Im lebenden Organismus Calcium-Bildgebung von neuronalen Ensembles in Netzwerken primärer sensorischer Neuronen in intakten Trigeminusganglien

Primäre sensorische Neuronen innervieren direkt Gewebe, einschließlich der Haut, und leiten sensorische Signale an das zentrale Nervensystem (Rückenmark oder Hirnstamm) weiter. Neuronen des Trigeminusgangliums (TG) innervieren den Kopf und reagieren auf sensorische Reize, einschließlich Schmerzen von den Zähnen, der periorbitalen Region, der orofazialen und kraniofazialen Region, dem Kiefergelenk ^1,2 und den Hirnhäuten ^3,4,5. TG-Neuronen variieren in Größe, Myelinisierungsgrad und Genexpressionsprofilen 6,7,8,9. Kleinere Neuronen sind nozizeptiv, während größere Neuronen im Allgemeinen auf nicht schmerzhafte mechanische Reize reagieren^10,11. Eine Dysfunktion der Neuronen des Trigeminusganglien kann sowohl die Neuronen selbst als auch die sensorischen Neuronen des Zentralnervensystems (ZNS) sensibilisieren^11,12.

In einem normalen physiologischen Kontext unter nicht-pathologischen Bedingungen sind feuernde Neuronen in vivo für Schmerzen notwendig, aber bis in die letzten zwei Jahrzehnte waren Werkzeuge zur Untersuchung intakter sensorischer Ganglien in vivo auf die gleichzeitige Überwachung relativ weniger Neuronen beschränkt¹³. Aufgrund der normalerweise niedrigen zytoplasmatischen Calciumkonzentrationen, des Calciumeinstroms während der Aktionspotentiale und der Verwendung von Calcium als zytoplasmatisches Signal ist die Calciumdynamik ein leistungsfähiger Ersatz für die Überwachung von Aktionspotentialen oder zellulärer Aktivität in vivo unter Verwendung von calciumsensitiven Fluoreszenzindikatoren. Der Grundgedanke für diese Methode ist, dass die Fluoreszenzmikroskopie diese Indikatoren gleichzeitig in Hunderten bis Tausenden von Neuronen in peripheren sensorischen Ganglien von Mäusen überwachen kann^{: 13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24} und Ratten^25,26. Dies ist ein großer Vorteil gegenüber Methoden, die eine begrenztere Anzahl von Neuronen in vivo überwachen können.

Das Ziel dieser Methode ist die direkte Beobachtung der zytoplasmatischen Ca2⁺-Dynamik in vivo im TG als Reaktion auf mechanische, temperaturbezogene, chemische und hormonelle Reize in Kopfschmerzmodellen 19,23,24. Diese Methode kann als Ergänzung zu Schmerzen oder anderen somatosensorischen Tests im orofazialen Bereich eingesetzt werden. In vivo wurde trigeminale Ca2⁺-Bildgebung verwendet, um die thermische und sensorische Kodierung zu charakterisieren^19,22, Klassen von Mechanorezeptoren^{zu untersuchen 27}, eine neue Klasse mechanosensitiver Neuronen^{zu entdecken 28}, trigeminale Reaktionen auf normale mechanische Belastungen der Hirnhäute zu überwachen²⁹, die Auswirkungen von Hormonen auf die Schmerzempfindlichkeit^{zu untersuchen 24}, orofaziale Schmerzmodelle zu charakterisieren³⁰und Studienbeitragende zu alkoholentzugsinduzierten Schmerzen²³.

Pirt-GCaMP3-Mäuse ermöglichen die Überwachung der neuronalen Aktivität in vivo, da sie den Ca2⁺-Sensor GCaMP3 in die Promotorregion des Pirt-Gens eingefügt haben, der in allen (>95%) primären sensorischen Neuronen stark exprimiert wird^12,18. In dieser Arbeit wird eine Technik zur Durchführung einer chirurgischen Exposition von in vivo TG und zur Sammlung und Analyse von Calcium-Indikatormikroskopiedaten für die rechte TG von Pirt-GCaMP3-Mäusen mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie demonstriert.

Alle hier beschriebenen Verfahren werden gemäß den vom Institutional Animal Care and Use Committee genehmigten Protokollen durchgeführt. Bei der Operation geht es nicht um das Überleben. Die Abschnitte 1 und 2 dieses Verfahrens müssen sofort nach Beginn des Verfahrens durchgeführt werden. Abschnitt 3 kann zu einem späteren Zeitpunkt durchgeführt werden.

1. Fixierung und Operation der Maus für die TG-Bildgebung auf der rechten Seite

HINWEIS: Pirt-GCaMP3 C57BL/6J Mäuse¹⁸ müssen unabhängig vom Geschlecht eine erwachsene Körpergröße haben (normalerweise 8 Wochen oder älter). Eine bilaterale TG-Bildgebung ist möglich. Die hier aufgeführten Zeiten sind Schätzungen eines erfahrenen Technikers. Wenn die Blutung mehr als normal ist, kann es für jede Zeit einige Minuten länger dauern.

1. Bereiten Sie eine sterile Kochsalzlösung mit 40 mg/ml Ketamin und 6 mg/ml Xylazin vor. Bereiten Sie nach der Bildgebung genügend Volumen für die Operation und Euthanasie vor (mindestens 9 μl pro Gramm Körpergewicht der Maus).
   HINWEIS: Bei der In-vivo-Bildgebung wurden viele Arten von Anästhesie eingesetzt. Achtung: Ketamin ist schädlich, wenn es injiziert, verschluckt oder mit den Augen in Berührung kommt. Mit Vorsicht behandeln.
2. Sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente in einem Bead-Sterilisator. Waschen Sie die Instrumente mit 70% Ethanol.
   HINWEIS: Alternativ können Sie die Instrumente vorher autoklavieren.
3. Injizieren Sie Pirt-GCaMP3-Mäusen 15-25 Minuten vor der Operation 2,25 μl Ketamin/Xylazin pro Gramm Körpergewicht (90 mg/kg bzw. 13,5 mg/kg Ketamin bzw. Xylazin). Überschreiten Sie nicht 120 mg/kg Ketamin.
4. Nach 15-25 Minuten Narkoseinjektion (Schritt 1.3) kneifen Sie die Hinterpfote mit einer Pinzette, um sicherzustellen, dass sich die Maus in einer chirurgischen Narkoseebene befindet.
   HINWEIS: Das Kneifen sollte intensiv genug sein, um bei einer bewussten Maus Lautäußerungen hervorzurufen, aber nicht stark genug, um Verletzungen zu verursachen. Es ist wichtig, die Maus nicht länger als nötig in diesem Schritt zu lassen, um einen Abfall der Körpertemperatur zu vermeiden. Es ist hilfreich, den Käfig warm zu halten, wenn möglich.
5. Legen Sie die Maus auf ein Heizkissen, um sicherzustellen, dass die Körpertemperatur bei 37 °C gehalten wird, und legen Sie den Kopf der Maus in eine stereotaktische Maske (Abbildung 1A, B), wobei der Kopf um ca. 15° nach links geneigt ist (Abbildung 1B).
   HINWEIS: Eine stereotaktische Maske, die sowohl den Kopf stabilisiert als auch einen Weg zur Verabreichung von Isofluran bietet, wird hier beschrieben. Wenn bei einem Verfahren kein Isofluran verwendet wird oder keine stereotaktische Maske verwendet wird, sollte eine andere Methode zur Stabilisierung des Kopfes angewendet werden, um Bewegungen zu verhindern.
6. Tragen Sie eine Augensalbe auf die Augen auf, um Trockenheit und Reizungen vorzubeugen, da Reizungen die Aktivität des Trigeminusnervs induzieren.
7. Rasieren Sie die rechte Seite des Kopfes der Maus.
   HINWEIS: Dieser Schritt dauert 90 s. Der Untersucher kann das Tier kurz vom Heizkissen nehmen, um es zu rasieren.
8. Machen Sie einen rechteckigen Schnitt von 9 mm x 5 mm zwischen dem rechten Ohr und dem rechten Auge (Abbildung 2A). Stoppen Sie die Blutung mit einem hämostatischen Tupfer oder einem Labortuch.
   HINWEIS: Dieser Schritt dauert 2 Minuten. Der Untersucher kann eine hämostatische Zange oder einen Retraktor verwenden, um den Schnitt offen zu halten. Dies ist ein Verfahren, das nicht überleben kann, was bedeutet, dass eine zusätzliche Reinigung nicht erforderlich ist. Der Untersucher kann jedoch die Operationsstelle mit Povidon-Jod abtupfen. Es wird die größte zulässige Schnittgröße angegeben. Wenn der Chirurg ausreichend qualifiziert ist, ist ein kleinerer Schnitt einem größeren Schnitt vorzuziehen, um Gewebeschäden zu minimieren. Das TG innerviert dieses Gewebe und könnte geschädigt werden.
9. Schneiden Sie das Gewebe (Periost) auf der Schädeloberfläche direkt ventral zum Auge (Abbildung 2B).
10. Bohren Sie mit einem Zahnbohrer und einer Kegelfissur TNT Bur 31p ein Loch von ca. 9 mm x 5 mm in den dorsalen Schädel, das auf der Inzisionsstelle zentriert ist (Abbildung 2C). Tragen Sie den Bohrer so leicht wie möglich auf die Schädeloberfläche auf.
    HINWEIS: Dieser Schritt dauert ca. 2 Minuten. Wenn der Chirurg ausreichend qualifiziert ist, ist ein kleineres Loch einem größeren Loch vorzuziehen.
11. Neigen Sie den Kopf, bis der TG deutlich sichtbar ist (Abbildung 2C). Wenn es zu Blutungen auf dem TG kommt, aspirieren Sie das Blut oder entfernen Sie das Blut, indem Sie es mit einem hämostatischen Tupfer oder einem Labortuch reinigen. Stellen Sie sicher, dass das TG deutlich sichtbar ist, ohne kortikales Gewebe zu entfernen (Abbildung 2C).
    HINWEIS: Wir bilden TG routinemäßig für 3-6 Stunden oder länger ab, ohne Anzeichen von Stress in den Neuronen, aber ein Forscher kann sich dafür entscheiden, ein Deckglas oder eine andere Abdeckung zu platzieren, um ein Austrocknen des TG zu verhindern.
12. Bewegen Sie das Tier und das Heizkissen auf den Mikroskoptisch und setzen Sie die Nase der Maus in den stereotaktischen Nasenkegel ein. Schließen Sie die Sauerstoff-/Isofluranleitungen so an, dass die Maus eine kontinuierliche Isofluran-Anästhesie erhält (Abbildung 3A).
    HINWEIS: Dieser Schritt dauert 3 Minuten. Kontinuierliches Isofluran erfordert Sauerstofftanks, Gasabgabeschläuche und einen Anästhesieverdampfer. Es ist auch möglich, die Anästhesie während des gesamten Eingriffs durch regelmäßige Injektionen von Anästhetikum aufrechtzuerhalten.
13. Positionieren Sie den stereotaktischen Rahmen so, dass sich das Objektiv des Mikroskops 9 mm direkt über der Schädelöffnung befindet (Abbildung 3B).
    HINWEIS: Die genaue Entfernung hängt vom Objektiv, dem Mikroskop und der Maus ab.
14. Setzen Sie das Rektumthermometer ein. Verbinden Sie das Netzkabel mit dem Rektalthermometer und dem Heizkissen. Verbinden Sie die Anästhesiemaske mit dem Isofluran in der Sauerstoffleitung mit 1% Isofluran.

2. TG-Bildgebung

HINWEIS: Verwenden Sie die grüne Einstellung (FITC) 495 nm, Emission 519 nm, Detektionswellenlänge 500-580 nm, GaAsP-Pmt1-Bildgebungsgerät, GaAsP-PMT-Detektor oder verwenden Sie die empfohlenen Einstellungen für das Mikroskop. In Tabelle 1 finden Sie eine Zusammenfassung der Softwareeinstellungen.

1. Verwenden Sie ein 5x/0,25 M27-Objektiv, die Software des Mikroskopherstellers und ein vertikales konfokales Laser-Scanning-Mikroskop. Lokalisieren Sie die TG-Oberfläche mit dem Mikroskop.
   HINWEIS: Die Wahl des Objektivs hängt vom Mikroskop und den Vorlieben des Untersuchers ab.
2. Stellen Sie das Objektiv und den Nasenkonus so ein, dass die TG-Oberfläche so flach wie möglich ist und die größtmögliche Oberfläche in der Fokusebene entsteht.
   HINWEIS: Ein flacherer TG sorgt für ein schärferes Bild, bewirkt, dass die Software schärfere Filme erstellt, bildet mehr Neuronen ab und vereinfacht und verbessert die Genauigkeit der Analyse im Vergleich zu einem stärker geneigten TG.
3. Halten Sie die Maus unter Narkose, indem Sie 1-1,5% Isofluran auf den Sauerstofffluss durch die Anästhesiemaske auftragen.
   HINWEIS: Das Tier muss während des gesamten Eingriffs genau überwacht werden, indem die Hinterpfote alle 20-30 Minuten eingeklemmt wird, um sicherzustellen, dass das Tier unter Narkose bleibt. Der Prozentsatz an Isofluran, der zur Aufrechterhaltung der Anästhesie erforderlich ist, hängt von der einzelnen Maus ab. Bewegt sich das Tier während einer Testklemme, muss das Isofluran erhöht werden. Wenn die Atmung flach wird, muss der Isofluran verringert werden. ACHTUNG: Isofluran ist schädlich, wenn es eingeatmet wird, und kann Schwindel oder Schläfrigkeit verursachen. Vermeiden Sie das Einatmen und sorgen Sie für eine ausreichende Belüftung des Arbeitsbereichs.
4. Laden des Hochgeschwindigkeits-Scanprotokolls des Mikroskops: Voxelgröße 4,160 μm x 4,160 μm x 14 μm, 512 x 512 Pixel, 10 optische Schichten Z-Stack, 1,02 luftige Einheiten (AU)/33 μm, 15 % 488 nm Laserleistung/75 mW, Pixelzeit 1,52 μs, Zeilenzeit 0,91 ms, Bildzeit 465 ms, LSM-Scangeschwindigkeit 8, bidirektionales Scannen, GaAsP-PMT-Detektorverstärkung 550 V, Digitale Verstärkung 1.
   HINWEIS: Die optimalen Einstellungen können je nach Mikroskop und Tier variieren.
5. Scannen Sie den TG in kurzen Bursts von 6-8 Zyklen. Erstellen Sie orthogonale Projektionen der Scans (ein Scan ergibt ein Filmbild), um einen Film zu erstellen und die Bildschärfe und Konsistenz zwischen den Bildern zu überprüfen. Passen Sie bei Bedarf die stereoskopische Bildposition und die Dicke des optischen Schnitts an und wiederholen Sie diesen Schritt, bis ein klarer, konsistenter Film erstellt wird.
   HINWEIS: Dieser Schritt muss wiederholt werden, wenn sich der Kopf der Maus bewegt oder der Ermittler die Maus neu positioniert oder die Fokusebene anpasst.
6. Laden des hochauflösenden Scanprotokolls des Mikroskops: Voxelgröße 0,520 μm x 0,520 μm x 14 μm, 4096 x 4096 Pixel, Z-Stack mit 6 optischen Schichten, 1,02 Airy Unit (AU)/33 μm, 20 % Laserleistung 488 nm/100 mW, Pixelzeit 0,52 μs, Zeilenzeit 4,95 ms, Bildzeit 20,26 s, LSM-Scangeschwindigkeit 6, bidirektionales Scannen, GaAsP-PMT Detektor Verstärkung 550 V, digitale Verstärkung 1.
   HINWEIS: Die optimalen Einstellungen hängen vom Mikroskop und vom Tier ab. Wenn Zellen mit td-Tomato markiert sind, stellen Sie das Mikroskop so ein, dass es zusätzlich zum grünen Kanal den roten Kanal mit 592 nm Anregung / 614 nm Emission und die Detektionswellenlänge 600-700 nm abtastet.
7. Erstellen Sie ein hochauflösendes Bild des TG.
   HINWEIS: Dieses Bild kann nützlich sein, um Neuronen zu zählen, den Durchmesser von schwachen Neuronen zu messen oder ein detailliertes Bild zu liefern, um zu unterscheiden, ob dasselbe Neuron auf zwei verschiedene Reize oder zwei verschiedene Neuronen reagiert hat.
8. Laden Sie das Hochgeschwindigkeits-Scanprotokoll des Mikroskops (siehe Schritt 2.4).
9. Zeichnen Sie die spontane Aktivität für 80 Zyklen (ca. 10 min) auf. Erstellen Sie einen orthogonalen Projektionsfilm, und überprüfen Sie, ob die Bilder klar und konsistent genug sind, um sie analysieren zu können.
   HINWEIS: Dadurch werden genügend Frames erzeugt, um spontane Aktivitäten zu analysieren. Die Anzahl kann verringert oder erhöht werden, je nachdem, wie wichtig die spontane Aktivität für ein bestimmtes Experiment ist.
10. Um eine Stimulation anzuwenden, stellen Sie das Mikroskop so ein, dass es 15-20 Zyklen scannt.
    HINWEIS: Seien Sie vorsichtig, wenn Sie Stimuli anwenden, um den Kopf der Maus nicht zu bewegen. Eine Verschiebung des TG um auch nur Mikrometer während des Stimulus kann die Bildgebung stören. Das Scannen ermöglicht es Zyklen, eine Ausgangslinie, einen Stimulus zu etablieren und die Neuronen zu beobachten, nachdem der Stimulus entfernt wurde.
11. Warten Sie, bis die Zyklen 1 bis 5 abgeschlossen sind, um eine Baseline zu generieren. Wenden Sie die Stimulation während der Scans 6-10 an. Warten Sie mindestens 5 Minuten nach jedem Stimulus, um eine Desensibilisierung der Neuronen zu vermeiden.
    HINWEIS: Jeder Stimulus erfordert einen separaten Scan mit 15-20 Zyklen. Wenden Sie zuerst mechanische Stimulation an, gefolgt von Kälte-, Wärme- und chemischer Stimulation. Wenden Sie eine niederfrequente Stimulation (z. B. geringe mechanische Kraft, Temperatur nahe der Raumtemperatur) vor einer hochfrequenten Stimulation (hohe mechanische Kraft, Temperatur weit von Raumtemperatur entfernt) an. Achten Sie darauf, den TG bei der Stimulation nicht zu bewegen. Wenn Scans deutlich zu hören sind, kann unmittelbar nach Scan 5 eine Stimulation angewendet werden. Jede Methode, die ein konsistentes Timing der Stimulation bietet, funktioniert jedoch. Siehe die Diskussion über die Stimulus-Anordnung.
12. Bei von Frey in dem Bereich, der durch den V2-Teil des TG innerviert wird, halten Sie das Filament und tragen Sie es von unmittelbar nach Scan 5 bis unmittelbar nach Scan 10 wiederholt auf den ipsilateralen Bereich unterhalb des Auges und über dem Mund auf.
13. Bei von Frey in dem Bereich, der durch den V3-Teil des TG innerviert wird, halten Sie das Filament und tragen Sie es von unmittelbar nach dem Ende von Scan 5 bis unmittelbar nach dem Ende von Scan 10 wiederholt auf den ipsilateralen Bereich direkt unter dem Ohr auf.
14. Für Kälte- und Wärmereize kühlen oder erhitzen Sie das Wasserbecherglas auf leicht unter (für Kälte) oder über (für Wärme) die gewünschte Temperatur und beginnen Sie dann mit dem Scannen mit einer Kunststoff-Transferpipette. Wenden Sie den Stimulus mit der Transferpipette unmittelbar nach Scan 5 auf den ipsilateralen Bereich direkt unter dem Auge, über dem Mund (für V2) oder knapp unter dem Ohr (für V3) an.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Temperatur innerhalb von 1 °C der gewünschten Temperatur für Scan 5 liegt. Um eine Desensibilisierung der Neuronen zu vermeiden, wenden Sie den Stimulus nicht an, wenn die Becherglastemperatur nicht korrekt ist. Kühlen oder erwärmen Sie das Wasser stattdessen erneut und versuchen Sie es erneut.
15. Am Ende der Experimente injizieren Sie ab Zyklus 6 50 mM Kaliumchlorid subkutan in die V2- oder V3-Areale, um alle responsiven Neuronen zu aktivieren und zu identifizieren.
16. Nachdem alle Reize verabreicht und aufgezeichnet wurden, euthanasieren Sie das Tier durch Überdosierung von Ketamin/Xylazin (200 mg pro kg Ketamin, 30 mg pro kg Xylazin oder 5 μl pro g der in Schritt 1.1 hergestellten Lösung) und enthaupten Sie es dann.

3. Protokoll für die Analyse

1. Öffnen Sie die orthogonale Projektionsdatei mit der Option Drag & Drop . Wählen Sie den Bildtyp unter Bild | Typ | RGB-Farbe. Optional: Verwenden Sie das StackReg^31-Plugin unter Plugins | jars | StackReg zur Korrektur von Bewegungsartefakten und Ausrichtungen.
   HINWEIS: Der Prüfer kann den Bildtyp nach Belieben auswählen. RGB vereinfacht die Erstellung von Farbbildern für die Veröffentlichung.
2. Öffnen Sie den ROI-Manager mit Analysieren | Werkzeuge | ROI-Manager.
3. Wählen Sie aktive Neuronen aus, indem Sie mit dem Ellipsen- oder Rechteckwerkzeug in der Symbolleiste eine ROI zeichnen, und platzieren Sie sie dann in der ROI-Datei, indem Sie im ROI-Manager-Fenster auf die Schaltfläche Hinzufügen klicken oder die Taste "t" drücken.
   HINWEIS: Speichern Sie ROI-Dateien häufig. ROIs können wiederhergestellt werden, indem Sie die ROI-Datei per Drag & Drop in ImageJ ziehen und auf das Kontrollkästchen Alle anzeigen am unteren Rand des ROI-Manager-Fensters klicken. Das Speichern einer ROI-.zip-Datei vereinfacht die Analyse im Vergleich zum Speichern von ROIs als Overlay. Ein Neuron, das während der Baseline-Periode fluktuiert, sollte als spontan aktiv ausgeschlossen werden, anstatt auf den Stimulus zu reagieren.
4. Klicken Sie unter Analysieren | Messeinstellungen, aktivieren Sie Mittlerer Grauwert (optional, aber empfohlen: Deaktivieren Sie alle anderen Kontrollkästchen unter Messeinstellungen).
5. Verwenden Sie das ROI-Fenster in Mehr | Multi-Measure zur Messung der Intensität.
   HINWEIS: Manchmal sind benachbarte Neuronen zu nah, um einen separaten ROI zu zeichnen. Diese Neuronen können in die Anzahl der aktiven Neuronen einbezogen werden, aber nicht in transiente Intensitätsmessungen.
6. Multi-Measure generiert eine CSV-Datei in einem neuen Fenster mit der Bezeichnung "Ergebnisse". Speichern Sie die CSV-Datei, indem Sie auf Datei | Speichern unter. Öffnen Sie die .csv Datei mit einer Tabellenkalkulationssoftware und speichern Sie die Datei als Tabelle.
   HINWEIS: Eine Analysevorlage finden Sie in der ergänzenden Datei 1 .
7. Berechnen Sie die transiente Intensität von Ca²⁺ als ΔF/F₀ = (F_t- F₀)/F₀, wobei F_t die Pixelintensität im ROI zum interessierenden Zeitpunkt und F₀ die Basisintensität ist, die durch die mittlere Intensität der 2-4 Frames vor dem Ca²⁺ -Transienten für spontane Aktivität oder der ersten 1-5 Frames für stimulusinduzierte Ca²⁺ -Transienten bestimmt wird. Schließen Sie alle Neuronen aus, die vor der Stimulation Ca2⁺ -Peaks erzeugen, und analysieren Sie die Aktivität nach der Stimulation nicht.
8. Für die transiente Intensitätsanalyse von Ca²⁺ nehmen Sie nach dem Zufallsprinzip eine Stichprobe von ungefähr der gleichen Anzahl von Neuronen aus jedem Ganglion, um zu verhindern, dass die Ganglien, die die größte Anzahl ansprechender Neuronen erzeugen, die Analyse dominieren. Schließen Sie Peaks mit ΔF/F₀ < 0,15 aus.
   HINWEIS: Es gibt alternative veröffentlichte Methoden zum Analysieren und Ein- und Ausschließen der Neuronen 15,16,19,22,32,33,34,35.
9. Messen Sie den Neuronendurchmesser, indem Sie mit dem Linienwerkzeug in der Symbolleiste die durchschnittliche Länge einer in ImageJ gezeichneten Linie entlang des längsten und kürzesten Durchmessers berechnen.
   HINWEIS: Ein Prüfer kann auch die Fläche und die elliptischen Parameter von ROIs messen, um den Durchmesser zu schätzen.

Bildgebung einer großen Anzahl von Neuronen und spezifischen Trigeminusästen durch konfokales Scannen des Pirt-GCaMP Trigeminusganglions
Nach chirurgischer TG-Exposition bei Pirt-GCaMP3-Mäusen ermöglicht die konfokale Mikroskopie die gleichzeitige Bildgebung von über >3.000 Neuronen (Abbildung 4). Dies bietet den großen Vorteil, dass Tausende von TG-Neuronen gleichzeitig in ihrem normalen physiologischen Kontext beobachtet werden können. Spontane Ca2+ -Transienten können ohne Stimulation überwacht werden (Abbildung 4A, B und Video 1). Stimuli können auf Areale angewendet werden, die von V2 (Abbildung 4D, E und Video 2) oder V3 (Abbildung 4G, H und Video 3) innerviert werden. Spontane Ca2+ -Transienten (Abbildung 4C) und Transienten, die als Reaktion auf diese Stimuli auftreten (Abbildung 4F und Abbildung 4I), können überwacht werden.

Erhöhte Anzahl von Zellen, die Ca2+-Transienten erzeugen, und erhöhte Amplitude von Ca2+ -Transienten aufgrund stärkerer Stimuli
Starke Stimulation oder schädliche Hitze erhöht die Ca2+-Reaktionen. Im Vergleich zu 0,4 g von Frey-Filamenten erhöhte die Anwendung von 2 g Filamenten die Anzahl der Neuronen, die Ca2+-Transienten erzeugten (Abbildung 5A, gepaarter Student's t-Test t = 3,786, df = 6, p = 0,0091). Es gab auch einen Anstieg der mittleren ΔF/F0-Amplitude von Ca2+-Transienten (Abbildung 5B,C, Zwei-Wege-ANOVA-Zeit × Stimulus-Wechselwirkung F5,2796 = 3,605, df = 5, p = 0,0030) und der Amplitude während des ersten Stimulus-Frames (Šidáks Mehrfachvergleichstest, t = 3,758, df = 2796, bereinigt p = 0,0010).

Abbildung 1: Stereotaktische Anästhesie-Kopfhalterung mit Maske für die Bildgebung. (A) Foto des Mauskopfhalters mit der Anästhesiemaske, die mit einem Heizkissen auf eine Metallplatte geschraubt ist. Gezeigt werden der Zahnhalter und die Nasenkonus-/Anästhesiemaske. Das Heizkissen ist mit Alufolie überzogen, um Beschädigungen zu vermeiden. (B) Foto der Maus, die in der Anästhesiekopfhalterung zur Vorbereitung der Operation und Bildgebung um 15° geneigt ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Chirurgische Exposition des Trigeminusganglions für die Bildgebung. (A) Eine Maus mit einem kleinen Schnitt in der Haut. (B) Die Maus mit Gewebe, das aus dem Schädel gereinigt wurde, um ein Loch für die Freilegung des Trigeminusganglions vorzubereiten. (C) Das rechte Trigeminusganglion freigelegt und für die Bildgebung vorbereitet. Es wurde kein Hirngewebe entfernt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Platzieren der Maus auf dem Mikroskoptisch für die Bildgebung. (A) Die Maus in der stereotaktischen Apparatur auf dem Mikroskoptisch. Das Rektalthermometer und der Isofluranschlauch sind abgebildet. (B) Die Maus, die für die Bildgebung vorbereitet ist. Das Objektiv befindet sich ca. 9 mm über dem chirurgisch präparierten Loch im Schädel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Anwendung schädlicher Wärmereize auf Areale, die von den V2- (Oberkiefer) und V3 (Unterkiefer) Regionen des Ganglion trigeminus innerviert werden. (A) Summe der Intensitätsprojektion des TG über 200 Frames (in BildJ auf Bild |Stapel|Projekt Z|Projektionstyp|Sum Slices). (B) Maximale Intensitätsprojektion des TG über 200 Bilder (in ImageJ klicken Sie auf Bild |Stapel|Projekt Z |Projektionstyp|Maximale Intensität). Gelbe Pfeilbeschriftungen zeigen reagierende Neuronen an. (C) ΔF/F 0-Intensitätsdiagramme der sechs Neuronen, die durch Callouts in Feld B angezeigt werden. Jedes Neuron wird in einer anderen Farbe dargestellt. (D) Projektion der TG mit maximaler Intensität vor Applikation von 50 °C Wasser auf die durch den Bereich V2 innervierte Haut. (E) Maximale Intensitätsprojektion des TG bei Anwendung von 50 °C Wasser auf die von der Fläche V2 innervierte Haut. Gelbe Pfeilbeschriftungen zeigen reagierende Neuronen an. (F) ΔF/F0 Intensitätsdiagramme der sechs Neuronen, die durch Callouts in Feld E angezeigt werden (schädliche Wärme, die auf den von Bereich V2 innervierten Bereich ausgeübt wird). (G) Maximale Intensität der Projektion des TG vor Applikation von 50 °C Wasser auf die von der Fläche V3 innervierte Haut. (H) Maximale Intensitätsprojektion von TG bei Anwendung von 50 °C Wasser auf die durch den Bereich V3 innervierte Haut. Gelbe Pfeilbeschriftungen zeigen reagierende Neuronen an. (I) ΔF/F 0-Intensitätsdiagramme von sechs Neuronen, die mit Callouts in Panel H markiert sind (schädliche Wärme, die auf den von V3 innervierten Bereich ausgeübt wird). Maßstabsleisten = 200 μm (A,B,D,E,G,H). Abkürzungen: TG = Ganglion trigeminus; ΔF/F0 = Ca2+ transiente Intensität. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Ca2+-Aktivität, die durch zwei verschiedene Kräfte in dem von V2 innervierten Bereich induziert wird. (A) Grafik der Anzahl der Neuronen in sieben Ganglien, die von V2 innerviert wurden, mitCa2+-Transienten während 0,4 g von Frey- und 2 g von Frey-Anwendungen und der Differenz in der Anzahl der aktivierten Neuronen zwischen 2 g von Frey und 0,4 g von Frey in den sieben Ganglien. Mittelwert und SEM werden angezeigt. (B) Diagramm der ΔF/F0-Intensität von Ca2+-Transienten, die durch 0,4 g von Frey- (oben) und 2 g von Frey-Anwendungen (unten) in dem von V2 innervierten Bereich erzeugt wurden. Graue Linien sind einzelne Zellen, rote Linie ist die mittlere Intensität. (C) Diagramm der mittleren ΔF/F0-Intensität von Ca2+-Transienten, die durch 0,4 g von Frey- und 2 g von Frey-Anwendungen in dem von V2 innervierten Bereich erzeugt werden. Mittelwert und SEM werden angezeigt. Die Statistiken für die Zellzahl sind gepaarte Schüler-t-Tests. Die Statistik für transiente Intensitäten ist die 2-Wege-ANOVA, gefolgt vom Šidák-Mehrfachvergleichstest. **p < 0,01. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Eine Zusammenfassung der Einstellungen des konfokalen Rastermikroskops, die zur Abbildung von Pirt-GCaMP3 im TG verwendet wurden. Spalte 3 enthält eine kurze Erläuterung der Funktionen der einzelnen Einstellungen. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Video 1: Spontane Ca2+-Aktivität im rechtsseitigen Trigeminusganglion. Ein Trigeminusganglion mit spontanen Ca2+-Transienten und konstant hoher Ca2+-Konzentration in Abwesenheit von Reizen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Video 2: Ca2+ -Transienten, die durch Applikation von 50 °C heißem Wasser auf den orofazialen Bereich induziert werden, der durch den V2-Ast des Trigeminusganglion innerviert wird. Ein Trigeminusganglion mit Ca2+ -Transienten als Reaktion auf die Anwendung von 50 °C heißem Wasser auf den orofazialen V2-Bereich. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Video 3: Ca2+ -Transienten, die durch Applikation von 50 °C heißem Wasser auf den orofazialen Bereich induziert werden, der durch den V3-Ast des Trigeminusganglion innerviert wird. Ein Trigeminusganglion mit Ca2+ -Transienten als Reaktion auf die Anwendung von 50 °C heißem Wasser auf den orofazialen V3-Bereich. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 1: Beispiel für eine Analysetabelle. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.