In dieser Studie etablieren wir ein detailliertes Protokoll für TurboID-basiertes Proximity-Labeling (PL) im Ovarialbereich von D. melanogaster , das Schritte von der Biotin-Supplementierung und Ovarialdissektion bis zur Validierung der Transgenexpression und der Anreicherung von biotinylierten Peptiden für die Massenspektrometrie abdeckt.
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Methodenartikel
Im lebenden Organismus Anwendung der TurboID-basierten Proximity-Markierung bei Drosophila melanogaster
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Proximity Labeling (PL) ist eine leistungsfähige Methode zur Kartierung von Protein-Protein-Interaktionsnetzwerken. Fortschritte bei der Markierung von Enzymen, insbesondere TurboID, haben seine Verwendung in biologischen Systemen ausgeweitet. TurboID ist aufgrund seiner Robustheit, Ungiftigkeit und Benutzerfreundlichkeit besonders vorteilhaft für In-vivo-Anwendungen . Dieses Enzym biotinyliert in Gegenwart von Biotin promiskuitiv benachbarte Biomoleküle, einschließlich Proteine und Nukleinsäuren, innerhalb eines Bereichs von etwa 10 nm. Wir haben diese Methode angewendet, um das Interaktom von Zucchini (Zuc) zu untersuchen, einem Schlüsselfaktor für die Biogenese der piwi-interagierenden RNA (piRNA) auf der äußeren Mitochondrienmembran (OMM) in Keimbahnzellen des Ovarieurs von Drosophila melanogaster . Durch die Expression von Zuc-TurboID in Keimzellen und die Supplementierung mit Biotin induzierten wir die Biotinylierung von Zuc-proximalen Proteinen. Massenspektrometrische Analysen nach der Anreicherung biotinylierter Peptide identifizierten Proteine in unmittelbarer Nähe von Zuc, einschließlich bekannter Interaktoren in der piRNA-Biogenese. Interessanterweise haben wir neue Interaktoren von Zuc entdeckt, die an der Proteinfaltung, der Membranorganisation und dem Vesikeltransport beteiligt sind.
Einleitung
Herkömmliche Methoden zur Kartierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPI), wie z. B. die Affinitätsreinigungs-Massenspektrometrie (AP-MS) und Hefe-2-Hybrid-Systeme (Y2H), können häufig nicht in der Lage sein, transient exprimierte oder membrangebundene Proteine mit geringer Abundanz zu erfassen. Diese Einschränkung ergibt sich aus ihrer Unfähigkeit, die nativen physiologischen Bedingungen einer lebenden Zelle zu replizieren 1,2,3. Um diese Herausforderungen zu meistern, hat sich PL als leistungsfähige Technik für die hochauflösende Prot....
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Protokoll
1. PL in der Erwachsenenfliege
- Zubereitung von Biotin Lebensmitteln
- 1 M NaOH-Lösung wird durch Verdünnung von 10 M NaOH-Stamm in dreifach destilliertem Wasser (TDW) hergestellt. Lagern Sie es bei Raumtemperatur (RT). Bereiten Sie 1 M Biotin-Stammlösung vor, indem Sie 0,0049 g Biotinpulver in 20 ml TDW auflösen. Fügen Sie 150-200 μl 1 M NaOH hinzu, um die Löslichkeit von Biotin zu erhöhen. Vortex, um die Lösung zu homogenisieren. Biotin-Stammlösung bei 4 °C lagern.
- Nehmen Sie das Fliegenfutter aus dem Fläschchen und erhitzen Sie es 2 Minuten lang in der Mikrowelle, bis es geschmolzen is....
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Ergebnisse
Beispielausgaben sind in Abbildung 1 dargestellt, Abbildung 2, Abbildung 3, Abbildung 4 wurden zuvor von Nguyen et al.20 veröffentlicht. Abbildung 1 veranschaulicht das experimentelle Verfahren der TurboID-basierten PL in Drosophila-Ovarien. Zunächst wurde ein Konstrukt generiert, das Zuc und TurboID kombinie.......
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Diskussion
Hier stellen wir ein umfassendes Verfahren für das TurboID-basierte Proximity-Labeling (PL) im Drosophila-Eierstock zur Verfügung, das durch umfangreiche Fehlerbehebung entwickelt wurde, um verschiedene Herausforderungen zu meistern. Ein zentrales Problem betraf genetische Konstrukte, da unterschiedliche Fusionslayouts die Proteinexpression und die Biotinylierungseffizienz erheblich beeinflussten. Zum Beispiel zeigte NES-V5-TurboID im Vergleich zu anderen Transgenen eine schwäch.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.
Danksagungen
Wir danken den Labormitgliedern für ihre Gespräche und Hilfe. Diese Arbeit wurde unterstützt von der National Research Foundation (NRF), die von der koreanischen Regierung (MSIT) finanziert wird (RS-2024-00345327 an M.L.; RS-2023-00219563 auf M.L.).
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Antikörper | |||
| Goat Anti-Maus IgG (H+L) Sekundärantikörper, HRP | Invitrogen | 31430 | Analytischer, lichtempfindlicher |
| Ziege Anti-Kaninchen IgG (H+L) hoch kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor plus 488 | Invitrogen | A32731 | Analytischer, lichtempfindlicher |
| Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (H+L) Sekundärantikörper, HRP | Invitrogen | 31460 | Lichtempfindlicher |
| HSP90-Antikörper in analytischer Qualität (Kaninchen) | Cell Signaling Technology | 4874 | Polyklonaler Antikörper |
| Pierce Streptavidin-Protein, HRP | Thermo Fisher Scientific | 21126 | in analytischer Qualität |
| , Alexa Fluor 594-Konjugat | Invitrogen | S11227 | Lichtempfindlicher, analytischer |
| AntikörperV5-Tag-Antikörper (Maus) | Invitrogen | R960-25 | Monoklonaler Antikörper |
| V5-Tag-Antikörper (Kaninchen) (D3H8Q) | Cell Signaling Technology | 13202 | Monoklonaler Antikörper |
| Fly Lines | Company< | strong>Katalognummer | Kommentare/Beschreibung |
| pUASp Tom20 V5-TurboID/ TM3 | Korea Drosophila Stock Center | 2373-2 | Fliegenmaterial |
| pUASp Zucchini V5-TurboID/Cyo | Korea Drosophila Stock Center | 2188 | Fly Material |
| pUASP_attB_V5-TurboID-NES/Cyo | Korea Drosophila Stock Center | 2635-4 | Fliegenmaterial |
| mit [*]; P{w[+mC]=matalpha4-GAL-VP16}V2H | Bloomington Drosophila Stock Center | 7062 | Fly stock |
| Equipments and Contakeables | Company | Katalognummer | strong> |
| Analysenwaage | Mettler Toledo | ME204 | 0,1 mg Lesbarkeit |
| Amersham Protran 0,45 NC Nitrozellulose Western Blotting Membranen (300 mm & 4 m) | Cytiva | ||
| 10600002-Axygen 1,7 mL MaxyClear Snaplock Mikrozentrifugenröhrchen | Corning | MCT-175-C | Co-Polymer |
| MARKE Deckglas (22 mm x 22 mm) | Sigma-Aldrich | BR470055 | Borosilikatglas |
| Pipettenspitzen (10 & Mikro; L) | Vertex | 4110N00 | Propylen-Pipettenspitzen |
| (1000 & Mikro; L) | Vertex | 4330N00 | Propylen-Pipettenspitzen |
| (200 & Mikro; L) | Vertex | 4230N00 | Propylen-Zellkulturplatte |
| (96 Well) | SPL | 300096 | Zentrifuge aus Polystyrol |
| mit flachem Boden (mit 1,5-2 mL röhrchengroßem Rotor) | Eppendorf | 5424 R | |
| Kühlzentrifuge mit festem Winkel (mit 5 mL röhrchengroßem Rotor) | Eppendorf | 5425 R | festem Winkel |
| - | - | ||
| ChemiDoc Bildgebungssystem | aus Edelstahl Biorad | 12003153 | Western-Blot-Bildgebungssystem |
| CO2 Fliegenpad | - | Anästhesieplatte | |
| CO2 Tank und Atemregler | - | Vorsicht vor Hochdruckgas und Schwindel | |
| Kompakter Inkubator | JSR | JSGI-10T | Vorsicht vor hoher Temperatur Temperatur |
| Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop | Zeiss | LSM 710 | Vorsicht vor intensivem Laserstrahl |
| Konisches Rohr (15 mL) | SPL | 50015 | Polypropylen /Polyethylen hoher Dichte |
| Konisches Röhrchen (50 mL) | SPL | 50050 | Polypropylen /Polyethylen hoher Dichte |
| Digitale Waage | - | - | - |
| Digitaler Timer | - | - | - |
| Dissektionsschale | - | - | Silikon |
| Dumont #5SF Pinzette | Fine Science Tools | 11252-00 | Superfeine Spitzen, Vorsicht vor scharfen Objekten |
| DynaMag-2 Magnet | Invitrogen | 12321D | Für Mikrozentrifugenröhrchen mit einer Größe von 1,5-2 ml |
| Fisherbrand Superfrost Plus Objektträger (25 mm x 75 mm) | Fisher Scientific | 12-550-15 | Vorsicht vor scharfen |
| Gegenständen Fliegenfutterflaschen (mit Papierstopfen) | Hansol Tech | FFB-21010-Fläschchen | |
| mit Fliegenfutter (mit Wattekappe) | Hansol Tech | FFV-11010-Fokussierter-Ultraschallgerät | |
| Covaris | M220 | Vorsicht vor Ultraschallwellen | |
| Gelmesser | Invitrogen | EI9010 | Edelstahl mit Kunststoffgriff |
| Güteklasse 3MM Chr Löschpapier (46 cm & mal 57 cm) | Cytiva | 3030-917 | Whatmann Papier |
| Handheld Homogenisator und Kunststoffstößel | Kimble | 749540-0000 | Akku-Motor |
| Heizblock | Fein-PCR | ALB6400 | Vorsicht bei hohen Temperaturen |
| Fusselfreies Taschentuch | Yuhan-Kimberly | 41112 | - |
| Flüssiger Stickstoff | - | Vorsicht vor Erfrierungen und Verbrennungen | |
| Mikrotiterplatten-Spektralphotometer | Agilent Technologies | Epoch | Monochromator-basierte Optik |
| Mikrowelle | - | Vorsicht vor Hochtemperatur-MilliTUBE | |
| 1 mL AFA-Faser | Covaris | PN 520135 | Glas |
| Mini-Gel-Tank | Thermo Fisher Scientific | A25977 | Vorsicht bei |
| Hochtemperatur-NuPAGE Bis-tris Mini-Protein-Gelen, 4– 12%, 1,0– 1,5 mm, 10-Well-Invitrogen-NP0323BOX | enthalten Polyacrylamid, Vorsicht vor Toxizität | ||
| NuPAGE Bis-tris Mini-Protein-Gele, 4– 12%, 1,0– 1,5 mm, 15-Well-Invitrogen | NP0321BOX | Enthält Polyacrylamid, Vorsicht vor Toxizität | |
| Pinsel (& Oslash; 1,8 mm) | Hwa hong | 791240-Pipetman | |
| L (P1000L) | Gilson | FA10006M | Einkanal-Mikropipette mit Metallabwerfer |
| Pipetman L (P200L) | Gilson | FA10005M | Einkanal-Mikropipette mit Metallabwerfer |
| Pipetman L ( P20L) | Gilson | FA10003M | Einkanal-Mikropipette mit Metall-Ejektor |
| Pipetman L (P2L) | Gilson | FA10001M | Einkanal-Mikropipette mit Metall-Ejektor |
| Stromversorgung | Major science | MP-310 | Vorsicht vor Hochspannungselektrizität |
| Programmierbarer Rotator | Biosan | RS-24-Protein | |
| LoBind Röhrchen | Eppendorf | ||
| 30108302-Rasierklinge | Dorco | 304020 | Edelstahl, Vorsicht vor scharfen Gegenständen |
| Rolle | - | - | -Serologische |
| Pipette (10 mL) | SPL | 91010 | Polystyrol |
| Serologische Pipette (25 mL) | SPL | 91025 | Serologische Polystyrolpipette |
| (5 mL) | SPL | 91005 | aus Polystyrol |
| (50 mL) | SPL | 91050 | |
| Mikrozentrifugenröhrchen aus Polystyrol mit Schnappverschluss und geringer Retention (1,5 mL) | Thermo Scientific | 3451PK | Polypropylen-Schwammpad |
| Invitrogen | EI9052-Stereomikroskop | ||
| Zeiss | Stemi 508-Stereomikroskop | ||
| Leica | |||
| ThermoMischer C | Eppendorf | 5382000015 | Mit 1,5 & 5 mL großen Blöcken |
| Pinzette | Aven Tools | 18526 | Kunststoff, flache Spitzen |
| Vortex-Mischer | Scientific Industries | SI-0236-XCell | |
| II Blot-Modul | Invitrogen | EI9051 | Vorsicht bei hohen Temperaturen |
| XCell SureLock Mini-Zelle | Invitrogen | EI0001 | Vorsicht vor |
| hohen TemperaturenChemikalien | Company | Katalognummer | Kommentare/Beschreibung |
| Aceton | Sigma-Aldrich | 650501 | Analytische |
| Qualität Acetonitril | Supelco | 1.00029.1000 | LC-MS-Qualität, Vorsicht vor Inhalationstoxizität und brennbaren |
| Albumin-Standardampullen (mit Rinderserumalbumin (BSA) in einer Menge von 2 mg/ml in 0,9 % Kochsalzlösung und 0,05 % Natriumazid) | Thermo Scientific | 23209 | Teil der Pierce BCA Protein Assay Kits (Thermo Scientific, 23225) |
| Albumin, Rinderserum | Bioshop | ALB001 | |
| Ammoniumbicarbonat | Sigma-Aldrich | 09830 | Biotin in analytischer Qualität |
| Sigma-Aldrich | B4639 | Zell- und Gewebekulturqualität | |
| (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670 | ECL-Substrat in Zellkulturqualität |
| Biorad | 1705060 | analytischer Qualität | |
| Sigma-Aldrich | MBD0015 | Lichtempfindliches, analytisches | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher Scientific | R0861 | |
| Fötales Rinderserum | Corning | 35-015-CV | in Zellkulturqualität |
| Sigma-Aldrich | F0507 | Reagenzqualität, Vorsicht vor Inhalationstoxizität | |
| Grace's Insektenmedium | Gibco | 11595030 | Zellkulturqualität |
| Instant-Trockenhefe | Keine Marke | N1019 | - |
| Iodacetamid | Sigma-Aldrich | I1149 | Lichtempfindliches Methanol in analytischer Qualität |
| Carlo Erba | 41484 | ||
| Nagellack | - | Clear-Type | |
| Novex Tris-glycin SDS-Probenpuffer (2X) | Invitrogen | LC2676 | |
| NuPAGE MOPS SDS Laufpuffer in analytischer Qualität (20X) | Invitrogen | NP0001 | |
| PageRuler Vorgefärbte Proteinleiter | Thermo Fisher Scientific | 26616 | Analytische Qualität |
| Phenylmethansulfonylfluorid | Thermo Fisher Scientific | 36978 | |
| Phosphatpuffer-Kochsalzlösung | Sigma-Aldrich | P4417 | Analytische |
| Qualität Pierce 16 % Formaldehyd (w/v) | Thermo Fisher Scientific | 28908 | analytischer Qualität |
| Thermo Scientific | 23225 | Analytische Qualität | |
| Pierce BCA Reagenz A (enthält Natriumcarbonat, Natriumbicarbonat, Bicinchoninsäure und Natriumtartrat in 0,1 M Natriumhydroxid) | Thermo Scientific | 23228 | Teil der Pierce BCA Protein Assay Kits (Thermo Scientific, 23225) |
| Pierce BCA Reagenz B (enthält 4 % Kupfersulfat) | Thermo Scientific | 1859078 | Teil der Pierce BCA Protein Assay Kits (Thermo Scientific, 23225) |
| Propionsäure | Sigma-Aldrich | 402907 | ACS-Qualität |
| Proteaseinhibitor-Cocktail-Set III | Calbiochem | 539134 | und Gewebekulturqualität |
| SlowFade Gold Antifade Eindeckmittel | Invitrogen | S36936 | Lichtempfindliches |
| Natriumchlorid (NaCl) | Bioneer | C-9025 | in analytischer Qualität |
| Sigma-Aldrich | D6750 | Analytische Qualität | |
| Natriumdodecylsulfat | Sigma-Aldrich | 71736 | |
| Natriumhydroxid (NaOH) | Biosesang | SR2018-100-00 | Analytische Qualität |
| Dreifach destilliertes Wasser | - | Ultrarein (Typ 1) | |
| Tris-gepufferte Kochsalzlösung | Sigma-Aldrich | 94158 | |
| Tris-Glycin-Transferpuffer | Koma Biotech | K0341001 | Analytische Qualität |
| Tris-HCl, pH 8 | Bioneer | C-9006 | Analytische Qualität |
| Triton x-100 | Sigma-Aldrich | 93443 | Molekulare Qualität |
| Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 20233 | Zellkulturqualität |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | Molekulare Qualität |
| Harnstoff | Sigma-Aldrich | U5378 | Molekular & Zellkultur-Qualität |
Referenzen
- Kim, D. I., Roux, K. J. Filling the void: Proximity-based labeling of proteins in living cells. Trend Cell Biol. 26 (11), 804-817 (2016).
- Mair, A., Xu, S. L., Branon, T. C., Ting, A. Y., Bergmann, D. C. Proximity labeling of protein....
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Nachdrucke und Genehmigungen
