Im lebenden Organismus Anwendung der TurboID-basierten Proximity-Markierung bei Drosophila melanogaster

Herkömmliche Methoden zur Kartierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPI), wie z. B. die Affinitätsreinigungs-Massenspektrometrie (AP-MS) und Hefe-2-Hybrid-Systeme (Y2H), können häufig nicht in der Lage sein, transient exprimierte oder membrangebundene Proteine mit geringer Abundanz zu erfassen. Diese Einschränkung ergibt sich aus ihrer Unfähigkeit, die nativen physiologischen Bedingungen einer lebenden Zelle zu replizieren ^1,2,3. Um diese Herausforderungen zu meistern, hat sich PL als leistungsfähige Technik für die hochauflösende Proteom-Kartierung auf Suborganellenebene in vivo herausgestellt. PL nutzt die Fusion eines promiskuitiven Enzyms mit einem Köderprotein, wodurch das Enzym die Bildung kurzlebiger reaktiver Moleküle katalysieren^{kann 1}. Diese reaktiven Moleküle, wie z. B. Biotin, markieren kovalent Proteine innerhalb weniger Nanometer um das Fusionsprotein⁴. Anschließend werden biotinylierte Proteine isoliert und massenspektrometrisch analysiert, um die Proteinidentifizierung in großem Maßstab zu erleichtern ^5,6.

In den letzten Jahren wurden verschiedene promiskuitive Enzyme entwickelt, um PL-Techniken voranzutreiben. Zwei weit verbreitete Enzyme sind die von Escherichia coli abgeleitete R118G-mutierte Biotin-Ligase (BioID) und das aus Erbsen gewonnene Ascorbatperoxidase-Enzym 2 (APEX2). BioID wandelt Biotin und ATP in Biotinyl-5'-adenylat (bioAMP)¹ um. Dieses reaktive Molekül bindet kovalent an Lysinreste benachbarter Proteine in ± Radius von 10 nm. Ein wesentlicher Vorteil von BioID-basiertem PL ist die Verwendung von Biotin. Es ist ein natürlich vorkommendes und ungiftiges Biomolekül in lebenden Organismen, das eine sichere In-vivo-Markierung ermöglicht⁶. BioID weist jedoch Einschränkungen auf, darunter eine langsame Markierungskinetik (18-24 h) und die Anforderung einer hohen Temperatur (37 °C) für eine optimale katalytische Aktivität⁴. Diese Eigenschaften können seine Anwendung bei der Untersuchung dynamischer biologischer Prozesse behindern. Währenddessen katalysiert APEX2 die Bildung von Biotin-Phenoxyl-Radikalen in Gegenwart von Biotin-Phenol und Wasserstoffperoxid (_H2O2)⁷. Diese Radikale reagieren hauptsächlich mit der Seitenkette von elektronenreichen Aminosäuren wie Tyrosin und können auch Cystein, Histidin und Tryptophan^{binden 8}. Die schnelle Markierungsfähigkeit des Peroxidase-Enzyms (< 1 min) eignet sich für die Erfassung dynamischer und transienter PPIs⁹. Darüber hinaus hat es einen größeren Nachweisbereich (bis zu 20 nm) als Biotin-Ligase. APEX2-basiertes PL hat jedoch seine Nachteile, einschließlich der Anforderung eines giftigen Oxidationsmittels, H₂O_2, und der geringen Permeabilität von Biotin-Phenol, die die Anwendbarkeit in vivo^{einschränken 10}.

Im Jahr 2018 entwickelten Branon et al. eine neue Biotin-Ligase namens TurboID, eine 35 kD-mutierte Version von BirA (der Biotin-Ligase, die in E. coli vorkommt⁾⁴. Dieses Enzym enthält eine Mutation an der R118-Position (R118S) zusammen mit 15 anderen Mutationen relativ zu BirA. Es weist eine doppelt so hohe katalytische Aktivität auf wie BioID. Die TurboID-induzierte Biotinylierung in 10 Minuten liefert proteomische Daten mit einer Größe und Spezifität, die mit einer 18-stündigen Markierung durch BioID vergleichbar sind. Darüber hinaus weist es eine hervorragende Markierungsaktivität bei 30 °C^{auf 4}. Daher eignet sich TurboID besser für den Einsatz bei Organismen wie Drosophila oder Caenorhabditis elegans, die üblicherweise bei 25 °C bzw. 20 °C aufgezogen werden.

In dieser Studie wollen wir TurboID-basiertes PL für Interaktomstudien im Drosophila-Eierstock nutzen. Die hier beschriebenen Protokolle werden verwendet, um das Interaktom von Zuc in Keimbahnzellen abzubilden. Zuc ist eine Endonuklease, die auf der äußeren Mitochondrienmembran (OMM) lokalisiert ist und die Biogenese von piRNAs vermittelt, kleinen nicht-kodierenden RNAs, die für die Aufrechterhaltung der Genomintegrität entscheidend sind 11,12,13. Durch den Vergleich von biotinylierten Proteinen, die in der Zuc-TurboID-Analyse identifiziert wurden, mit denen von zwei zusätzlichen Kontrollen, NES-TurboID und Tom20-TurboID, definierten wir unterschiedliche Zuc-interagierende Kandidaten.

1. PL in der Erwachsenenfliege

1. Zubereitung von Biotin Lebensmitteln
   1. 1 M NaOH-Lösung wird durch Verdünnung von 10 M NaOH-Stamm in dreifach destilliertem Wasser (TDW) hergestellt. Lagern Sie es bei Raumtemperatur (RT). Bereiten Sie 1 M Biotin-Stammlösung vor, indem Sie 0,0049 g Biotinpulver in 20 ml TDW auflösen. Fügen Sie 150-200 μl 1 M NaOH hinzu, um die Löslichkeit von Biotin zu erhöhen. Vortex, um die Lösung zu homogenisieren. Biotin-Stammlösung bei 4 °C lagern.
   2. Nehmen Sie das Fliegenfutter aus dem Fläschchen und erhitzen Sie es 2 Minuten lang in der Mikrowelle, bis es geschmolzen ist.
      HINWEIS: Standard-Fliegenfutter enthält 5 % Maismehl, 3 % Hefe, 10 % Saccharose, 1 % Agar, 0,3 % Propionsäure und 0,3 % Methyl-4-hydroxybenzoat¹³.
   3. Geben Sie Biotinbrühe mit einer Endkonzentration von 100 μM in das geschmolzene Lebensmittel und mischen Sie es durch Vortexen. Geben Sie sofort 4,5 ml mit Biotin angereicherte Lebensmittel mit einer serologischen Pipette in jede leere Durchstechflasche ab. Lassen Sie die Lebensmittel 30 min abkühlen, legen Sie eine Wattekappe auf das Fläschchen und lagern Sie dann die Biotin-Lebensmittel bei 4 °C.
      HINWEIS: Biotin muss hinzugefügt werden, bevor das Lebensmittel abkühlt und aushärtet.
2. Biotin-Fütterung
   1. Kreuzen Sie die transgenen Fliegen, die das TurboID-Fusionsprotein überexprimieren, mit gewebe- oder zellspezifischen GAL4-Fliegen 14,15,16. Als Negativkontrolle sollten Wildtyp-Fliegen mit GAL4-Treiberfliegen gekreuzt werden, um sicherzustellen, dass keine Biotinylierungsinduktion stattfindet.
   2. Etwa 10 Tage nach der Kreuzung beginnen die Nachkommen zu schlüpfen. Trockenhefepulver in TDW auflösen und zu einer glatten Paste verrühren. Tragen Sie einen Laborlöffel Hefepaste auf die Wand eines neuen Fläschchens auf. Tippe vorsichtig auf das alte Fläschchen mit den frisch geschlüpften Fliegen, um die Fliegen am Boden einzusammeln. Drehen Sie das alte Fläschchen auf das neue Fläschchen mit der Hefepaste um und stellen Sie sicher, dass die Ränder beider Fläschchen ausgerichtet sind, um ein Entweichen von Fliegen zu verhindern.
   3. Tippe diese Fläschchen aneinander, um Fliegen aus dem alten Fläschchen in den unteren Teil des neuen Fläschchens zu übertragen. Sobald die Fliegen übertragen wurden, setzen Sie die Wattekappen sowohl auf die neuen als auch die alten Fläschchen sicher zurück. Warten Sie 3 Tage. Hefepaste kann bei RT einige Tage gelagert werden.
      HINWEIS: Der Fliegentransfer muss so schnell wie möglich erfolgen, da die Fliegen nur vorübergehend betäubt werden.
   4. Bereiten Sie eine 0,5%ige Propionsäurelösung vor, indem Sie 250 μl Propionsäurestamm in 50 mL TDW verdünnen. Lagern Sie es bei RT.
   5. Am 3^. Tag 100 μM Biotin-Arbeitslösung herstellen, indem 1 M Biotin-Stamm in TDW verdünnt und dann 500 μl 0,5 % Propionsäure hinzugefügt werden. Biotin-Arbeitslösung mit Trockenhefepulver mischen und rühren, bis eine Paste entsteht. Geben Sie einen Laborlöffel Biotin-Hefepaste an die Wand des Biotin-Lebensmittelfläschchens. Die Biotin-Hefepaste kann bei RT einige Tage gelagert werden.
   6. Teilen Sie die Fliegen in zwei Gruppen ein. Bewahren Sie eine Gruppe als Kontrolle in der Durchstechflasche mit normalem Futter auf und übertragen Sie die andere Gruppe in die Durchstechflasche mit Biotin (Biotin-Hefepaste hinzugefügt), um die Biotinylierung zu starten. Nach 16 Stunden Biotinylierung werden die Fliegen in ein neues Fläschchen für normale Lebensmittel übertragen.
      HINWEIS: Wir haben zuvor einen Biotin-Fütterungstest für 4 Stunden, 8 Stunden und 16 Stunden durchgeführt. Das Biotinylierungssignal war nach 16 h Fütterung am stärksten, daher wählten wir diesen Zeitpunkt für nachfolgende Experimente.
3. Sammlung der Eierstöcke von Drosophila
   1. Setzen Sie die Fliegen in das CO₂ -Fliegenkissen, behalten Sie die Weibchen und entsorgen Sie die Männchen. Nachdem die Fliegen richtig betäubt wurden (sich nicht mehr bewegen), pipettieren Sie 1 ml des kalten Insektenmediums von Grace auf die Sezierschale.
   2. Bringen Sie eine Fliege mit einer Pinzette mit feiner Spitze zur Sezierschale und lassen Sie sie in das Medium eintauchen. Halten Sie den Brustkorb mit einer Pinzette fest, achten Sie darauf, den Körper nicht zu zerquetschen. Entfernen Sie dann mit einer anderen Pinzette vorsichtig die Spitze des hinteren Bauches (wo sich der Genitalteil befindet).
   3. Drücke die Eierstöcke mit der Pinzette langsam heraus (vom Oberbauch nach unten).
   4. Sobald sie heraus sind, entfernen Sie Muskelnetze und anderes Gewebe, das die Eierstöcke umgibt. Achten Sie darauf, die Eierstöcke nicht zu beschädigen.
   5. Übertragen Sie die sauberen Eierstöcke vorsichtig mit einer Pinzette in ein 1,7-ml-Röhrchen. Halten Sie die Tube auf Eis. Wiederholen Sie die Schritte 1.3.2 - 1.3.4 für die nächsten Fliegen.
   6. Schleudern Sie das Röhrchen 30 s lang bei 4 °C bei 3.500 x g herunter und entfernen Sie dann mit Mikropipettenspitzen das restliche Medium. Achten Sie darauf, die Eierstöcke nicht zu berühren.
   7. Frieren Sie das Röhrchen mit flüssigem Stickstoff ein und lagern Sie die Eierstöcke bei -80 °C. Die Eierstockproben sind 1 Jahr lang haltbar.

2. Transgenexpression und Nachweis biotinylierter Proteine mittels Western-Blot-Assay

HINWEIS: Für den Western-Blot-Assay sind etwa fünf Eierstockpaare pro Probe zu entnehmen.

1. Lyse von Gewebe
   1. Tauen Sie das gefrorene Eierstockgewebe auf. Fügen Sie 50 μl RIPA-Lysepuffer (50 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 0,1 % Natriumdodecylsulfat (SDS), 0,5 % Natriumdesoxycholat, 1 % Triton X-100) hinzu, ergänzt mit 1x Proteasehemmer (PI)-Cocktail und 1 mM Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF). Lagern Sie den RIPA-Lysepuffer (ohne 1x PI-Cocktail und 1 mM PMSF) bei 4 °C.
      HINWEIS: PI-Cocktail und PMSF sollten erst kurz vor dem Experiment hinzugefügt werden.
   2. Unterbrechen Sie die Eierstöcke mit einem Handhomogenisator, der mit einem Kunststoffstößel gekoppelt ist (1 min pro Röhrchen). Ein 10-minütiger Gewebelyseprozess auf Eis ist erforderlich, um eine vollständige Lyse zu gewährleisten, gefolgt von einer Homogenisierung.
   3. Zentrifugieren Sie bei 13.500 x g für 10 min bei 4 °C, um Proteinlysat von Ablagerungen zu trennen.
   4. Pipettieren Sie klares Proteinlysat in ein neues 1,7-ml-Röhrchen (vermeiden Sie es, die Lipidschicht darüber zu legen) und lagern Sie das Lysat dann bis zur weiteren Verwendung bei -20 °C.
2. Messung der Proteinkonzentration mittels Bicinchoninsäure (BCA)-Assay
   1. Bereiten Sie das wirkende Reagenz (WR) aus Bicinchoninsäure (BCA) vor, indem Sie Reagenz A und Reagenz B in einem Verhältnis von 50:1 mischen. Mischen Sie 1 μl Lysat oder verdünnten BSA-Standard mit 200 μl WR in einer 96-Well-Platte (in Duplikaten) und inkubieren Sie die Platte dann 30 Minuten lang bei 37 °C.
      1. Berechnen Sie, wie viel WR mit dieser Formel erforderlich ist:
         (# Standards + # Proben) × (# Replikationen) × (WR-Volumen pro Probe)
         Um einen Satz Proteinstandards herzustellen, bereiten Sie mehrere Verdünnungen von 2 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA) in RIPA-Lysepuffer (ohne PI-Cocktail und PMSF) mit Endkonzentrationen 0, 25, 125, 250, 500, 750, 1000, 1500 und 2000 μg/ml vor.
   2. Messen Sie die Absorption mit einem Mikroplatten-Reader bei einer Wellenlänge von 495 nm. Generieren Sie eine Standardkurve aus BSA-Absorptionswerten und bestimmen Sie dann die Proteinkonzentration.
3. Western-Blot-Assay
   1. Gel-Elektrophorese
      1. Geben Sie 30-50 μg Proteinlysat in den 2x SDS-Ladepuffer. Fügen Sie TDW (falls erforderlich) hinzu, um eine endgültige Proteinkonzentration von 2 μg/μl und eine 1x SDS-Endkonzentration zu erhalten, und kochen Sie die Probe dann 10 Minuten lang bei 95 °C.
      2. Bereiten Sie den laufenden Puffer vor, indem Sie 25 mL 20x MOPS-Puffer mit 500 mL TDW mischen, um eine 1x Konzentration des laufenden Puffers zu erhalten. Lagern Sie es bei RT.
      3. Spülen Sie die Vertiefungen mit Bis-Tris-Gel mit 1 ml Laufpuffer (3x) und geben Sie dann Bis-Tris-Gel in die Elektrophoresekammer. Füllen Sie die Vorderseite der Kammer mit dem neuen Laufpuffer, bis alle Vertiefungen eingetaucht sind (± 250 ml). Füllen Sie die Rückseite der Kammer mit dem gebrauchten Laufpuffer (die Hälfte des verwendeten Volumens des neuen Laufpuffers ist ausreichend).
      4. Laden Sie die Probe auf Bis-Tris-Gel und verwenden Sie 4 μl vorgefärbte Proteinleiter als Marker. Elektrophorese durchführen (200 V, 30 min). Entfernen Sie das Gel aus der Kassette und spülen Sie es mit TDW aus.
   2. Membran-Blotting
      1. Stellen Sie einen Transferpuffer her, indem Sie 20 mL Transferpuffer (25x Stamm) und 50 mL Methanol in 430 mL TDW geben.
      2. Ordnen Sie ein Sandwich bestehend aus Blotting-Pads, Filterpapier, Gel und Nitrozellulosemembran in einem Blot-Modul an. Bevor Sie eine neue Schicht stapeln, verwenden Sie eine Walze, um Blasen zu entfernen.
      3. Setzen Sie das Blot-Modul in die Transferkammer ein und füllen Sie die Kammer mit 500 mL Transferpuffer. Proteine für 1 h bei 175 mA übertragen.
         HINWEIS: Der Transferpuffer sollte vor dem Experiment frisch zubereitet werden.
   3. Blockierend
      1. Fügen Sie 5 mL Tween20-Stamm in 45 mL TDW hinzu, um 10% Tween20-Stammlösung herzustellen. Löse zwei phosphatgepufferte Kochsalztabletten (PBS) in 400 ml TDW auf. Entfernen Sie 4 ml der Lösung und fügen Sie dann 4 ml 10% Tween20 (Endkonzentration 0,1%) hinzu, um 1x PBST-Lösung herzustellen. Lagern Sie es bei RT.
      2. Entfernen Sie die getupfte Membran aus der Transferkammer und spülen Sie sie mit 1x PBST ab.
         HINWEIS: Wenn die Membran mit verschiedenen Antikörpern inkubiert werden muss, schneiden Sie sie mit einer sauberen Edelstahlklinge entsprechend den erwarteten Proteingrößen ab, bevor Sie den Blockierungsschritt durchführen.
      3. Um die Genexpression zu überprüfen, verwenden Sie 2% BSA in 1x PBST für den Blockierungsschritt (1 h, RT). Stellen Sie eine 2%ige BSA-Lösung her, indem Sie 1 g BSA in 50 mL 1x PBST geben. Für den Nachweis biotinylierter Proteine ist eine Blockierung mit 3 % BSA in 1x PBST (über Nacht, 4 °C) durchzuführen. Lösen Sie 1,5 g BSA-Pulver in 50 mL 1x PBST auf, um eine 3%ige BSA-Lösung herzustellen. Blockierlösungen bei 4 °C lagern.
         HINWEIS: Die verwendete BSA unterscheidet sich von der im BCA-Assay verwendeten. BSA für BCA-Assay ist Teil des BCA-Kits.
   4. Inkubation von Primärantikörpern
      1. Verdünnen Sie 1 μl α-V5 in 10 ml 2 % BSA (1: 10.000) und 10 μl Haushaltsgen α-HSP90 in 2 % BSA (1: 1.000). Geben Sie 2,7 μl Streptavidin-Meerrettich-Peroxidase-Konjugat (SA-HRP) in 9 ml 1x PBST-Lösung, um 0,3 μg/ml SA-HRP-Lösung herzustellen.
      2. Um die Genexpression zu überprüfen, inkubieren Sie die Membran über Nacht bei 4 °C mit Primärantikörpern. Für den Nachweis biotinylierter Proteine inkubieren Sie die Membran 1 h lang bei 4 °C. Lagern Sie den Primärantikörper wieder bei 4 °C. Es kann mehrmals verwendet werden.
      3. Waschen Sie die Membran mit 1x PBST für 3x bei RT für jeweils 15 min.
   5. Inkubation von sekundären Antikörpern
      1. Bereiten Sie eine sekundäre Antikörperlösung vor, indem Sie 2 μl Anti-Kaninchen- oder Anti-Maus-IgG (Meerrettichperoxidase (HRP) konjugiert) in 10 ml 2 % BSA (1: 5.000) geben.
         HINWEIS: Für SA-HRP ist kein Sekundärantikörper erforderlich. Fahren Sie direkt mit dem Visualisierungsschritt fort. Sekundärantikörper sollten vor dem Experiment frisch verdünnt werden.
      2. Membran in Sekundärantikörperlösung für 40 min bei RT inkubieren. Membran mit 1x PBST für 3x bei RT für jeweils 15 min waschen.
   6. Proteinnachweis mit der Methode der verstärkten Chemilumineszenz (ECL)
      1. Mischen Sie 750 μl Luminol und 750 μl HRP-Lösung (Verhältnis 1:1). Halten Sie die Membran im Waschpuffer feucht, während Sie die Mischung vorbereiten.
         HINWEIS:Diese Mischung sollte vor dem Experiment frisch zubereitet werden. Da die Chemikalien lichtempfindlich sind, halten Sie sie von Sonnenlicht oder anderen intensiven Lichtquellen fern (kurzzeitige Exposition gegenüber Laborlicht ist in Ordnung).
      2. Tauchen Sie die Membran 30 s in die Lösung und legen Sie sie dann zwischen durchsichtige Plastikplatten. Beobachten Sie geblähte Proteinbanden mit einem Chemidoc-Instrument.

3. Validierung der Transgenexpression und Lokalisierung durch Immunfluoreszenzfärbung

HINWEIS:Um die Genexpression und -lokalisation zu überprüfen, sezieren Sie etwa fünf Eierstockpaare pro Probe von 2 Tage alten Weibchen, die mit Hefepaste gefüttert wurden. Junge Eierstöcke enthalten überwiegend frühe Stadien der Eikammern, die sich aufgrund des Reichtums an Ammenzellen (Keimbahnzellen) und ihrer relativ durchlässigen Membranen ideal für die Immunfluoreszenzfärbung eignen¹⁷. Späte Stadien der Eikammern sind steifer und schwieriger zu durchdringen, da sich der Eierschalenkomplex im Stadium 9¹⁸ bildet. Für den Protein-Biotinylierungstest werden etwa fünf Eierstockpaare pro Probe von 4 Tage alten Weibchen, die mit Biotin gefüttert wurden, wie in Schritt 1.2 beschrieben, präpariert.

1. Probenvorbereitung
   1. Halten Sie den hinteren Teil eines präparierten Eierstocks mit einer Pinzette an Ort und Stelle. Verwende eine weitere Pinzette, um den Eierstock vorsichtig in einzelne Eikammern auseinander zu ziehen. Arbeiten Sie vorsichtig, um ein Aufreißen der Eikammern zu vermeiden. Das Protokoll zur Isolierung der Eikammer wurde in¹⁹ ausführlich beschrieben. Pipettieren Sie die Eikammern vorsichtig in ein 1,7-ml-Röhrchen und waschen Sie sie dann mit 1 mL 1x PBS (RT). Schneiden Sie vor dem Pipettieren den Rand der Pipettenspitzen ab, um zu verhindern, dass die Eikammern in den Spitzen stecken bleiben.
      HINWEIS: Verwenden Sie nur Eierkammern der Stufe ≤ 9 (durchsichtige). Reife Eizellen und Eikammern im späten Stadium verwerfen ≥ 10. Durch das Pipettieren schwimmen die Eikammern in der Lösung. Lassen Sie daher die Eikammern am Boden absetzen (5 Minuten lang), bevor Sie mit den nächsten Schritten fortfahren.
2. Fixierung
   1. Verdünnen Sie 3,125 ml 16 % Formaldehyd (FA)-Stamm in 6,875 ml 1x PBS, um eine 5 %ige FA-Lösung herzustellen. Lagern Sie es bei RT.
      HINWEIS: FA ist lichtempfindlich, halten Sie es also von Licht fern.
   2. Pipettieren Sie 1 ml 5%iges Formaldehyd (FA) in das Röhrchen mit den Eizellen. Setzen Sie den Schlauch auf den Multirotator und fixieren Sie die Eizellen für 30 Minuten.
      HINWEIS: Von der Fixierung bis zum Schritt der Kernfärbung werden die Experimente an einem Multirotator mit sanfter Rotation durchgeführt.
   3. Bereiten Sie 0,5 % Triton X-100 in 1x PBS (1x PBT) als Waschlösung vor, indem Sie 10 mL 10 % Triton X-100 Material in 190 mL 1x PBS geben. Lagern Sie es bei RT.
   4. Spülen Sie die festen Eierkammern 1x aus, danach waschen Sie 3x bei RT für 10 Minuten. Verwenden Sie 1 ml 1x PBT sowohl für den Spül- als auch für den Waschschritt.
3. Blockierend
   1. Bereiten Sie 5 % fötales Rinderserum (FBS) vor, indem Sie 250 μl FBS-Stamm in 4,75 ml 1x PBT geben.
      HINWEIS: Diese Lösung sollte vor dem Experiment frisch hergestellt werden.
   2. Geben Sie 1 ml 5% FBS in das Röhrchen und führen Sie den Blockierungsschritt für 1 h bei RT durch. Spülen Sie die Eizellen 1x.
4. Inkubation von Primärantikörpern
   1. Zur Überprüfung der Transgenexpression und -lokalisation verdünnen Sie 2 μl α-V5 und 2 μl α-ATP5A oder α-Tom20 (als mitochondrialen Marker) in 400 μl 1x PBT (Verhältnis 1:200).
      HINWEIS: Obwohl zwei Antikörper zusammen verwendet werden können, um eine Probe zu färben, müssen ihre Wirte unterschiedlich sein. Damit soll eine überlappende Bindung nachfolgender Sekundärantikörper vermieden werden.
   2. Die Eikammern werden mit 400 μl verdünnter Primärantikörperlösung inkubiert (über Nacht, 4 °C).
      HINWEIS: Ähnlich wie beim Western-Blot-Assay können Primärantikörper mehrfach für die Immunfärbung verwendet werden. Stellen Sie vor der Lagerung einer Antikörperlösung sicher, dass sie keine Eikammern enthält.
   3. Spülen Sie die Eierkammern 1x aus, danach waschen Sie 3x bei RT für 10 min.
5. Inkubation von sekundären Antikörpern
   1. Verdünnen Sie 2 μl Ziegen-α-Rb-IgG Alexa Fluor 488 und 2 μl Ziegen-α-M IgG Alexa Fluor 594 in 400 μl 1x PBT (Verhältnis 1:200). Inkubieren Sie die Eikammern mit 400 μl verdünnter Sekundärantikörperlösung für 2 h bei RT. Für den Biotinylierungsnachweis fügen Sie 2 μl Streptavidin-konjugiertes Alexa Fluor 594 zu 1x PBT (Verhältnis 1:200) hinzu und inkubieren Sie zusammen mit einem Sekundärantikörper.
      HINWEIS: Schützen Sie die Probe in diesem Schritt vor Licht. Sekundärantikörper sollten vor dem Experiment frisch verdünnt werden. Mehrere Sekundärantikörper können zusammen verwendet werden, aber jeder Primärantikörper sollte auch verschiedenen Fluorophoren zugeordnet werden, die von verschiedenen Wirten stammen, um überlappende Signale zu vermeiden. Zum Beispiel bindet 488 Goat α-Rb an Kaninchen α-V5. Bei Maus-α-ATP5A wird 594 Goat α-M als komplementärer Sekundärantikörper verwendet. Bei der Biotinylierungsdetektion sollte auf die Verwendung anderer Farbstoffe mit der gleichen Wellenlänge wie Streptavidin-Konjugat verzichtet werden.
   2. Spülen Sie die Eierkammern 1x aus, danach waschen Sie 3x bei RT für 10 min.
6. Nukleare Färbung
   1. Verdünnen Sie 1 μl DAPI in 1 ml 1x PBS (Verhältnis 1:1.000). Inkubieren Sie die Eikammern mit 1 ml verdünnter DAPI-Lösung für 5 min bei RT.
      HINWEIS: DAPI sollte vor dem Experiment frisch verdünnt werden.
   2. Spülen Sie die Eierkammern 1x aus, danach waschen Sie 3x bei RT für 10 min.
      HINWEIS: Die Eikammern können vor der Montage einige Stunden lang in 1x PBS-Lösung bei 4 °C gelagert werden, es wird jedoch empfohlen, so schnell wie möglich fortzufahren.
7. Montage von Schienen
   1. Reinigen Sie den Objektträger mit fusselfreiem Tuch und notieren Sie dann die Probeninformationen. 1x PBS aus der Tube nehmen, aber eine kleine Menge übrig lassen, um Trockenheit zu vermeiden.
   2. Schneiden Sie den Rand der Mikropipettenspitzen ab und pipettieren Sie dann vorsichtig die Eikammern auf den Objektträger. Verteilen Sie die Eierkammern mit einer Pinzette vorsichtig auf dem Objektträger und vermeiden Sie ein Verklumpen. Betrachten Sie die Objektträger unter einem Mikroskop (2-fache Vergrößerung ist ausreichend), um sicherzustellen, dass die Eikammern gleichmäßig verteilt sind.
   3. Entfernen Sie das restliche PBS mit einer Mikropipette aus dem Objektträger. Pipettieren Sie 15-30 μl Antifading-Lösung (lichtempfindlich) auf den Objektträger und stellen Sie sicher, dass er mit allen Eikammern in Kontakt kommt.
   4. Halte die Kante der Objektträgerabdeckung mit einer Pinzette fest und lege sie dann auf die Glasschiene (von einer Kante zur anderen), so dass sie die Eierkammern bedeckt. Gehen Sie es langsam an, um Blasen zu vermeiden. Tupfen Sie überschüssige Lösung mit fusselfreiem Tuch ab und versiegeln Sie dann die Deckglaskanten mit Nagellack. Lassen Sie den Nagellack gut trocknen (± 5 min).
   5. Bilden Sie die Objektträger mit einem konfokalen Mikroskop ab. Lagern Sie Objektträger bei -20 °C.

4. Anreicherung von biotinylierten Peptiden für die massenspektrometrische Analyse

HINWEIS: Für die Massenspektrometrie-Probe werden etwa 3 mg Proteine benötigt. Desetieren Sie daher etwa 100 Eierstockpaare, um diese Menge zu erhalten.

1. Lyse von Gewebe
   1. Tauen Sie das gefrorene Eierstockgewebe auf. Bereiten Sie in der Zwischenzeit 1x Tris-gepufferte Kochsalzlösung (TBS) vor, indem Sie 1 TBS-Tablette in 500 ml TDW auflösen. Lagern Sie es bei RT. Bereiten Sie 2 % SDS in 1x TBS als Lysepuffer vor, indem Sie 4 ml 10 % SDS-Material in 16 mL 1x TBS verdünnen. Lagern Sie es bei RT.
   2. Geben Sie 500 μl 2% SDS in 1x TBS (ergänzt mit 1x PI-Cocktail) in das Röhrchen mit den Eierstöcken. Warten Sie einige Minuten, bis die Zellen lysiert sind und die Lösung klebrig wird.
   3. Pipettieren Sie das Lysat in ein 1 ml großes Militube, das eine AFA-Faser (Adaptive Focused Acoustics) enthält. Schneiden Sie die Pipettenspitzen vor dem Gebrauch ab. Um eine effiziente Beschallung zu gewährleisten, übertragen Sie maximal 500 μl Lysat pro Röhrchen.
   4. Die Beschallung wird unter folgenden Bedingungen durchgeführt: Spitzeneinfallsleistung 75 W, Tastverhältnis 10 %, Zyklen pro Burst 200, Zeit 180 s, Temperatur 6 °C.
      HINWEIS: Wenn eine Probe mehrmals beschallt werden muss, legen Sie einige Intervalle dazwischen fest, um die Erzeugung von übermäßiger Hitze zu vermeiden.
2. Aceton-Fällung
   1. Bringen Sie das Lysat in ein 5-ml-Röhrchen mit geringer Bindung und geben Sie dann kaltes Aceton im 6-fachen des Probenvolumens in das Röhrchen. Fügen Sie z. B. 3 ml Aceton zu 500 μl Lysat hinzu.
      HINWEIS: Aceton sollte vor Gebrauch bei -20 °C vorgekühlt werden.
   2. Den Vortex-Schlauch auffüllen, in den Multirotator laden und über Nacht (± 16 h) bei -20 °C inkubieren.
      HINWEIS: Dies ist ein Stopppunkt, was bedeutet, dass das Experiment nach diesem Schritt vorübergehend pausiert werden kann.
   3. Pelletierte präzipitierte Proteine bei 15.000 x g für 15 min bei 4 °C. Überstand entsorgen und das Röhrchen bei 4 °C nach unten drehen.
   4. Fügen Sie 2 ml einer Mischlösung hinzu, die zu 90 % aus kaltem Aceton und zu 10 % aus 1x ELS besteht. Pipettieren Sie in einer Auf- und Abbewegung, um das Pellet und die Lösung zu mischen. Schneiden Sie die Pipettenspitzen vor Gebrauch ab.
   5. Wirbeln Sie das Röhrchen ein, laden Sie es in den Multirotator und inkubieren Sie es 2 h lang bei -20 °C.
   6. Pelletieren Sie Proteine bei 15.000 x g für 15 min bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand und drehen Sie das Röhrchen bei 4 °C nach unten. Öffnen Sie das Rohr und trocknen Sie das Pellet 10 Minuten lang an der Luft.
      HINWEIS: Trocknen Sie das Pellet nicht zu lange, da es später schwierig ist, es wieder aufzuhängen.
   7. Bereiten Sie 500 mM Ammoniumbicarbonat (ABC)-Stammlösung vor, indem Sie 0,7906 g ABC in 20 ml TDW auflösen. Stellen Sie 50 mM ABC-Arbeitslösung her, indem Sie 3 mL 500 mM ABC-Stammlösung in 27 mL TDW verdünnen.
   8. Bereiten Sie 8 M Harnstofflösung vor, indem Sie 0,4805 g Harnstoff in 1 mL 50 mM ABC hinzufügen.
      HINWEIS: Die Harnstofflösung sollte vor dem Experiment frisch zubereitet werden.
   9. Resuspendieren Sie das Proteinpellet in 500 μl 8 M Harnstoff. Das Volumen von 8 M Harnstoff kann reduziert werden, um die Proteinkonzentration zu erhöhen.
   10. Übertragen Sie das resuspendierte Protein in ein 1 ml großes Miliröhrchen, das die AFA-Faser enthält, und führen Sie dann die Beschallung unter den gleichen Bedingungen durch, die in Schritt 4.1.4 beschrieben sind.
   11. Führen Sie einen BCA-Assay durch, um die Proteinkonzentration zu bestimmen. Dieser Schritt ist ein Stopppunkt. Lagern Sie die Proteinprobe bis zur weiteren Verwendung bei 4 °C.
3. Trypsin-Verdauung
   1. Mischen Sie 3 mg Proteine mit TDW (falls erforderlich) in einem 5-ml-Röhrchen mit geringer Bindung, um insgesamt 500 μl Lösung herzustellen.
   2. Denaturieren Sie Proteine mit einem Thermoblock bei 450 U/min für 1 h bei 37 °C.
   3. Geben Sie 5 μl 1 M DTT (gelöst in TDW) in das Röhrchen, um eine Endkonzentration von 10 mM DTT zu erreichen, und reduzieren Sie dann die Proteine mit einem Thermoblock bei 450 U/min für 1 h bei 37 °C.
   4. Bereiten Sie 400 mM Iodacetamid vor, indem Sie 0,0111 g Iodacetamid in 150 μl ABC auflösen. Geben Sie 55 μl 400 mM Iodacetamid in das Röhrchen (Endkonzentration 40 mM) und alkylieren Sie dann Proteine mit einem Thermoblock bei 450 U/min für 1 h bei 37 °C.
      HINWEIS: Iodacetamid ist lichtempfindlich und alle Jodacetamidlösungen sollten vor dem Experiment frisch zubereitet werden.
   5. Verdünnen Sie die Probe durch Zugabe von 50 mM ABC-Lösung, bis das Gesamtvolumen 4 mL erreicht. Nach der Verdünnung beträgt die Harnstoffkonzentration in der Lösung etwa 1 M.
   6. 1 M CaCl₂ Stammlösung herstellen, indem 1,1098 g CaCl₂ in 10 mL TDW aufgelöst werden. Geben Sie 4 μl 1 M CaCl₂ Stamm in das Röhrchen, um eine Endkonzentration von 1 mM zu erreichen, und pipettieren Sie dann auf und ab, um die Lösung zu homogenisieren.
   7. Bereiten Sie eine 1 mg/ml Trypsin-Stammlösung vor, indem Sie 0,001 g Trypsin zu 1 ml ABC hinzufügen. Geben Sie 150 μl Trypsin in das Röhrchen (Trypsin: Probe = Verhältnis 1:20). Verdauen Sie das Protein mit einem Thermoblock bei 450 U/min für 16 Stunden bei 37 °C.
      HINWEIS: Trypsin sollte vor dem Experiment frisch aufgelöst werden. Dieser Schritt ist ein Stopppunkt. Lagern Sie verdaute Peptide bis zur weiteren Verwendung bei 4 °C.
4. Anreicherung von biotinylierten Peptiden
   HINWEIS: Wasch- und Elutionspuffer sollten vor dem Experiment frisch zubereitet werden.
   1. Bereiten Sie 2 M Harnstoff in 1x TBS Lösung vor, indem Sie 1,2012 g Harnstoff in 10 mL 1x TBS hinzufügen.
   2. Verwenden Sie 150 μl Streptavidin-konjugierte magnetische Kügelchen pro 3 mg Probe. Waschen Sie die Streptavidin-Kügelchen mit 1 mL 2 M Urea in 1x EL und wiederholen Sie diesen Schritt 4x. Legen Sie die Tube nach jedem Waschen für 1 Minute auf ein Magnetgestell und entsorgen Sie dann den Waschpuffer.
      HINWEIS: Pierce Streptavidin Magnetic Beads werden empfohlen, da sie PEG-ähnliche Hintergrundsignale in den Ergebnissen der Massenspektrometrie minimieren.
   3. Pipettieren Sie 1 ml verdauter Peptide in das Kügelchen-Röhrchen, mischen Sie es vorsichtig und kombinieren Sie dann die Mischung mit der restlichen Probe in einem 5-ml-Röhrchen mit geringer Bindung. Stellen Sie das Röhrchen auf einen Multirotator und inkubieren Sie es 1 h lang bei RT.
   4. Füllen Sie 1 mL der Mischung in ein 1,5 mL Röhrchen und legen Sie es für 1 Minute auf das Magnetgestell. Entsorgen Sie den Überstand. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis alle Perlen gesammelt sind.
   5. Bereiten Sie 2 M Harnstoff in 50 mM ABC vor, indem Sie 0,7207 g Harnstoff in 6 mL von 50 mM ABC auflösen. Waschen Sie die Perlen mit 1 mL 2 M Urea in 50 mM 2x und mit 1 mL TDW einmal. Legen Sie die Tube nach jedem Waschen für 1 Minute auf ein Magnetgestell und entsorgen Sie dann den Waschpuffer.
   6. Bereiten Sie eine 10%ige Ameisensäure-Stammlösung vor, indem Sie 1 ml Ameisensäure in 9 ml TDW lösen. Bereiten Sie den Elutionspuffer vor, der aus 80 % Acetonitril und 0,1 % Ameisensäure in TDW besteht. Mischen Sie beispielsweise 1,2 ml Acetonitril, 15 μl 10 % Ameisensäurematerial und 285 μl TDW, um 1,5 ml Elutionspuffer herzustellen.
      ACHTUNG: Acetonitril und Ameisensäure sind aufgrund ihrer flüchtigen Eigenschaften schädlich, tragen Sie also eine Maske und seien Sie vorsichtig beim Umgang mit ihnen.
   7. Pipettieren Sie 100 μl Elutionspuffer in das Röhrchen, homogenisieren Sie vorsichtig und eluieren Sie die Peptide dann mit einem Thermoblock bei 300 U/min für 5 min bei 60 °C. Stellen Sie das Röhrchen nach der Elution auf ein Magnetgestell und geben Sie das Eluat in ein neues 1,5-ml-Röhrchen. Vermeiden Sie die Einnahme von Kügelchen beim Übertragen des Eluats. Wiederholen Sie diesen Schritt 5x.
   8. Legen Sie das Röhrchen mit 500 μl Eluat für 5 Minuten auf ein Magnetgestell und füllen Sie es dann in ein neues 1,5-ml-Röhrchen um, um eine vollständige Entfernung der Kügelchen zu gewährleisten. Die eluierten Proben können dann getrocknet und für die massenspektrometrische Analyse verwendet werden.
   9. Weitere Informationen zur LC-MS/MS-Analyse von angereicherten Peptidproben und zur MS-Datenverarbeitung finden Sie unter Nguyen et ^al.20.

Beispielausgaben sind in Abbildung 1 dargestellt, Abbildung 2, Abbildung 3, Abbildung 4 wurden zuvor von Nguyen et al.20 veröffentlicht. Abbildung 1 veranschaulicht das experimentelle Verfahren der TurboID-basierten PL in Drosophila-Ovarien. Zunächst wurde ein Konstrukt generiert, das Zuc und TurboID kombiniert (Zuc-V5-TurboID). Bekannte und unterschiedliche Suborganellenbewohner, nämlich das nukleare Exportsignal (NES) und die translocasefarbene äußere Mitochondrienmembran (Tom20), wurden ebenfalls mit TurboID fusioniert (NES-V5-TurboID und Tom20-V5-TurboID). NES-V5-TurboID dient zur Biotinylierung zytosolischer Proteine und fungiert als Negativkontrolle. Als Positivkontrolle markiert Tom20-V5-TurboID das OMM-Proteom. Fliegen, die diese Transgene überexprimierten, wurden mit matα-GAL4-Fliegen gepaart, um die Genexpression in Keimbahnzellen zu steuern. Die Nachkommen wurden 16 Stunden lang mit Biotin gefüttert, um PL zu initiieren; Dann wurden ihre Eierstöcke präpariert und verschiedenen Analysen unterzogen. Abbildung 2 zeigt das in Abschnitt 2 des Protokolls beschriebene Versuchsergebnis. Der Nachweis mit V5-Antikörpern zeigt, dass Transgene im Eierstock sowohl mit als auch ohne zusätzliches Biotin gut exprimiert werden. Darüber hinaus erhöht das Vorhandensein von exogenem Biotin die Protein-Biotinylierungsfähigkeit von Transgenen, wie in SA-HRP offenbart. Die Western-Blot-Ergebnisse wurden durch Immunfluoreszenzfärbung im Eierstock weiter bestätigt (Abbildung 3). Konfokale Bilder zeigten eine starke überlappende Expression zwischen Transgenen und proximalen Proteinen nach der Biotin-Fütterungsbehandlung, wie sie vom V5-Antikörper bzw. vom Streptavidin-konjugierten Alexa Fluor 594 eingefangen wurde. Zuc-V5-TurboID-Proteomdaten, die aus der Massenspektrometrie gewonnen wurden, wurden durch eine Genontologie-Analyse (GO) weiter charakterisiert. Die angereicherten biotinylierten Proteine sind an verschiedenen biologischen Prozessen beteiligt, die von der Chaperon-vermittelten Proteinfaltung und der Organisation des Endomembransystems über die Regulation des endoplasmatischen Retikulums (ER) bis hin zum Golgi-Vesikel-vermittelten Transport reichen (Abbildung 4).

Abbildung 1: TurboID-basierte PL-Strategie im Ovar von Drosophila. Abkürzungen: POI = Protein of Interest. Die Biotinmarkierung wurde entweder für 0 oder 16 h durchgeführt. Diese Zahl wurde von20 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Western-Blot-Analyse zur Bestätigung von Transgenexpressionen und biotinylierten Proteinmustern in Keimbahnzellen. Die NES-, Tom20- und Zuc-V5-TurboID-Expressionen wurden mit V5-Antikörpern bei 36, 56 bzw. 65 kDa nachgewiesen, wie die schwarzen Pfeile zeigen. Das SA-HRP-Blotting zeigte stärkere und vielfältigere Biotinylierungssignale in transgenen Gruppen als in der Kontrollgruppe. In transgenen Gruppen stieg die Biotinylierungsaktivität nach 16 h exogener Biotinzugabe im Vergleich zur nicht mit Biotin zugesetzten Bedingung an. HSP90 wird als Ladekontrolle eingesetzt. Diese Zahl wurde von20 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Konfokale Bilder von Transgenen und proximalen biotinylierten Proteinen, die in Keimbahnzellen ko-exprimiert werden. Die Färbung mit V5-Antikörpern und Alexa Fluor 488-konjugierten Sekundärantikörpern (grün) zeigte, dass NES-V5-TurboID gleichmäßig im Zytoplasma verteilt war. Die Zuc-V5-TurboID-Expression war stärker in den Mitochondrien konzentriert, ähnlich wie bei der Tom20-V5-TurboID-Expression. Die Färbung mit Streptavidin-konjugiertem Alexa Fluor 594 (rot) bestätigte die Biotinylierungsaktivität. TurboID kann die Proteinbiotinylierung an bestimmten Stellen innerhalb von Keimbahnzellen aktivieren, wie das überlappende Signal zwischen TurboID-fusionierten Proteinen und proximalen biotinylierten Proteinen (gelb) zeigt. DAPI (blau) wurde für die Kernfärbung verwendet. Maßstabsleisten: 20 μm. Diese Zahl wurde von20 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Biologische Prozessrollen des angereicherten Zuc-V5-TurboID-Proteoms mittels GO-Analyse. Die Interaktionskarte zeigt mehrere angereicherte biotinylierte Proteine als Kandidaten von Zuc-Interaktionspartnern. Die gleichen Farbknoten verknüpfen die Kandidaten und ihre vorhergesagten Funktionen. Die Knotengröße stellt das Signifikanzniveau dar. Potentielle Zuc-Interaktionspartner sind maßgeblich an der Chaperon-vermittelten Proteinfaltung, der Organisation des Endomembransystems und der Regulation des ER-zu-Golgi-Vesikel-vermittelten Transports beteiligt. Diese Zahl wurde von20 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.