes Gewebe geschnitten wird, was von den Herstellern räumlicher Transkriptomplattformen offiziell im Vergleich zu postfixiertem Gewebe unterstützt wird. Wir validieren diesen Ansatz mit mehreren molekularen Profiling-Methoden, die eine erfolgreiche Integration sowohl mit der manuellen RNAscope-In-situ-Hybridisierung (12 Ziele) als auch mit der räumlichen Xenium-Sequenzierung (300 Ziele) zeigen. Die Technik bewahrt konsistent die Gewebearchitektur über die Proben hinweg und behält gleichzeitig die RNA-Qualität bei, die für diese empfindlichen molekularen Anwendungen geeignet ist.

Diese methodische Weiterentwicklung ermöglicht neue Untersuchungen zu retinalen Zelltypverteilungen, molekularen Gradienten über Laminae und räumlichen Aspekten der Netzhautpathologie. Die Vielseitigkeit der Technik und die Kompatibilität mit modernen Plattformen der räumlichen Biologie bilden die Grundlage für eine umfassende molekulare Kartierung der komplexen zellulären Organisation der Netzhaut.

Einleitung

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Retinale Neuronen haben räumliche Topographien entwickelt, die die Informationsverarbeitung erleichtern, was bei vielen Arten zu groben Spezialisierungen wie Foveas, Area Centralis und Streifen führt 1,2,3. Im Gegensatz zu der gut verstandenen Vielfalt der Photorezeptorverteilung ist die räumliche Spezialisierung der retinalen Produktion, die von retinalen Ganglienzellen (RGCs) gebildet wird, weniger klar. Für die meisten Arten ist die räumliche Verteilung der RGCs völlig unbekannt. Selbst für die Maus, wohl eines, wenn nicht sogar das am besten untersuchte Wirbeltiermodell der visuellen Funktion, wurde weniger als ein Drittel der RGC-Subtypen mit traditionellen Techniken wie der Immunhistochemie des gesamten Mountkartiert 2. Diese Techniken scheitern, da die meisten RGC-Subtypen keinen spezifischen genetischen Marker haben. Stattdessen werden höherdimensionale molekulare Informationen für eine genaue RGC-Klassifikation4 mittels Einzelzell-RNA-Sequenzierung benötigt 5,6,7.

Informationen über die RGC-Verteilung sind wichtig, da die an der Maus beobachteten Topographien klare ökologische Korrelate zwischen RGC-Platzierung und Sehfunktion zeigen. Das auffälligste Beispiel ist die räumliche Organisation der ɑON-S RGCs, die sich in der temporalen Netzhaut gruppieren. Diese Region erhält während des Jagdverhaltens9 das Bild der Beute8. Es ist auch allgemein bekannt, dass RGC-Subtypen unterschiedlich anfällig für Krankheiten sind10 und einige häufige Krankheiten wie das Glaukom eine räumliche Komponente für ihr Fortschreiten haben11,12. Eine wichtige Frage, mit der sich das Feld konfrontiert sieht, lautet daher: Wie ist die räumliche Organisation von RGC-Subtypen, wenn sie die Netzhaut1 kacheln? Diese Wissenslücke schränkt derzeit die Erkenntnisse über andere visuell gesteuerte Verhaltensweisen und Krankheiten ein.

Der Fokus der vorliegenden Methode liegt darauf, diese molekularen Wissenslücken durch einen en-face-Kryosektionsansatz zu schließen, der räumliche Beziehungen bewahrt und gleichzeitig eine hochauflösende molekulare Analyse ermöglicht. Moderne räumliche Sequenzierungsplattformen wie Xenium von 10X stellen einen transformativen Fortschritt in der molekularen Profilerstellung dar und bieten beispiellose Einblicke in die Gewebeorganisation und zelluläre Interaktionen. Diese Plattformen haben jedoch zusammen mit Low-Plex-Techniken wie RNAscope und räumlich barcodierten Sequenzierungsmethoden wie Visium eine entscheidende technische Einschränkung: Sie erfordern Gewebeschnitte, die dünner als 20 μm sind. Diese Anforderung stellt eine besondere Herausforderung für das Netzhautgewebe dar, das typischerweise 200 μm dick ist.

Bisher haben sich die Forscher bei der Anwendung dieser Technologien auf Netzhautgewebe vor allem auf Querschnitte verlassen13. Während Querschnitte molekulare Beziehungen innerhalb von Kern- und plexiformen Schichten im Kontext vertikaler Schaltkreise effektiv aufzeigen, sind sie weniger geeignet, um die breiteren räumlichen Verteilungen von Netzhautzellen zu erfassen, die ganze Präparationen traditionell aufgedeckt haben8. Jüngste Versuche der flächendeckenden Schnitte wurden durch Einschränkungen der Schnittdicke eingeschränkt, wobei Studien nur 50 μm Abschnitte erreichten, die für moderne molekulare Analyseplattformen mit hohem Plex14 zu dick sind. Andere historische Ansätze, die zur Untersuchung einzelner retinaler Lamina eingesetzt wurden, aber nicht mit modernen räumlichen Sequenzierungstechniken kompatibel sind, umfassen enzymatische Verdauung in Kombination mit mechanischer Dissoziation15,16 oder mechanische Dissoziationen allein17,18,19,20. Hier stellen wir eine neuartige Kryosektionstechnik vor, die speziell für dünnes, gekrümmtes Netzhautgewebe entwickelt wurde und diese Einschränkungen überwindet. Kurz gesagt, unsere Methode umfasst die Extraktion der hinteren Augenkammer, das Erstellen von Entlastungsschnitten sowohl durch die Netzhaut als auch durch die Sklera, das Abflachen des Gewebes mit der inneren Netzhaut gegen ein Deckglas, das Einbetten des Gewebes in die OCT und schließlich die Kryosektion von der äußeren zur inneren Netzhaut (Abbildung 1). Unsere Methode behält räumliche Beziehungen bei und erzeugt gleichzeitig Abschnitte, die dünn genug (<20 μm) für hochdimensionale Werkzeuge der räumlichen Biologie sind, wie durch die erfolgreiche Implementierung sowohl mit dem manuellen RNAscope (12 Targets) als auch mit der automatisierten Xenium-Plattform (300 Targets) validiert wurde, was die Kompatibilität über verschiedene Komplexitätsskalen der molekularen Analyse hinweg zeigt.

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Protokoll

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Alle Versuche wurden in Übereinstimmung mit und mit Genehmigung des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) und der einschlägigen institutionellen Richtlinien durchgeführt, die diese Methoden unter der Aufsicht der University of Colorado genehmigen. Alle Schritte im Zusammenhang mit der Verwendung von Tieren und der Euthanasie müssen den örtlichen Vorschriften und Versuchsgenehmigungen entsprechen. Alle Mäuse wurden mit der Standardpflege in einer akkreditierten tierärztlichen Einrichtung mit freiem Zugang zu Futter und Wasser untergebracht. Diese Kryosektionstechnik baut auf Standard-Netzhautdissektionstechniken auf, die für C57BL/6-Mäuse optimiert sind. Um diese Technik zu entwickeln, wurden etwa 150 Mäuse beiderlei Geschlechts im Alter von 6 Wochen bis 2 Jahren verwendet. Die abschließende Technik, die hier kommuniziert wird, hat eine Erfolgsquote von etwa 95 %, unabhängig von den demografischen Merkmalen der Maus. Beachten Sie, dass, wenn für eine Stufe keine Temperatur angegeben ist, mit einer Raumtemperatur von ca. 20-25 °C zu rechnen ist. Lösungen, bei denen keine Temperatur angegeben ist, funktionieren, wenn sie gekühlt sind, und daher liegt der Arbeitstemperaturbereich für Lösungen zwischen 4 und 25 °C.

1. Präparieren

  1. Betäuben Sie die Maus mit Isofluran und validieren Sie die Anästhesie mit Zehenkneifen oder befolgen Sie die örtlichen Regeln und Vorschriften, um die Anästhesie einzuleiten und zu bestätigen, da andere Methoden ebenso geeignet sind.
  2. Euthanasieren Sie die Maus durch Gebärmutterhalsluxation: Sichern Sie den Kopf der Maus mit einer Hand und den Schwanzansatz mit der anderen und ziehen Sie dann in entgegengesetzte Richtungen. Führen Sie eine sekundäre Euthanasie durch Enthauptung durch.
  3. Brennen Sie den Schläfenpol des Globus auf die Hornhaut, um die Orientierung zu behalten und eine Schwachstelle für die Dissektion zu schaffen (Abbildung 2B und Abbildung 3A).
  4. Tauchen Sie den Globus in Ames-Lösung in eine Schale, die ein Stück Filterpapier enthält (größer als der Globus, aber kleiner als die Schale).
    HINWEIS: Die Verwendung anderer Lösungen als Ames führt zu einer Verschlechterung der Netzhaut (Abbildung 4A).
  5. Entfernen Sie mit einer scharfen Pinzette #5 und einer Irisschere vorsichtig alle Muskeln, Faszien, Gefäße und Nerven aus dem Globus (Abbildung 2E, F und Abbildung 3B), ohne die Sklera zu punktieren (Abbildung 2D).
    HINWEIS: Das Durchstechen der Sklera während dieses Schritts (Abbildung 4B) führt zu einem Gewebevorfall (Abbildung 4C).
  6. Positionieren Sie die Spitze einer Irisschere senkrecht zur Hornhautmarke, wobei die Schere parallel zum Sehnervenkopf verläuft. Punktieren Sie den Globus an dieser Position (Abbildung 3C,D).
  7. Machen Sie einen einzigen sauberen Schnitt durch die Hornhaut und den Limbus, der sich in der Sklera und der Netzhaut in Richtung des Sehnervenkopfes fortsetzt (Abbildung 3E).
    HINWEIS: Schneiden Sie nicht durch den Sehnervenkopf, da sich sonst die Sklera und die Netzhaut trennen. Die genaue Länge dieses Schnitts hängt von der Größe des Globus ab, die zwischen alten und jungen Tieren sowie bei einigen Cre-Linien im Verhältnis zu Wildtyp-Tieren dramatisch variieren kann. Wir empfehlen, etwa 1 mm Gewebe zwischen der tiefsten Ausdehnung dieses Schnitts und dem Sehnervenkopf zu belassen.
  8. Positionieren Sie die Klinge senkrecht zum Anfangsschnitt (Abbildung 3F,G), etwa 1 mm hinter dem Limbus (Abbildung 2C). Beginnen Sie, radial durch die Sklera und die Netzhaut zu schneiden.
    1. Halten Sie eine gleichmäßige Schnittlinie posterior und parallel zum Limbus aufrecht, indem Sie den Globus mit einer scharfen Pinzette führen und drehen. Die Minimierung von Schnitten ist zwar ideal, aber legen Sie Wert darauf, einen sauberen radialen Pfad beizubehalten. Wenn sich Netzhaut und Sklera trennen, positionieren Sie die Irisschere neu, um sie zusammenzuschneiden.
      HINWEIS: Ein Schnitt in den Limbus kann während der Linsenextraktion zu einer Trennung der Netzhaut von der Sklera führen. Kleine Scheren und Rotationen sind akzeptabel. Vermeiden Sie es, Gewalt anzuwenden, um es zu sichern, da dies die Gefahr eines Netzhautvorfalls birgt.
    2. Schätzen Sie den hinteren Abstand von 1 mm mit der mittleren Breite der Irisschere. Wenn Sie sich nicht sicher sind, gehen Sie in eine hinterere Position, da sich die Verbindung der Netzhaut zum Limbus nach innen krümmt. Ein weiter hinten liegender Schnitt ermöglicht die flache Extraktion der Netzhaut.
  9. Nach Abschluss des radialen Schnitts parallel zum Limbus auf verbleibende Netzhautverbindungen prüfen. Trennen Sie diese vorsichtig mit einer Irisschere, bis der vordere und der hintere Globus getrennt sind.
  10. Trennen Sie mit zwei Paaren scharfer Pinzetten #5 vorsichtig den vorderen und hinteren Teil des Globus (Abbildung 3H). Bei älteren Mäusen können transparente Fasern die Linse mit der Netzhautschale verbinden; Trennen Sie diese vorsichtig mit einer Irisschere und minimieren Sie dabei die Trennung zwischen Netzhaut und Sklera.
    HINWEIS: Die Linse sollte am Limbus und an der Hornhaut befestigt bleiben.
  11. Schneiden Sie die Netzhaut mit dem Filterpapier als Stützplattform mit einer Irisschere in ein Kleeblattmuster (auch bekannt als Eisernes Kreuz) (Abbildung 3I-K).
    HINWEIS: Kleeblattschnitte sollten kürzer sein als der primäre Orientierungsschnitt, der ursprünglich durch den Limbus gemacht wurde, wenn die Aufzeichnung der Orientierung mit dieser Scheibe gewünscht wird. Wir empfehlen, diese drei neuen radialen Schnitte so zu verkleinern, dass sie etwa 1-2 mm kürzer sind als der primäre Schnitt. Wenn ein anderes Merkmal, wie z. B. der Opsin-Gradient, zur Orientierung verwendet wird, ist es angemessen, dass alle Schnitte gleich lang sind, wobei immer etwa 1 mm Gewebe zwischen der tiefsten Stelle des Schnitts und dem Sehnervenkopf erhalten bleibt, um eine Trennung von Netzhaut und Sklera zu verhindern.
  12. Wiederholen Sie die Dissektion mit dem zweiten Auge. Um die Nekrose zu minimieren, vollständige Entfernung des zweiten Auges in der Vorderkammer innerhalb von 10 Minuten nach der Euthanasie.

2. Kryokonservierung

  1. Bereiten Sie eine Einweg-Transfer-Kunststoffpipette vor, indem Sie die Spitze so abschneiden, dass eine Öffnung entsteht, die größer ist als die präparierte Netzhaut und Sklera (im Folgenden als Netzhaut bezeichnet).
  2. Saugen Sie die Netzhaut vorsichtig in die Pipette und legen Sie sie auf einen Objektträger aus Glasmikroskop. Entfernen Sie mit einem Labortuch vorsichtig überschüssige Ames-Lösung um die Netzhaut, bis sie nicht mehr frei schwimmen kann und abgeflacht werden kann.
  3. Entfalten Sie mit zwei scharfen Pinzetten #5 die Netzhaut und positionieren Sie sie flach mit der inneren Augenmuschel nach oben. Abhängig von der Größe des Gewebes machen Sie 0,5 bis 2 mm Reliefschnitte in jedem Kleeblattsegment, um die Netzhaut weiter abzuflachen, und passen Sie das Gewebe sorgfältig an, um eine Faltung zu verhindern (Abbildung 5A). Entfernen Sie die zusätzliche Ames-Lösung, bis die Flüssigkeit nur noch an der Netzhaut verbleibt.
  4. Drücken Sie mit einem Deckglas schnell auf die Netzhaut (Abbildung 5B) und übertragen Sie sie mit der umgebenden Flüssigkeit, so dass die äußere Sklera nach oben zeigt und die innere Augenmuschel das Deckglas berührt, d. h. die retinalen Ganglienzellen zeigen nach oben (Abbildung 5C).
  5. Vergewissern Sie sich, dass die Netzhaut nicht gefaltet ist, und nehmen Sie bei Bedarf Anpassungen vor. Fügen Sie Ames-Lösung hinzu, um die Handhabung zu erleichtern. Da sich das Gewebe mit überschüssiger Flüssigkeit kräuselt, verwenden Sie ein Labortuch, um alle überschüssige Ames-Lösung zu entfernen, und lassen Sie die Netzhaut 5-10 Sekunden lang an der Luft trocknen.
    HINWEIS: Wenn keine kurze Lufttrocknung zugelassen wird, kann dies während der Kryosektion zufällig zu einer Gewebe-OCT-Trennung führen. Übermäßige Lufttrocknung kann zu Gewebeschäden durch Salzkristalle führen.
  6. Tragen Sie OCT Medium auf, um die Netzhaut zu bedecken, und verwenden Sie eine Pinzette, um diese Schicht gleichmäßig auf dem Deckglas zu verteilen und so eine Netzhautflotation zu verhindern. Lassen Sie das OCT-Medium 30 s in die Netzhaut eindringen.
  7. Schockfrosten Sie die Netzhaut in der OCT (Abbildung 5D) entweder mit einer Metallplatte, die indirekt mit flüssigem Stickstoffdampf gekühlt wird, oder indem Sie sie in direkten Kontakt mit Trockeneis bringen.
  8. Lagern Sie die Netzhaut bei sofortiger Verwendung auf Trockeneis oder bei längerer Lagerung in einem Gefrierschrank bei -80 °C in einer Plastiktüte oder einem Behälter mit Trockenmitteln.

3. Kryosektion

  1. Stellen Sie die Kryostatkammer auf -18 °C und den Tisch auf -12 °C ein. Legen Sie die Netzhaut in die Kammer, um sie an die Temperatur anzupassen.
  2. Erstellen Sie eine OCT-Kuppel auf dem Probenfutter. Wenn Sie den Kryostaten des gleichen Modells verwenden, stellen Sie sicher, dass diese Kuppel die inneren 2-3 Ringräume einnimmt. Nach dem Einfrieren schneiden Sie die OCT-Kalotte, um eine flache Tischoberfläche parallel zur Klinge auf dem Spannfutter zu schaffen, um die laminare Ebenheit zu erhalten (Abbildung 6A).
  3. Erstellen oder notieren Sie die Orientierungshilfe, die das Spannfutter mit dem Kryostatentisch in Verbindung bringt.
    HINWEIS: Bei dem von uns empfohlenen Kryostaten ist die Orientierungshilfe eine zentrale Linie, die in die 12-Uhr-Position über dem Spannfutterhalter geätzt ist, während das Spannfutter selbst an den äußersten Ringen einen dreieckigen Ausschnitt hat. Zusammen bezeichnen wir diese Funktionen als Orientierungshilfe. Wenn Ihr Kryostat nicht über solche Eigenschaften verfügt, empfehlen wir Ihnen, einen Permanentmarker zu verwenden, um Ihren eigenen zu erstellen.
  4. Bereiten Sie die Netzhaut mit einer Rasierklinge für den Transfer vor, indem Sie überschüssiges OCT, das die Netzhaut umgibt, seitlich entfernen und dann die Netzhaut vorsichtig vom Deckglas trennen, um sie beweglich zu machen.
  5. Nehmen Sie das Spannfutter vom Tisch und geben Sie einen kleinen Tropfen flüssiges OCT auf die vorbereitete ebene OCT-Tischoberfläche.
  6. Legen Sie die Netzhaut direkt auf das flüssige OCT. Drücken Sie die Netzhaut mit einem vorgekühlten (-18 °C) Glasobjektträger 10-30 s lang gegen den OCT-Tisch, bis sie eingefroren ist.
  7. Tragen Sie zusätzliches OCT auf die Netzhaut und das Stadium auf, um eine vollständige Verklebung zu gewährleisten. Frieren Sie im Schnellgefrierbereich des Kryostaten ein. Inkubieren Sie das Netzhaut-/OCT-Stadium mindestens 30 Minuten lang im Kryostaten, um eine vollständige Verbindung zu gewährleisten.
  8. Beginnen Sie mit dem Schneiden:
    1. Schneiden Sie überschüssige OCT vorsichtig ab, bis die Netzhaut sichtbar wird (Abbildung 6B). Verwenden Sie die Rasierklinge, um überschüssiges OCT von den Blockkanten zu entfernen.
      HINWEIS: Ziehen Sie den Tisch immer ein, bevor Sie das Schneiden nach dem manuellen, radialen Trimmen fortsetzen. Für das Besäumen von Scheiben auf der Vorderseite empfehlen wir, die gleiche Schnittstärke zu verwenden, die für die gewünschten Schnitte verwendet wird. Die Beschnittdicke kann jedoch je nach Benutzerpräferenz zwischen 10 μm und 100 μm liegen.
    2. Fahren Sie mit dem Trimmen fort, während Sie die Abschnitte auf das Vorhandensein von Sklera untersuchen. Wenn die Sklera sichtbar ist, passen Sie den Tischwinkel nach Bedarf an. Fahren Sie mit dem Beschneiden fort, bis die Abschnitte eine gleichmäßige Skleraverteilung aufweisen, was eine optimale Ebenheit und maximale Kleeblattfläche in jedem Abschnitt gewährleistet.
    3. Sammeln Sie Gewebeschnitte (Abbildung 6C).
      HINWEIS: Die optimale Mächtigkeit hängt vom endgültigen Assay ab und muss diesem Downstream-Protokoll entsprechen. Wenn beispielsweise 10X Xenium verwendet wird, empfehlen wir 20 μm dicke Abschnitte. Für 10X Visium sind hingegen 15 μm dicke Abschnitte besser geeignet.
    4. Verwenden Sie vorgekühlte Folien und manipulieren Sie die Abschnitte mit zwei Pinseln in Position.
    5. Legen Sie einen Finger unter den Schnitt, bis das OCT schmilzt und das Gewebe haftet (ca. 5 s).
    6. Legen Sie den Objektträger zum erneuten Einfrieren des Gewebes wieder auf eine kalte Oberfläche.
      HINWEIS: Beim Sammeln von Abschnitten in kleinen Bereichen (z. B. für Xenium) können mehrere Gefrier-Tau-Zyklen erforderlich sein. Dies hat zwar keine Auswirkungen auf sondenbasierte Techniken, kann aber die RNA-Qualität für unvoreingenommene Sequenzierungsansätze beeinträchtigen.
  9. Lagern Sie die Objektträger für den sofortigen Gebrauch auf Trockeneis, am nächsten Tag bei -20 °C für RNAscope und bei -80 °C für die Langzeitlagerung.

4. Zielerkennung und Mikroskopie

HINWEIS: Obwohl die Technik mit anderen molekularen Profilierungsmethoden kompatibel ist, nennen wir RNAscope als ein validiertes Beispiel.

  1. Probenvorbereitung:
    1. Nehmen Sie die Objektträger aus der -80 °C Lagerung und erwärmen Sie sie 1 h lang bei -20 °C.
      HINWEIS: Objektträger können bis zu 12 Stunden lang bei -20 °C gelagert werden, bevor mit dem Rest dieses Verfahrens begonnen wird, sollten jedoch nicht zu lange bei -20 °C gelagert werden, um den RNA-Abbau zu minimieren.
  2. Erhitzen Sie die Objektträger schnell auf 37 °C für 10 s.
  3. Fixieren Sie das Gewebe, indem Sie die Objektträger 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in frisches 4%iges PFA tauchen.
  4. Waschen Sie die Objektträger gründlich mit 1x PBS.
  5. Gewebedehydrierung durch Ethanol-Serie: 50% Ethanol für 5 min, 70% Ethanol für 5 min, 100% Ethanol für 5 min, frisches 100% Ethanol für 5 min.
    HINWEIS: Dies ist ein kritischer Schritt der Qualitätskontrolle für die Gewebemontage. Wenn es während der Dehydrierung zu einer Gewebeablösung kommt, deutet dies auf eine OCT-Überlappung von benachbarten Abschnitten während der Montage hin. Sorgfältiges Trimmen von überschüssigem OCT während des Schneidens und Montierens verhindert dieses Problem.
  6. Vorbereitung der Barriere:
    1. Trocknen Sie die Objektträger 5 Minuten lang bei Raumtemperatur an der Luft.
    2. Zeichnen Sie mit einem hydrophoben Barrierestift eine Barriere um jeden Gewebeabschnitt. Lassen Sie die Barriere 5 Minuten lang bei Raumtemperatur vollständig trocknen.
  7. Molekularer Nachweis:
    1. Wenden Sie die Protease-IV-Behandlung zur Permeabilisierung des Gewebes an.
    2. Fahren Sie mit dem Herstellerprotokoll für die Hybridisierung der Zielsonde (2 Stunden bei 40 °C), die Signalverstärkungsschritte (drei sequenzielle Verstärker) und die Fluorophordetektion (vier aufeinanderfolgende Runden für die Drei-Plex-Färbung) fort.
  8. Bildgebung:
    1. Führen Sie vor jeder Montage des Deckglases eine nukleare DAPI-Gegenfärbung durch.
    2. Montieren Sie das Deckglas mit einem Antifading-Montagemedium.
    3. Aufnahme mittels Fluoreszenzmikroskopie mit entsprechenden Filtersets.
    4. Erfassen Sie für die Multiplex-Erkennung dasselbe Feld in allen vier Erkennungsrunden für die rechnerische Registrierung.
    5. Behalten Sie konsistente Belichtungseinstellungen zwischen den Runden bei, um einen genauen Signalvergleich zu ermöglichen.
      HINWEIS: Ausführliche Informationen zur Implementierung von RNAscope finden Sie in den Herstellerprotokollen (siehe Materialtabelle). Befolgen Sie bei vollautomatischen Plattformen wie Xenium alle Schritte des Herstellerprotokolls genau wie angegeben. Bei allen Protokollen ist davon auszugehen, dass ein Versagen aufgrund einer Gewebeablösung höchstwahrscheinlich während eines frühen Dehydratisierungs- oder Waschschritts aufgrund einer OCT-Überlappung auftreten wird, wie in diesem Beispielprotokoll angegeben.

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Ergebnisse

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Die erfolgreiche Implementierung dieses Protokolls führt zu intakten Netzhautschnitten , die für mehrere molekulare Profilierungsansätze geeignet sind, während die räumlichen Beziehungen über die Netzhautoberfläche erhalten bleiben. Wir demonstrieren die Nützlichkeit des Protokolls durch einen systematischen Validierungsansatz, der von der konventionellen Immunhistochemie über den manuellen Multiplex-RNA-Nachweis bis hin zur automatisierten molekularen Profilerstellung mit hohem Durchsatz reicht.

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Diskussion

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Die hier vorgestellte Methode adressiert eine kritische technische Barriere in der retinalen Raumbiologie, indem sie die Herstellung dünner Gesichtsschnitte ermöglicht, die für moderne molekulare Profiling-Technologien geeignet sind. Die wichtigsten Schritte im Protokoll konzentrieren sich auf die Handhabung des Gewebes während der ersten Dissektion und die präzise Kontrolle von Temperatur und Hydratation während der Kryokonservierung und Sektion. Eine erfolgreiche Implementieru...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

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Wir danken der Human Immune Monitoring Shared Resource (RRID:SCR_021985) innerhalb des University of Colorado Cancer Center (P30CA046934) für ihre fachkundige Unterstützung beim Betrieb der 10X Xenium-Plattform. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (R01EY035293) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Ames″ MediumSigma-AldrichA1420-10X1LSpezifische Marke nicht wichtig
Beadsmith Thread Zap, Thread BurnerThe Beadsmith Store7.90524E+11Alternative Kauterisatoren können verwendet werden
KryostatLeicacm1950Wichtige Überlegungen sind das separat steuerbare Volumen in Abhängigkeit von der Tischtemperatur.
TrockeneisNANANA
Fine Science Tools Dumont #5 PinzetteFine Science Tools 1129500NC9889584Spezifische Marke nicht wichtig
Fisher Healthcare Tissue-Plus O.C.T. CompoundFisher Scientific23-730-571Spezifische Marke nicht wichtig
Fisherbrand High Precision Straight Slender Fine Point Pinzette/PinzetteFisher Scientific12-000-127Spezifische Marke nicht wichtig
Fisherbrand Standard PräparierschereFisher Scientific08-951-20Spezifische Marke nicht wichtig
Fisherbrand Superfrost Plus ObjektträgerFisher Scientific22-037-246Spezifische Marke nicht wichtig
Integra Miltex Noyes Iris SchereIntegra Miltex 18151012-460-278Spezifische Marke nicht wichtig
Olympus IX81 Spinning-Disk-EpifluoreszenzmikroskopFür Abbildung 7
RNAscope HiPlexACDBio
Rechteckige DeckgläserFisher Scientific12-541-033Spezifische Marke nicht wichtig
NatriumbicarbonatSigma-AldrichS6014-25GSpezifische Marke nicht wichtig
Thermo Scientific Nunc GlasbodenschalenFisher Scientific12-567-400Spezifische Marke nicht wichtig
World Precision Instrument Precision Stereo Zoom Trinokulares Mikroskop (IV) auf GalgenständerWorld Precision Instrument PZMTIVBS50-253-8607Spezifische Marke nicht wichtig
Zeiss Axio Imager.M2 Epifluoreszenzmikroskop Optisches Schneiden aktiviert (für Abbildung 8)

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Baden, T., Euler, T., Berens, P. Understanding the retinal basis of vision across species. Nat Rev Neurosci. 21 (1), 5-20 (2020).
  2. Heukamp, A. S., Warwick, R. A., Rivlin-Etzion, M. Topographic variations in retinal encoding of visual space. Annu Rev Vis Sci. 6, 237-259 (2020).
  3. Collin, S. P. A web-based archive for topographic maps of retinal cell distribution in vertebrates. Clin Exp Optom. 91 (1), 85-95 (2008).
  4. Budoff, S. A., Poleg-Polsky, A. GraSP gene targets to hierarchically infer sub-classes with CuttleNet. bioRxiv. , (2024).
  5. Rheaume, B. A., et al. Single cell transcriptome profiling of retinal ganglion cells identifies cellular subtypes. Nat Commun. 9 (1), 2759(2018).
  6. Tran, N. M., et al. Single-cell profiles of retinal ganglion cells differing in resilience to injury reveal neuroprotective genes. Neuron. 104 (6), 1039-1055.e12 (2019).
  7. Yan, W., et al. Mouse retinal cell atlas: Molecular identification of over sixty amacrine cell types. J Neurosci. 40 (27), 5177-5195 (2020).
  8. Bleckert, A., Schwartz, G. W., Turner, M. H., Rieke, F., Wong, R. O. L. Visual space is represented by nonmatching topographies of distinct mouse retinal ganglion cell types. Curr Biol. 24 (3), 310-315 (2014).
  9. Holmgren, C. D., et al. Visual pursuit behavior in mice maintains the pursued prey on the retinal region with least optic flow. eLife. 10, e70838(2021).
  10. Tapia, M. L., Nascimento-dos-Santos, G., Park, K. K. Subtype-specific survival and regeneration of retinal ganglion cells in response to injury. Front Cell Dev Biol. 10, 956279(2022).
  11. Berchuck, S. I., Mukherjee, S., Medeiros, F. A. Estimating rates of progression and predicting future visual fields in glaucoma using a deep variational autoencoder. Sci Rep. 9 (1), 18113(2019).
  12. de Gainza, A., et al. The trajectory of glaucoma progression in 2-dimensional structural-functional space. Ophthalmol Glaucoma. 3 (6), 466-474 (2020).
  13. Choi, J., et al. Spatial organization of the mouse retina at single cell resolution by MERFISH. Nat Commun. 14 (1), 4929(2023).
  14. Kremers, L., et al. Super-resolution STED imaging in the inner and outer whole-mount mouse retina. Front Ophthalmol. 3, 1126338(2023).
  15. Simon, P., Thanos, S. Combined methods of retrograde staining, layer-separation and viscoelastic cell stabilization to isolate retinal ganglion cells in adult rats. J Neurosci Methods. 83 (2), 113-124 (1998).
  16. Lindqvist, N., Vidal-Sanz, M., Hallböök, F. Single cell RT-PCR analysis of tyrosine kinase receptor expression in adult rat retinal ganglion cells isolated by retinal sandwiching. Brain Res Brain Res Protoc. 10 (2), 75-83 (2002).
  17. Fontaine, V., Kinkl, N., Sahel, J., Dreyfus, H., Hicks, D. Survival of purified rat photoreceptors in vitro is stimulated directly by fibroblast growth factor-2. J Neurosci. 18 (23), 9662-9672 (1998).
  18. Sandu, C., Hicks, D., Felder-Schmittbuhl, M. -P. Rat photoreceptor circadian oscillator strongly relies on lighting conditions: Molecular clock in rat photoreceptors. Eur J Neurosci. 34 (3), 507-516 (2011).
  19. Jaeger, C., et al. Circadian organization of the rodent retina involves strongly coupled, layer-specific oscillators. FASEB J. 29 (4), 1493-1504 (2015).
  20. Hecht, R. M., Shi, Q., Garrett, T. R., Sivyer, B., Morgans, C. Split retina as an improved flatmount preparation for studying inner nuclear layer neurons in vertebrate retina. J Vis Exp. (203), e65757(2024).
  21. Budoff, S. A., Poleg-Polsky, A. A Complete spatial map of mouse retinal ganglion cells reveals density and gene expression specializations. bioRxiv. , (2025).

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