Aufbereitung von intaktem Gewebe für die mikroskopische Analyse der Endosperm-Zellschicht in sich entwickelnden und reifen Arabidopsis-Samen

Da Pflanzen sessile Organismen sind, ist die Keimung von Samen ein entscheidendes Ereignis, das über ihr Schicksal entscheidet. Die Entscheidung für die Keimung wird sowohl von internen als auch von Umweltfaktoren streng reguliert, wie z. B. der Ruhephase des primären Samens, der Temperatur, der Lichtintensität und -wellenlänge sowie der Stickstoffkonzentration 1,2,3,4,5,6. Samen haben komplexe Strukturen, die aus mehreren Gewebetypen bestehen⁷. Bei den trockenen Samen von Arabidopsis ist der Embryo, der sich zu einem Keimling entwickelt, von einer einzigen Schicht Endosperm und der äußersten Schicht, der Testa, umgeben. Die Testa besteht aus mehreren Schichten abgestorbener Zellen, während der Embryo und das Endosperm auch in trockenen Samen am Leben bleiben. Das Endosperm wird allgemein als Speichergewebe angesehen, das Nährstoffe für das Wachstum des Embryos liefert und zusammen mit der Testa eine mechanische Beständigkeit gegen den Radialvorsprung verleiht 8,9,10,11,12,13.

Mehrere neuere Studien haben gezeigt, dass das Endosperm eine wesentliche Rolle bei der Regulierung einer optimalen Samenkeimung spielt 14,15,16,17. Zum Beispiel erkennt der Photorezeptor Phytochrom B (PHYB) in Endospermzellen entweder rotes (R) oder dunkelrotes (FR) Licht und reguliert so die Keimreaktionen¹⁵. Das Endosperm fungiert auch als temperaturempfindliches Gewebe und unterdrückt die Keimreaktion bei hohen Temperaturen¹⁶. Die Qualitätskontrolle des Endosperms ist entscheidend für eine optimale Keimung der Samen, insbesondere bei langfristig gelagerten Samen¹⁷.

Die Bildgebung lebender Zellen ist nun notwendig, um die physiologischen Funktionen des Endosperms weiter aufzuklären. Die mikroskopische Analyse intakter Endospermzellen, die fluoreszenzmarkierte Proteine exprimieren, ermöglicht die Untersuchung der molekularen Mechanismen, durch die das Endosperm die Samenkeimung reguliert. Die Vorbereitung intakter Endospermzellen für die mikroskopische Betrachtung ist jedoch eine Herausforderung, insbesondere bei Arabidopsis-Samen . Die Samen haben einen Durchmesser von etwa 0,4 mm, und das Endosperm ist eine einzellige Schicht, die sich zwischen dem Embryo und der Testa befindet, was eine präzise Manipulation erschwert. Folglich wurde das Endosperm trotz seiner wichtigen physiologischen Rolle nur selten mit Hilfe von Lebendzell-Bildgebung beobachtet.

In diesem Artikel wird ein Protokoll für die schnelle Präparation von intakten Endosperm-Zellschichtproben vorgestellt, die für die Bildgebung lebender Zellen sowohl in sich entwickelnden als auch in reifen Samen geeignet sind.

In dieser Studie wurden zwei verschiedene Verfahren für die Präparation von lebenden Endosperm-Zellschichtproben etabliert: eines für die Entwicklung von Seeds und eines für reife Samen. Je nach Festigkeit des Testas sind leicht unterschiedliche Ansätze erforderlich. Die Einzelheiten zu den verwendeten Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Aufbereitung von intakten Endospermproben aus sich entwickelnden Samen

1. Sammlung von Siliques
   1. Ziehen Sie Arabidopsis-Pflanzen bis zur Blüte auf Erde oder Steinwolle an.
   2. Vollständig geöffnete Blüten mit farbigen Fäden markieren (0 Tage nach der Blüte, 0 DAF).
      HINWEIS: Vermeiden Sie die Verwendung von grünen, gelben oder braunen Fäden zum Markieren von Blumen, da diese Farben schwer von wachsenden oder reifen Pflanzen und Siliques zu unterscheiden sind.
   3. Schneiden Sie die markierten sich entwickelnden Siliquen am Stiel ab (siehe Abbildung 1(1)) und sammeln Sie sie in 1,5-ml-Röhrchen.
      HINWEIS: Die Entwicklung von Siliques von 12-16 DAF ist für die Zubereitung mit diesem Protokoll geeignet.
2. Zerlegung von sich entwickelnden Samen
   HINWEIS: Die folgenden Schritte müssen auf nassem Filterpapier durchgeführt werden, um die Proben vor dem Austrocknen zu schützen. Manipulationen sollten unter einem Stereomikroskop durchgeführt werden.
   1. Trennen Sie ein Ventil (siehe Abbildung 1(2)) von der Feder (siehe Abbildung 1(1)) mit zwei Pinzetten: eine mit dicken Spitzen zum Halten und die andere mit scharfen Spitzen zum Reißen).
   2. Nehmen Sie die sich entwickelnden Samen vorsichtig mit einer Pinzette und geschlossenen Spitzen von den Siliquen auf, um eine Beschädigung der Samen zu vermeiden (Abbildung 1(2)).
   3. Halten Sie den Samen mit einer Pinzette, ohne den Samen zu zerstoßen, und machen Sie mit einer Injektionsnadel eine etwa 0,2 mm große Narbe auf der Hode und dem Endosperm, die den Embryo umgibt (27 G, 0,40 mm × 19 mm) (Abbildung 1(3)).
      HINWEIS: Die optimale Stelle für die Narbe befindet sich an der Verbindungsstelle zwischen Keimblättern und Keimwurzel.
   4. Schieben Sie den Embryo heraus, indem Sie den Samen mit einer Zange einklemmen (Abbildung 1(4)). Zerdrücken Sie die leere Samenhülle, die aus Testa und Endosperm besteht, nicht und versuchen Sie, ihre runde Form beizubehalten.
   5. Führen Sie die Injektionsnadel in die leere Samenhülle an der Narbe ein und stechen Sie sie von innen nach außen ein (Abbildung 1(5)).
   6. Halten Sie die Nadel in Position, kratzen Sie mit geschlossenen Spitzen mit einer Pinzette auf die Oberfläche des Hodens und schneiden Sie eine Seite der leeren Samenhülle ab, damit sie sich öffnen kann (Abbildung 1(6)).
   7. Öffnen Sie die leere Samenhülle mit einer Pinzette mit scharfen Spitzen in ein Blatt (Abbildung 1(7)). Die Probe sollte nun als Doppelschicht, bestehend aus der Endosperm- und der Hodenschicht, isoliert werden (Abbildung 1(8)).
      HINWEIS: Wenn die Probe dazu neigt, sich zusammenzurollen, wenn Wasser als Einbettmedium in Schritt 3 verwendet wird, teilen Sie die blattförmige Probe in zwei Stücke. Samen, die von Siliken bei etwa 18 DAF geerntet wurden (zu diesem Zeitpunkt ist die Testa braun, aber noch nicht vollständig trocken), können ebenfalls nach diesem Protokoll verarbeitet werden, obwohl die Samen vor der Zubereitung einige Minuten lang getrunken werden müssen.

2. Aufbereitung von intakten Endospermproben aus reifen Samen

1. Imbibition von reifem Saatgut
   1. Geben Sie 1 ml doppelt destilliertes Wasser in ein 1,5-ml-Röhrchen mit trockenen Arabidopsis-Samen .
   2. Bewahren Sie die Samen mindestens 40 Minuten lang bei Raumtemperatur auf (Abbildung 2(1)).
      HINWEIS: Bei trockenen Samen und Samen, die innerhalb von 40 Minuten nach der Imbibition liegen, ist es schwierig, an der Testa und dem Endosperm zu vernarben und den Embryo aus dem Inneren des Samens zu entfernen, ohne die leere Samenhülle in den Schritten 2.2.1 und 2.2.2 zu beschädigen, während eine längere Imbibitionszeit die Manipulation erleichtert.
   3. Verwenden Sie eine 1000-μl-Mikropipette, um die aufgenommenen Samen auf nasses Filterpapier zu übertragen.
2. Zerlegung von reifem Saatgut
   HINWEIS: Die folgenden Schritte müssen auf nassem Filterpapier durchgeführt werden, um die Proben vor dem Austrocknen zu schützen. Manipulationen sollten unter einem Stereomikroskop durchgeführt werden.
   1. Halten Sie den Samen mit einer Pinzette, ohne den Samen zu zerstoßen, und machen Sie mit einer Injektionsnadel eine etwa 0,2 mm große Narbe auf der Hode und dem Endosperm, die den Embryo umgeben (Abbildung 2(2)).
   2. Schieben Sie den Embryo heraus, indem Sie den Samen mit einer Zange einklemmen (Abbildung 2(3)). Zerdrücken Sie nicht die leere Samenhülle, die die Testa und das Endosperm enthält. Versuchen Sie, die runde Form beizubehalten.
   3. Schneiden Sie die Ober- und Unterseite der leeren Saatguthülle mit einer Injektionsnadel zu einem Zylinder ab (Abbildung 2(4)).
   4. Schneiden Sie die zylindrische leere Saatguthülle entlang ihrer Mittelachse in zwei Stücke (Abbildung 2(5)). Die Proben sollten als Doppelschichten, bestehend aus der Endospermschicht und der Testaschicht, isoliert werden (Abbildung 2(6)).

3. Mikroskopische Betrachtung

1. Legen Sie die Endospermproben in Blattform auf einen Objektträger und montieren Sie sie in Wasser oder Perfluordecalin (PFD).
   HINWEIS: Wenn Luftblasen zwischen der Probe und dem Deckglas verbleiben, wäre Perfluordecalin (PFD), das sich als besonders nützlich für die Abbildung von Proben mit Lufteinschlüssen wie Blättern^{18, 19} erwiesen hat, nützlich. PFD ist dafür bekannt, die niedrigste Oberflächenspannung zu haben, so dass es die Lufträume auf der Probenoberfläche leicht füllen kann. Für die Zeitraffer-Bildgebung wird jedoch die Verwendung von Wasser als Eindeckmedium empfohlen, da der Wassergehalt in reifen Samen reichlich vorhanden sein sollte, um die zelluläre Liquidität zu erhalten.
2. Legen Sie vorsichtig ein Deckglas über die Probe. Stellen Sie sicher, dass die Endospermschicht dem Deckglas zugewandt ist.
   HINWEIS: Nagellack oder Fett können verwendet werden, um die Ränder des Deckglases zu versiegeln, um ein Austrocknen der Probe und des Einbettmediums zu verhindern.

Unter Verwendung des in Abbildung 1 gezeigten Protokolls wurden Endospermproben aus sich entwickelnden Samen hergestellt, die bei 14 DAF aus Siliquen geerntet wurden (zu diesem Zeitpunkt ist die Testa noch grün). Es wurden zahlreiche großflächige Endospermzellen und ihre intrazellulären Strukturen beobachtet (Abbildung 3A). In diesem Experiment wurden Seeds verwendet, die PHYB exprimieren und mit GFP am C-Terminus (PHYB-GFP) fusionieren. Es ist allgemein bekannt, dass PHYB bei Aktivierung durch rotes Licht in den Zellkern transloziert und PHYB-positive Speckles bildet, die als Photobodies (PBs) bekannt sind und an der Samenkeimung beteiligt sind 4,20,21,22. Die Proben wurden von Pflanzen geerntet, die unter kontinuierlichen weißen Lichtbedingungen bei 22 °C angebaut wurden. Wie in Abbildung 3B gezeigt, wurden PBs im Zellkern in Endospermzellen nachgewiesen. Dieses Ergebnis entspricht einer früheren Studie, die zeigte, dass PHYB im Endosperm die optimale Samenkeimung reguliert15. Zusätzlich wurde eine Zeitrafferbildgebung von lebenden Zellen durchgeführt, um zu bestätigen, dass die isolierten Endospermzellen auch nach der Probenvorbereitung ihre biologische Aktivität beibehielten, indem die Photoreversibilität von Phytochrom FR/R beobachtet wurde (Abbildung 3C). Endospermproben wurden aus Entwicklungssamen hergestellt, die bei etwa 17-18 DAF aus Siliquen geerntet wurden. PBs wurden bei der Dissektion im Zellkern nachgewiesen, während sie nach Bestrahlung mit dunkelrotem Licht vollständig verschwanden. In der Folge induzierte die Rotlichtbestrahlung erneut PBs. Diese Photoreversibilität des Phytochroms wurde zweimal nachgewiesen, was darauf hindeutet, dass die nach diesem Protokoll isolierten Endospermzellen ihre biologische Aktivität für mindestens 4,5 Stunden nach der Dissektion beibehielten (Abbildung 3C).

Als nächstes wurden Endospermproben von reifen Samen (bei denen die Testa braun ist) vorbereitet, wie in Abbildung 2 gezeigt. In diesem Experiment wurde die Motilität der Mitochondrien anhand von Samen beobachtet, die mitochondrial-targeted GFP (mtGFP)23 exprimieren und nach der Ernte etwa ein Jahr lang in einem Exsikkator bei Raumtemperatur im Dunkeln gelagert worden waren. Es wurde berichtet, dass sich die Mitochondrien im Embryo aktiv bewegen und die Morphologie nach der Aufnahme und dem Übergang zu den Keimbedingungen dynamisch verändern24. Es wurde eine fluoreszierende Zeitrafferbildgebung von Mitochondrien in intakten Endospermzellen nach 3 Stunden Samenaufnahme durchgeführt und die mitochondriale Bewegung nachgewiesen (Ergänzender Film 1). Die Mitochondrien im Endosperm bewegten sich unmittelbar innerhalb des Zytosols nach einer kurzen Periode der Imbibition bei 22 °C. Nach 1 Tag Samenaufnahme bei 22 °C wurden dynamischere Mitochondrien beobachtet (Abbildung 4 und ergänzender Film 2).

Abbildung 1: Vorbereitung der Endosperm-Probe aus sich entwickelnden Samen. Schritt 1: Ein Ventil wird von der Replum getrennt. Schritt 2: Die sich entwickelnden Samen werden gesammelt. Schritt 3: Mit einer Injektionsnadel wird eine Narbe auf der Hode und dem Endosperm erzeugt. Schritt 4: Der Embryo wird entnommen, indem der Samen mit einer Pinzette eingeklemmt wird. Schritt 5: Die Injektionsnadel wird von innen nach außen durch die leere Saatguthülle eingeführt. Schritt 6: Die Oberfläche der Testa wird mit einer Pinzette zerkratzt. Schritt 7: Der leere Samenumschlag wird mit einer Pinzette in Bogenform geöffnet. Schritt 8: Die endgültige Probe des Endospermblattes wird für die mikroskopische Betrachtung vorbereitet. Alle Arbeitsschritte werden auf nassem Filterpapier unter einem Stereomikroskop durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Vorbereitung der Endosperm-Probe aus reifen Samen. Schritt 1: Trockene Samen werden mehr als 40 Minuten lang in einem 1,5-ml-Röhrchen in Wasser getränkt. Schritt 2: Mit einer Injektionsnadel wird eine Narbe auf der Hode und dem Endosperm erzeugt. Schritt 3: Der Embryo wird entnommen, indem der Samen mit einer Pinzette eingeklemmt wird. Schritt 4: Die Ober- und Unterseite der leeren Saatguthülle werden zu einem Zylinder geschnitten. Schritt 5: Die zylindrisch geformte leere Saatguthülle wird entlang ihrer Mittelachse geschnitten. Schritt 6: Die endgültige Probe des Endospermblatts wird für die mikroskopische Betrachtung vorbereitet. Alle Arbeitsschritte werden auf nassem Filterpapier unter einem Stereomikroskop durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Fluoreszierende Bildgebung einer intakten Endosperm-Zellschicht unter Verwendung von sich entwickelnden Samen. Intakte Endosperm-Zellschichtproben wurden aus sich entwickelnden Samen von 14-Tage-nach-Blüte (DAF) Siliques (A, B) und 17-18 DAF-Siliques (C) hergestellt. Die mikroskopische Bildgebung wurde mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop durchgeführt, das mit einer Öl-Immersionsobjektiv Plan-Apochromat 63× und einem Weißlichtlaser ausgestattet war. (A) Ein konfokales Bild des Endosperms unter differentiellem Interferenzkontrast (DIC) zeigt große Flächen mit zahlreichen intakten Endospermzellen. Maßstabsbalken: 20 μm. (B) Es werden konfokale Bilder des Endosperms gezeigt, das PHYB-GFP exprimiert, mit PHYB-GFP in grün und Chlorophyll-Autofluoreszenz in Cyan. Photokörper (PBs) in einem Zellkern sind durch weiße Pfeilspitzen gekennzeichnet. Maßstab: 10 μm; Vergrößerter Bildmaßstab: 2,5 μm. Das GFP-Signal wurde mittels Fluoreszenz-Lebensdauermikroskopie (FLIM) von der Autofluoreszenz der Proteinspeichervakuolen (PSVs) getrennt. Die Fluoreszenzlebensdauer wurde mit TauScan ermittelt und mit der TauSeparation-Funktion getrennt. Die durchschnittliche Fluoreszenzlebensdauer für GFP betrug 2,2 ns. Die GFP-Fluoreszenz wurde bei 488 nm angeregt und zwischen 500 und 530 nm gesammelt, während die Chlorophyll-Autofluoreszenz bei 405 nm angeregt und zwischen 688 und 729 nm gesammelt wurde. (C) Konfokale Bilder des Endosperms, das PHYB-GFP exprimiert, unter kontinuierlichem weißem Licht (cWL), kontinuierlichem fernrotem Licht (cFR) oder kontinuierlichem rotem Licht (cR) werden präsentiert. PHYB-GFP ist in Grün dargestellt, und PSV-Autofluoreszenz ist in Magenta dargestellt. Maßstab: 10 μm; Vergrößerter Bildmaßstab: 2,5 μm. Lichtintensitäten: WL, 46,5 μmol/m2/s; FR, 35,2 μmol/m2/s; R, 18,6 μmol/m2/s. Die PSV-Autofluoreszenz wurde bei 561 nm angeregt und zwischen 565-621 nm gesammelt. Das GFP-Signal wurde mit der gleichen Methode wie oben beschrieben getrennt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Fluoreszierende Lebendzellbildgebung einer intakten Endosperm-Zellschicht unter Verwendung reifer Samen. Die mikroskopische Bildgebung wurde mit der gleichen Methode durchgeführt, die in Abbildung 3 beschrieben ist. (A) Es wird ein konfokales Bild der gesamten intakten Endospermzellschicht gezeigt, das aus dem ergänzenden Film 2 entnommen wurde. Mitochondrien sind grün markiert und PSV-Autofluoreszenz ist magenta markiert. Maßstabsbalken: 10 μm. (B) Eine Zeitrafferserie von vergrößerten Bildern aus dem gestrichelten quadratischen Bereich in Feld (A) zeigt die Bewegung eines Mitochondriums, angezeigt durch weiße Pfeilspitzen. Maßstabsleiste: 5 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzender Film 1: Es wird ein Zeitraffervideo von mtGFP in der Endospermzellschicht eines reifen Samens 3 h nach der Imbibition gezeigt. Alle 10 s wurde ein Bild aufgenommen, und die Bildrate des Videos beträgt 10 Bilder/s. Maßstab: 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzender Film 2: Es wird ein Zeitraffervideo von mtGFP in der Endosperm-Zellschicht eines reifen Samens 1 Tag nach der Imbibition gezeigt. Alle 10 s wurde ein Bild aufgenommen, und die Bildrate des Videos beträgt 10 Bilder/s. Maßstab: 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

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