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Methodenartikel

Häufigkeit und Verteilung von Crossovers bei Caenorhabditis elegans Meiose durch SNP-Genotypisierung mittels Real-time PCR

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DOI:

10.3791/68183

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11. Juli 2025

 ,  ,  , 
1Graduate School of Biology-Oriented Science and Technology, Kindai University, 2Department of Genetic Engineering, Faculty of Biology-Oriented Science and Technology, Kindai University, 3Graduate School of Frontier Biosciences, Osaka University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll bietet eine Methode zur Messung der Crossover-Frequenzen und -Verteilung während der Meiose bei Caenorhabditis elegans. Zur Bestimmung der Herkunft der Chromosomen wurde eine Einzelnukleotid-Polymorphismus-Genotypisierung mit real-time PCR verwendet. Das 4-Punkt-Mapping ermöglichte es, die Crossover-Verteilungen der Regionen des linken Arms, des Zentrums und des rechten Arms jedes Chromosoms zu bestimmen.

Zusammenfassung

Caenorhabditis elegans ist ein hervorragender Modellorganismus für die Untersuchung der Meiose. Neben allgemeinen Vorteilen, wie einem kurzen Fortpflanzungszyklus, vielen Nachkommen und einem transparenten Körper für die Bildgebung, gibt es sechs Paare homologer holozentrischer Chromosomen. Es gibt eine starke Crossover-Interferenz und eine Regulierung der Crossover-Verteilung. Um die Crossover-Häufigkeit zu messen, wurden das sichtbare Marker-Mapping, das Snip-SNP-Mapping und die Quantifizierung zytologischer Marker als Vorläufer der Crossover-Bildung entwickelt. In dieser Arbeit stellen wir eine modifizierte SNP-Genotypisierungsmethode vor, um die Crossover-Häufigkeit und -Verteilung in der Oogenese von C. elegans zu messen. Durch diese Methode können die mühsamen Schritte des Restriktionsverdaus und der Gelelektrophorese entfallen und die unklare Beurteilung von ungeschnittenen DNA-Banden vermieden werden. Die Genotypisierung des Einzelnukleotid-Polymorphismus (SNP) wird unter Verwendung des Bristol/Hawaiian-Hybridstamms durchgeführt. Die Kreuzung von Hermaphroditen mit myo-3p::GFP-exprimierenden Männchen ermöglicht es uns, uns auf die Oogenese zu konzentrieren. Ein einzelnes Wurmlysat erzeugt eine ausreichende DNA-Matrize für alle sechs Chromosomen. Die 5'-Exonuklease-basierte TaqMan-Chemie und SNP-spezifische MGB-Sonden (Minor Groove Binder) ermöglichen den präzisen Nachweis von SNP mit einer Genotypisierungsrate von ca. 97,7%. Wir nutzen die genaue Detektion von SNPs, um die Crossover-Frequenz in C. elegans zu messen. Diese Methode kann auch zur Bestimmung der Crossover-Frequenz in männlichen oder Crossover-defekten Mutanten sowie für spezifischere Chromosomenintervalle angewendet werden.

Einleitung

Die Crossover-Bildung zwischen homologen Chromosomen ist essentiell für die korrekte Segregation der Chromosomen und auch für die Erzeugung genetischer Vielfalt1. Fehler bei der Crossover-Bildung verursachen Aneuploidie, die zu Unfruchtbarkeit, Fehlgeburten und Geburtsfehlern führen kann2. Die Crossover-Häufigkeit variiert je nach Chromosomenregion, Mutantentyp, Alter und Geschlecht, was die Notwendigkeit unterstreicht, die Crossover-Häufigkeit unter jeder dieser Bedingungen genau zu messen 3,4,5. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, die Crossover-Frequenz jeder Chromosomendomäne genau zu messen und dadurch die Verteilung der Crossover über die gesamte Länge des C. elegans-Chromosoms genau zu bestimmen.

Traditionell wird die Zwei-Punkt-Kartierung unter Verwendung morphologischer Marker verwendet, um die Kreuzungsfrequenz 6,7,8,9,10 zu messen. Bei C. elegans werden Phänotypen von dumpigen, kurzen, fetten Körpern (Dpy) und unkoordinierten Bewegungen (Unc) häufig verwendet, um Chromosomenkarten zu erstellen6. Die Vorteile dieser Methode sind die geringen Kosten und die Möglichkeit, viele Nachkommen zu analysieren. Zu den Nachteilen dieser Methoden gehören die Einschränkung der Auswahl der interessierenden Loci und die Unfähigkeit, letale Nachkommen zu verwenden, da ihre Phänotypen nicht sichtbar sind. Um die Unannehmlichkeiten bei der Standortwahl zu überwinden, wurden Tc1-Transposons als Marker für polymorphe sequenzmarkierte Stellen (STS) verwendet11,12. Tc1s können mittels PCR und Elektrophorese nachgewiesen werden. Während der Standardstamm Bristol N2 30 Kopien des Tc1-Transposons aufwies, wiesen die C. elegans-Isolate aus Bergerac in Frankreich (RW7000 und DP13) 500 Kopien von Tc1 auf. Daher variieren die Anzahl und Verteilung der Tc1-Transposons zwischen den Isolaten, und dies wird verwendet, um die Chromosomen der Nachkommen von Hybridwürmern zwischen den Isolaten mittels PCR zu analysieren. Anschließend wurden SNPs auch zur Messung der Crossover-Häufigkeit und -Verteilung verwendet13,14. Der SNP zwischen den Stämmen Bristol N2 und Hawaiian CB4856 trat alle 1.000 bpauf 15,16. SNPs werden als Restriktionsfragmentlängenpolymorphismen (RFLP) mittels PCR, Restriktionsverdau und Elektrophorese nachgewiesen. Kürzlich wurden kleine Insertions-/Deletionsstellen (InDel) sowie SNPs zwischen Bristol N2 und hawaiianischem CB4856 als effizientere Marker vorgeschlagen17. Die Messung der Crossover-Frequenz mit Tc1, RFLP und InDel erfordert jedoch arbeitsintensive Prozesse wie PCR, Restriktionsenzymbehandlung und Elektrophorese. Wenn nicht jeder Prozess in einer groß angelegten Analyse optimiert wird, können die Ergebnisse aufgrund von Faktoren wie der Genauigkeit der PCR, der Art des verwendeten Restriktionsenzyms, der Effizienz der DNA-Spaltung und der Klarheit und Trennung der Banden während der Elektrophorese falsch interpretiert werden. Im Gegensatz dazu nutzt die vorgeschlagene Methode die SNP-Genotypisierung durch real-time PCR, um eine genaue und präzise Quantifizierung zu ermöglichen.

Crossover sind nicht zufällig entlang der Chromosomen verteilt. Bei C. elegans bilden sich einzelne Kreuzungen häufiger in den Armen und werden in der Mitte unterdrückt 3,5. Mit der morphologischen Zwei-Punkt-Kartierung kann nicht identifiziert werden, wo Crossover außerhalb von Markergenen stattfinden. Umgekehrt ermöglicht die SNP-Kartierung eine Erhöhung der Marker und erleichtert nachweislich die Bestimmung der genauen Region eines Crossovers entlang des gesamten Chromosoms 5,14,18. In dieser Studie verwendeten wir die von Rockman und Kruyglyak vorgeschlagenen chromosomalen Domänengrenzen5 und wählten vier SNPs für die Analyse aus: an beiden Enden des Chromosoms und an beiden Enden der Zentrums-/Armgrenzen.

Unter Ausnutzung der vorherigen Methoden haben wir eine genaue und schnelle SNP-Nachweismethode durch Echtzeit-PCR unter Verwendung von TaqMan, 5'-Nuklease19, vorgeschlagen, um den Crossover zwischen dem linken Arm, der Mitte und dem rechten Arm jedes Chromosoms zu messen. Die Vorteile unserer Methode gegenüber alternativen Technologien im Vergleich zu früheren Studien 20,21,22 sind Genauigkeit und Einfachheit. Diese Methode ist eine qPCR-angewandte Crossover-Analysemethode für C. elegans und eignet sich hervorragend für Forscher, die die Meiose untersuchen.

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Protokoll

1. Erste genetische Kreuzung

  1. Bereiten Sie Gegenplatten vor, die aus normalen Nematodenwachstumsmediumplatten (NGM) mit einem kleinen OP50-Spot (~5 mm Durchmesser) in der 35-mm-Schale bestehen.
  2. Fügen Sie drei L4-Hermaphroditen des Bristol-N2-Stammes (oder Mutanten mit Bristol-Hintergrund) und neun junge erwachsene Männchen des hawaiianischen CB4856-Stammes auf einer Paarungsplatte hinzu (Abbildung 1A).
    HINWEIS: Um Mutanten mit hoher embryonaler Letalität zu analysieren, ist es notwendig, in dieser Kreuzung ausgewogene Mutanten mit sowohl Bristol- als auch Hawaii-Hintergrund zu verwenden. Um Mutanten mit hawaiianischem Hintergrund zu erhalten, müssen die Bristol-Mutanten mindestens sechsmal mit dem hawaiianischen Stamm gekreuzt werden, bis alle SNP-Stellen von Interesse einen hawaiianischen Hintergrund haben. Infolgedessen enthält die hawaiianische Mutante nur in der mutierten Region und auf dem Balancer-Chromosom Bristol-Hintergrund.
  3. Inkubiere die Platte 1,5 Tage lang bei 20 °C, um die beiden Stämme zu paaren. Übertragen Sie jeden Hermaphroditen mit OP50 auf eine neue einzelne NGM-Platte.
  4. Legen Sie die Platten für 1 Tag in einen 20 °C heißen Inkubator, damit sie befruchtete Eier legen können. Übertragen Sie jeden Hermaphroditen mit OP50 auf eine neue einzelne NGM-Platte.
  5. Legen Sie die Platten für 1 Tag in einen 20 °C heißen Inkubator, damit die befruchteten Eier wieder gelegt werden können. Entfernen Sie die Hermaphroditen. Bewahren Sie die Platten 0,5 - 1 Tag in einem 20 °C Inkubator auf, um die Nachkommen auf L4 wachsen zu lassen.

2. Zweites Kreuz

  1. Wählen Sie sechs gekreuzte L4-Hermaphroditen (Bristol/Hawaii-Hybriden) und 12-15 ccIs4251[(pSAK2) myo-3p::GFP::LacZ::NLS + (pSAK4) myo-3p::mitochondrial GFP + dpy-20(+)] I (TTS24) Bristol Männchen auf eine neue Paarungsplatte (Abbildung 1B).
    HINWEIS: Der eingefügte Stamm ccIs4251 stammt vom Caenorhabditis Genetics Center und muss mehr als sechsmal mit dem Wildtyp-N2-Stamm ausgekreuzt werden.
  2. Bewahren Sie die Platte 1,5 Tage bei 20 °C in einem Inkubator auf, um sich zu paaren. Übertragen Sie jeden Hermaphroditen mit OP50 auf eine neue NGM-Platte.
  3. Legen Sie die Platten für 1 Tag in einen 20 °C heißen Inkubator, damit sie befruchtete Eier legen können. Übertragen Sie jeden Hermaphroditen mit OP50 auf eine neue einzelne NGM-Platte.
  4. Bewahren Sie die Platten 1 Tag lang in einem 20 °C heißen Inkubator auf, damit sie wieder befruchtete Eier legen können. Übertragen Sie jeden elterlichen Hermaphroditen in ein PCR-Röhrchen mit 3 μl Lysepuffer, um zu überprüfen, ob die erste Kreuzung erfolgreich war.
  5. Überprüfen Sie die Genotypen der Eltern als Bristol/Hawaiian-Hybrid mittels PCR in einer Region von Chromosom V. Trennen Sie die Banden durch 2,5 % Agarose-Gelelektrophorese.
    1. Im SNP, WBVar01973670, beträgt die Länge des PCR-Amplikons aus dem Bristol-Genom 220 bp und aus dem hawaiianischen Genom 196 bp. Wenn die PCR-Ergebnisse darauf hindeuten, dass es sich bei den Eltern um Bristol-Homozygoten handelt, liegt dies an der Selbstbefruchtung der ersten Kreuzung. Verwenden Sie die Nachkommen dieser Würmer nicht für weitere Analysen.

3. Probenahme

  1. Bereiten Sie den Wurmlysepuffer wie folgt vor: 50 mM KCL, 10 mM Tris pH 8,2, 2,5 mM MgCl2, 0,45 % IGEPAL CA-630 (NP-40), 0,45 % Tween 20 und 0,01 % Gelatine. Durch Filtration sterilisieren und bei Raumtemperatur lagern. Unmittelbar vor der Anwendung 3 μl 20 mg/ml Proteinase K (in H2O) zu 1 ml Lysepuffer geben und in Aliquoten bei -20 °C lagern.
  2. Überprüfen Sie die Expression des GFP am Körperwandmuskel der Nachkommen der zweiten Kreuzung mit einem Fluoreszenzpräpariermikroskop, bevor Sie die Würmer in einzelne PCR-Röhrchen geben. Die Vergrößerung beträgt 6,1-55x und die verwendete Wellenlänge 440-460 nm.
  3. Wählen Sie einen GFP-positiven Einzelwurm und geben Sie ihn in jedes PCR-Röhrchen mit 3 μl Wurmlysepuffer (Abbildung 1C). Sammeln Sie insgesamt 360 (90 x 4 biologische Replikate) adulte männliche gekreuzte Nachkommen in jedem von 360 PCR-Röhrchen.
    HINWEIS: Um zu vermeiden, dass selbstbefruchtete Nachkommen ausgewählt werden, sollten GFP-positive Würmer für die Probenahme ausgewählt werden. Unverpaarte Hermaphroditen, die jünger als L4 sind, stehen ebenfalls für die Analyse von Autosomen zur Verfügung, aber da sie eine unterschiedliche Anzahl von X-Chromosomen haben, müssen Männchen und Hermaphroditen nach dem Wachstum zu L4 identifiziert und bei der Analyse des X-Chromosoms entnommen werden.
  4. Legen Sie die Proben für 5 Minuten in einen -80 °C Gefrierschrank. Die Proben können bei -80 °C gelagert werden, bis die Lyse beginnen kann.
  5. Bei der Analyse von Mutanten mit hoher embryonaler Letalität sollten die toten Embryonen anstelle der lebenden Larven gesammelt werden, um unverzerrte Ergebnisse zu erhalten. Um Embryonen zu entnehmen, verwenden Sie eine Pipettenspitze mit 0,5 μl Chitinaselösung (20 mg/ml Chitinase, 50 mM NaCl, 70 mM KCl, 2,5 mM MgCl2, 2,5 mM CaCl2). Entnehmen Sie die Embryonen innerhalb von 4 Stunden nach der Lege.
    HINWEIS: Tote Embryonen, die vor mehr als 4 Stunden gelegt wurden, sind für die PCR-Analyse ungeeignet, wahrscheinlich aufgrund des Abbaus der genomischen DNA.

4. Proben-Lyse

  1. Stellen Sie die PCR-Röhrchen im Thermocycler für 1 h auf 60 °C und anschließend 15 Minuten lang auf 95 °C ein. Geben Sie 100 μl nukleasefreies Wasser in jedes Röhrchen und mischen Sie es gut.
  2. Lagern Sie die Proben bei -20 °C, bis Sie mit der SNP-Genotypisierung durch Echtzeit-PCR beginnen.

5. SNP-Genotypisierung

  1. Stellen Sie eine Mischung wie folgt her (Abbildung 2). In ein 1,5-ml-Röhrchen 125 μl Master Mix, 6 μl SNP Genotyping Assay (40x), 280 μl destilliertes Wasser (DW), Forward Primer (450 nM), Reverse Primer (450 nM), Probe 1 (100 nM), Probe 2 (100 nM) geben.
    HINWEIS: Die Sonden und Primer sind in Tabelle 1 aufgeführt.
  2. Mischen Sie gründlich, indem Sie mehrmals pipettieren, um eine gleichmäßige Konzentration zu gewährleisten. Geben Sie 4 μl der Mischung in jede Vertiefung einer 96-Well-PCR-Platte auf der Stützbasis mit einer 12-Kanal-Mikropipette.
  3. 1 μl Lysat, das jede genomische DNA enthält, in jede Vertiefung geben und durch mehrmaliges Pipettieren mischen.
  4. Bereiten Sie Positivkontrollen vor, d. h. Bristol-Homozygoten, Hawaii-Homozygoten und Bristol/Hawaii-Hybriden, und drei No-Template-Kontrollen als Negativkontrollen (Abbildung 3A).
  5. Versiegeln Sie die Platte mit einer optischen Klebefolie. Drücken Sie die Folie mit einem Applikator auf die Ränder jeder Vertiefung.
  6. Zentrifugieren Sie die Platte kurz, um die Flüssigkeit am Boden aufzufangen und Luftblasen aus der Flüssigkeit zu entfernen.
  7. Legen Sie die Platte auf das real-time PCR-Instrument. Klicken Sie in der Software auf die Schaltfläche Neues Experiment erstellen .
  8. Legen Sie in der Einstellung Eigenschaften den Gerätetyp auf QuantStudio 1 System, den Blocktyp auf 96-Well-Block mit 0,2 ml, den experimentellen Typ auf Genotypisierung, Chemie auf TaqMan-Reagenzien und den Ausführungsmodus auf Schnell fest.
  9. Stellen Sie in der Einstellung Methode das Volumen auf 5 μl ein (stellen Sie sicher, dass das richtige Reaktionsvolumen mit der Einstellung übereinstimmt), die Zykluszahl auf 40 Zyklen (Standard). Stellen Sie die Temperatur- und Zeiteinstellungen wie folgt ein: Pre-Read-Tisch bei 25 °C für 30 s, Hold-Stufe (Enzymaktivierung, Heißstart) bei 95 °C für 20 s, PCR-Tisch bei 95 °C für 1 s, 60 °C für 20 s und Post-Read-Tisch bei 25 °C für 30 s.
  10. Passen Sie in der Einstellung "Platte" die Positionen der Samples und Regler an die einzelnen Vertiefungen auf dem Software-Bildschirm an.
  11. Speichern Sie das Experiment auf einem USB-Gerät, laden Sie es in das Echtzeit-PCR-Gerät und klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen .

6. Datenanalyse

  1. Speichern Sie die Ergebnisse auf einem USB-Stick und übertragen Sie sie zur Datenanalyse auf einen Computer.
  2. Analysieren Sie Echtzeit-Delta-Rn (dRn)-Daten mit der folgenden Formel, wobei Rn (normalisierter Reporter) das Fluoreszenzsignal des Reporterfarbstoffs VIC und FAM ist, normalisiert durch Division durch das Fluoreszenzsignal des passiven Referenzfarbstoffs ROX.
    dRn = Rn - Grundlinie
  3. Überprüfen Sie das Diagramm der allelischen Diskriminierung.
  4. Bestätigen Sie die Trennung der Cluster (Abbildung 3B). Im Alleldiskriminierungsdiagramm sind Bristol-Homozygoten in der unteren rechten Ecke gruppiert, Bristol/Hawaii-Hybriden sind in der oberen rechten Ecke gruppiert, hawaiianische Homozygoten sind in der oberen linken Ecke gruppiert und negative Kontrollen sind in der unteren linken Ecke gruppiert. Verwenden Sie die folgenden Farbcodes:
    Rot: Bristol-Allel
    Blau: Hawaiianisches Allel
    Grün: Heterozygot
    Schwarz: Negative Kontrolle
  5. Exportieren Sie die Ergebnisse in eine Tabellenkalkulation und stellen Sie die Genotypisierungsdaten von allen vier SNP-Positionen zusammen. Wenn es unbestimmte Aufrufe an vier aufeinanderfolgenden Positionen gibt, schließen Sie die Daten vom N-Wert aus. Verwenden Sie 90 Proben pro Platte für die Analyse.
    1. Identifizieren Sie die Crossover wie folgt: Wenn der SNP an Position #1 ein Bristol/Hawaiian-Hybrid ist und die Positionen #2-#4 alle Bristol-Homozygoten sind [B/H]-[B/B]-[B/B]-[B/B] oder Position #1 ein Bristol-Homozygot ist und Position #2-#4 alle Bristol/Hawaii-Hybriden sind [B/B]-[B/H]-[B/H]-[B/H], Diese Ergebnisse deuten auf ein einzelnes Crossover zwischen den Positionen #1 und #2 (irgendwo auf dem linken Arm des Chromosoms) hin. In ähnlicher Weise tritt im Fall von [B/H]-[B/H]-[B/B]-[B/B] oder [B/B]-[B/B]-[B/H]-[B/H] ein einzelner Crossover zwischen #2 und #3 (irgendwo in der zentralen Region des Chromosoms) auf, und im Fall von [B/H]-[B/H]-[B/H]-[B/B] oder [B/B]-[B/B]-[B/B]-[B/H], Ein einzelnes Crossover findet zwischen #3 und #4 (irgendwo auf dem rechten Arm des Chromosoms) statt.
      HINWEIS: Es gibt sechs Muster von Doppelkreuzungen. Links und rechts: [B/B]-[B/H]-[B/H]-[B/B] und [B/H]-[B/B]-[B/B]-[B/H], links und Mitte: [B/B]-[B/H]-[B/B]-[B/B]-[B/B] und [B/H]-[B/B]-[B/H]-[B/H], mittig und rechts: [B/B]-[B/B]-[B/H]-[B/B] und [B/H]-[B/H]-[B/B]-[B/H].

7. Statistische Auswertung

  1. Geben Sie die Werte in die SPSS Statistics-Software (IBM) ein. Für den Vergleich der Crossover-Verteilung am linken Arm, der zentralen Region und dem rechten Arm der Chromosomen fügen Sie 82 Chromosomen mit einem Crossover am linken Arm, 20 Chromosomen mit einem Crossover am zentralen Bereich und 68 Chromosomen mit einem Crossover am rechten Arm ein.
  2. Führen Sie eine ANOVA- und Bonferroni-Korrektur durch und bestimmen Sie die statistische Signifikanz mit einem zweiseitigen p-Wert. Führen Sie so viele Vergleiche wie nötig durch, z. B. linker Arm gegen Mitte oder WT gegen Mutante.

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Ergebnisse

Wir haben die vier SNP-Stellen auf Chromosom II in C. elegans mittels SNP-Genotypisierungsassay nachgewiesen, um die Crossover-Bildung pro voller Länge des Chromosoms, im linken Arm, in der zentralen Region und im rechten Arm zu quantifizieren. Der Nachweis von SNPs erfolgt gemäß den Angaben des Herstellers. Der Mastermix enthält Taq-DNA-Polymerase, hitzelabile Uracil-N-Glykosylase (UNG), dNTP mit dUTP und passiven Referenz-ROX-Farbstoff. Die Taq-DNA-Polymerase wird bei 95 °C aktiviert und ermöglicht die Hemmung...

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Diskussion

In dieser Arbeit haben wir eine Methode zur Messung der Crossover-Häufigkeit und -Verteilung in der Meiose von C. elegans eingeführt, die auf der SNP-Genotypisierung von gekreuzten Nachkommen der Bristol/Hawaiian-Hybridart basiert. Während die herkömmliche Snip-SNP-Methode (RFLP) eine Gelelektrophorese nach der PCR erfordert und der Nachweis von DNA-Banden ein Geldokumentationssystem erfordert14,18, erfordert die SNP-Gen...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Danksagungen

Die Stämme wurden freundlicherweise vom Caenorhabditis Genetics Center (CGC) zur Verfügung gestellt, das vom NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440) finanziert wurde. Wir danken den Mitgliedern des Saito-Labors für ihre hilfreichen Diskussionen bezüglich dieser Arbeit. Diese Arbeit wurde von der Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) durch das KAKENHI Grant JP23K05868 an TTS unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
101-1000μ l PipettenspitzeQSP111-N-Q
0,5 mol/I-EDTA-Lösung (pH 8,0)Nacalai tesque14347-21
10mol/I-Natriumhydroxid-LösungNacalai tesque94611-45
10X DreamTaq Grüner PufferThermo Fisher Scientific EP0713
10μ L, lange Spitze, vergrößertFUKAEKASEI, WATSON110-207C
200 Mio. Jahre L, Standard-Spitze, graduiertFUKAEKASEI, WATSON110-705C
Agar PulverNacalai tesque01028-14
AgarosePH JapanPH108
Autoklav TOMY Modell ES-215 Hochdruck-DampfsterilisatorTOMY SEIKOES-215
Bacto Pepton Enzymatischer Verdau von ProteinThermo Fisher Scientific 211677
BorsäureNacalai tesque05215-05
Caenorhabditis elegans Bristol Wildtyp Caenorhabditis Genetik ZentrumN2
Caenorhabditis elegans Hawaiianischer WildtypCaenorhabditis Genetik ZentrumCB4856
CalciumchloridNacalai tesque06729-55
ccIs4251 [(pSAK2) myo-3p::GFP::LacZ::NLS + (pSAK4) myo-3p::mitochondriales GFP + dpy-20(+)] ILaboratorium SaitoTTS24ursprünglich von PD4251
CholesterinNacalai tesque08721-62
Benutzerdefinierte TaqMan SNP-Genotypisierungs-AssaysThermo Fisher Scientific 4332077
Desoxynukleotid (dNTP) LösungsmischungNeuengland BiolaboreNr. N04470
DigPrint Doc Tablet DP-T130zBio-WerkzeugeDP-T130z
Di-KaliumhydrogenphosphatNacalai tesque28726-05
PräpariermikroskopNikonSMZ-745 C-DS
Dream Taq DNA-PolymeraseThermo Fisher Scientific EP0713
Ethidiumbromid-LösungNacalai tesque14631-94
Forward Primer für WBVar01973670IDT103988736ATGTCTCACCCAAGGTTGAA
GelatineNacalai tesque166-31
Gilson PIPETMAN Klassische PipetteThermo Fisher Scientific 
IGEPAL CA-630Sigma-Aldrich18896
Magnesiumsulfat-HeptahydratNacalai tesque21003-75
MicroAmp Optische 96-Well-Recon-PlatteThermo Fisher Scientific N8010560
MicroAmp Optische AdhädivenfolieThermo Fisher Scientific 4311971
MiniAmp  ThermocyclerThermo Fisher Scientific MiniAmp
Mini-Sub Cell GT Horizontales Elektrophorese-System, 7 x 10 cm TablettBio-Rad Laboratorien1704466
Nichipet EXIINichiryo00-NPX2-2
Nichipet EXII MULTINichiryo00-NPM-12VP
Pippete Mate NEONichiryo00-PMNEO
KaliumchloridNacalai tesque285-38
KaliumdihydrogenphosphatNacalai tesque28720-65
Proteinase KThermo Fisher Scientific EO0491
QuantStudio 1 Real-Time-PCR-System, 96 Wells, 0,2 mLThermo Fisher Scientific Nr. A40426
Quick-Load Lila 1kb Plus DNA LeiterNeuengland BiolaboreN0550S
Reverse Primer für WBVar01973670IDT103988737tggctactcctagtcactga
NatriumchlorideNacalai tesque31319-45
TaqPath ProAmp MastermixThermo Fisher Scientific Nr. A30866
TC Dish 35, StandardSARSTEDT83.3900
Tris (Hydroxymethyl) aminomethanNacalai tesque35406-75
Trizma-BasisSigma-Aldrich  T1503-1KG
Tween 20Yoneyama Reagenz03706
WormStuff WurmpickelGenesee Scientific59-AWP
WormStuff Wurmspitzen (90/10% Pt/Ir, 30 Gauge)Genesee Scientific59-30PI36

Referenzen

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