Das im Folgenden beschriebene Protokoll ist eine einfache und effektive Methode zur Isolierung von Retinoid-haltigen Zellen aus hochgradig heterogenen Lungenzellpopulationen unter Verwendung spezifischer Retinoid-Autofluoreszenz und unter Anwendung einer fluoreszenzaktivierten Zellsortierung.
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Methodenartikel
Isolierung von Lungen-Retinoid-haltigen Zellen durch Zellsortierung
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Retinoide (Vitamin A und seine Metaboliten) sind ein essentieller Lipidbestandteil der alveolären Mikroumgebung, und ein zelltypspezifischer Retinoidstoffwechsel ist erforderlich, um die funktionelle Gesundheit der sich entwickelnden und erwachsenen Lunge zu erhalten. Lungenzellen nutzen spezifische Signalwege, die eine effiziente Aufnahme von zirkulierenden Retinoiden aus dem Blut als Retinol (ROH) ermöglichen, gefolgt von einer intrazellulären schrittweisen Umwandlung von ROH in die transkriptionell aktive Retinoidspezies, die all-trans-Retinsäure (ATRA). Die ATRA-vermittelte (oder Retinoid-vermittelte) Signalgebung ist entscheidend für die Regulierung der Lungenalveolarisierung, der Surfactant-Produktion, der Angiogenese, der Permeabilität und der Immunität. Wichtig ist, dass bestimmte Lungenzellen, einschließlich Fibroblasten, Retinoide in Form von Retinylestern (RE) akkumulieren können, die als ROH gelagert oder weiter mobilisiert werden können, um sie bei Bedarf auf die Nachbarzellen zu übertragen. Lungenretinoid-haltige Zellen können isoliert und aus der Einzelzellsuspension verdauter Lungen entnommen werden, indem Retinoid-Autofluoreszenz (die Emission bei 455 nm bei Anregung bei 350 nm) und fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) verwendet wird. Die zusätzliche zellspezifische in vivo Markierung von Lungenzellen mit rot fluoreszierendem Protein ermöglicht die Isolierung und Sammlung spezifischer Retinoid-haltiger Lungenzellpopulationen. Die gesammelten Zellen können direkt analysiert oder kultiviert werden, um weitere Analysen der Zellmorphologie, der Genexpression und der Reaktionsfähigkeit auf pharmakologische Manipulationen durchzuführen. Diese Technik der Isolierung und Anwendung ist wichtig für Tiermodellstudien zur Lungengesundheit und Lungenschädigung, um einen tieferen Einblick in die zellulären Aspekte des Retinoidstoffwechsels in der Lunge und der lipidvermittelten zellulären Kommunikation zu erhalten.
Einleitung
Retinoide (Vitamin A und seine Metaboliten) sind ein essentieller Lipidbestandteil der alveolären Mikroumgebung, und ein zelltypspezifischer Retinoidstoffwechsel und -signalweg sind erforderlich, um die funktionelle Gesundheit der sich entwickelnden und erwachsenen Lunge zu erhalten 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 <....
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Protokoll
Alle beschriebenen Verfahren und Versuche mit Mäusen wurden mit Genehmigung des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Rutgers University (IACUC ID: PROTO202200111) gemäß den Kriterien des von der National Academy of Sciences erstellten Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Labortieren55 durchgeführt.
1. Überlegungen und Vorbereitungen für den Versuch
- Tierhaltung und Manipulationen
HINWEIS: In den Studien können drei Monate alte (10-12 Wochen alte) männliche und weibliche Mäuse verwendet werden. In den beschriebenen Experimenten....
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Ergebnisse
Isolierung von Retinoid-haltigen Zellen der Lunge
Mauslungen (von Lrat+/+ und Lrat-/-) Mäusen wurden enzymatisch verdaut, und Einzelzellsuspensionen wurden hergestellt und gemäß dem oben beschriebenen Verfahren einer FACS unterzogen. Die Zellsortierung und Datenerfassung wurde auf einem Cytek Aurora™ Zellsortiersystem durchgeführt, das von der SpectroFlo CS-Software Version 1.3.0 mit einer 100-μm-Düse und einem Druck v.......
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Diskussion
Die Fähigkeit des Vitamin-A-Nachweises in menschlichen und tierischen Geweben und dessen histologische Visualisierung mittels Fluoreszenzmikroskopie wurde bereits in den 1940er Jahren erstmals berichtet59,60. Das Phänomen der Retinoid-Autofluoreszenz wurde dann erfolgreich auf Studien angewendet, die darauf abzielten, hohe Konzentrationen von Vitamin A in Geweben in vitro zu lokalisieren 61 und di.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde finanziert durch ein Stipendium der National Institutes of Health/National Heart, Lung, and Blood Institute (NIH/NHLBI) R01 HL171112 (an I.S.), einen Karriereentwicklungspreis (an I.S.) des Rutgers Center for Environmental Exposures & Disease, finanziert von den National Institutes of Health/National Institute of Environmental Health Sciences (NIH/NIEHS) P30 ES005022, und Start-up-Fonds von Rutgers, The State University of New Jersey (an I.S.). Die Autoren danken den Mitarbeitern der Immune Monitoring and Flow Cytometry Shared Resource am Rutgers Cancer Institute (teilweise unterstützt mit Mitteln des NCI-CCSG P30C....
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 10 mL serologische Pipette | Avantor/VWR | 76452-284 | |
| 100 µ m Sieb | Greiner Bio-One | 542000 | |
| 15 mL Falkenröhrchen | Corning | 352099 | |
| 40 µ m Sieb | Greiner Bio-One | 542040 | |
| 50 mL Falcon Tube | Corning | 352070 | |
| Zellkulturschale, 35 mm & 10 mm | Corning | 430165 | |
| Zellsortiermedien | Gibco | A59688DJ | |
| Kollagenase Typ IV | Worthington Biochemical Corporation | LS004188 | |
| Cytek Aurora Zellsortiersystem | Cytek Biosciences | ||
| Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Falcon 5 ml Polypropylen-Rundbodenröhrchen, 12 mm & 75 mm | Corning | 352063 | |
| Falcon 5 ml Polystyrol-Rundbodenröhrchen mit Zellsiebkappe, 12 mm & 75 mm | Corning | 352235 | |
| FlowJo Software | Becton Dickinson | Durchflusszytometrie-Software | |
| HBSS mit Ca2+/Mg2+ | Gibco | 14925-092 | |
| HBSS ohne Ca2+/Mg2+ | Gibco | 14175-095 | |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Einweg-Flaschenaufsatzfilter | ThermoFisher | 595-3320 | |
| Lyse roter Blutkörperchen Puffer | Sigma-Aldrich | R7757 | |
| SpectroFlo CS Software | Cytek Biosciences | Version 1.3.0 | |
| Chirurgisches Design Royaltek Edelstahl Chirurgische Skalpellklingen | Fisher Scientific | 22-079-683 | |
| SYTOX Grüner Farbstoff für tote Zellen | Invitrogen | S34860 | |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T2859 |
Referenzen
- Shmarakov, I. O., et al. Retinoids stored locally in the lung are required to attenuate the severity of acute lung injury in male mice. Nat Commun. 14 (1), 851(2023).
- Bogue, C. W., Jacobs, H. C., Dynia, D. W., Wilson, C. M., Gross, I.
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Nachdrucke und Genehmigungen
