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Methodenartikel

Weit verbreitete Transduktion neokortikaler Neuronen der Maus durch Subarachnoidal-Injektion von AAV2

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DOI:

10.3791/68235

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23. Mai 2025

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1Institute of Higher Nervous Activity and Neurophysiology, Russian Academy of Sciences, 2Faculty of Biology and Biotechnology, National Research University High School of Economics

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Es wird eine neue Technik zur großflächigen Verabreichung von Adeno-assoziierten Viren beschrieben, die eine Subarachnoidalvirus-Infusion verwendet. Diese Methode gewährleistet nicht nur eine weit verbreitete Transduktion von neokortikalen Neuronen der Maus in oberflächlichen Schichten, sondern führt auch zu einer selektiven Expression des Transgens in pyramidalen Neuronen der fünften Schicht, selbst wenn ein nicht-selektiver Promotor verwendet wird.

Zusammenfassung

Rekombinante Adeno-assoziierte Viren sind ein flexibles und leistungsfähiges Werkzeug für die Verabreichung und Expression verschiedener Gene, die in vielen Bereichen der experimentellen Biologie, insbesondere in den Neurowissenschaften, von Interesse sind. Die beliebteste Methode, um die Expression eines gewünschten Transgens in einem bestimmten Gehirnbereich zu steuern, besteht darin, einen AAV-Vektor direkt in das Hirnparenchym zu injizieren. Diese Methode erlaubt jedoch keine großflächige neuronale Transduktion, die für einige in vivo-Experimente erforderlich ist. In diesem Artikel stellen wir eine neue Technik für die weit verbreitete Genexpression im Neokortex der Maus vor, die auf einer viralen Infusion in den Subarachnoidalraum des Gehirns basiert. Diese neuronale Markierungsmethode gewährleistet nicht nur eine weit verbreitete Transduktion von Neuronen in oberflächlichen neokortikalen Schichten adulter Mäuse, sondern führt auch zur Expression des Transgens in einer großen Population von pyramidalen Neuronen der fünften Schicht mit hoher Spezifität, selbst wenn ein starker nicht-selektiver Promotor wie CAG verwendet wird. Da die Zelltransduktion in erheblicher Entfernung von der Injektionsstelle stattfindet, kann diese Methode außerdem dazu beitragen, Hirngewebe für spätere optische oder elektrophysiologische Aufzeichnungen der neuronalen Aktivität zu erhalten.

Einleitung

Das Säugetiergehirn besteht aus vielen hemmenden, exzitatorischen und modulatorischen Zellen, die durch Billionen von Synapsen zu Schaltkreisen miteinander verbunden sind1. Eine der zentralen Herausforderungen der Neurowissenschaften besteht darin, die Rolle unterschiedlicher Zelltypen bei der Organisation und Funktion von Schaltkreisen und Verhalten im Gehirn zu entschlüsseln. Die Manipulation genetisch definierter Zellen im Gehirn erfordert Methoden zur Einführung und Expression von Transgenen. Virale Gentransfersysteme sind bei weitem die effektivste und einfachste Methode für die Genübertragung in das zentrale Nervensystem2. Virale Verabreichungssysteme basieren auf replizierenden Viren (Adenoviren, Adeno-assoziierte Viren (AAVs), Lentiviren und Retroviren), die in der Lage sind, genetische Informationen in eine Wirtszelle zu bringen 2,3.

AAV-basierte Vektoren sind mittlerweile zu einem der am weitesten verbreiteten Werkzeuge für die Verabreichung gewünschter Transgene an Zellen im Gehirn geworden, sowohl für die neurowissenschaftliche Grundlagenforschung als auch für die Entwicklung von Gentherapien für neurologische Erkrankungen. Im Vergleich zu anderen Viren besitzen replikationsdefekte AAVs viele Eigenschaften, die sie zu idealen Vektoren für diese Zwecke machen. Vor allem transduzieren AAV-Vektoren effizient sich nicht teilende (terminale differenzierte) Zellen wie Neuronen und Gliazellen, was zu einer hohen Transgenexpression in vivoführt 2. Die Vektoren können leicht bei einem hochfunktionellen Titer hergestellt werden, der für die In-vivo-Verwendung geeignet ist 3,4,5. Wichtig ist, dass die Adeno-assoziierte Virus-vermittelte Genverabreichung in vivo keine histopathologischen Veränderungen und vektorbedingte Toxizität hervorruft6. Im Gegensatz zu adenoviralen Vektoren löst die In-vivo-Verabreichung von AAV-Vektoren in Tiermodellen in der Regel keine Immunantworten des Wirts gegen transduzierte Zellen aus, was eine stabile Transgenexpression innerhalb des Hirnparenchyms über längere Zeiträume ermöglicht 2,7,8.

Ein weiterer Grund für die Beliebtheit von AAV-Vektoren ist die breite Palette von AAV-Serotypen mit einzigartigen Gewebe- und Zelltyp-Tropismen 9,10,11,12,13,14. Unterschiedliche Kapsidproteine, die von verschiedenen AAV-Serotypen exprimiert werden, führen zur Verwendung unterschiedlicher Zelloberflächenrezeptoren für den Zelleintritt und damit zu spezifischen Tropismen10,14.

Der AAV-Tropismus wird nicht nur durch Kapsidproteine, sondern auch durch viele andere Faktoren bestimmt14. Es wurde gezeigt, dass die AAV-Serotypen 1, 2, 6, 7, 8 und 9 in Primärkulturen sowohl Neuronen als auch Astrozyten transduzierten15,16, aber nach intraparenchymaler Hirninjektion einen starken neuronalen Tropismus aufwiesen17,18. Die Methode, die zur Herstellung von AAV-Vektoren verwendet wird, kann auch den Nervenzelltropismus beeinflussen, selbst bei demselben Serotyp. Zum Beispiel besaß CsCl-gereinigtes AAV8 nach intraparenchymaler Hirninjektion einen starken astroglialen Tropismus, während Iodixanol-gereinigtes AAV8, das unter identischen Bedingungen injiziert wurde, nur Neuronentransduzierte 19. Der AAV-Tropismus kann auch durch die injizierte Dosis und das Volumen14 beeinflusst werden. Zum Beispiel transduzierte rAAV2/1 mit hohem Titer effizient sowohl kortikale exzitatorische als auch inhibitorische Neuronen, aber die Verwendung niedrigerer Titer zeigte eine starke Präferenz für die Transduktion kortikaler inhibitorischer Neuronen20.

Daher ist es nicht möglich, eine robuste Zelltypspezifität allein auf der Grundlage des Kapsid-Serotyps zu erreichen. Zelltypspezifische Promotoren können verwendet werden, um den breiten natürlichen Tropismus des AAV-Kapsids zu überwinden. Zum Beispiel wird humanes Synapsin I für das Targeting von Neuronenverwendet 21, der CaMKII-Promotor kann die Transgenexpression in glutamatergen exzitatorischen Neuronen mit hoher Spezifität steuern20, der ppHcrt-Promotor zielt auf Hypocretin (HCRT)-exprimierende Neuronen im lateralen Hypothalamusab 22, der PRSx8-Promotor zielt auf noradrenerge und adrenerge Neuronen ab, die Dopamin-Beta-Hydroxylase23 exprimieren, und der GFAP-Promotor kann die Astrozyten-spezifische Expressionsteuern 24. Einige zellspezifische Promotoren weisen jedoch eine schwache transkriptionelle Aktivität auf und können keine ausreichende Transgenexpression bewirken25. Darüber hinaus behalten die kurzen Promotoren, die in AAV-virale Vektoren passen, oft keine Zelltypspezifität bei 1,26. So konnte beispielsweise gezeigt werden, dass ein CaMKII-Konstrukt auch inhibitorische Neuronen transduziert12.

Neben der Zelltypspezifität (Tropismus) ist die Transduktionseffizienz ein weiteres wesentliches Merkmal von AAVs. Die verschiedenen AAV-Serotypen haben unterschiedliche Diffusionseigenschaften. AAV2 und vier virale Vektoren diffundieren weniger leicht durch das Hirnparenchym und vermitteln daher die Transduktion über einen kleineren Bereich17,27. Die am weitesten verbreitete neuronale Transduktion wird bei den AAV-Serotypen 1, 9 und rh beobachtet.10 11,17,18,19,28.

Die beliebteste Methode, um die Expression eines gewünschten Transgens in einem bestimmten Hirnbereich zu steuern, besteht darin, den AAV-Vektor direkt in die interessierende Hirnregion (Parenchym) zu injizieren3. Nach intraparenchymaler Injektion transduzieren selbst AAV-Serotypen mit effektiverer Diffusion durch das Gehirn typischerweise nur einen lokalen Bereich um die Injektionsstelle 12. Darüber hinaus ist die intraparenchymale Injektion ein invasives Verfahren und führt zu Gewebeschäden in der Nähe der interessierenden Region. Daher ist diese Methode der Virusinjektion für einige experimentelle Aufgaben ungeeignet. Zum Beispiel ist eine umfangreiche Markierung von Zellen in Experimenten zur Untersuchung der kortikalen Neuronenfunktionen bei frei beweglichen Tieren sehr wünschenswert, einschließlich unter Verwendung von Ein- oder Zwei-Photonen-Mikroskopie 29,30,31,32.

Hier beschreiben wir eine neue Adeno-assoziierte Virusinjektionstechnik, die die Subarachnoidalvirus-Infusion verwendet, um eine weit verbreitete Transduktion von neokortikalen Neuronen in erwachsenen Mäusen zu ermöglichen und Hirngewebe für nachfolgende optische oder elektrophysiologische Aufzeichnungen der neuronalen Aktivität zu erhalten. Diese Methode gewährleistete nicht nur eine weit verbreitete Transduktion von Neuronen in oberflächlichen neokortikalen Schichten, sondern führte auch zu einer Expression des Transgens in einer großen Population von pyramidalen Neuronen der fünften Schicht mit hoher Spezifität, selbst wenn ein starker nicht-selektiver Promotor wie CAG verwendet wurde.

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Protokoll

Die Experimente wurden an adulten C57Black/6 Mäusen im Alter von 2-4 Monaten beiderlei Geschlechts durchgeführt (Puschtschino-Zuchtzentrum, Abteilung des Shemyakin-Ovchinnikov-Instituts für Bioorganische Chemie der RAS). Die Mäuse wurden in einem temperierten Vivarium (22 °C ± 2 °C, 12 h Hell-Dunkel-Zyklus, Licht an um 08.00 Uhr) mit Futter und Wasser ad libitum untergebracht. Alle Versuchsverfahren wurden in Übereinstimmung mit den ARRIVE-Richtlinien und der Richtlinie 2010/63/EU für Tierversuche durchgeführt. Das Studienprotokoll wurde von der Ethikkommission der IHNA RAS genehmigt (Protokoll N1 vom 01.02.2022). Es wurden alle Anstrengungen unternommen, um das Leiden der Tiere zu minimieren und die Zuverlässigkeit der Ergebnisse zu gewährleisten.

1. Vorbereitung auf die Operation

  1. Sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente vor Beginn der Operation. Reinigen Sie den Operationsbereich mit 70 % Ethanol.
  2. Überprüfen Sie den Isofluranspiegel im Anästhesiesystem und füllen Sie es bei Bedarf auf. Legen Sie ein sauberes Papiertuch auf den Boden der Induktionskammer.
  3. Lege ein Heizkissen auf den stereotaktischen Rahmen. Decken Sie den Block mit einem sauberen Papiertuch ab.
  4. Bereiten Sie eine Flasche mit 2 % Bleichmittel vor, um Mikropipettenspitzen, Röhrchen, Wattestäbchen und andere Gegenstände zu sammeln, die mit dem Virus in Kontakt kommen.
  5. Nehmen Sie ein Aliquot AAV aus dem -80 °C Gefrierschrank und legen Sie es zum Auftauen auf Eis.

2. Vorbereitung der Spritze

  1. Reinigen Sie eine 5 μl Hamilton Mikrospritze mit einer 33G stumpfen RN-Nadel. Aspirieren und geben Sie dann 70% Ethanol ab. 3x mit frischem Ethanol wiederholen. Spülen Sie die Spritze mit destilliertem Wasser aus, um das überschüssige Ethanol zu entfernen. 3x wiederholen.
  2. Nehmen Sie den Kolben heraus und füllen Sie den Zylinder mit einer Insulinspritze durch den Flansch mit Vaselineöl. Achten Sie darauf, dass sich keine Luftblasen in der Mikrospritze befinden.
    HINWEIS: Eingeschlossene Luft ist komprimierbar und beeinträchtigt die Genauigkeit und Präzision der Spritze.
  3. Setzen Sie den Kolben wieder in die Mikrospritze ein und geben Sie einen Tropfen Öl ab. Setzen Sie die Spritze so in den stereotaktischen Injektor ein, dass die Skala sichtbar ist, um das Volumen der abgegebenen Lösung zu überwachen.

3. Vorbereitung der Mäuse für die Operation

  1. Wiegen Sie eine Maus. Platzieren Sie die Maus in der Anästhesie-Induktionskammer, die mit dem Isofluran verbunden ist. Schalten Sie den Isofluran-Verdampfer ein, der auf 5% eingestellt ist, und stellen Sie die Durchflussrate auf 250 mL/min ein. Eine adäquate Narkosetiefe wird innerhalb von 5 bis 7 min erreicht.
  2. Um das chirurgische Niveau der Anästhesie zu überprüfen, überprüfen Sie, ob während eines schmerzhaften Kneifens in der Hinterpfote kein Schneebesen und kein Blinzeln vorhanden ist, und ob bei Augenkontakt kein Blinzeln auftritt.
  3. Schalten Sie das Verdampfer-Auslassventil von der Induktionskammer auf die stereotaktische Maske um. Reduzieren Sie das Isofluran auf 1,8%-2,0% und stellen Sie die Flussrate entsprechend dem Gewicht der Maus ein (70-90 mL/min für Mäuse mit einem Gewicht zwischen 25 und 35 g).
  4. Nehmen Sie die Maus aus der Induktionskammer und legen Sie sie in das stereotaktische Gerät auf ein Heizkissen (37 °C), um eine Unterkühlung während der chirurgischen Anästhesie zu vermeiden. Setzen Sie die Frontzähne in den Zahnsteg ein und montieren Sie dann die Tiermaske.
  5. Positionieren Sie das Tier vorsichtig auf den Ohrbügeln. Die korrekte Kopfhaltung im stereotaktischen Apparat ermöglicht eine vertikale, aber nicht laterale Bewegung des Kopfes. Stellen Sie sicher, dass die Positionierung des Tieres keinen Stress verursacht. Überwachen Sie die Narkosetiefe, die Atmung des Tieres und die Körpertemperatur während der gesamten Operation sorgfältig.
  6. Rasieren Sie den Kopf von den Augen bis hinter die Ohren. Reinigen Sie die rasierte Oberfläche des Kopfes, indem Sie einen Tupfer mit 70 % Ethanol und anschließend einen Abstrich mit einer 5%igen Alkohollösung aus Jod machen.
  7. Tragen Sie ophthalmisches Gel auf, um ein Austrocknen der Augen zu verhindern. Tragen Sie 4% ige Lidocainlösung topisch und Dexamethason (0,02 ml bei 4 mg/ml) subkutan auf, um chirurgische Schmerzen zu verhindern und die mögliche Entzündungsreaktion zu reduzieren.
  8. Machen Sie mit einer sterilen Skalpellklinge und einer Schere einen 4-5 mm langen Schnitt entlang der Mittellinie des Kopfes, um die Kopfhaut zu öffnen. Beginnen Sie mit einem kleinen Schnitt zwischen den Ohren und erweitern Sie ihn dann mit einer Schere, um Schäden am Schädel zu vermeiden.
  9. Tupfen Sie die Oberfläche des Schädels mit einer kleinen Menge 3% Wasserstoffperoxid ab, um die stereotaktischen Orientierungspunkte zu visualisieren: Bregma und Lambda. Stoppen Sie die Reaktion mit 0,9% NaCl-Kochsalzlösung sofort. Kratzen Sie das Gewebe auf dem Schädel mit einem Knochenschaber ab.
  10. Montieren Sie den vorbereiteten motorisierten Injektor mit der Hamilton-Spritze auf dem stereotaktischen Arm. Richten Sie eine chirurgische Lichtquelle auf den freiliegenden Schädel und fokussieren Sie das Mikroskop auf das Bregma.
  11. Wenn du durch das Mikroskop schaust, bewege den Arm des stereotaktischen Apparats so, dass die Spitze der Nadel direkt über dem Bregma zentriert ist.
  12. Richten Sie Bregma und Lambda mit der Spitze der Nadel horizontal aus und bewegen Sie dann den Arm zurück zum Bregma und notieren Sie die Koordinaten. Verwenden Sie diese Bregma-Koordinaten und die Atlas-Koordinaten des interessierenden Bereichs, um die relativen Koordinaten des Zielbereichs zu berechnen.
  13. Bewegen Sie die Nadel in den Zielbereich. Senken Sie die Nadel bei den neuen Koordinaten ab und markieren Sie diese Position. Wählen Sie den Ort für die virale Mikroinjektion in unmittelbarer Nähe des Zielbereichs unter Berücksichtigung der Ausbreitung des Virus aus.
    HINWEIS: Dadurch wird eine Beschädigung des Gewebes im interessierenden Bereich vermieden. Wir verwendeten die folgenden Koordinaten für die Region of Interest: AP-3.4, ML -2.0 und für die virale Mikroinjektion: AP-2.0, ML -1.4. Die obigen Koordinaten sind optimal, wenn primäre Neuronen des visuellen Kortex infiziert werden sollen.
  14. Vermeiden Sie nach Möglichkeit Regionen mit großen Blutgefäßen. Unter einem Operationsmikroskop, heller Kaltlichtbeleuchtung und 0,9 % NaCl-Kochsalzlösung sollten große Blutgefäße im Schädel und auf der Gehirnoberfläche sichtbar werden.

4. Virus-Injektion

  1. Nehmen Sie einen sterilen Zahnbohrer (0,5 - 0,8 mm Durchmesser). Betrachten Sie die Oberfläche des Schädels durch das Operationsmikroskop und bohren Sie eine kleine Kraniotomie manuell (von Hand) oder mit einem Mikrobohrer. Achten Sie darauf, keinen übermäßigen Druck auf den Schädel auszuüben.
  2. Schieben Sie den Arm aus dem Weg, um eine Beschädigung der Mikrospritzennadel während des Bohrens des Kraniotomie (Lochs) zu vermeiden. Tragen Sie 0,9 % NaCl-Kochsalzlösung auf und pausieren Sie intermittierend, um eine Erwärmung des Knochens und eine Beschädigung der Dura mater zu vermeiden. Verwenden Sie Druckluft, um Knochenstaub wegzublasen.
    HINWEIS: Die folgenden Arten von Hartmetall-Zahnbohrern sind geeignet: birnenförmig (bevorzugt), abgerundeter Zylinder und rund.
    1. Wenn Sie den Knochen mit dem Bohrer ausdünnen, stellen Sie sicher, dass die Ausdünnung über den gesamten Umfang gleichmäßig ist. Dies erleichtert die Entfernung des Knochens, ohne die Dura mater zu beschädigen. Verwenden Sie dazu zunächst einen Bohrer mit runder Spitze und dann einen Bohrer mit flacher Spitze. Halten Sie den Bohrer senkrecht zum Knochen; Andernfalls ist eine Seite dünner als die andere.
      HINWEIS: Je kleiner die Größe des Bohrers und je kleiner die durchgeführte Kraniotomie ist, desto komplexer ist die Manipulation. Es wird empfohlen, eine Kraniotomie mit kleinerem Durchmesser (0,5-0,6 mm) durchzuführen, wenn das Tier weiterhin für In-vivo-Arbeiten verwendet wird. Wenn Sie planen, das Gehirn des Tieres für Ex-vivo-Arbeiten zu verwenden, ist ein größerer Kraniotomiedurchmesser akzeptabel, um das Verfahren zu vereinfachen.
  3. Wenn der ausgedünnte Knochen weich und durchsichtig ist, hören Sie auf zu bohren. Wenn sich eine ausreichend große Vertiefung im Knochen bildet, stoppen Sie häufig die Rotation und überwachen Sie die Dicke des Knochens. Das Auftreten von Rissen im Knochen deutet darauf hin, dass eine Ausdünnung ausreichend ist.
  4. Baden Sie das Loch mit steriler Kochsalzlösung und entfernen Sie dann die überschüssige Kochsalzlösung mit einem Wattestäbchen. Entfernen Sie die verbleibende Knochenschicht mit einer 27G-Nadel mit hakenförmiger Spitze und/oder mit einer Pinzette mit feiner Spitze. Vermeiden Sie es, die Dura zu beschädigen.
  5. Decken Sie die Oberfläche des Schädels mit einem sterilen Stück Papiertuch ab, das mit Kochsalzlösung angefeuchtet ist. Lege ein Stück saubere, transparente Folie auf die Oberfläche des Mäuseschädels über dem Papier.
  6. Bewegen Sie den stereotaktischen Arm nach hinten und positionieren Sie die Mikrospritzennadel direkt über dem Film. Geben Sie das überschüssige Öl ab, bis ein Volumen von 2 μL erreicht ist.
    HINWEIS: Das endgültige Volumen des Öls kann je nach Volumen der Mikrospritze variieren. Wir verwendeten eine 5 μL 75-RN Hamilton Mikrospritze.
  7. Pipettieren Sie ein Virusvolumen, das dem injizierten Volumen + 2 μl entspricht, auf ein Stück transparente Folie.
  8. Wenn Sie durch das Operationsmikroskop schauen, senken Sie den Arm nach unten, bis sich die Nadelspitze in der Mitte des Tropfens des Virus befindet. Laden Sie das Virus mit einem motorisierten Injektor in die Mikrospritze. Entsorgen Sie die Spitze der Mikropipette und die transparente Folie in der Flasche mit 2 % Bleichmittel.
  9. Entfernen Sie das mit Kochsalzlösung angefeuchtete Papier von der Oberfläche des Schädels und trocknen Sie den Schädel mit einem Wattestäbchen. Verwenden Sie den stereotaktischen Arm, um die Nadel über der Einstichstelle zu positionieren.
  10. Geben Sie einen Tropfen des Virus ab, um sicherzustellen, dass die Nadel nicht verstopft ist. Mit einer 30 G Nadel mit hakenförmiger Spitze einen kleinen Schlitz in die Dura stechen.
    HINWEIS: Es ist wichtig, einen möglichst kleinen Schlitz in die Dura mater zu bohren, damit die Nadel eindringen kann, ohne einen Spalt zwischen der Nadel und der Dura mater zu hinterlassen, aus dem das Virus austreten könnte.
  11. Senken Sie die Nadel der Spritze bis zur Dura ab und berechnen Sie die entsprechende Tiefe. Schätzen Sie die kortikale Tiefe der Insertion relativ zu dem Punkt, an dem die Nadel zum ersten Mal die Oberfläche der Rinde berührt hat.
  12. Führen Sie die Nadelspitze langsam bis zu einer Tiefe von 300 μm in die Rinde ein. Warten Sie 2-3 Minuten, damit die Dura an der Nadel haften kann, und ziehen Sie die Nadel dann langsam bis zu einer Tiefe von 200 μm zurück. Warten Sie weitere 2-3 Minuten, damit sich das Gehirngewebe absetzen kann. Dies führt dazu, dass die Nadel die Dura nach oben zieht und einen subduralen Raum schafft, in dem sich das Virus ausbreiten kann.
    HINWEIS: Um kortikale Schäden zu minimieren, verwenden Sie eine 33-G-Nadel oder niedrigere G-Nadeln. Denken Sie daran, dass die Wahrscheinlichkeit, dass der Geweberückfluss die Spitze verstopft, umso höher ist, je kleiner der Innendurchmesser der Spitze ist. Es ist wichtig, eine stumpfe Nadel anstelle einer abgeschrägten Nadel zu verwenden, da eine stumpfe Nadel einen kontrollierteren Tropfen der Viruslösung ausstößt.
    1. Wenn die Nadel beim Absenken auf 150-200 μm nicht durch die Dura mater geht und diese stattdessen biegt, hören Sie mit dem Absenken auf. Hebe die Nadel an und mache einen etwas größeren Schnitt in der Dura Mater, dann versuche wieder, die Nadel zu senken.
    2. Wenn beim Absenken der Nadel aktiv Flüssigkeit aus dem Schnitt austritt, warten Sie, bis sie aufhört zu lecken. Andernfalls ist es schwierig, die Nadel zu kontrollieren, die durch die Dura geht. Tupfen Sie die überschüssige Zerebrospinalflüssigkeit mit einer Gewebespitze ab. Sobald die Flüssigkeit nicht mehr fließt, heben Sie die Nadel an und versuchen Sie es erneut.
  13. Beginnen Sie mit der Injektion der Virussuspension mit einer Geschwindigkeit von 0,06 μl/min, während Sie das abgegebene Volumen überwachen. Injizieren Sie 1 μl Virus. Injizieren Sie das Virus in einer einzigen Tiefe, um die Versiegelung zwischen Nadel und Rindengewebe nicht zu beschädigen.
    1. Fehlerbehebung: Zu Beginn der Injektion kann es zu einem Virusrückfluss an die Gehirnoberfläche kommen. Beenden Sie die Injektion, warten Sie 2-3 Minuten und fahren Sie dann mit der Virusinjektion fort. Wiederholen Sie diese Aktionen (Schritte), bis der Virusrückfluss gestoppt wird. Viren und Liquor cerebrospinalis bleiben an der Nadel haften und verhindern einen Rückfluss.
    2. Eine andere Möglichkeit, den Virusrückfluss zu stoppen, besteht darin, eine kleine Menge Agarose auf die Oberfläche des Kortex zu geben. Es unterdrückt das Pulsieren der Hirnrinde und hilft auch, die Nadel abzudichten. Achten Sie aber darauf, dass die Pipette nicht durch die Agarose verstopft ist.
    3. Da die Nadel im abgesenkten Zustand möglicherweise nicht vollständig, sondern nur teilweise durch die Dura mater hindurchgeht, kann es sein, dass eine Seite der Nadel nicht fest an der Dura anliegt, was zu einem Rückfluss des Virus führen kann. Ziehen Sie in diesem Fall die Nadel langsam aus dem Gewebe zurück und versuchen Sie wieder, sie abzusenken.
  14. Sobald die Infusion abgeschlossen ist, halten Sie die Nadel für weitere 10 Minuten an der Zielstelle. Dadurch kann sich das Virus von der Injektionsstelle weg verteilen. Ziehen Sie die Nadel langsam aus dem Gehirn zurück, um zu verhindern, dass das Virus wieder aus dem Nadeltrakt zurückströmt.
  15. Sobald die Nadelentnahme abgeschlossen ist, überprüfen Sie, ob sie nicht verstopft ist, indem Sie einen kleinen Tropfen Virus abgeben. Verschließen Sie den Hautschnitt mit 5-0 resorbierbaren oder nicht resorbierbaren Nähten.

5. Nachsorge

  1. Tragen Sie nach dem Schließen des Einschnitts die antibakterielle Salbe topisch auf. Injizieren Sie eine Mischung aus Kochsalzlösung (5 ml/kg) und 5% Glukose (5 ml/kg) subkutan, um Dehydration zu verhindern und die Genesung nach der Anästhesie zu erleichtern. Injizieren Sie Ketoprofen intramuskulär (2,5 mg/kg), um die Schmerzen zu lindern.
  2. Setzen Sie das Tier in einen frischen Käfig auf ein Heizkissen und überwachen Sie, bis es sich von der Narkose erholt hat. Nachdem die Maus reagiert hat, setzen Sie das Tier in seinen Heimatkäfig.

6. Histologie

  1. Frühestens 21 Tage nach der Virusinjektion betäuben Sie Mäuse tief mit Isofluran, wie in Schritt 3 beschrieben.
  2. Machen Sie mit einer schmalen Schere einen Schnitt (10 -15 mm) in der Mitte des Brustbereichs und legen Sie die Brusthöhle frei. Trennen Sie vorsichtig das Zwerchfell und öffnen Sie die Brust mit einer Schere.
  3. Führen Sie eine 22G 1 1/2 Nadel in die linke Herzkammer ein und machen Sie mit einer Schere einen Schnitt in den rechten Vorhof. Perfundierte mit 50 mL vorgekühlter 100 mM phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), gefolgt von 100 mL vorgekühltem 10 % gepuffertem Formalin.
  4. Entnehmen Sie vorsichtig das gesamte Gehirn der Maus. Machen Sie dazu mit einer Schere einen sagittalen Schnitt entlang der Mitte der Kopfhaut. Entfernen Sie anschließend den Schädelknochen Stück für Stück mit einer Knochenzange mit flachen Spitzen, beginnend am Schnittpunkt der sagittalen und lambdoiden Naht und nach vorne zum Nasenbein. Wenn das Gehirn freigelegt ist, schneiden Sie durch die Riechkolben, lockern Sie das Gehirn mit einem gebogenen Spatel heraus und geben Sie es in ein 50-ml-Röhrchen mit 10 % gepuffertem Formalin.
  5. Repariere das Gehirn über Nacht. Befestigen Sie das Hirngewebe mit Gewebekleber auf einer Metallplattform eines Vibratoms. Schneiden Sie Stirnabschnitte mit einer Dicke von 50 μm mit Klingen aus Kohlenstoffstahl.

7. Immunfärbung

  1. Tag 1
    1. Waschen Sie die Gehirnscheiben 3x für je 5 min mit 1x PBS mit 0,3% Triton X-100 (PBS-T). Inkubieren Sie die Schnitte in PBS-T für 20 Minuten bei Raumtemperatur (RT).
    2. Blockieren Sie die unspezifische Bindung für 1 h bei RT mit einem Blockierungspuffer, der aus 5 % normalem Ziegenserum (NGS) und 0,3 % Triton X-100 in 1x PBS besteht.
    3. Die Schnitte werden über Nacht bei 4 °C mit Primärantikörpern gegen Parvalbumin oder Calbindin inkubiert, die 1:500 im Blockierungspuffer verdünnt sind (5 % NGS und 0,3 % Triton X-100 in 1x PBS).
  2. Tag 2
    1. Waschen Sie die Partien 3x für 10 min in PBS-T. Inkubieren Sie im Dunkeln für 2 h bei RT mit Sekundärantikörpern (Ziege anti-Kaninchen IgG (H+L) kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 546), verdünnt 1:500 im Blockierungspuffer (5% NGS und 0,3% Triton X-100 in 1x PBS).
    2. Die Abschnitte 3x für je 5 min in 1x PBS waschen. Übertragen Sie Gehirnschnitten mit einer weichen Bürste auf Objektträger.
    3. Geben Sie sofort 0,1 ml Antifading-Eindeckmedium in jeden Abschnitt. Decken Sie die Scheiben mit einem Deckglas von 22 mm x 50 mm ab.
    4. Konfigurieren Sie das konfokale Mikroskop auf eine 20-fache oder 60-fache Vergrößerung (A/1,4, Öl). Verwenden Sie Laser mit einer Wellenlänge von 488 nm und 594 nm, um Mehrkanalbilder der interessierenden Gehirnregionen aufzunehmen.

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Ergebnisse

In einer Pilotreihe von Experimenten verwendeten wir die traditionelle intrakortikale Injektionsmethode, um Pyramidenneuronen der fünften Schicht im Neokortex der Maus durch AAV2 zu transduzieren, das das schnelle Channelrhodopsin (oChIEF)- Gen trug, das mit dem fluoreszierenden EGFP-Protein unter dem CaMKII-Promotor fusioniert war. In Übereinstimmung mit dem charakteristischen Merkmal von AAV212 erhielten wir eine relativ kleine Infektionsfläche von nicht mehr als 1 mm Breite (

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Diskussion

Wir haben eine neue Methode zur Transduzierung neokortikaler Neuronen der Maus entwickelt, indem wir eine Suspension von AAV2-Viruspartikeln in den Subarachnoidalraum des Gehirns injizieren. Dies sorgt für eine weit verbreitete Virusverteilung, die fast viermal größer ist als das infizierte Gewebevolumen, wenn die gleiche Virusmenge direkt in das Hirnparenchym injiziert wird.

Die Injektion von Virusvektoren direkt in die Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) über ver...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Danksagungen

Die Arbeit wurde mit finanzieller Unterstützung der Russischen Wissenschaftsstiftung, Zuschuss 20-15-00398P, durchgeführt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Ausrüstung
10 & Mikro; L Gasdichte Spritze Modell 1701 RN (5 μl 75 RN Hamilton Mikrospritze)Hamilton UnternehmenTeil/REF # 7634-01, Hamilton oder Kat.-Nr. HAM7634-01, Merck
33 G RN-Nadel, Spitze Typ 3Hamilton UnternehmenTeil/REF # 7803-05, Hamilton
Binokulares MikroskopNikon oder MicromedModell MC-4 ZOOM
Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop auf Cerna-BasisThorLabs (Englisch)
KaltlichtquelleRWDModell 76312
Leica VT1000 S Mikrotom mit vibrierender KlingeLeica Biosystems76001-014
Low-Flow-Anästhesiesystem mit StarterkitKent Scientific Corporation13-005-111 (Modell SomnoSuite)
Mechanische Pipette 0,1 – 2,5 & Mikro; L Eppendorf Research plusEppendorf3123000012
Mechanische Pipette 10 – 100 &Mikro; L Eppendorf Research plusEppendorf3123000047
Mäuse-RasiererRWDModell CP-5200
Mikrobohrer mit Bohrern (0,5 mm, rund)RWD78001, 78040
oder Desctop Digitales Stereotaktisches Instrument, Maus-Anästhesiemaske, Maus-Ohrbügel (60 Grad)RWDModelle 68027, 68665, 68306
LuftkompressorBambiBB8
Manuelle Einkanalpipette 0,5-10 &Mikro; LRAINN17008649
Stereotaktisches Instrument für KleintiereKOPFModell 962
Stereotaktischer InjektorStoelting10-000-004
Chirurgische Instrumente (Werkzeuge)
30 G Zahnnadel (Ni-pro)Biodent Co. Ltd.Um die Dura aufzuschlitzen
KnochenschaberWerkzeuge für die Feinwissenschaft10075-16
Zange für KnochenWerkzeuge für die Feinwissenschaft16025-14Um den Schädelknochen zu entfernen
Gebogene SpatelFabrik für medizinische Versorgung in MoshaiskUm das Gehirn aus dem Schädelgewölbe zu entfernen
ZahnfräserDRENDEL + ZWEILINGFür die Kraniotomie; Form: birnenförmig / runder Endzylinder / rund; Durchmesser der Spitze: 0,55-0,8 mm Durchmesser
Nadelhalter (Halsey Micro Needle Holder)Werkzeuge für die Feinwissenschaft12500-12
Chirurgisches Nahtmaterial aus Polypropylen oder chirurgisches Nahtmaterial Vicryl (5-0, resorbierbar)Walter Produkte (Ethicon)S139044 (W9442)
Skalpellgriff (#3) mit Skalpellklingen (#11)Werkzeuge für die Feinwissenschaft10003-12, 10011-00
Schere (extra schmale Schere)Werkzeuge für die Feinwissenschaft14088-10die Haut schneiden
Schere (Feinschere)Werkzeuge für die Feinwissenschaft14094-11Naht schneiden
Chirurgisches Nahtmaterial PROLENE (Polyproptlene)Ethicon (Johnson & Johnson)
Pinzette (Pinzette #5)Werkzeuge für die Feinwissenschaft11252-20
Pinzette (polierte Inox-Pinzette)Werkzeuge für die Feinwissenschaft11210-20
Einwegartikel
1 ml InsulinspritzeSITEKMEDZum Laden von Vaselineöl in eine Mikrospritze, zur Verabreichung von Medikamenten
ZellkulturplatteSPL Biowissenschaften
Wattestäbchen
Cover-GläserFisher Scientific12-545E
Insulin-Spritzennadel (27 G)SITEKMEDUm Trümmer aus einem Loch zu entfernen (Kraniotomie)
Fusselfreie Tücher CLEANWIPERNetLink (Englisch)
ObjektträgerFisher Scientific12-550-15
PapierhandtücherLuscan
ParafilmStatLabSTLPM996
Sterile OP-HandschuheDermagrip
Steriler Spritzenvorsatzfilter (0,2 μ m)Corning431229
Arzneimittel/Chemikalien (Reagenzien)
10 % gepuffertes Formalin oder 4 % ParaformaldehydThermo Scientific ChemikalienNr. J61899. AK
Alkoholische Jodlösung (5%))Erneuerung
Antibiotische Salbe Baneocin (Bacitracin + Neomycin)SandozAntibakterielles Mittel zur äußerlichen Anwendung
Aqua PolymountPolywissenschaften18606-20
Carbomer Eye Gel Vidisic (Augengel)BAUSCH+LOMB (Santen)
Carboxylat-modifizierte FluoSphere Mikrosphären (rot)Thermo Fisher ScientificNr. F-8801
Dexamethason (4 mg/ml)Ellara (KRKA)Synthetisches Glukokortikoid
Destilliertes H2O
Ethanol (70%)
Flexoprofen 2,5% (Ketoprofen)VICNichtsteroidale Antirheumatika (NSAIDs)
Glukoselösung 5%Solopharm
Ziege Anti-Kaninchen IgG (H+L) kreuzadsorbiert, Alexa Fluor 546Thermo Fisher ScientificNr. A-11010
IsofluranKarizoo
Lidocain-Lösung (2 % / 4%)Solopharm
Normales Ziegenserum (NGS)Abcam (Englisch)AB7481
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)Öko-Dienstleistungen
Kaninchen Anti-Parvalbumin AntikörperMerck MilliporeAB15736
Rekombinanter monoklonaler Kaninchen-Anti-Calbindin-AntikörperAbcam (Englisch)Artikel-Nr.: ab108404
Kochsalzlösung (0,9 % NaCl in H2O)Solopharm
Triton X-100Sigma-Aldrich50-178-1844
Vaseline-ÖlGenel

Referenzen

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