Dieser Artikel enthält ein detailliertes Protokoll der genetischen Transformationsmethode, die durch Agrobacterium tumefaciens vermittelt wird, um transgenes Solanum nigrum herzustellen.
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Methodenartikel
Genetische Transformation vermittelt durch Agrobacterium tumefaciens in Solanum nigrum
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Solanum nigrumist ein verwaister Verwandter der Nachtschattengewächse von Kartoffel und Tomate, und seine frischen Früchte sind eine nahrhafte und köstliche Beere. Die ganze Pflanze von S. nigrum kann als Medizin verwendet werden. Der wilde S. nigrum weist jedoch einige unerwünschte Eigenschaften auf. Glücklicherweise bieten gentechnische Techniken, insbesondere Gen-Editing-Technologien wie CRISPR/Cas9, wertvolle Möglichkeiten, S. nigrum schnell zu verbessern, indem diese Mängel behoben werden. Bei den meisten Pflanzen wird die Pflanzenverbesserung durch Gen-Editing-Technologie durch die durch Agrobacterium tumefaciens vermittelte genetische Transformation erreicht. In diesem Artikel haben wir die genetischen Transformationsprotokolle, die durch A. tumefaciens in S. nigrum vermittelt werden, detailliert beschrieben. Die Keimblätter und Hypokotyle von S. nigrum-Keimlingen wurden als Explantate für die genetische Transformation verwendet. Da S. nigrum resistent gegen Kanamycin ist, wurde das DsRed-Gen als visueller Marker zur Identifizierung transgener Pflanzen verwendet. Die genetische Transformation von S. nigrum kann nach diesen Operationsprotokollen effizient abgeschlossen werden. Der Nachweis von T1-transgenen Pflanzen kann direkt daran identifiziert werden, ob sie rote Fluoreszenz emittieren, ohne dass eine PCR-Identifizierung erforderlich ist.
Einleitung
Solanum nigrum (bekannt als Schwarzer Nachtschatten, 2n = 6x = 72) ist ein Nachtschattenverwandter von Kartoffel und Tomate1. Die Frucht ist eine kugelförmige Beere, die sich nach der Reifung schwarz färbt. Die frische Frucht ist eine nahrhafte und leckere Beere. Die ganze Pflanze von S. nigrum kann als Medizin verwendet werden, mit der Wirkung, Blutstauungen zu zerstreuen, Schwellungen zu reduzieren, Hitze zu beseitigen und zu entgiften. S. nigrum synthetisiert zwei verschiedene Klassen von spezialisierten Metaboliten aus einem gemeinsamen Cholesterinvorläufer: steroidale Saponine in seinen Blättern und steroidale Glykoalkaloide (SGAs) in seinen Beeren. Uttrosid B, ein steroidales Saponin, das aus S. nigrum gewonnen wird, wurde kürzlich von der US-amerikanischen Food and Drug Administration als Orphan Drug zur Behandlung des hepatozellulären Karzinomszugelassen 2. Der Knockout des GAME15-Gens in S. nigrum führte dazu, dass Pflanzen sowohl Saponine als auch steroidale Alkaloide fehlten, und zeigte auch, dass steroidale Saponine schwere landwirtschaftliche Schadschädlinge kontrollieren2. Polyphenole in S. nigrum reduzieren Gewicht und Körperfett, indem sie die Adipozyten und den Fettstoffwechsel beeinflussen3. S. nigrum kann Cadmium anreichern und wird als Modellpflanze für die Untersuchung der Cadmiumanreicherung verwendet 4,5. S. nigrum ist eine nicht domestizierte Pflanze, und ihre Forschungsgrundlage ist relativ schwach. Es ist inspirierend, dass die Forschung an S. nigrum in den letzten Jahren allmählich zugenommen hat. Das Genom des hexaploiden S. nigrum wurde kürzlich zusammengesetzt, und S. nigrum könnte sich aus seinem diploiden Solanum americanum (2n = 2x = 24)6,7 entwickelt haben. Daher ist S. nigrum eine Pflanze, die sowohl einen medizinischen als auch einen essbaren Wert besitzt. Die Forschung an S. nigrum trägt nicht nur zu einem tieferen Verständnis seiner Anwendungsmöglichkeiten bei der Behandlung menschlicher Krankheiten bei, sondern liefert auch wertvolle Einblicke in die Verbesserung der landwirtschaftlichen Produktion. Die Etablierung eines genetischen Transformationssystems in S. nigrum ist also die Grundlage für die genetische Verbesserung durch transgene und Gen-Editing-Technologie.
Es gibt mehrere Berichte, die sich auf die durch Agrobacterium tumefaciens vermittelte genetische Transformation von S. nigrumkonzentrieren 8,9,10,1 1. In unserer früheren Arbeit etablierten wir ein A. tumefaciens LBA4404-vermitteltes genetisches Transformationssystem für S. nigrum und transformierten AcMYB110 in S. nigrum, wodurch wir neue Keimplasmen von S. nigrum mit erhöhtem Anthocyaningehalt erhielten1. Transgene und geneditierte S. nigrum-Pflanzen wurden mit A. tumefaciens EHA105-vermittelter genetischer Transformation erhalten10. Verschiedene fluoreszierende Proteine haben grüne, rote, gelbe, orangefarbene und blaue Fluoreszenzemissionen und werden häufig zur Anzeige zellulärer Lebensaktivitäten verwendet12. Im genetischen Transformationsprozess von Pflanzen werden rot fluoreszierende Gene häufig als Reportergene verwendet, um gentechnisch veränderte Ereignisse von nicht gentechnisch veränderten Ereignissen zu unterscheiden13. Die Verwendung des DsRed-Gens als Reportergen ermöglicht eine bequeme Unterscheidung transgener Ereignisse, während die Verwendung des R2R3-MYB-Transkriptionsfaktors als Reportergen durch den Genotyp der Pflanzen beeinflusst werden kann14. Bei transgenen Nachkommen können transgene Pflanzen auch mit optischen Instrumenten (z. B. Fluoreszenzmikroskopen oder bildgebenden Systemen) leicht von nicht-transgenen Pflanzen unterschieden werden, wodurch eine PCR-basierte Identifizierung überflüssig wird. Durch die Integration des fluoreszierenden Proteinreportergens mit der CRISPR-Gen-Editing-Technologie wurden die Fruchtbarkeitsgene in Mais präzise deletiert, was zur Schaffung einer nuklearen sterilen Linie und einer kontrollierten nuklearen sterilen Erhaltungslinieführte 15. Die Selbstbestäubung und Fruchtbildung von Erhaltungspflanzen führt zu 1:1-Nachkommen von Erhaltungs- und sterilen Linien. Basierend auf unterschiedlichen Lumineszenzeigenschaften kann eine zerstörungsfreie Sortierung von Halter- und Sterilliniensaatgut durch visuelle oder maschinelle Erkennungerreicht werden 15. Die Verwendung des fluoreszierenden Proteingens als Reportergen vereinfacht daher die Identifizierung von transgenem Saatgut oder Pflanzen, ohne dass eine PCR-Analyse erforderlich ist. Dies stellt einen wesentlichen Vorteil im Bereich der genetischen Transformation dar. Diese Methode zielt darauf ab, das Protokoll der Agrobacterium tumefaciens-vermittelten genetischen Transformation in S. nigrum zu beschreiben, wobei das rot fluoreszierende Gen DsRed als Reportergen verwendet wird.
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Protokoll
1. Aseptische Sämlingszucht
HINWEIS: Die folgenden Schritte werden auf einer supersauberen Bank durchgeführt.
- Sammle wilde Samen von S. nigrum in Liaocheng City, China, und nenne sie Snlc1. Nehmen Sie 50 wilde Samen von S. nigrum und geben Sie sie in ein 2-ml-Zentrifugenröhrchen. Nachdem Sie 30 Minuten lang 1 ml 5% Gibberellin eingeweicht haben, verwerfen Sie die Gibberellinlösung.
- Fügen Sie 1 ml 75%iges Ethanol hinzu, schütteln Sie es 1 Minute lang und entsorgen Sie dann das Ethanol.
- Fügen Sie 1 ml 2%ige Natriumhypochloritlösung hinzu und desinfizieren Sie die Oberfläche der Samen 10 Minuten lang. Schütteln Sie das Zentrifugenröhrchen gründlich, um die Samenoberfläche zu sterilisieren. Nach 10 Minuten verwerfen Sie das Natriumhypochlorit.
- Waschen Sie die Samen 5x mit sterilisiertem Wasser, um Reste von Natriumhypochlorit zu entfernen. Legen Sie die Samen in Petrischalen mit einem Durchmesser von 90 mm, die 1/2 MS Festmedium enthalten. Die Platten werden in einer Pflanzenwachstumskammer unter einer Photoperiode von 16 h hell / 8 h dunkel bei 25 °C kultiviert (Abbildung 1A).
2. Kultur von A. tumefaciens LBA4404
- Transformieren Sie den binären Vektor pRed130516 , der mit einem rot fluoreszierenden Gen, DsRed2, beheimatet ist, in A. tumefaciens LBA4404 durch Elektroporation mit MicroPulser mit Parametern: Spannung 1800 V, Kapazität 25 μF, Widerstand 200 Ω, Küvette 1 mm. Kultivieren Sie die Bakterien auf festem LB-Medium mit 50 mg/l Kanamycin und 50 mg/l Rifampicin bei 28 °C für 48 h.
- Entnehmen Sie einen Klon von LBA4404, das pRed1305 enthält, und kultivieren Sie es in 1 ml flüssigem LB-Medium mit 50 mg/l Kanamycin und 50 mg/l Rifampicin in einem 15-ml-Zentrifugenröhrchen in einem Tischkonzentrator mit 180 U/min bei 28 °C für 12 h.
- Geben Sie 50 mL flüssiges LB mit dem gleichen Antibiotikum zu 1 mL Bakterienlösung und kultivieren Sie es dann 6 h lang in einem Tischkonzentrator mit 200 U/min bei 28 °C.
- Beenden Sie die Kultivierung, wenn der OD600 des Bakterienkulturmediums 0,4 beträgt, und zentrifugieren Sie dann die Bakterienlösung bei 2200 x g für 10 min bei 25 °C.
- Resuspendieren Sie die zentrifugierten Bakterien mit Infektionslösung (IS: M519 4,43 g/L, Saccharose 30 g/L, 6-BA 2 mg/L, AS, 100 μmol/L, pH 5,8) und stellen Sie die Konzentration der Bakterienlösung mit einem Spektralphotometer auf OD600= 0,6 ein.
3. Explantatinfektion mit A. tumefaciens
HINWEIS: Die folgenden Schritte werden auf einer supersauberen Bank durchgeführt.
- Züchten Sie die Samen 7 Tage lang, bis sich die Keimblätter des Sämlings entfaltet haben (Abbildung 1B). Schneiden Sie die beiden Keimblätter und das ca. 1 cm lange Hypokotyl mit einem sterilisierten, scharfen Skalpell in einer Kulturschale mit Filterpapier, das mit bakteriellem IS angefeuchtet ist, von den Sämlingen ab und entsorgen Sie die Primärwurzeln. Seien Sie vorsichtig, wenn Sie ein Skalpell verwenden.
- Die Explantate 30 min in der Infektionslösung ziehen lassen. Legen Sie die Explantate auf trockenes Filterpapier, damit die Bakterienlösung auf der Oberfläche des Explantats aufgenommen werden kann.
- Legen Sie die Explantate in IS-Festmedium (0,7 % Agar; Abbildung 1C). Legen Sie die Explantate in eine Pflanzenwachstumskammer ohne Licht bei 19 °C und kultivieren Sie sie 3 Tage lang.
4. Unterscheidung der Explantate
HINWEIS: Die folgenden Schritte werden auf einer supersauberen Bank durchgeführt.
- Nehmen Sie die Explantate bei 19 °C aus der Wachstumskammer der Pflanze. Waschen Sie die Explantate 5x mit sterilisiertem Wasser und legen Sie die Explantate auf trockenes, sterilisiertes Filterpapier.
- Die Explantate in ein Sprossdifferenzierungsmedium (SD: M519 4,43 g/L, Saccharose 30 g/L, 6-BA 2 mg/L, ZT 0,5 mg/L, Cef 100 mg/L, Carb 100 mg/L, 0,7 g/L Agar, pH 5,8) geben und 4 Wochen lang bei 25 °C kultivieren (Abbildung 1D,E).
- Schneiden Sie den Kallus/die Knospen von Explantaten mit roter Fluoreszenz unter dem grünen Anregungslicht einer Handleuchtstofflampe mit einem Skalpell ab, übertragen Sie sie dann auf ein neues SD-Medium und kultivieren Sie sie 4 Wochen lang bei 25 °C (Abbildung 1F,G).
5. Bewurzelung und Umtopfen
- Schneiden Sie die rot fluoreszierenden Knospen mit einer Leuchtstofflampe ab, geben Sie sie in das Bewurzelungsmedium (RM: M519 4,43 g/L, Saccharose 30 g/L, 6-BA 2 mg/L, ZT 0,5 mg/L, Cef 100 mg/L, Carb 100 mg/L, 0,7 g/L Agar, pH 5,8) und kultivieren Sie sie 2-4 Wochen lang bei 25 °C, um die Wurzelproduktion zu fördern.
- Verpflanzen Sie die Sämlinge mit roter Fluoreszenz und einer Wurzellänge von mehr als 2 cm in den Boden (Abbildung 1H-K). Entfernen Sie vor der Transplantation den Agar von Hand von den Wurzeln, um ein übermäßiges Wachstum von Bakterien in den Wurzeln zu vermeiden.
6. Testen von gentechnisch veränderten T0-Pflanzen mit PCR-Amplifikation
- Extraktion der genomischen DNA einer unabhängigen transgenen Linie unter Verwendung der Cetyltrimethylammoniumbromid-Methode (CTAB)17.
- Amplifizieren Sie das DsRed-Gen mit dem Primer-Set RedF (5'-TGGCCTCCTCCGAGAAC-3') und RedR (5'-CGGAGGGGAAGTTCACG-3') unter Verwendung von 10 ng genomischer DNA als Template in einem 15-μl-Reaktionsvolumen, das 7,5 μl 2x PCR-Mastermix und 0,3 μl jedes Primers (10 μmol/l) enthält. Das erwartete DNA-Fragment betrug 393 bp. Die PCR-Produkte werden einer 1%igen Agarose-Gelelektrophorese unterzogen, um festzustellen, ob es sich um transgene Pflanzen handelt.
7. Identifizierung von transgenen Pflanzen der T1-Generation mit einer Leuchtstofflampe
- Ernten Sie die Früchte von T0-transgenen Pflanzen von S. nigrum , die sich vollständig schwarz-violett verfärbt haben, und drücken Sie dann die Kerne in den Früchten von Hand aus. Trocknen Sie die Samen auf natürliche Weise bei Raumtemperatur für ca. 1 Woche an der Luft.
- Kultivieren Sie die getrockneten Samen in 1/2 MS-Medium gemäß den Schritten 1.1 bis 1.4 dieses Protokolls und stellen Sie sie für 1 Woche in eine Pflanzenwachstumskammer. Unterscheiden Sie transgene Sämlinge und nicht-transgene Sämlinge mit einer tragbaren Leuchtstofflampe.
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Ergebnisse
Genetische Transformation durch Agrobacterium tumefaciens zur Herstellung von transgenem S. nigrum.
Nach der Infektion der Keimblätter und Hypokotyle von S. nigrum-Sämlingen mit A. tumefaciens konnten wir feststellen, ob die Agrobacterium-Infektion erfolgreich war, da DsRed als Reportergen verwendet wurde. Rote Fluoreszenz trat nach der Infektion 3-...
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Diskussion
Bisher wurden genetische Transformationsmethoden für S. nigrum, vermittelt durch A. tumefaciens, in verschiedenen Laboratorien etabliert 8,9,10,11. Die meisten dieser Transformationsmethoden verwenden Kanamycin als Selektionssubstanz 8,9,10,11.
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde vom Forschungsfonds der Universität Liaocheng (318012028) und der Naturwissenschaftlichen Stiftung der Provinz Shandong (ZR2020MC034) unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 2X SanTaq PCR Master Mix (mit blauem Farbstoff) | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | B532061 | Der 2X SanTaq PCR Mix enthält MgCl?, dNTPs, Taq-DNA-Polymerase, PCR-Puffer, Ladefarbstoff und PCR-Enhancer. |
| 6-BA | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | C14819266 | Künstliche Cytokinine |
| Agar | Tianjin Damao Chemical Reagent Partnership Enterprise (Kommanditgesellschaft) | CAS-Nr.: 9002-18-0 | Feststoffe |
| AS | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | K914BA0002 | Induktion einer effizienten Expression von Agrobacterium |
| Carb | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | Verifizierter | |
| - Cef | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | I526BA0010 | Antibiotikum |
| Gibberellin | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | K514BA0009 | Fördert die Keimung von Samen |
| Kanamycin | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | I614BA0013 | Antibiotikum |
| LB Medium | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | B540113 | Züchten Sie die Bakterien |
| MicroPulser ( Gene Pulser Xcell) | Bio-Rad, US | 617BR1 06783 | Gene Pulser Xcell |
| MS Festmedium | Phytotech Co., Ltd., USA | HCA0519228A | Murashige & Skoog Basalmedium mit Vitaminen, M519 |
| Kunststoffbox | LiaoSu, China | T909H | Pflanze Pflanzkasten |
| Rifampicin | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | S180305 | Antibiotikum |
| Saccharose | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | CAS-NR.: 57-50-1 | Als Kohlenstoffquelle |
| Tanon-5200Multi Maschine | Tanon Co., Ltd., China | 5200Multi | Beschleunigte Trennung |
| von wildem Solanum nigrum | gesammelt in Liaocheng | ||
| City ZT | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | J921BA0014 | Regulatoren für das Pflanzenwachstum |
Referenzen
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Nachdrucke und Genehmigungen
