Es wird eine neue Technik zur großflächigen Verabreichung von Adeno-assoziierten Viren beschrieben, die eine Subarachnoidalvirus-Infusion verwendet. Diese Methode gewährleistet nicht nur eine weit verbreitete Transduktion von neokortikalen Neuronen der Maus in oberflächlichen Schichten, sondern führt auch zu einer selektiven Expression des Transgens in pyramidalen Neuronen der fünften Schicht, selbst wenn ein nicht-selektiver Promotor verwendet wird.
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Methodenartikel
Weit verbreitete Transduktion neokortikaler Neuronen der Maus durch Subarachnoidal-Injektion von AAV2
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Rekombinante Adeno-assoziierte Viren sind ein flexibles und leistungsfähiges Werkzeug für die Verabreichung und Expression verschiedener Gene, die in vielen Bereichen der experimentellen Biologie, insbesondere in den Neurowissenschaften, von Interesse sind. Die beliebteste Methode, um die Expression eines gewünschten Transgens in einem bestimmten Gehirnbereich zu steuern, besteht darin, einen AAV-Vektor direkt in das Hirnparenchym zu injizieren. Diese Methode erlaubt jedoch keine großflächige neuronale Transduktion, die für einige in vivo-Experimente erforderlich ist. In diesem Artikel stellen wir eine neue Technik für die weit verbreitete Genexpression im Neokortex der Maus vor, die auf einer viralen Infusion in den Subarachnoidalraum des Gehirns basiert. Diese neuronale Markierungsmethode gewährleistet nicht nur eine weit verbreitete Transduktion von Neuronen in oberflächlichen neokortikalen Schichten adulter Mäuse, sondern führt auch zur Expression des Transgens in einer großen Population von pyramidalen Neuronen der fünften Schicht mit hoher Spezifität, selbst wenn ein starker nicht-selektiver Promotor wie CAG verwendet wird. Da die Zelltransduktion in erheblicher Entfernung von der Injektionsstelle stattfindet, kann diese Methode außerdem dazu beitragen, Hirngewebe für spätere optische oder elektrophysiologische Aufzeichnungen der neuronalen Aktivität zu erhalten.
Einleitung
Das Säugetiergehirn besteht aus vielen hemmenden, exzitatorischen und modulatorischen Zellen, die durch Billionen von Synapsen zu Schaltkreisen miteinander verbunden sind1. Eine der zentralen Herausforderungen der Neurowissenschaften besteht darin, die Rolle unterschiedlicher Zelltypen bei der Organisation und Funktion von Schaltkreisen und Verhalten im Gehirn zu entschlüsseln. Die Manipulation genetisch definierter Zellen im Gehirn erfordert Methoden zur Einführung und Expression von Transgenen. Virale Gentransfersysteme sind bei weitem die effektivste und einfachste Methode für die Genübertragung in das zentr....
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Protokoll
Die Experimente wurden an adulten C57Black/6 Mäusen im Alter von 2-4 Monaten beiderlei Geschlechts durchgeführt (Puschtschino-Zuchtzentrum, Abteilung des Shemyakin-Ovchinnikov-Instituts für Bioorganische Chemie der RAS). Die Mäuse wurden in einem temperierten Vivarium (22 °C ± 2 °C, 12 h Hell-Dunkel-Zyklus, Licht an um 08.00 Uhr) mit Futter und Wasser ad libitum untergebracht. Alle Versuchsverfahren wurden in Übereinstimmung mit den ARRIVE-Richtlinien und der Richtlinie 2010/63/EU für Tierversuche durchgeführt. Das Studienprotokoll wurde von der Ethikkommission der IHNA RAS genehmigt (Protokoll N1 vom 01.02.2022). Es wurden a....
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Ergebnisse
In einer Pilotreihe von Experimenten verwendeten wir die traditionelle intrakortikale Injektionsmethode, um Pyramidenneuronen der fünften Schicht im Neokortex der Maus durch AAV2 zu transduzieren, das das schnelle Channelrhodopsin (oChIEF)- Gen trug, das mit dem fluoreszierenden EGFP-Protein unter dem CaMKII-Promotor fusioniert war. In Übereinstimmung mit dem charakteristischen Merkmal von AAV212 erhielten wir eine relativ kleine Infektionsfläche von nicht mehr als 1 mm Breite (
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Diskussion
Wir haben eine neue Methode zur Transduzierung neokortikaler Neuronen der Maus entwickelt, indem wir eine Suspension von AAV2-Viruspartikeln in den Subarachnoidalraum des Gehirns injizieren. Dies sorgt für eine weit verbreitete Virusverteilung, die fast viermal größer ist als das infizierte Gewebevolumen, wenn die gleiche Virusmenge direkt in das Hirnparenchym injiziert wird.
Die Injektion von Virusvektoren direkt in die Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) über ver.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.
Danksagungen
Die Arbeit wurde mit finanzieller Unterstützung der Russischen Wissenschaftsstiftung, Zuschuss 20-15-00398P, durchgeführt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Ausrüstung | |||
| 10 & Mikro; L Gasdichte Spritze Modell 1701 RN (5 μl 75 RN Hamilton Mikrospritze) | Hamilton Unternehmen | Teil/REF # 7634-01, Hamilton oder Kat.-Nr. HAM7634-01, Merck | |
| 33 G RN-Nadel, Spitze Typ 3 | Hamilton Unternehmen | Teil/REF # 7803-05, Hamilton | |
| Binokulares Mikroskop | Nikon oder Micromed | Modell MC-4 ZOOM | |
| Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop auf Cerna-Basis | ThorLabs (Englisch) | ||
| Kaltlichtquelle | RWD | Modell 76312 | |
| Leica VT1000 S Mikrotom mit vibrierender Klinge | Leica Biosystems | 76001-014 | |
| Low-Flow-Anästhesiesystem mit Starterkit | Kent Scientific Corporation | 13-005-111 (Modell SomnoSuite) | |
| Mechanische Pipette 0,1 – 2,5 & Mikro; L Eppendorf Research plus | Eppendorf | 3123000012 | |
| Mechanische Pipette 10 – 100 &Mikro; L Eppendorf Research plus | Eppendorf | 3123000047 | |
| Mäuse-Rasierer | RWD | Modell CP-5200 | |
| Mikrobohrer mit Bohrern (0,5 mm, rund) | RWD | 78001, 78040 | |
| oder Desctop Digitales Stereotaktisches Instrument, Maus-Anästhesiemaske, Maus-Ohrbügel (60 Grad) | RWD | Modelle 68027, 68665, 68306 | |
| Luftkompressor | Bambi | BB8 | |
| Manuelle Einkanalpipette 0,5-10 &Mikro; L | RAINN | 17008649 | |
| Stereotaktisches Instrument für Kleintiere | KOPF | Modell 962 | |
| Stereotaktischer Injektor | Stoelting | 10-000-004 | |
| Chirurgische Instrumente (Werkzeuge) | |||
| 30 G Zahnnadel (Ni-pro) | Biodent Co. Ltd. | Um die Dura aufzuschlitzen | |
| Knochenschaber | Werkzeuge für die Feinwissenschaft | 10075-16 | |
| Zange für Knochen | Werkzeuge für die Feinwissenschaft | 16025-14 | Um den Schädelknochen zu entfernen |
| Gebogene Spatel | Fabrik für medizinische Versorgung in Moshaisk | Um das Gehirn aus dem Schädelgewölbe zu entfernen | |
| Zahnfräser | DRENDEL + ZWEILING | Für die Kraniotomie; Form: birnenförmig / runder Endzylinder / rund; Durchmesser der Spitze: 0,55-0,8 mm Durchmesser | |
| Nadelhalter (Halsey Micro Needle Holder) | Werkzeuge für die Feinwissenschaft | 12500-12 | |
| Chirurgisches Nahtmaterial aus Polypropylen oder chirurgisches Nahtmaterial Vicryl (5-0, resorbierbar) | Walter Produkte (Ethicon) | S139044 (W9442) | |
| Skalpellgriff (#3) mit Skalpellklingen (#11) | Werkzeuge für die Feinwissenschaft | 10003-12, 10011-00 | |
| Schere (extra schmale Schere) | Werkzeuge für die Feinwissenschaft | 14088-10 | die Haut schneiden |
| Schere (Feinschere) | Werkzeuge für die Feinwissenschaft | 14094-11 | Naht schneiden |
| Chirurgisches Nahtmaterial PROLENE (Polyproptlene) | Ethicon (Johnson & Johnson) | ||
| Pinzette (Pinzette #5) | Werkzeuge für die Feinwissenschaft | 11252-20 | |
| Pinzette (polierte Inox-Pinzette) | Werkzeuge für die Feinwissenschaft | 11210-20 | |
| Einwegartikel | |||
| 1 ml Insulinspritze | SITEKMED | Zum Laden von Vaselineöl in eine Mikrospritze, zur Verabreichung von Medikamenten | |
| Zellkulturplatte | SPL Biowissenschaften | ||
| Wattestäbchen | |||
| Cover-Gläser | Fisher Scientific | 12-545E | |
| Insulin-Spritzennadel (27 G) | SITEKMED | Um Trümmer aus einem Loch zu entfernen (Kraniotomie) | |
| Fusselfreie Tücher CLEANWIPER | NetLink (Englisch) | ||
| Objektträger | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Papierhandtücher | Luscan | ||
| Parafilm | StatLab | STLPM996 | |
| Sterile OP-Handschuhe | Dermagrip | ||
| Steriler Spritzenvorsatzfilter (0,2 μ m) | Corning | 431229 | |
| Arzneimittel/Chemikalien (Reagenzien) | |||
| 10 % gepuffertes Formalin oder 4 % Paraformaldehyd | Thermo Scientific Chemikalien | Nr. J61899. AK | |
| Alkoholische Jodlösung (5%)) | Erneuerung | ||
| Antibiotische Salbe Baneocin (Bacitracin + Neomycin) | Sandoz | Antibakterielles Mittel zur äußerlichen Anwendung | |
| Aqua Polymount | Polywissenschaften | 18606-20 | |
| Carbomer Eye Gel Vidisic (Augengel) | BAUSCH+LOMB (Santen) | ||
| Carboxylat-modifizierte FluoSphere Mikrosphären (rot) | Thermo Fisher Scientific | Nr. F-8801 | |
| Dexamethason (4 mg/ml) | Ellara (KRKA) | Synthetisches Glukokortikoid | |
| Destilliertes H2O | |||
| Ethanol (70%) | |||
| Flexoprofen 2,5% (Ketoprofen) | VIC | Nichtsteroidale Antirheumatika (NSAIDs) | |
| Glukoselösung 5% | Solopharm | ||
| Ziege Anti-Kaninchen IgG (H+L) kreuzadsorbiert, Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | Nr. A-11010 | |
| Isofluran | Karizoo | ||
| Lidocain-Lösung (2 % / 4%) | Solopharm | ||
| Normales Ziegenserum (NGS) | Abcam (Englisch) | AB7481 | |
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) | Öko-Dienstleistungen | ||
| Kaninchen Anti-Parvalbumin Antikörper | Merck Millipore | AB15736 | |
| Rekombinanter monoklonaler Kaninchen-Anti-Calbindin-Antikörper | Abcam (Englisch) | Artikel-Nr.: ab108404 | |
| Kochsalzlösung (0,9 % NaCl in H2O) | Solopharm | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 50-178-1844 | |
| Vaseline-Öl | Genel |
Referenzen
- Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. Genetic dissection of neural circuits. Neuron. 57 (5), 634-660 (2008).
- Sena-Esteves, M., Gao, G. Introducing Genes into Mammalian Cells: Viral Vectors. Cold Spring Harb Protoc. 2020 (8), (2020).
- Kootstra, N. A., Verma, I. M.
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Nachdrucke und Genehmigungen
