Arbeitsablauf mit einem kryogenen Koinzidenz-Fluoreszenz-, Elektronen- und Ionenstrahlmikroskop zur gezielten Fräsung von Zellen

Zusammenfassung

Dieser Workflow ermöglicht die Lamellenproduktion für fluoreszenzmarkierte biologische Strukturen, die klein (<1 μm axiale Ausdehnung) und selten (1 Kopie pro Zelle) sind, unter Verwendung einer kryogenen trikoinzidenten Bildgebungsplattform. Diese Plattform integriert Fluoreszenzmikroskopie, fokussiertes Ionenstrahlfräsen und Rasterelektronenmikroskopie in einer einzigen Fokusposition und ermöglicht die gleichzeitige Fluoreszenzmikroskopie während des Fräsens.

Zusammenfassung

Das kryogene Mahlen fokussierter Ionenstrahlen mit Rasterelektronenmikroskopie (CryoFIB-SEM) hat sich zum dominierenden Ansatz für die Präparation von unter 200 nm dicken Lamellen von Zellen für die kryogene Elektronentomographie (CryoET) entwickelt. In jüngster Zeit wurde die Fluoreszenzmikroskopie in CryoFIB-REM-Systeme integriert, um die Lamellenproduktion in Richtung fluoreszenzmarkierter Ziele zu lenken. In den meisten Implementierungen haben die optischen und die Ionenstrahl-Bildgebungssysteme jedoch unterschiedliche Fokusebenen in verschiedenen Bereichen der Vakuumkammer – sie funktionieren effektiv wie zwei separate Mikroskope. Diese Konfiguration erfordert eine Bildregistrierung zwischen den Modalitäten, die oft nicht die Genauigkeit aufweist, die erforderlich ist, um kleine, seltene Strukturen zuverlässig in situ anzuvisieren. Wir stellen einen Workflow vor, der auf einer maßgeschneiderten trikoinzidenten Bildgebungsplattform basiert, die die gleichzeitige Fluoreszenzbildgebung und das Fräsen fokussierter Ionenstrahlen ermöglicht. Dies ermöglicht eine Echtzeit-Fluoreszenzrückkopplung, die verwendet werden kann, um zu bestimmen, wann das Mahlen beendet werden muss, um fluoreszenzmarkierte Strukturen von Interesse in der endgültigen Lamelle zu erhalten. Mit diesem Ansatz zielten wir auf das Mikrotubuli-organisierende Zentrum (MTOC) in vitrifizierten Makrophagen ab und erreichten eine Erfolgsrate von >60%, die durch anschließende kryogene Elektronentomographie und korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie bestätigt wurde.

Einleitung

Die kryogene Elektronentomographie (CryoET) ermöglicht die Visualisierung biologischer Proben in einem nahezu nativen Zustand mit makromolekularer Auflösung 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 . Die Dicke eukaryotischer Zellen – oft mehrere Mikrometer – übersteigt jedoch die mittlere freie Weglänge (~300 nm) von 300 kV-Elektronen, wodurch die Eindringtiefe von ungestreuten Elektronen begrenzt und damit die nutzbare Probendicke eingeschränkt wird. Um dies zu erreichen, kann ein fokussierter Ionenstrahl (FIB) verwendet werden, um den größten Teil der kryogenisch konservierten Zelle in einem als CryoFIB-Mahlen bekannten Verfahren abzutragen, wodurch Lamellen erzeugt werden, die dünn genug für die CryoET-Bildgebung sind 12,13,14,15,16.

In den zuvor berichteten Arbeitsabläufen werden die Proben zunächst in verglastem Eis durch Tauchgefrieren 17,18,19 konserviert und dann in ein Zweistrahlgerät geladen, das sowohl mit einem KryoFIB als auch mit einem Rasterelektronenmikroskop (REM) ausgestattet ist. Die REM-Bildgebung kann verwendet werden, um subzelluläre Merkmale von Interesse wie Organellen und sogar einige proteinhaltige Strukturen zu identifizieren^20,21. Diese Informationen können verwendet werden, um den CryoFIB-Mahlprozess zu steuern, bei dem die Probe schrittweise abgetragen wird, mit dem Ziel, eine unter 200 nm dicke Lamelle herzustellen, die für CryoET 13,14,22 geeignet ist. Dieser Ansatz stellt jedoch zwei zentrale Herausforderungen dar, die mit dem vorliegenden Protokoll angegangen werden. Zunächst ist es oft notwendig, CryoET von spezifischen proteinhaltigen Strukturen zu erhalten, aber das REM kann schädlich sein, und die meisten proteinhaltigen Strukturen sind mit dem REM nicht erkennbar, wenn ungefärbtes biologisches Material abgebildet wird. Wie kann das Fräsen auf beschädigungsfreie Weise genau auf bestimmte subzelluläre Regionen oder Regionen mit spezifischen Biomolekülen gelenkt werden? Zweitens kann es auch nach der Herstellung dünner Lamellen und anschließender KryoET schwierig sein, spezifische Biomoleküle in den endgültigen Rekonstruktionen zu identifizieren, da die Auflösung, das Signal-Rausch-Verhältnis und/oder der Kontrast, die für die eindeutige Identifizierung erforderlich sind, unzureichend sind. Wie können die räumlichen Positionen dieser Biomoleküle im Rahmen von Kryo-ET-Rekonstruktionen bestimmt werden?

Um beiden Herausforderungen zu begegnen, hat sich das Feld zunehmend der Fluoreszenzmikroskopie zugewandt. Genetisch kodierte fluoreszierende Proteine oder exogene Farbstoffe, die Zielproteine binden, werden routinemäßig verwendet, um spezifische Biomoleküle von Interesse zu markieren ^5,23,24. Die kryogene Fluoreszenzmikroskopie von vitrifizierten Zellen, die nach dem Mahlen entnommen wurden, kann mit den resultierenden Tomogrammen korreliert werden. Dieser Ansatz, der als kryogene korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie (CryoCLEM) bekannt ist, ist gut etabliert und wird häufig zur Lokalisierung spezifischer Proteine in CryoET-Rekonstruktionen verwendet 5,12,23,24. Zu den jüngsten Fortschritten gehört der Einsatz von fluoreszierenden Biosensoren und hochauflösenden Methoden zur Verbesserung der komplementären Information und der räumlichen Präzision 25,26,27,28,29.

CryoCLEM ist eine Möglichkeit, die zweite oben genannte Herausforderung zu überwinden, indem es die Bestimmung der Position spezifischer Proteine innerhalb der Lamelle ermöglicht. CryoCLEM tut jedoch nichts für den Anwender, wenn die endgültige Lamelle die interessierenden Proteine nicht enthält. Glücklicherweise kann die Fluoreszenzmikroskopie auch verwendet werden, um das Fräsen auf markierte Bereiche von Interesse zu lenken. Obwohl das fluoreszenzgesteuerte FIB-Mahlen eine neuere Entwicklung als CryoCLEM ist und erste Arbeitsabläufe vor etwa einem Jahrzehnt entstanden sind¹², hat es eine schnelle und breite Akzeptanz gefunden. Die frühen Protokolle stützten sich auf externe Lichtmikroskope, um 2D- oder 3D-Fluoreszenzdatensätze zu erfassen, die dann nach der Übertragung der Probe in das CryoFIB-REM als REM- und Ionenstrahlbilder registriert wurden. In jüngerer Zeit wurden Fluoreszenzmikroskope direkt in die CryoFIB-REM-Vakuumkammern integriert. Diese Integration reduziert die Eiskontamination während des Transfers und ermöglicht eine einfachere Abbildung der endgültigen Lamelle. Mittlerweile wurden mehrere Plattformen entwickelt, um die Fluoreszenzmikroskopie mit CryoFIB-REM für das fluoreszenzgesteuerte Fräsen zu kombinieren. Diese haben erfolgreich auf Organellen und große Proteinkomplexe abgezielt ^5,23,24. Mit wenigen Ausnahmen³⁰ erzeugt der optische Pfad jedoch eine separate Fokusebene in einem anderen physikalischen Bereich der Vakuumkammer als das FIB-REM. Daher ist beim Direktfräsen nach wie vor eine präzise Registrierung zwischen Fluoreszenz- und Ionenbildern erforderlich, ebenso wie bei der Verwendung eigenständiger optischer Mikroskope.

Dieser Registrierungsprozess ist aufgrund von drei Schlüsselfaktoren anfällig für Ungenauigkeiten: Brechungsindex-Fehlanpassungen (die zu scheinbaren Fokusverschiebungen führen)^31,32, Probenbewegung während des Fräsens und Lokalisierungsfehler. Darüber hinaus wird die Registrierung typischerweise durch mikrometergroße fluoreszierende Fiduciale unterstützt, die sowohl in Ionen- als auch in optischen Modalitäten sichtbar sind und als Ausrichtungspunktpaare verwendet werden, um Transformationen zwischen den Ionen- und optischen Bildern zu berechnen. Diese Kügelchen können jedoch das Fluoreszenzsignal der Probe verdecken oder mit ihm konkurrieren, und ihre Lokalisierung und Ausrichtung auf optischen und Ionenbildern ist langsam und benutzerintensiv. Zusammengenommen haben diese Einschränkungen die routinemäßige Ausrichtung auf kleine und seltene Merkmale behindert. Obwohl es schwierig ist, eine genaue Grenze für die Strukturen zu definieren, die derzeit in dünnen Lamellen konserviert werden können, gelten registrierungsbasierte Ansätze im Allgemeinen als unwirksam für die Erfassung von Zielen mit axialen Abmessungen unter einem Mikrometer³³.

Hier berichten wir über die Verwendung eines trikoinzidenten Bildgebungssystems, das FIB, REM und Fluoreszenzmikroskopie in einer einzigen Fokusposition integriert^34,35. Diese Konfiguration ermöglicht ein einfacheres und genaueres fluoreszenzgesteuertes Fräsen im Vergleich zu nicht koinzidenten Integrationen, da optische und Ionenbilder nicht mehr registriert werden müssen. Unter idealen Bedingungen mit geringem Hintergrund und hohem Signal kann eine Führungsgenauigkeit in der Größenordnung von 10 nm erreicht werden³⁶. Es ermöglicht auch die Erfassung von mehrfarbigen kryogenen Fluoreszenzmikroskopiedaten während des gesamten Mahlprozesses, einschließlich der endgültigen dünnen Lamelle, was eine korrelative Analyse und Lokalisierung von subbeugungsbegrenzten Zielen^{ermöglicht 35}. Um dies zu erreichen, verwenden wir ein maßgeschneidertes Bildtransformations-Toolkit, um diese Fluoreszenzbilder präzise mit der Transmissionselektronenmikroskopie mit geringer Vergrößerung auszurichten, um zu bestimmen, wo CryoET gesammelt werden soll, um die Datenerfassung zu rationalisieren und die Zielerfassung in den endgültigen tomographischen Rekonstruktionen sicherzustellen.

Um das Fräsen zu steuern, nutzen wir die Fähigkeit des Systems, Änderungen der Fluoreszenzintensität in Echtzeit zu überwachen. Anstatt zu versuchen, optische und Ionenbilder auszurichten, um unser Ziel zu finden, beobachtet der Benutzer einfach das Fluoreszenzsignal der Probe. Mit fortschreitendem Fräsen verhält sich die Fluoreszenz auf sehr charakteristische Weise: Sie wird zunächst heller, wenn der Kohlenstoffstützfilm zwischen dem Mikroskopobjektiv und der fluoreszenzmarkierten Probe entfernt wird, nimmt dann allmählich ab, wenn unscharfes autofluoreszierendes Material weggefräst wird, und nimmt schließlich stark ab, wenn die markierte Struktur selbst teilweise entfernt wird. Dieses Echtzeitsignal bestimmt genau, wo man sich im Fräsprozess befindet und wann das Fräsen gestoppt werden muss, und stellt sicher, dass das zu untersuchende Ziel in der endgültigen Lamelle³⁷ gehalten wird. Im detaillierten Protokoll werden wir auch einen fortschrittlicheren Ansatz diskutieren, der Oszillationen in der Fluoreszenzhelligkeit aufgrund interferometrischer Effekte verwendet, um das Fräsen von Objekten mit einer axialen Ausdehnung von <300 nm zu führen.

Wir demonstrieren den Nutzen der Plattform, indem wir auf das Mikrotubuli-Organisationszentrum (MTOC)³⁸ abzielen. Das MTOC ist ein kritisches Organell, das an der Zellteilung und -differenzierung beteiligt ist. In Säugetierzellen zeigt die Fluoreszenzmikroskopie von markiertem Tubulin das MTOC als einzelnes fluoreszierendes Punctum mit einem Durchmesser von etwa 1 μm in lebenden Zellen. Dieser Ansatz wurde verwendet, um das MTOC erfolgreich mit hoher Genauigkeit an dünnen Lamellen vitrifizierter Zellen zu lokalisieren. Die detaillierte Organisation der Mikrotubuli am MTOC und ihre Wechselwirkungen mit anderen Organellen werden in nachfolgenden tomographischen Rekonstruktionen aufgedeckt. Dieser Arbeitsablauf ermöglicht eine hochpräzise korrelative Fluoreszenzmikroskopie und CryoFIB-REM ohne Registrierung, reduziert den Benutzeraufwand und erweitert den Zugang zu zellulären Strukturen, die bisher unerschwinglich klein waren, um sie mit nicht koinzidenten Ansätzen robust zu erfassen.

Definitionen und Gerätebeschreibung
Das integrierte optische Mikroskop wird in Boltje et ^al.35 ausführlich beschrieben, und weitere Details zur Verwendung des integrierten Mikroskops finden sich in einem kürzlich veröffentlichten Protokoll³⁴. Das Objektiv ist von unten integriert und mit x-, y- und z-Positionierungsfunktionen ausgestattet, um eine Ausrichtung auf den lagegleichen FIB-SEM-Punkt zu ermöglichen. Es arbeitet derzeit mit einem 100-fachen, 0,85 NA-Objektiv mit einem Deckglaskorrektor. Die optische Abbildung erfolgt durch ein Deckglas, das das Objektiv vor gesputtertem Material und Strahlung sowohl vom FIB als auch vom REM schützt. Die Weitfeldbeleuchtung wird durch einen Satz von LEDs gewährleistet, die mehrere sichtbare Wellenlängen abdecken. Die Fluoreszenzdetektion erfolgt mit einem sCMOS-Detektor. Es gibt drei definierte Tischpositionen: Belastung: die Tischposition, in die die Probe geladen wird; Beschichtung: die Tischposition für die Beschichtung über das Gasinjektionssystem; 3-Strahl: Die Tischposition, für die alle drei Mikroskope (FIB, REM und optische) gemeinsam ausgerichtet werden können.

Protokoll

HINWEIS: Bei dem hier verwendeten trikoinzidenten System handelt es sich um eine kundenspezifische kryogene Fluoreszenzbildgebungskomponente, die in ein kommerziell erhältliches Doppelstrahl-FIB-REM-System integriert ist. Das Prinzip und die Reihenfolge der Vorgänge können im Allgemeinen an zukünftige trikoinzidente Implementierungen angepasst werden.

1. Einrichtung

1. Kühlen Sie das System auf kryogene Temperatur. Überwachen Sie die Temperatur mit zwei Sensoren: einer befindet sich auf dem Probentisch und der andere in der Kammer. Halten Sie den Probentisch ca. 20 °C wärmer als die Kammer (z. B. Tisch bei ~-170 °C, Kammer bei ~-190 °C), um Eisbildung auf der Probe zu minimieren. Der Abkühlvorgang dauert in der Regel ca. 1,5 h.

2. Laden der Probe

1. Verwenden Sie flüssigen Stickstoff, um die Übergabestation manuell zu kühlen, sobald sich die Systemtemperatur der kryogenen Temperatur (ca. -167,5 °C) nähert. Die Systemtemperatur wird in der oberen linken Ecke der Lichtmikroskopie-Software angezeigt.
2. Legen Sie ein geclipptes Autogrid in die Probenkassette ein, die für das kryogene Lichtmikroskopiesystem ausgelegt ist. Die Kassette besteht aus einem verklebten Deckglas und einem Abstandshalter, zwischen denen das Autogrid positioniert ist. Verschließen Sie die Kassette, indem Sie die Ringschraube festziehen, und setzen Sie sie dann in den Schlitz an der Transferstation³⁴ ein.
3. Befestigen Sie die Transferstation an das System und verwenden Sie die interne Kammerkamera, um die Probenkassette auf den Probentisch zu führen.

3. Gasinjektionssystem (GIS) für die Probenbeschichtung

1. Öffnen Sie die Lichtmikroskopie-Steuerungssoftware und bewegen Sie den Probentisch von der Lade- in die Beschichtungsposition.
2. Führen Sie die GIS-Nadel mit der FIB-SEM-Steuerungssoftware ein, indem Sie auf das Schneeflockensymbol klicken. Wählen Sie unter GIS-Steuerung die Option GIS-Nadel einfügen aus.
3. Lassen Sie die GIS-Abscheidung für 30 s zu, indem Sie den Gasfluss öffnen.
   HINWEIS: Dies variiert je nach Probentyp zwischen 20 s und 1 min. Ziel dieses Schritts ist es, die Probe während des anschließenden FIB-Mahlvorgangs ausreichend zu schützen.
4. Ziehen Sie die GIS-Nadel ein, und bewegen Sie den Probentisch wieder in die vordefinierte Ladeposition .

4. Ausrichtung des Drei-Strahl-Systems

HINWEIS: Dieser Abschnitt ist eine Adaption von Wang³⁹.

1. Bewegen Sie in der Lichtmikroskopie-Software den Probentisch von der Belastungsposition in die vordefinierte 3-Strahl-Position .
2. Klicken Sie in der FIB-SEM-Software auf das obere linke Fenster und stellen Sie das REM auf eine 100-fache Vergrößerung ein.
3. Klicken Sie auf der Registerkarte Ausrichtung der Lichtmikroskopie-Software auf die Funktion Ansicht, um einen REM-Atlas des Rasters zu erhalten. Dieses Atlasbild verwendet zuvor eingestellte Parameter.
4. Identifizieren Sie einen quadratischen Bereich mit durchbrochenem Kohlenstofffilm und doppelklicken Sie darauf, um den Probentisch an diese Stelle zu verschieben.
5. Kehren Sie zur FIB-SEM-Steuerungssoftware zurück und stellen Sie das REM auf eine höhere Vergrößerung ein, um auf den ausgewählten quadratischen Bereich zu fokussieren, der im Sichtfeld zentriert ist.
6. Wiederholen Sie die Schritte 4.4 und 4.5 nach Bedarf, bis das REM auf ein erkennbares Muster fokussiert ist, z. B. die scharfe Kante eines durchbrochenen Kohlenstofffilms.
7. Schalten Sie das Fluoreszenzmikroskop ein und passen Sie die X-, Y- und Z-Koordinaten an die REM-Ansicht an.
8. Fräsen Sie mit dem FIB ein kleines Muster, z.B. ein kleines Rechteck oder einen Kreis.
9. Vergewissern Sie sich, dass das Muster sowohl in der FIB- als auch in der Fluoreszenzmikroskopansicht sichtbar ist. Passen Sie ggf. die Ausrichtung an, indem Sie die Schritte 4.3-4.7 befolgen.
   HINWEIS: Die Ausrichtung und Registrierung des optischen Mikroskops und des Ionenmikroskops ist abgeschlossen.

5. Ziellokalisierung und Fräsen

HINWEIS: Dieser Abschnitt ist eine Adaption von Wang³⁹.

1. Wechseln Sie zur Registerkarte Lokalisierung in der Lichtmikroskopie-Software und richten Sie Fluoreszenzkanäle ein, indem Sie die richtigen Anregungs- und Filterbedingungen aktivieren. Weisen Sie jedem Fluorophor einen separaten Kanal zu und fügen Sie einen zusätzlichen Kanal für Durchlicht (oder Hellfeld) hinzu.
2. Identifizieren Sie das gewünschte Ziel, indem Sie die LED-Leistung und die Belichtungszeit für jeden Leuchtstoffkanal einstellen. Als Referenz verwenden Sie bei der Bildgebung von SiR-Tubulin eine Belichtungszeit von 1,2 s mit einer konstanten LED-Leistungseinstellung von 30 mW.
   HINWEIS: Die Parameter können zwischen den Fluorophoren variieren. Die optische Intensität sollte bei der Probe unter ~25-50 W/cm² bleiben. Eine höhere Intensität kann zu einer erheblichen Erwärmung und Entglasung der Probe führen^37,40.
3. Wenn Sie mit den Parametern zufrieden sind, erwerben Sie einen fluoreszierenden Z-Stack für das Vorfräsen, der in axialer Richtung verläuft. Markieren Sie dann das Ziel als ROI.
4. Wechseln Sie zur FIB-SEM-Software, um eine Lamelle mit dem ROI zu zeichnen.
5. Führen Sie ein Schruppfräsen durch, um das Volumen des Materials etwa 3 μm über und unter dem ROI zu entfernen. Lassen Sie in der Zwischenzeit das Fluoreszenzmikroskop während des Fräsens eingeschaltet, um eine Abnahme des Fluoreszenzsignals zu überwachen.
6. Verdünnen Sie den ROI mit dem Reinigungsquerschnittsmodus auf ~2 μm.
7. Öffnen Sie das Python-basierte interferometrische Toolkit über das Terminal, um das Fluoreszenzsignal zu überwachen, während die Lamelle ausgedünnt wird (https://github.com/pdahlb/trico_softwaresuite⁾³⁶.
8. Für das anschließende Fräsen und Polieren folgen Sie einem der beiden unten in den Schritten 5.9 oder 5.10 beschriebenen Ansätze, um das Direktfräsen basierend auf den Abmessungen der ausgewählten Ziele durchzuführen.
   1. Axiale Ausdehnung des Ziels > 300 nm
      HINWEIS: Hier werden wir einen halbdestruktiven Ansatz für das Direktfräsen verwenden.
      1. Wählen Sie in der Python-GUI das gewünschte Ziel in der Fluoreszenzmikroskopaufnahme aus. Die Software beginnt automatisch mit der Darstellung der Helligkeit als Funktion der Zeit bei jedem neuen Frame.
      2. Überwachen Sie die Fluoreszenzintensität mit dem Python-Toolkit. Fräsen Sie die Probe im Reinigungsquerschnittsmodus von unten, um gegebenenfalls restliches Stützfolienmaterial zu entfernen.
         HINWEIS: Wenn die Stützfolie entfernt wird, sollte eine Verstärkung der Fluoreszenz beobachtet werden.
      3. Verwenden Sie schnelle Abfälle der Fluoreszenzintensität – was auf den Verlust von fluoreszierendem Material hinweist – als Hinweis darauf, wann die Fräsrichtung gewechselt werden sollte. Wenn z.B. das Fräsen von unten nach oben beobachtet wird und eine starke Abnahme der Fluoreszenz beobachtet wird, stoppen Sie das Fräsen und wechseln Sie zum Fräsen von oben nach unten.
         HINWEIS: Wenn eine Struktur zu schnell entfernt wird, reduzieren Sie den Frässtrom in der FIB-SEM-Software, um das Entfernen des Ziels zu verlangsamen.
   2. Axiale Ausdehnung des Ziels ≤ 300 nm
      HINWEIS: Hier wird der interferometrische Effekt zum Direktfräsen³⁶ verwendet.
      1. Wählen Sie in der Python-GUI das gewünschte Ziel in der Fluoreszenzmikroskopaufnahme aus. Die Software beginnt automatisch mit der Darstellung der Helligkeit als Funktion der Zeit bei jedem neuen Frame.
      2. Beginnen Sie damit, von oben nach unten durch ein Testtarget zu fräsen. Überwachen Sie den Streifenkontrast, bevor Sie durch die Fluoreszenzintensität durch das Ziel fräsen. Das Fluoreszenztarget wird kontinuierlich an einen 2D-Gauß-Ton angepasst, wobei die Anpassung verwendet wird, um eine integrierte Intensität zu erhalten, die dann aufgetragen wird.
      3. Nachdem das Target durchgefräst wurde, passen Sie die Schwingungen in der Intensitätskurve mit der Python-GUI an die folgende Modellfunktion an:
         
         Dabei ist A die Amplitude der Schwingung, λ die Wellenlänge der Anregung, k ein Dämpfungsterm, der die Kohärenzlänge der Lichtquelle darstellt, ein Phasenfaktor Φ und d die Entfernung zum Einfangobjekt. Vom Testziel aus können alle Terme in vernünftigen Grenzen vorhergesagt werden, so dass die Entfernung d die einzige freie Variable ist, die verwendet wird, um dem Benutzer mitzuteilen, wo sich das fluoreszierende Objekt relativ zu seiner Fräsung befindet. Siehe Sica et al. für weitere Einzelheiten³⁶.
         HINWEIS: Für nachfolgende Ziele passt das Toolkit die Intensitätskurve mit derselben Modellfunktion an und schätzt, wo das Fräsen von oben nach unten gestoppt werden muss. Alle Beschläge erfolgen gleichzeitig mit dem Fräsen. Ziel ist es, das Fräsen zu stoppen, wenn das Ziel in einer Tiefe liegt, die der Hälfte der gewünschten Lamellendicke unter der Oberseite entspricht.
      4. Nachdem das Top-Down-Fräsen abgeschlossen ist, finalisieren Sie die Lamelle, indem Sie von unten nach oben im Reinigungsquerschnittsmodus fräsen, bis die gewünschte Dicke erreicht ist.
9. Nehmen Sie ein Fluoreszenzbild nach dem Fräsen auf.

6. Sammlung von korrelativen Lichtmikroskopie- und Tilt-Serien

1. Nachdem Sie die Probe an CryoTEM übertragen haben, erstellen Sie einen Atlas-Überblick über das Gitter bei 182x, um eine ausreichende Abdeckung des gesamten Gitters zu ermöglichen.
2. Nehmen Sie bei einer geeigneten Zwischenvergrößerung von 6.500x bis 11.000x eine Reihe von Montagebildern der endgültigen Lamelle bei 0° Neigung auf.
3. Lesen Sie die Mehrkanal-Fluoreszenzbilder nach dem Fräsen und das Projektionsbild aus Schritt 6.2 in eine benutzerdefinierte projektive Transformationssoftware für die ROI-Registrierung (https://github.com/pdahlb/CLEM_software_suite.git).
4. Wählen Sie insgesamt 8-10 Paare von Referenzpunkten aus, um die projektive Bildtransformation präzise zu berechnen.
   HINWEIS: Bei diesen Punkten kann es sich um offensichtliche Merkmale handeln (z. B. Lamellenkanten, sichtbare Eiskontamination oder offene Gitterlöcher), die sowohl in der optischen Hellfeldmikroskopie als auch in der Elektronenmikroskopie vorhanden sind.

7. Sammlung von Neigungsserien mit hoher Vergrößerung

1. Verwenden Sie dieses überlagerte Fluoreszenz- und Transmissionselektronenmikroskopiebild als Referenz für Benutzer, um einen Bildbereich innerhalb der Grenzen der Kamerarahmengröße für die Tilt-Reihenerfassung mit hoher Vergrößerung auszuwählen.
2. Wählen Sie die Vergrößerung und die Parameter der Neigungsreihe basierend auf der biologischen Fragestellung.
   HINWEIS: Für die Demonstration haben wir Daten von 54° mit 2°-Schritten bei einer Pixelgröße von 3,5 Å 41,42,43 gesammelt.

Ergebnisse

Wir markierten differenzierte Makrophagenzellen vor dem Einfrieren mit dem Tubulin-Marker SiR-Tubulin. Gemäß dem Protokoll identifizierten wir das MTOC unter dem Fluoreszenzmikroskop als einzelnes fluoreszierendes Punctum mit einem Durchmesser von ~ 1 μm (Abbildung 1A). Zusätzlich beobachteten wir fibrillenartige fluoreszierende Strukturen, die vom MTOC in Richtung Zellperipherie strahlen, was mit dem Mikrotubuli-Netzwerk übereinstimmt (Abbildung 1A). Schrittweise Frässchnappschüsse bei unterschiedlichen Probendicken sind in Abbildung 1B dargestellt. Bemerkenswert ist, dass, als die Lamelle eine Dicke von etwa 800 nm erreichte, das einzelne MTOC-Punctum in zwei benachbarte Flecken mit jeweils etwa 700 nm Durchmesser auflöste. Die anschließende Analyse bestätigte, dass jeder Speckle einer einzelnen Zentriole entsprach.

Die gleichzeitige Bildgebung und das Fräsen ermöglichten es uns, Änderungen der Fluoreszenzintensität in Echtzeit zu überwachen. Insbesondere beobachteten wir einen Anstieg der Fluoreszenz nach der Entfernung von nicht fluoreszierendem Material und dem absorbierenden Trägerfilm (Abbildung 1B-D). Als die Lamelle von 2 μm auf 800 nm verdünnt wurde, nahm die Fluoreszenzintensität stark ab, was die fortschreitende Entfernung der markierten Strukturen widerspiegelt. Dieser Rückgang setzte sich fort, als die Lamelle weiter unter 200 nm ausgedünnt wurde (Abbildung 1B-D). Das korrelierte Fluoreszenzbild und der elektronenmikroskopische Atlas zeigen, dass unser Workflow eine präzise Ausrichtung für das Fräsen ermöglicht (Abbildung 2A). Rekonstruierte Tomogramme und segmentierte Modelle zeigen, dass die Zentriolen aus Mikrotubuli-Tripletts bestehen, was mit früheren Berichten^{übereinstimmt} 42,43,44,45 (Abbildung 2A,B). In Fällen, in denen nur ein fluoreszierender Fleck in der endgültigen Lamelle erhalten ist, beobachten wir ein einzelnes Zentriol im entsprechenden Tomogramm (Abbildung 2B).

Abbildung 1: Arbeitsablauf von trikoinzidentem CryoFM-FIB-SEM zur präzisen Lokalisierung des Mikrotubuli-organisierenden Zentrums. (A) (links) Lebendzellmikroskopie und (rechts) CryoFM des MTOC. Maßstabsleiste = 10 μm. (B) Schrittweise Schnappschüsse von CryoFM und CryoFIB für das gezielte Fräsen. Die Nahaufnahme der FM-Ansicht wird durch gelbe gestrichelte Felder angezeigt. Zentriolen sind als gelbe Pfeile markiert. Maßstabsleiste = 5 μm. (C) Fluoreszenzintensität von MTOC während des CryoFIB-Fräsens. (D) Fluoreszenzlinienprofil über das MTOC, das in verschiedenen Stadien während des CryoFIB-Mahlens aufgenommen wurde. Abkürzungen: CryoFM-FIB-SEM = Kryogene Fluoreszenzmikroskopie mit fokussiertem Ionenstrahlfräsen und Rasterelektronenmikroskopie; MTOC = Mikrotubuli-organisierendes Zentrum; ROI = Region von Interesse. Diese Abbildung ist eine Adaption von Wang³⁹. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Molekulare Details des MTOC, die durch einen trikoinzidenten CryoFM-FIB-SEM-Workflow aufgedeckt wurden. (A) Korreliertes FM-, EM- und Segmentierungsmodell des MTOC. (a) FM-Bild nach dem Fräsen. Dies ist das gleiche Bild aus dem letzten Ausschnitt von Abbildung 1B , markiert als 180 nm, aber gedreht, um der CryoET-Rekonstruktion und -Segmentierung zu entsprechen. Maßstabsleiste = 5 μm; (b) Vergrößerte Ansicht des gestrichelten Bereichs in Gelb von (a). c) Korrelierte FM- und TEM-Projektion der gestrichelten Fläche in Cyan (siehe Nummer 2). Maßstabsbalken = 1 μm. (d) Segmentiertes Modell der tomographischen Rekonstruktion in der interessierenden Region (gelb, Zentriole; grün, Mikrotubuli). Maßstabsleiste = 100 nm. (B) Repräsentative FM-Bilder und tomographische Schnitte von zwei verschiedenen Lamellen, die unterschiedliche Zentriolausrichtungen darstellen. FM: Maßstabsleiste = 5 μm. Tomographische Schnitte: Maßstabsbalken = 200 nm. Abkürzungen: CryoFM-FIB-SEM = Kryogene fokussierte Ionenstrahlfräsung mit Rasterelektronenmikroskopie; MTOC = Mikrotubuli-organisierendes Zentrum; FM = Fluoreszenzmikroskopie; ET = Elektronentransmission; TEM = Transmissionselektronenmikroskopie. Diese Abbildung ist eine Adaption von Wang³⁹. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Unsere Ergebnisse unterstreichen den Nutzen der Tri-Coinzident-Imaging-Plattform, die gleichzeitiges Fluoreszenz-Imaging und Fräsen ermöglicht. Unter Nutzung dieses Feedbacks demonstrieren wir zwei fluoreszenzgesteuerte Mahlstrategien – halbdestruktiv und interferometrisch –, die umständliche und registrierungsbasierte Ansätze überflüssig machen, die grundlegende Genauigkeitseinschränkungen in Bezug auf Brechungsindexabweichungen und Bewegungen während des Fräsens aufweisen 12,33,46. Da die genaue Führung auf der Fluoreszenzmikroskopie und nicht auf dem REM beruht, führt die optische Strahlung nicht zu nachweisbaren Schäden, solange die Intensität unter dem Schwellenwert gehalten wird, der zur Entglasung führt^37,47. Die hier demonstrierten Fähigkeiten erweitern die zugänglichen biologischen Proben um seltene und kleine (<300 nm axiale Ausdehnung) interessante Ziele und rationalisieren gleichzeitig den Arbeitsablauf.

Der wichtigste Schritt in diesem Protokoll besteht darin, anhand von Änderungen der Fluoreszenzhelligkeit eines Ziels von Interesse zu bestimmen, wann das Mahlen gestoppt werden soll. Derzeit ist dies ein schneller manueller Eingriff erforderlich, um das Fräsen zu den gewünschten Zeiten zu stoppen. Diese Methode hat sich für die aktuellen Ziele, die erforscht wurden, als ausreichend erwiesen, aber zukünftige Modifikationen könnten das Python-Toolkit weiter in das FIB-System integrieren, um das Fräsen direkt zu stoppen. Diese Modifikation kann erforderlich sein, wenn schnellere Fräsgeschwindigkeiten erforderlich sind, da dadurch weniger Zeit für manuelle Eingriffe bleibt. Wenn langsamere Fräsgeschwindigkeiten toleriert werden können, bleibt bei Bedarf mehr Zeit für manuelle Eingriffe.

Nach der Generierung lamellenhaltiger biologischer Strukturen, die von Interesse sind, ermöglicht unsere maßgeschneiderte Bildtransformationssoftware eine Korrelation auf CryoTEM-Ebene, indem sie Atlasübersichten von Lamellen verwendet, um die CryoET-Datenerfassung zu leiten. Insgesamt ist das hier vorgestellte Protokoll essentiell für die Abbildung fluoreszenzmarkierter, kleiner und seltener biologischer Ziele durch kryogene Elektronentomographie in dicken eukaryotischen zellulären Proben. Im Vergleich zu bestehenden nicht zusammenfallenden Kryo-FIB-Systemen, wie z. B. dem Aquilos 2 mit iFLM, erzielt unser Workflow eine höhere Erfolgsquote bei der Ausrichtung auf diese Merkmale.

Diese hohe Zielgenauigkeit geht auf Kosten der Effizienz. Da das Fräsen nicht automatisiert, sondern manuell erfolgt, ist der Durchsatz bei der Lamellenerzeugung begrenzt. In einer 8-stündigen Mahlsitzung produzieren wir in der Regel 6-8 Lamellen, von denen etwa fünf ein interessantes Ziel enthalten. Wir glauben jedoch, dass dieser Workflow in Zukunft automatisiert werden könnte, um den Durchsatz zu verbessern. Die Automatisierung würde benutzerdefinierte Skripte erfordern, um aktive Fräsbereiche im FIB-Bild kontinuierlich zu überwachen und die Fluoreszenzintensität in Echtzeit zu verfolgen, um die Zielretention zu gewährleisten. Die wichtigsten Herausforderungen bleiben bestehen, darunter die Einrichtung einer effektiven Kommunikation zwischen allen benutzerdefinierten Skripten und der Steuerungssoftware sowohl für das CryoFIB-REM als auch für das Fluoreszenzmikroskop.

Mit Blick auf die Zukunft gibt es noch viel zu tun, um andere fortschrittliche Fluoreszenzmikroskopietechniken zu integrieren, die bereits erwähnt wurden, einschließlich fluoreszierender Biosensoren, hochauflösender Bildgebung und konfokaler Mikroskopie. Nichtsdestotrotz gehen wir davon aus, dass trikoinzidente Geometrien in zukünftigen Instrumenten zum Standard werden und dass die simultane Fluoreszenzbildgebung während des Fräsens zur Routine wird. Wenn ja, könnte dieses Protokoll als wertvoller Leitfaden für Forscher dienen, die molekulare Details der kleinen und seltenen biologischen Strukturen erfassen wollen, die trotz ihrer Größe und Häufigkeit für die Zellbiologie von zentraler Bedeutung sind.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Aquilos 2 Kryo-FIB	ThermoFisher Scientific		https://www.thermofisher.com/us/en/home/electron-microscopy/products/dualbeam-fib-sem-microscopes/aquilos-cryo-fib.html?cid=msd_ls_xseg_xmkt_sdb-aquilos_285811_na_pso_gaw_pei90m & gad_source=1& gad_campaignid=12 764255901& gbraid=0AAAAADxi_GS s7OvZmg4cgCUm0PjSiq9X9& gclid= Cj0KCQjwh5vFBhCyARIsAHBx2w xlIfYHMvqY3sSWu6oEAdUynCSf9 KRg9Jhjp7l0Dot9qTl6GyQaEo8aAiy 2EALw_wcB
Autogrid-kompatible Kryo-Gridbox	Elektronenmikroskopiewissenschaften		https://www.emsdiasum.com/autogrid -compatible-cryo-grid-box?srsltid= AfmBOorQAd3esD8fLmnDDO2TvrNk cj4UINXFnPSMgrpEmkWd0H7ImUq7
Autogitterringe und C-Clips	Nanosoft		https://www.nanosoftmaterials.com/product-page/100-pack-autogrid-rings-c-clips
CLEM-Softwaresuite	Dahlberg-Forschungsgruppe an der Stanford/SLAC		https://github.com/pdahlb/CLEM_software_suite.git
Libelle 2022.1	Objektforschungssysteme		https://dragonfly.comet.tech/
ENZEL	Delmic B. V.		Das ENZEL-System ist ein maßgeschneidertes Instrument und derzeit nicht kommerziell erhältlich
IMOD 4.12	Universität von Colorado		https://bio3d.colorado.edu/imod/
LD4 flüssiger Stickstoff-Dewar	Nanosoft		https://www.nanosoftmaterials.com/product-page/ld4-liquid-dewar-4-liters
MATLAB 2023	MathWorks		https://www.mathworks.com/products/matlab.html
Pindeckel-Manipulatorwerkzeug	Nanosoft		https://www.nanosoftmaterials.com/product-page/pin-lid-manipulator-tool
Python-Toolkit	Dahlberg-Forschungsgruppe an der Stanford/SLAC		https://github.com/pdahlb/trico_softwaresuite
Quantifoil R2/2, LF, 200 Mesh, Au EM Gitter	Elektronenmikroskopiewissenschaften		https://www.emsdiasum.com/quantifoil-r-22-lf-200-mesh-gold
Seriell-EM	Universität von Colorado Boulder		https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/
Spearlab-Standardschiff (Transfer-Dewar)	Nanosoft		https://www.nanosoftmaterials.com/product-page/spearlab-standard-vessel
Pinzette	Elektronenmikroskopiewissenschaften		https://www.emsdiasum.com/style-3sa