Isolierung und Kultivierung von primären Cholangiozyten aus Mäusen mit polyzystischer Lebererkrankung unter Verwendung einer zweistufigen Verdauungsmethode

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine optimierte zweistufige Verdaumethode zur Isolierung von hochreinen und lebensfähigen primären Cholangiozyten aus Wildtyp-Mäusen und Mäusen mit polyzystischer Lebererkrankung.

Zusammenfassung

In diesem Protokoll haben wir eine zweistufige Verdauungsmethode optimiert, um hochreine und lebensfähige primäre Cholangiozyten von Wildtyp-Mäusen und Mäusen mit polyzystischer Lebererkrankung (PLD) zu isolieren. Nach der Anästhesie der Mäuse wurden die Lebern durch die untere Hohlvene mit 50 ml Lösung A perfundiert, gefolgt von 30 ml Lösung B bei 37 °C, um das Lebergewebe enzymatisch zu verdauen. Mechanische Dissoziation, Schütteln und Mikrodissektion wurden durchgeführt, um adhärente Parenchymzellen zu entfernen, wobei ein intakter Gallenbaum übrig blieb. Anschließend wurde der Gallenbaum fein zerkleinert und unter Schütteln 60 min bei 37 °C verdaut. Die resultierende Einzelzellsuspension wurde mit einem 70 μm Zellsieb aufgefangen. Die Cholangiozyten wurden mittels immunomagnetischer Isolierung aufgereinigt. Die Zellsuspension wurde mit einem Anti-EpCAM-Antikörper unter Rotation für 45 Minuten bei 4 °C inkubiert, gefolgt von der Zugabe von Protein-G-Kügelchen und einer weiteren Rotation von weiteren 45 Minuten bei 4 °C. Nach drei Wäschen mit PBS wurden die Cholangiozyten mit einem Magnetseparator gesammelt. Die gereinigten primären Cholangiozyten wurden in Cholangiozyten-Kulturmedium resuspendiert und auf Zellkulturschalen ausgesät, die mit 1 mg/ml Typ-I-Rattenschwanzkollagen beschichtet waren. Die Reinheit der Cholangiozyten wurde durch Immunfärbung des Cholangiozyten-spezifischen Markers Cytokeratin-19 (CK19) bestätigt. Obwohl sich diese Studie auf die Isolierung primärer Cholangiozyten aus Wildtyp- und PLD-Mäusen konzentrierte, sind wir zuversichtlich, dass das Protokoll auch auf andere Mausmodelle angewendet werden kann. Diese detaillierte zweistufige Verdauungsmethode ermöglicht in vitro Studien von Cholangiopathien und die Entwicklung zielgerichteter Therapien.

Einleitung

Cholangiozyten, die Epithelzellen, die den intrahepatischen Gallenbaum auskleiden, bilden eine Monoschicht und machen etwa 3-5 % der gesamten Zellpopulation der Leber aus¹. Diese Zellen verbinden sich in der Leber zu einem komplexen dreidimensionalen duktalen Netzwerk². Unter normalen Bedingungen erfüllen Cholangiozyten lebenswichtige Funktionen, einschließlich Sekretion, Absorption, Reparatur von Verletzungen und dienen als Immunbarriere, wodurch sie eine entscheidende Rolle in der Physiologie und Pathologie der Leber spielen. Eine Dysfunktion der Cholangiozyten kann jedoch zu verschiedenen Krankheiten führen, darunter PLD, primär sklerosierende Cholangitis, Cholangiokarzinom und cholestatische Leberschädigung ^3,4,5.

Unter den Krankheiten, die mit der Cholangiopathie in Verbindung stehen, sticht PLD als Erbkrankheit hervor, die durch die Bildung zahlreicher flüssigkeitsgefüllter Zysten gekennzeichnet ist, die von Cholangiozyten ausgehen. Die fortschreitende Vergrößerung dieser Zysten verringert die Lebensqualität der Patienten erheblich⁶. Die derzeitigen Behandlungsoptionen für PLD sind nach wie vor unzureichend und bieten eine begrenzte Wirksamkeit, sind aber oft mit hohen Rezidivraten und Komplikationen verbunden⁷. Dies unterstreicht die dringende Notwendigkeit, sichere und wirksame therapeutische Strategien zu entwickeln, um den ungedeckten klinischen Bedarf im PLD-Management zu decken.

Die Erforschung der Mechanismen von Cholangiopathien, einschließlich PLD, wurde durch den Mangel an geeigneten Zelllinien erheblich behindert. Um diese Einschränkung zu beheben, haben sich die Verwendung von Krankheitsmausmodellen und die Isolierung von primären Cholangiozyten aus diesen Modellen für In-vitro-Experimente als von unschätzbarem Wert erwiesen, um die molekularen Mechanismen aufzudecken, die Cholangiopathien zugrunde liegen, und potenzielle therapeutische Strategien zu identifizieren.

In unserer aktuellen Studie⁸ haben wir erfolgreich ein PLD-Mausmodell mit Pkd1-bedingtem Knockout (KO) Mäusen etabliert. Leberzysten wurden bereits 1 Monat nach der Pkd1-Deletion beobachtet und nahmen im Laufe der Zeit progressiv an Größe zu. Während Protokolle zur Isolierung von Cholangiozyten aus Ratten und Menschen gut dokumentiert sind ^9,10, bleibt die Isolierung von primären Cholangiozyten aus Mäusen aufgrund ihrer geringen Größe und der komplizierten Architektur der Pfortader- und Gallengangssystem eine besondere Herausforderung. Bestehende Methoden sind mit erheblichen Einschränkungen konfrontiert, darunter geringe Zellreinheit, schlechte Viabilität, komplexe Verfahren und hohe Kosten ^11,12.

Dieses Manuskript stellt ein detailliertes Protokoll zur Isolierung hochreiner primärer Cholangiozyten aus Mäusen mit einer zweistufigen Verdauungsmethode vor. Dieser optimierte Ansatz zielt darauf ab, In-vitro-Studien zu unterstützen, die Untersuchung der molekularen Mechanismen zu erleichtern, die Cholangiopathien zugrunde liegen, und die Entwicklung neuartiger therapeutischer Strategien voranzutreiben.

Protokoll

Alle Behandlungs- und Versuchsprotokolle für Mäuse wurden von der Ethikkommission der Medizinischen Universität Tianjin genehmigt (Dok.-Nr.: TMUa-MEC 2022016).

1. Vorbereitung von Geräten und Lösungen

1. Sterilisieren Sie chirurgische Instrumente (Scheren, Pinzetten und Skalpellgriffe), indem Sie sie mindestens 1 Tag vor der Zellisolierung autoklavieren.
2. Bereiten Sie das Cholangiozyten-Kulturmedium mindestens 1 Tag vor der Zellisolierung mit den in Tabelle 1 aufgeführten Reagenzien vor. Sterilisieren Sie das Cholangiozyten-Nährmedium, indem Sie es durch einen 0,22-μm-Filter filtrieren.
3. Bereiten Sie Lösung A und Lösung B mindestens 1 Tag vor der Zellisolierung mit den in Tabelle 2 aufgeführten Reagenzien für die Leberperfusion der Maus vor. Sterilisieren Sie Lösung A und Lösung B durch Autoklavieren oder Filtrieren durch einen 0,22-μm-Filter und stellen Sie ihren pH-Wert mit sterilem NaOH unter sanftem Rühren auf 7,35 ein.
   HINWEIS: Cholangiozyten-Nährmedium, Lösung A und Lösung B können mindestens einen Monat lang bei 4 °C gelagert werden.
4. Geben Sie vor Beginn des Experiments Kollagenase II-Pulver zu Lösung B und mischen Sie vorsichtig, um eine Endkonzentration von 0,5 mg/ml zu erreichen. Sowohl Lösung A als auch Lösung B vor Gebrauch in einem 37 °C warmen Wasserbad vorwärmen.
5. Bereiten Sie unmittelbar vor Beginn des Experiments 6 cm große Schalen vor, die mit sterilem PBS gefüllt sind, und legen Sie sie auf Eis, um sie während des Eingriffs kalt zu halten.

2. Durchblutung der Verdauung des Lebergewebes

1. Betäuben Sie die Maus mit einer Überdosis Isofluran-Inhalation. Legen Sie die betäubte Maus in Rückenlage und sichern Sie sie mit Klebeband, um den Eingriff zu erleichtern.
2. Öffnen Sie die Bauchhöhle der Maus, nachdem Sie den Bauch mit 75% Ethanol sterilisiert haben, und binden Sie dann mit einer gepressten Nadel einen Schlupfknoten um die untere Hohlvene. Spülen Sie einen intravenösen 24-G-Katheter mit Lösung A mit einer 20-ml-Spritze.
3. Führen Sie den intravenösen Katheter in die untere Hohlvene unterhalb des Slipknotens ein, befestigen Sie den Slipknoten und fixieren Sie den Katheter mit Klebeband.
4. Perfundieren Sie die Leber mit 50 ml Lösung A durch die untere Hohlvene mit einer 20-ml-Spritze und schneiden Sie die Leberpfortader ein, um die Perfusionslösung abzulassen. Halten Sie die Perfusionsrate bei 10 ml/min.
5. Setzen Sie die Perfusion mit 30 mL Lösung B, die Kollagenase II enthält, bei einer Flussrate von 3,5 mL/min mit einer Schlauchpumpe fort.
   HINWEIS: Dieser Schritt ist für die Verdauung von Lebergewebe vorgesehen.
6. Entnehmen Sie das erfolgreich durchblutete Lebergewebe und legen Sie es in eine 6 cm große Schale, die mit kaltsterilem PBS gefüllt ist.

3. Isolierung von Cholangiozyten

HINWEIS: Da die Anzahl der Cholangiozyten bei normalen Mäusen relativ gering ist, wird empfohlen, eine Gruppe von 2-6 Mäusen für das Verfahren zu verwenden. Für Mauskrankheitsmodelle mit abnormaler Cholangiozytenproliferation, wie z. B. PLD, sind jedoch die Cholangiozyten einer einzelnen Maus ausreichend. Sofern nicht anders angegeben, müssen Proben und Reagenzien immer auf Eis aufbewahrt werden, und alle Eingriffe sollten in einer biologischen Sicherheitswerkbank durchgeführt werden.

1. Dissoziieren und schütteln Sie das Lebergewebe mechanisch mit einer gebogenen Pinzette. Führen Sie anschließend eine Mikrodissektion unter einem Präpariermikroskop durch, um anhaftende Parenchymzellen zu entfernen, wobei ein intakter Gallenbaum übrig bleibt. Entferne das Gallenblasengewebe, bevor du mit dem nächsten Schritt fortfährst.
   Waschen Sie das Taschentuch 2x mit PBS.
2. Zerkleinern Sie den Gallenbaum mit einer chirurgischen Klinge fein und verdauen Sie ihn in 3 ml Aufschlusslösung (Tabelle 3) pro Maus unter Schütteln (90 U/min) bei 37 °C für 60 Minuten. Nach 30 Minuten pipettieren Sie die Mischung vorsichtig mit einer Pipettenspitze, um sie gründlich zu mischen.
   HINWEIS: Die Aufschlusslösung sollte vor der Verwendung frisch zubereitet werden.
3. Die Zellsuspension wird durch ein 70 μm Zellsieb geleitet. Verwenden Sie den Kolben einer 5-ml- oder 10-ml-Spritze, um die Zellsuspension vorsichtig durch das Sieb zu drücken. Waschen Sie das Sieb mit PBS.
4. Die Zellsuspension bei 500 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Waschen Sie die Zellen 3x mit RPMI-Medium.
5. Erneut bei 500 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren.
6. Der Überstand wird verworfen und die Zellen werden in 900 μl RPMI-Medium mit 40 μl DNase I resuspendiert. 2 μg Anti-EpCAM-Antikörper werden hinzugefügt und die Suspension auf einem Rotator (20 U/min) bei 4 °C für 45 min inkubiert.
7. Zentrifugieren Sie bei 500 x g für 5 min bei 4 °C.
8. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml RPMI-Medium, das 40 U/ml DNase I enthält. Geben Sie 20 μl Protein G-Kügelchen in die Zellsuspension und inkubieren Sie mit Rotation (20 U/min) bei 4 °C für weitere 45 Minuten.
   HINWEIS: Der Anti-EpCAM-Antikörper kann auch mit Protein-G-Kügelchen vorinkubiert werden, um vor der Einführung der Zellsuspension einen Bead-Antikörper-Komplex zu erzeugen.
9. Waschen Sie die Zellen 3x mit PBS mit einem Magnetabscheider.
10. Führen Sie die Zellzählung und die Beurteilung der Zellviabilität mit Trypanblau-Färbung (0,04 %, 3 min) auf einem Hämozytometer durch.
    HINWEIS: Es ist nicht notwendig, die Kügelchen von den Cholangiozyten zu entfernen, sie lösen sich auf natürliche Weise, sobald die Kultivierung beginnt, und beeinträchtigen die Zellkultur nicht.

4. Kultur der Cholangiozyten

HINWEIS: Bereiten Sie vor der Cholangiozytenkultur frische, mit Kollagen überzogene Zellkulturschalen vom Typ I zu. Alle Reagenzien auf Eis vorkühlen.

1. Mischen Sie gemäß den Anweisungen des Herstellers steriles ddH₂O, 10x PBS, 1 N NaOH und Typ I Rattenschwanzkollagen, um eine Endkonzentration von 1 mg/ml Typ I Rattenschwanzkollagen in 1x PBS zu erreichen. Beschichten Sie die Zellkulturschalen gleichmäßig mit der Mischung und stellen Sie die Schalen 30 Minuten lang bei 37 °C mit 5 % CO₂ in einen Inkubator, damit sich das Kollagen verfestigen kann.
2. Waschen Sie die mit Kollagen überzogenen Zellkulturschalen vom Typ I mit Rattenschwanz mit vorgewärmtem PBS.
3. Resuspendieren Sie die Cholangiozyten in vorgewärmtem Cholangiozyten-Kulturmedium. Die Zellsuspension wird auf 1 mg/ml Typ I mit Kollagen beschichtete Zellkulturschalen vom Typ I ausgesät und bei 37 °C mit 5 % CO₂ inkubiert. Ersetzen Sie das Medium alle 2 Tage.

5. Passieren und Kryokonservieren von Cholangiozyten

1. Waschen Sie die Cholangiozyten zweimal mit PBS und inkubieren Sie die Zellen dann in 0,25% Trypsin bei 37 °C für 5-10 Minuten.
2. Fügen Sie ein gleiches Volumen Cholangiozyten-Nährmedium hinzu, um das Trypsin zu neutralisieren, und zentrifugieren Sie dann 5 Minuten lang bei 500 x g .
3. Bereiten Sie mit Kollagen beschichtete Zellkulturschalen vom Typ I mit Rattenschwanz zu, wie in Schritt 4.1 beschrieben.
4. Führen Sie die Schritte 4.2 und 4.3 aus.
5. Wenn eine Kryokonservierung erforderlich ist, resuspendieren Sie die Cholangiozyten in einem Lagermedium (9:1 FBS: DMSO) und lagern Sie sie in einem -80 °C Gefrierschrank oder flüssigem Stickstoff. Tauen Sie die Zellen nach Bedarf für die zukünftige Verwendung auf.

6. Validierung der Cholangiozyten

HINWEIS: Die Reinheit der Cholangiozyten wurde durch Färbung auf den Cholangiozytenmarker CK19 beurteilt.

1. Waschen Sie die Cholangiozyten 2x mit PBS, fixieren Sie dann die Zellen für 15 min in 4% Paraformaldehyd.
2. Waschen Sie die Cholangiozyten mit PBS und permeabilisieren Sie die Zellen dann 8 Minuten lang mit 1% Triton X-100.
3. Waschen Sie die Cholangiozyten mit PBS und blockieren Sie dann die Zellen 1 h lang in 5% BSA.
4. Waschen Sie die Cholangiozyten mit PBS und inkubieren Sie die Zellen dann mit dem Primärantikörper gegen CK19 (Verdünnung 1:12 mit 2 % BSA) über Nacht bei 4 °C.
5. Waschen Sie die Cholangiozyten 2x mit PBS, dann inkubieren Sie die Zellen mit dem Esels-Anti-Ratten-Sekundärantikörper Alexa Fluor 488 (Verdünnung 1:1.000 mit PBS) für 1 h bei Raumtemperatur.
6. Waschen Sie die Cholangiozyten mit PBS, färben Sie sie 15 Minuten lang mit 4',6-Diamidino-2-phenylindol und betrachten Sie sie unter dem Mikroskop.

Ergebnisse

Das Workflow-Diagramm für den zweistufigen Verdauungsprozess zur Isolierung von Cholangiozyten ist in Abbildung 1 dargestellt. Der gesamte Vorgang dauert ~5 h. Zuerst wird die Leber durch die untere Hohlvene mit Lösung A durchblutet, um Blut zu entfernen, was durch das Blassen der Leber angezeigt wird. Die Leber wird dann mit Lösung B perfundiert, die Kollagenase II enthält, um die Gewebeverdauung zu initiieren. Dieser erste Verdauungsschritt ist zeitkritisch...

Diskussion

Dieses Protokoll bietet eine detaillierte Methode zur Isolierung hochreiner primärer Cholangiozyten aus Mäusen unter Verwendung eines zweistufigen Verdauungsprozesses, der die Untersuchung der molekularen Mechanismen ermöglicht, die Cholangiopathien zugrunde liegen. Mehrere kritische Schritte sind unerlässlich, um die erfolgreiche Isolierung von Cholangiozyten zu gewährleisten.

Der erste kritische Schritt ist die Sicherstellung einer effektiven Durchblutung un...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0,22 μm m filter	PALL	4612
0,25 % Trypsin	Gibco	25200-056
10 mL	Spritze KONSMED	10 mL 1,2*30TWLB
20 mL	Spritze KONSMED	20 mL 1,2*30TWLB
24 G intravenöser Katheter	WEGO	24GX19  mm/Y-G
3,3',5-Trijod-L-thyronin	Sigma	T5516	1,7 mg/mL Vorrat
4% Paraformaldehyd	Solarbio	P1110
5 mL Spritze	KONSMED	5 mL 0,7*30TWLB
6 cm Schalen	Thermo Scientific	150462
70 µ m Zell-Sieb	Corning	352350
Anti-CK19 Antikörper	DSHB	TROMA-III
Anti-EpCAM Antikörper	DSHB	G8.8
BSA	Solarbio	A8020
CaCl2	Sangon Biotech	A501330	2 M Lager
Chemisch definiertes Lipidkonzentrat (100x)	Gibco	11905-031
Collagenase II	Worthington	LS004176
Collagenase XI	Sigma	C7657	3,2 mg/mL Bestand
Dexamethason	Sigma	D1756	10 mg/mL
Bestand Präpariermikroskop	Leica	EZ4
DMEM/F12 (1:1)	VivaCell biosciences	C3130-0500
DMSO	Sigma	D2650
DNase I	Sigma	D4513	10 U/μ L Vorrat
Esel Anti-Ratte Alexa Fluor 488 Sekundärantikörper	Invitrogen	A21208
EGTA	Solarbio	E8050	50 mM (PH = 8) Vorrat
Epidermaler Wachstumsfaktor (1 mg/ml)	Sigma	SRP3196
Ethanolamin	Sigma	E9508
Fötales Rinderserum	VivaCell biosciences	C04001-500
Forskolin	Sigma	F3917	20 mM Lager
Gentamicin/Amphotericin Lösung (500x)	Gibco	R01510
Hämozytometer	QIUJING	XB. K.25.
HEPES	Sigma	H4034
Hyaluronidase	Sigma	H3506	10 mg/ml
Bestand Insulin-Transferrin-Selen (100x)	Gibco	41400045
Isofluran	RWD	R510-22-10
KCl	Sangon Biotech	A100395
L-Glutamin (200 mM)	Sigma	G7513
Magnetabscheider	Promega	Z5342
MEM nicht-essentielle Aminosäuren (100x)	Gibco	11140050
MEM Vitaminlösung (100x)	Gibco	11120052
MgCl2	Sangon Biotech	A100288	1,5 M Bestand
Na Pyruvat  (100 mM)	Gibco	11360070
Na2HPO4	Sangon Biotech	A600487
NaCl	Sangon Biotech	A610476
NaOH	Sangon Biotech	A620617	1 N Aktien
PBS	VivaCell biosciences	C3580-0500
PBS	Solarbio	P1010
Penicillin-Streptomycin (100x)	Gibco	15140-122
Peristaltische Pumpe	BaodingRongbai	YZ1515PPS
Protein G-Kügelchen	Invitrogen	10004D
Rotator	Kylin-Bell	QB-528
RPMI	VivaCell biosciences	C3010-0500
Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor	Sigma	T6522	10 mg/mL Vorrat
Gequetschte Nadel	Jinhuan Medical	HM601
Triton X-100	Solarbio	T8200
Trypanblau	Sigma	T6146	10 mg/ml Vorrat
Typ I Rattenschwanz Kollagen	BD	354236