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Methodenartikel

Minimalinvasives Cisterna magna-Injektionsmodell für Studien zur leptomeningealen Metastasierung bei Mäusen

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DOI:

10.3791/68190

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23. Mai 2025

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1Department of Neurosurgery, the First Affiliated Hospital, School of Medicine, Zhejiang University, 2Life Sciences Institute, Zhejiang University, 3Zhejiang Key Laboratory of Molecular Cancer Biology, Life Sciences Institute, and Department of Orthopaedic Surgery, the Second Affiliated Hospital, School of Medicine, Zhejiang University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Das Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Injektion von Tumorzellen über den perkutanen Punktionsweg in die Cisterna magna, das bei Mäusen eine robuste leptomeningeale Metastasierung induziert und so das Trauma und die extrakranielle Tumorlast reduziert.

Zusammenfassung

Die leptomeningeale Metastasierung (LM), die Ausbreitung von Krebszellen in die mit Liquor (CSF) gefüllten Leptomeningen, ist eine seltene, aber verheerende Komplikation bei fortgeschrittenen soliden Tumoren. Patienten mit LM haben oft eine schlechte Prognose, das Überleben wird in Wochen bis Monaten gemessen. Die Entwicklung von In-vivo-Modellen , die die Komplexität von LM genau nachbilden, ist für das Verständnis ihrer zellulären und pathologischen Mechanismen und die Bewertung potenzieller Therapien unerlässlich. Maus-LM-Modelle werden typischerweise durch intrakardiale, Carotis-Arterien- oder Cisterna magna-Injektion von Tumorzellen erstellt. Intrakardiale oder Carotis-Injektionen führen jedoch häufig zu einer erheblichen extrakraniellen und Hirntumorbelastung, was die biolumineszierende Bildgebung erschwert und zu einer Mortalität führt, die nicht mit LM zusammenhängt. In der Zwischenzeit erfordert die konventionelle Cisterna magna-Injektion invasive Verfahren wie Hautschnitte und Muskeldissektionen, was sie sowohl traumatisch als auch ressourcenintensiv macht. Hier beschreiben wir ein minimal-invasives Verfahren zur Injektion von Tumorzellen in den leptomeningealen Raum durch die Cisterna magna, ohne dass ein Hautschnitt erforderlich ist. Dieser Ansatz reduziert die extrakranielle Tumorbildung, minimiert das chirurgische Trauma und verkürzt die Zeit und den postoperativen Pflegeaufwand im Vergleich zu anderen chirurgischen Methoden. Wichtig ist, dass es konsistent LM mit minimaler Infiltration des Hirnparenchyms induziert, was durch Zwei-Photonen-Mikroskopie und histologische Analyse bestätigt wurde. Dieser optimierte Ansatz bietet ein effizientes und zuverlässiges Modell für die Untersuchung von LM in der präklinischen Forschung.

Einleitung

Die metastasierende Erkrankung bleibt die größte Herausforderung für Patienten mit fortgeschrittenen Krebserkrankungen. Die leptomeningeale Metastasierung (LM) bezieht sich auf die Ausbreitung von Krebszellen auf die Pia mater, die Arachnoidea mater und den Subarachnoidalraum. LM aus soliden Tumoren wird bei Lungenkrebs (9 %-25 %), Brustkrebs (5 %-20 %) und Melanomen (6 %-18 %)1,2 immer häufiger, was vor allem auf ein längeres Überleben und verbesserte Diagnosetechniken zurückzuführen ist. Krebszellen können auf verschiedenen Wegen in den leptomeningealen Raum eindringen, darunter 1) direkte Invasion durch periphere Strukturen wie Dura mater, Knochen und Nerven; 2) hämatogene Ausbreitung durch das Venensystem; und 3) Eintritt durch den arteriellen Kreislauf, wo Krebszellen durch gefensterte Gefäße in den Plexus choroideus und anschließend in die mit Liquor gefüllten Ventrikel gleiten 3,4,5. Tumorzellen, die in den leptomeningealen Raum gelangen, sehen sich mit mehreren Herausforderungen konfrontiert, darunter der Entzug von Wachstumsfaktoren, begrenzte metabolische Zwischenprodukte und hypoxische Bedingungen6. Aufgrund des Mangels an geeigneten Werkzeugen und Techniken ist jedoch nur unzureichend verstanden, wie Tumorzellen diese Wege navigieren und unwirtliche Bedingungen überwinden, um den leptomeningealen Raum zu besiedeln. Trotz Fortschritten bei multimodalen Therapien, einschließlich Strahlentherapie, systemischer Behandlung und intrathekaler Injektionstherapie, bleibt die Prognose für LM-Patienten schlecht, wobei das Überleben in der Regel zwischen 2 und 4 Monaten liegt 3,7,8,9. Daher besteht ein dringender Bedarf an einem tieferen Verständnis der Biologie der leptomeningealen Metastasen, um die derzeitigen Behandlungen zu verbessern und neue, zielgerichtete Therapien zu entwickeln. Um dies zu erreichen, müssen In-vivo-Modelle entwickelt werden, die die komplexen Merkmale von LM rekapitulieren.

Im Gegensatz zu Metastasen in Organen wie Leber, Knochen und Gehirn entwickelt sich LM in der Regel Jahre nach der Diagnose des Primärtumors 10,11,12. In ähnlicher Weise ist LM in Mausmodellen mit spontanen Metastasen selten, da es eine geringe Inzidenz aufweist und Mäuse typischerweise Metastasen an anderen Stellen erliegen. Experimentelle murine LM-Modelle können durch verschiedene Methoden erstellt werden, einschließlich intrakardialer, intrakarotisartiger Arterie oder alternativ durch direkte Injektion in die Cisterna magna oder zerebrale Ventrikel. Die intrakardiale Injektion von Krebszellen ist zwar weit verbreitet9, führt jedoch häufig zu einer signifikanten extrakraniellen Tumorlast, die zu einer Mortalität führt, die nicht mit LM zusammenhängt. Alternative Ansätze, wie die Injektion von Tumorzellen durch die Halsschlagader13,14, erfordern umfangreiche spezialisierte Ressourcen und führen zu großen chirurgischen Schnitten, die traumatisch sind. Darüber hinaus führt diese Methode in erster Linie zu Metastasen im Hirngewebe selbst und nicht zu Leptomeningen und ist zeitaufwändig und ineffizient für die Etablierung von LM-Modellen15. Die Injektion in die Cisterna magna ermöglicht die direkte Abgabe von Tumorzellen in den leptomeningealen Raum. Mehrere Studien haben diesen Ansatz verwendet, um LM-Mechanismen zu untersuchen und neue Behandlungen zu evaluieren 6,16,17.

In diesem Manuskript stellen wir ein praktisches transcisterna magna-Injektionsprotokoll vor, das eine direkte perkutane Punktion beinhaltet, um schnell und stabil eine größere Anzahl von Mäusen mit LM zu erzeugen. Diese Methode umgeht die Gehirn-Blut-Schranke und ermöglicht somit eine effiziente Xenotransplantation von Tumorzellen im Leptomeninge-Raum. Es reduziert auch das chirurgische Trauma und die Eingriffszeit erheblich und induziert zuverlässig LM bei Mäusen. Wir bestätigten das Auftreten von LM mit minimaler Infiltration in das Hirnparenchym, was durch Zwei-Photonen-Mikroskopie und histologische Analyse bestätigt wurde. Daher repliziert das resultierende Modell die komplexe Mikroumgebung von LM originalgetreu und bietet ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung krankheitsassoziierter zellulärer und pathologischer Mechanismen und zur Bewertung potenzieller Therapien.

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Protokoll

Alle tierexperimentellen Verfahren in diesem Manuskript wurden von der ZJU-Labortierschutz- und Ethikprüfungskommission (ZJU20230155) überprüft und genehmigt. C57BL/6J- und NSG-Mäuse wurden aus dem ZJU-Versuchstierzentrum gewonnen und unter spezifisch pathogenfreien Bedingungen untergebracht. Dieses Protokoll verwendet die murine Lungenkrebszelllinie, das Lewis-Lungenkarzinom (LLC1), und die humane Lungenkrebszelllinie A549, die beide mit GFP und Glühwürmchen-Luziferase markiert sind. Beide Zelllinien werden freundlicherweise von Dr. Xiang H. F. Zhang (Baylor College of Medicine, USA)18 zur Verfügung gestellt. Hier verwenden wir LLC1-Zellen als Beispiel. Das Verfahren zur Injektion von A549-Zellen ist nahezu identisch, mit der Ausnahme, dass 6 x 104 A549-Zellen in NSG-Mäuse injiziert wurden.

1. Vorbereitung von Krebszellen für die Injektion

  1. Kultivieren Sie 1,0 x 106 LLC1-Zellen in DMEM, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) und 0,1 mg/ml Penicillin-Streptomycin bei 37 °C in einem 5 % CO2 -Inkubator. Wenn die Zellen eine Konfluenz von 70 % bis 90 % erreichen, trypsinisieren Sie sie 1 Minute lang mit 2 ml 0,25 % Trypsin/EDTA-Lösung. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für 3 min, waschen Sie sie 2x mit eiskaltem PBS und suspendieren Sie sie wieder in 1 mL phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
  2. Die Konzentration lebensfähiger Zellen ist mit einer Trypanblau-Lösung und einem Hämozytometer19 zu bestimmen. Stellen Sie sicher, dass die Zellviabilität mehr als 90 % beträgt, wobei die Mehrheit der Zellen einzeln ist. Stellen Sie die Zellkonzentration auf 2 x 106 Zellen/ml in eiskaltem PBS ein.
  3. Aliquotieren Sie 50 μl der Zellsuspension in separate Mikrozentrifugenröhrchen, um wiederholtes Pipettieren zu vermeiden.
  4. Bewahren Sie die Zellsuspensionen bis zur Injektion auf Eis auf. Injizieren Sie 10 μl GFP-Luciferase-markierte LLC1-Zellen pro Maus in diesem Protokoll, entsprechend 2 x 104 Zellen pro Maus.
    HINWEIS: Passen Sie die Zellzahl nach Bedarf basierend auf der metastatischen Kinetik der injizierten Zelllinien an.

2. Vorbereitung der Mäuse

HINWEIS: In dieser Studie wurden männliche C57BL/6J-Mäuse im Alter von 6-8 Wochen verwendet.

  1. Autoklavieren Sie alle chirurgischen Instrumente und Handschuhe, die mit OP-Abdecktüchern gefüllt sind. Desinfizieren Sie die Tischgeräte und nicht-chirurgischen Geräte mit 75 % Ethanol und decken Sie dann den Arbeitsbereich mit wasserdichten Vorhängen ab.
  2. Bereiten Sie einen sauberen Haltungskäfig und ein Wärmekissen für die Genesung nach dem Eingriff vor.
  3. Betäuben Sie die Maus durch subkutane Injektion von 2 % Tribromethanol (200 mg/kg). Überprüfen Sie die Narkosetiefe mit einem Pinch-Test, bevor Sie fortfahren. Tragen Sie eine sterile Augensalbe auf, um die Augen vor Hornhautschäden zu schützen, sobald die Maus betäubt ist.
  4. Rasieren Sie das Fell aus der hinteren Hinterhauptregion mit einer Schermaschine und tragen Sie anschließend Enthaarungscremes auf, um das Fell in derselben Region vollständig zu entfernen.
  5. Positionieren Sie die Maus in Bauchlage mit dem Hals über einem 15-ml-Zentrifugenröhrchen. Sichern Sie den Kopf und den unteren Rücken mit Klebeband und tasten Sie den Raum zwischen Hinterhaupt und C1-Wirbel mit dem Zeigefinger ab (Abbildung 1).
  6. Desinfizieren Sie den hinteren Hinterhauptbereich durch drei Wischrunden mit 75 % ethanolgetränkten sterilen Wattestäbchen, gefolgt von einem chirurgischen Betadin-Peeling. Decken Sie die unsterilen Teile des Tieres mit einem sterilen Tuch ab.

3. Cisterna magna Injektion

HINWEIS: Für die folgenden Schritte sind aseptische Techniken erforderlich, einschließlich der Verwendung von persönlicher Schutzausrüstung und sterilen Handschuhen.

  1. Pipettieren Sie die Zellsuspension vorsichtig und aspirieren Sie 10 μl zur Injektion mit einer 31G-Insulinspritze mit 8 mm.
  2. Palpieren Sie den Bereich zwischen dem Hinterhauptbein und C1 der Maus mit dem Zeigefinger, um die genaue Punktionsstelle am unteren Medianrand des hinteren Hinterhauptschädels zu lokalisieren. Markieren Sie diese Seite bei Bedarf.
  3. Führen Sie die Nadel in einem Winkel von 45°-50° durch die identifizierte Einstichstelle in die Cisterna magna ein und dringen Sie bis zu einer Tiefe von 4 mm vor. Ein deutliches Durchbruchsgefühl zeigt an, dass die Nadel erfolgreich in die Cisterna magna eingedrungen ist.
    1. Wenn die Einstichstelle schwer zu lokalisieren ist, machen Sie einen kleinen Schnitt von 3-5 mm auf Ohrhöhe, um die hintere Mittellinie freizulegen. Wenn ein chirurgischer Schnitt erforderlich ist, verabreichen Sie Meloxicam (5 mg/kg/Tag) und Buprenorphin (0,1 mg/kg) subkutan 1 h vor der Operation.
  4. Injizieren Sie die Zellsuspension langsam, indem Sie den Spritzenkolben vorschieben und die Spritze ruhig halten, während Sie die Hand auf den Tisch legen.
  5. Halten Sie die Spritze nach der Inokulation weitere 10 s an Ort und Stelle, damit sich der intrakranielle Druck ausgleichen kann. Ziehen Sie dann die Nadel zurück und drücken Sie mit einem sterilen Wattestäbchen 1-2 Minuten lang auf die Einstichstelle.

4. Pflege nach der Injektion

  1. Bringen Sie die Tiere in saubere Käfige auf einem Heizkissen und überwachen Sie sie genau, bis sie sich vollständig erholt haben.
    1. Falls ein Schnitt gemacht wird, verschließen Sie die Wunde mit Gewebekleber und Klammern. Verabreichen Sie 2-3 Tage nach der Operation zusätzliche Schmerzmittel, um die Schmerzen zu kontrollieren und die Genesung zu unterstützen.
  2. Überwachen Sie die Mäuse nach dem Eingriff 7 Tage lang engmaschig und überprüfen Sie täglich die körperlichen Aktivitäten der Tiere und das Erscheinungsbild in der Umgebung der Injektionsstelle.

5. Beurteilung des Wachstums von leptomeningealen Tumoren

  1. Biolumineszenz-Bildgebung
    1. Betäuben Sie die Maus und verabreichen Sie D-Luciferin (150 μg/g) in die retroorbitale Vene. Legen Sie die Mäuse in die Bildgebungskammer und positionieren Sie sie in einem dafür vorgesehenen Nasenkonus auf dem Anästhesieverteiler. Verwenden Sie Lichtleitbleche zwischen den Tieren, um Signalstörungen zu minimieren.
    2. Bilden Sie die Tiere sofort mit dem IVIS-System mit einer Belichtungszeit zwischen 0,5 s und 2 minab 6. Bestätigen Sie die erfolgreiche Inokulation von Tumorzellen im leptomeningealen Raum durch ein dispersives Biolumineszenzsignal über den Kopf und das Rückenmark (Abbildung 2A).
    3. Überwachen Sie das Fortschreiten der LM alle 4 Tage durch Biolumineszenz-Bildgebung. Passen Sie die Bildgebungsintervalle basierend auf der Kinetik des Tumorwachstums an.
  2. Histologische Analyse
    1. Betäuben Sie die Mäuse, wenn sie deutlich weniger aktiv waren oder 20 % ihres Körpergewichts verloren hatten, und schnitten Sie die Haut und die Rippen, um ihre Brusthöhle freizulegen. Führen Sie vorsichtig eine Kanüle mit stumpfer Spitze in die linke Herzkammer ein und schieben Sie die Kanüle in die aufsteigende Aorta vor. Perfundieren Sie das Tier langsam mit 20 mL PBS durch die Kanüle.
    2. Verwenden Sie eine Schere, um den Kopf zu entfernen, und machen Sie einen Schnitt in der Mitte der Kopfhaut, um den Schädel freizulegen. Schneiden Sie die umgebenden Weichteile heraus. Schneiden Sie entlang des Orbitakamms, führen Sie dann eine Schere in das Foramen magnum ein und schieben Sie sich vorsichtig mit Aufwärtsdruck entlang der inneren Oberfläche des Schädels, um Gewebeschäden zu vermeiden.
    3. Entfernen Sie die Schädelknochen und extrahieren Sie dann vorsichtig das Gehirn. Fixieren Sie das Gehirn 24 h lang in 4 % Paraformaldehyd bei 4 °C und äquilibrieren Sie es dann 24 h lang in 15 % Saccharose-PBS-Lösung, gefolgt von 30 % Saccharose-PBS-Lösung für weitere 24 Stunden bei 4 °C.
    4. Legen Sie das Gewebe in eine Kryoform, die mit Optimum Cutting Temperature (OCT) gefüllt ist, und lagern Sie es dann 30 min20 auf Trockeneis.
    5. Schneiden Sie das OCT-eingebettete Gehirn mit einem Kryostaten in 10 μm dicke Abschnitte. Lagern Sie die Abschnitte bis zur weiteren Anwendung in einem -80 °C heißen Gefrierschrank.
    6. Es wird eine Hämatoxylin/Eosin (H&E)-Färbung auf den Objektträgern des Gehirnsdurchgeführt 21. Das Vorhandensein von Tumorzellen am Hirnrand deutet darauf hin, dass Metastasen ausschließlich im leptomeningealen Raum auftreten (Abbildung 3 und Tabelle 1).
  3. Zwei-Photonen-Mikroskopie
    1. Betäuben Sie die Mäuse mit LM. Entfernen Sie die Kopfhaut, die die dorsale Schädeloberfläche bedeckt, mit einer Pinzette und einer Schere. Verwenden Sie eine Skalpellklinge, um das dünne Periost von der Schädeloberfläche zu entfernen.
    2. Dünnen Sie den Schädel mit einem Schleifbohrer aus, bis die Pialgefäße durch den ausgedünnten Schädel sichtbar sind. Stabilisieren Sie den Beobachtungsbereich des Mauskopfes mit einem dreieckigen Kopfstück, das mit Gewebekleber22,23 befestigt ist.
    3. 0,025 ml 5 % (w/v) TRITC-Dextran in eine infraorbitale Vene verabreichen, um die Blutgefäße zu markieren22.
    4. Führen Sie eine Zwei-Photonen-Mikroskopie durch die Bildgebungsfenster durch und rekonstruieren Sie den leptomeningealen Raum (Abbildung 4). Detektion des Knochens durch zweite harmonische Fluoreszenz bei 450 nm Emission mit 900 nm Anregung24. Visualisieren Sie GFP-markierte Tumorzellen und Dextran-markierte Gefäße durch Sammeln von Fluoreszenzsignalen bei 507 nm und 572 nm Emission bei 900 nm bzw. 1000 nm Anregung.
  4. Stereo-Fluoreszenzmikroskop
    1. Entfernen Sie das Gehirn der Maus und legen Sie es unter ein Stereomikroskop. Visualisieren Sie GFP-markierte Zellen mit einem GFP-spezifischen Filtersatz (Abbildung 5).

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Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt die Platzierung der Maus für die Injektion und die Einstichstelle aus der Seiten- und Frontansicht. Abbildung 2 zeigt repräsentative in vivo Biolumineszenzbilder von Tieren, die mit verschiedenen Ansätzen auf die Erzeugung von LM getestet wurden. GFP-Luciferase-markierte LLC1-Zellen wurden den Tieren auf verschiedenen Wegen injiziert, gefolgt von biolumineszierender Bildgebung. Wie in Abbildung 2A...

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Diskussion

LM ist eine aggressive und tödliche Erkrankung. Sobald die Tumorzellen in den mit Liquor gefüllten Raum metastasiert haben, verbreiten sie sich schnell im gesamten Zentralnervensystem25. Diese Zellen siedeln sich an und dringen in das Gehirn, das Rückenmark, den Hirn- und Spinalnerven ein, was schließlich zu einer raschen neurologischen Verschlechterung und schließlich zum Tod führt17. Um die zugrundeliegenden pathophysiologischen Mechanism...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.

Danksagungen

Die Autoren danken den Mitgliedern des Zhang-Labors für ihre wertvollen Diskussionen und Unterstützung während dieser Studie. W.Z. wird unterstützt durch die Fundamental Research Funds for the Zhejiang Provincial Universities (2023QZJH60), das Science Fund Program for Distinguished Young Scholars der National Natural Science Foundation of China (588020-X42306/041) und den Startup-Fonds des Life Sciences Institute der Zhejiang University.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1,5 ml Eppendorf TubenBioscharfBS-15-M-S
15ml ZentrifugenröhrchenLABSELECTNr. CT-002-15A
31G x 8mm Insulinspritze (0,3ml)Versprochen/
SchleifbohrerGLOBALEBIOGEGZ-AM1
Heizmatte für TiereWoggee/
KryoformSupinSP-AB-7 x 7 x 5
Enthaarungs-CremesNair1.00023E+11
D-LuciferinGold BiologieGLÜCK-1G
DMEMGibcoC11995500CP
FBSGibco10270-106
IVIS-SpektrumSchieblehre/
KetaminJiangsu Hengrui Pharmaceuticals Co., Ltd.H20193336
Optimale SchnitttemperaturSakura4583-1
ParaformaldehydSCR80096618
PBSServicebiografieNr. G4202-500ML
Pen/Strep Amphotericin BGibco15140122
RasierapparatHipidogArtikel-Nr.: 2103CGMJ3373-GQ22N526
Stereo-FluoreszenzmikroskopOlymp/
Gerade PinzetteBeyotimeFS019Muss autoklaviert werden
Chirurgische SchereBeyotimeFS001Muss autoklaviert werden
Dreieckiges Kopfstück zur MausfixierungTranszendieren Sie das VivoskopTVS-FDM-027
TRITC-Dextran, MW 70000MedChemExpressHY-158082C
Trypsin/EDTA-LösungGibco25200056
Zwei-Photonen-Laser-Scanning-MikroskopieOlymp/
Vetbond Tissue-Klebstoffe3M1469SB
XylazinSigmaNr. X1126

Referenzen

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