Methodenartikel

Mausmodell der metabolischen Dysfunktion-assoziierten steatotischen Lebererkrankung mit Fibrose

DOI:

10.3791/68294

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18. Juli 2025

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1Brooklyn College, City University of New York

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Mausmodell der metabolischen Dysfunktion-assoziierten steatotischen Lebererkrankung (MASLD) mit metabolischer Dysfunktion, hepatischen Genexpressionsveränderungen und histopathologischen Leberveränderungen, die der menschlichen MASLD ähneln, einschließlich Fibrose, die bis zum fortgeschrittenen Fibrosestadium 3 fortschreitet. Dieses Modell kann in Studien zur MASLD-Pathophysiologie und in präklinischen Studien zu neuen Therapien verwendet werden.

Zusammenfassung

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Leberfibrose ist der wichtigste Prädiktor für unerwünschte Ergebnisse bei metabolischer Dysfunktion, assoziierter steatotischer Lebererkrankung (MASLD). In präklinischen Studien mit MASLD sind Mäuse das am häufigsten verwendete Krankheitsmodell. In diesen Modellen ist Leberfibrose jedoch schwer zu induzieren. Dieses Protokoll beschreibt ein Mausmodell der MASLD, in dem hyperphagische Ay-Mäuse mit einer Diät gefüttert werden, die reich an Fett und Fruktose ist und der durchschnittlichen Diät in den USA ähnelt. Die Mäuse entwickeln Lebersteatose, Verletzungen, Entzündungen und Fibrose. Die Fibrose schreitet von einer perizellulären Fibrose im Stadium 1 nach 16 Wochen zu einer brückenförmigen Fibrose im Stadium 3 nach 12 Monaten fort. Diese Mäuse entwickeln auch Fettleibigkeit, Hypertriglyceridämie, Glukoseintoleranz und Hyperinsulinämie. Dieses Krankheitsmodell repliziert die Histopathologie der Leber, die Veränderungen der hepatischen Genexpression und die metabolische Dysfunktion der menschlichen Krankheit. Dieses Protokoll umfasst zwei Methoden zur Quantifizierung der Fibrose: die histologische Färbung von Kollagen durch Picro-Sirius Red und die Quantifizierung des Lebergehalts an Hydroxyprolin. Diese Methoden können für die Untersuchung der MASLD-Pathophysiologie und für präklinische Studien potenzieller Therapien verwendet werden.

Einleitung

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Die mit metabolischer Dysfunktion assoziierte steatotische Lebererkrankung (MASLD) ist mit einer Prävalenz von 31 % bis 40 % in den USA und 42 % weltweit die häufigste Lebererkrankung 1,2,3,4. Patienten mit MASLD können eine mit metabolischer Dysfunktion assoziierte Steatohepatitis (MASH), früher als nichtalkoholische Steatohepatitis (NASH) bezeichnet, Zirrhose und hepatozelluläres Karzinom entwickeln 5,6. MASLD erhöht das Risiko für hepatozelluläres Karzinom und ist nach dem jüngsten Anstieg der Prävalenz von MASLD zur häufigsten Lebererkrankung bei Patienten geworden, die ein hepatozelluläres Karzinom entwickeln 7,8. Bei MASLD ist die Fibrose der primäre Prädiktor für das Fortschreiten der Zirrhose und für ungünstige klinische Ergebnisse, einschließlich leberbedingter Morbidität (Leberdekompensation, Leberversagen oder Leberkrebs) und leberbedingter Mortalität 6,9,10,11. Dementsprechend fördert die Food and Drug Administration die Entwicklung von Therapeutika, die sich auf MASH/NASH mit Fibrose konzentrieren, sowie die Verwendung geeigneter Tiermodelle12.

In präklinischen Studien mit Arzneimitteln und in mechanistischen Studien mit MASLD werden am häufigsten Mausmodelle verwendet13. Tausende von Mausmodellen von MASLD wurden beschrieben, was auf einen mangelnden Konsens über ein optimales Modell hindeutet 13,14. Die Etablierung optimaler Modelle steht vor mehreren Herausforderungen. Obwohl es relativ einfach ist, Fettleibigkeit und Steatose bei Mäusen zu induzieren, indem man ihnen fettreiches Futter füttert, ist es schwieriger, Leberfibrose zu induzieren 13,14,15,16. In MASLD-Modellen, die von fettleibigen Diäten angetrieben werden, entwickelt sich die Fibrose langsam17 Obwohl dieses langsame Fortschreiten die menschliche Krankheit besser nachahmen kann18, erhöht es die Dauer und die Kosten von Tierversuchen. Diäten mit hohem Cholesteringehalt (z. B. 2 %) fördern die Entwicklung von Fibrose; Sie verringern jedoch auch die endogene Synthese von Cholesterin, was das Gegenteil des bei der menschlichen Krankheit beschriebenen Anstiegs darstellt 15,16. Einige MASLD-Modelle verwenden mutierte oder genetisch veränderte Mäuse; Sie können jedoch Vorbehalte haben: OB/OB-Mäuse entwickeln Fettleibigkeit, Steatose und Insulinresistenz, aber ihnen fehlt Leptin, das ein Mediator der Fibrose ist; PTEN-Null-Mäuse entwickeln Steatose, aber keine Insulinresistenz15,17. Daher erfordern Mausmodelle von MASLD oft lange Studienzeiten, Diäten mit hohem Cholesteringehalt oder genetische Manipulationen, um eine signifikante Fibrose zu entwickeln14. Um einige dieser Probleme anzugehen, haben wir ein Mausmodell entwickelt, in dem die Tiere MASLD mit einer Fibrose entwickeln, die von perizellulärer/perisinusoidaler (Stadium 1) zu einer brückenförmigen Fibrose (Stadium 3) fortschreitet19.

Das Ziel dieses Artikels ist es, dieses Modell der MASLD mit Leberfibrose und zwei Methoden zur Quantifizierung der Fibrose zu beschreiben: die histologische Kollagenfärbung durch Picro-Sirius Rot und die Quantifizierung des Hydroxyprolingehalts in der Leber.

Der Grund für die Entwicklung dieses Modells war, dass die nützlichsten Tiermodelle diejenigen sind, die die menschliche Krankheit am besten replizieren, sowohl in Bezug auf die Krankheitstreiber als auch auf Veränderungen in der Histopathologie und Genexpression. Daher haben wir eine Diät verwendet, die der durchschnittlichen Diät in den USA ähnelt, einschließlich mäßig hoher Mengen an Fett und Fruktose19,20. Wir verfütterten diese Diät an Mäuse, die die Agouti-Gelbmutation (Ay) trugen, die ausgiebig als Modelle für Fettleibigkeit verwendet wurden21. Diese Mäuse exprimieren ubiquitär das Agouti-Protein, einen Antagonisten der Melanocortin-Rezeptoren, einschließlich MC4R, das Hyperphagie verursacht und die erhöhte Nahrungsaufnahme repliziert, die bei menschlicher Fettleibigkeit üblich ist 21,22,23. Dieses Modell rekapituliert die Veränderungen, die MASH definieren, einschließlich Steatose, hepatozelluläre Verletzungen, Entzündungen, Fibrose und metabolische Dysfunktion.

Die Hauptvorteile dieses Modells sind die Eigenschaften, die es der menschlichen Krankheit ähnlich machen. Das Modell verwendet eine westliche Diät, die so konzipiert wurde, dass sie der typischen US-Diät ähnelt und sich als die effektivste Diät bei der Replikation des Phänotyps des menschlichen MASLDerwiesen hat 14,20. Die Mäuse entwickeln histopathologische Veränderungen der Leber, die denen ähneln, die in der Leber von Menschen mit MASH beschrieben wurden 19,24. Die Mäuse entwickeln eine metabolische Dysfunktion, die ein wesentliches Kriterium für die Diagnose von MASLD5 ist. Die Lebern von Mäusen mit MASH zeigen Veränderungen in der Genexpression, die die von Menschen mit MASH/NASH19 rekapitulieren. In einer kürzlich durchgeführten Studie wurden 39 Mausmodelle von MASLD auf ihre Ähnlichkeit mit der menschlichen Krankheit verglichen. Es umfasste MC4R-Knock-out-Mäuse, die den gleichen Mechanismus der Hyperphagie haben und die gleiche Diät erhielten wie das von uns beschriebene Modell14. Dieses Modell belegte den fünften Platz (von 39) aufgrund seiner Ähnlichkeit mit menschlicher MASLD, wie sie durch Phänotyp, Leberhistopathologie und Transkriptomik bewertet wurde14.

Weitere Vorteile dieses Modells sind: Ay-Mäuse sind im Jackson Laboratory im Handel erhältlich und im Stamm C57BL/6J erhältlich, der häufig in Stoffwechselstudien verwendet wird21,25; Mutierte Mäuse sind leicht an ihrer Haarfarbe zu erkennen; Das Modell kann mit Modellen des Funktionsgewinns oder -verlusts kombiniert werden, um die Rolle spezifischer Gene bei der Entwicklung von MASLD zu untersuchen. Und schließlich verwendet das Modell keine Nährstoffmängel (Cholin- oder Methioninmangel), ungewöhnliche Nahrungsbestandteile (Cholsäure, Ethionin), einen ungewöhnlich hohen Gehalt an spezifischen Nährstoffen (Transfette) oder Hepatotoxine (Tetrachlorkohlenstoff), die keine häufigen Ursachen für MASLD sind und die menschliche Krankheit möglicherweise nicht replizieren 13,14,17.

Diese Methode eignet sich sowohl für die Untersuchung von Mechanismen, die zur Entwicklung und zum Fortschreiten der MASLD beitragen, als auch für die Evaluation von Interventionen zu ihrer Behandlung oder Prävention. Dieses Modell ist besonders nützlich, da die Tiere nicht nur sowohl Steatohepatitis als auch metabolische Dysfunktion entwickeln, sondern auch eine Fibrose, die bis zum Stadium 3 fortschreitet. Das Modell ist möglicherweise nicht geeignet für die Untersuchung von Mechanismen, die das Fressverhalten beeinflussen (z. B. GLP1R-Agonisten), da diese Mäuse Hyperphagie haben.

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Protokoll

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Dieses Protokoll folgt den Tierhaltungsrichtlinien des Brooklyn College; IACUC-Protokoll Nummer 318.

1. Mausmodell von MASLD mit Fibrose

  1. Züchte Mäuse, um Ay-Nachkommen zu zeugen. Bilden Sie Zuchtpaare mit Ay-Mäusen (B6. Cg-Ay/J). Notiere das Geburtsdatum der Welpen.
  2. Stellen Sie sicher, dass die Würfe eine ähnliche Anzahl von Jungtieren haben, um eine angemessene und gleichmäßige Fütterung und ein gleichmäßiges Wachstum zu fördern. Ziel ist es, fünf bis sechs Jungtiere pro Wurf zu haben, da dies die durchschnittliche Wurfgröße für C57BL/6J-Mäuse ist. Zusätzliche Welpen, vorzugsweise solche des Geschlechts, die nicht benötigt werden, können eingeschläfert oder gepflegt werden.
    HINWEIS: Die Verwendung von Ay-Männchen und Wildtyp-Weibchen (C57BL/6J Jax 0000664) kann die Effizienz der Zucht verbessern, da weibliche Wildtyp-Mäuse vom Typ C57BL/6J leicht zu beschaffen sind und möglicherweise bessere Züchter sind als weibliche Ay-Mäuse.
  3. Richten Sie Käfige für Experimente ein, wie unten beschrieben.
    1. Identifizieren Sie die Ay-Mäuse an ihrer gelben Fellfarbe. Weisen Sie jeder Maus eine eindeutige Identifizierung zu und markieren oder markieren Sie die Mäuse.
      HINWEIS: Das Agouti-Gelb (Ay) Allel des Agouti-Gens verleiht eine gelbe Fellfarbe. Das Allel ist bei Heterozygoten semidominant. Homozygotie führt zur embryonalen Letalität. Daher sind Mäuse mit gelber Fellfarbe heterozygot für das Ay-Gen.
    2. Entwöhnen Sie Mäuse, wenn sie 21 Tage alt sind. Gruppieren Sie Mäuse, die während der Studie im selben Käfig untergebracht werden. Halten Sie drei oder vier Ay-Mäuse pro Käfig, je nach erwartetem Körpergewicht und institutionellen Richtlinien.
    3. Füttern Sie Standardfutter und Wasser. Stubieren Sie Mäuse bei Standardtemperatur (20-23 °C) und relativer Luftfeuchtigkeit (40 % bis 60 %) mit einem 12 h hellen und 12 h dunklen Zyklus.
  4. Füttern Sie die Ay-Mäuse ab einem Alter von 8 Wochen mit einer fett- und fruktosereichen Diät (High Fat and Fructose Diet, HFFD), wie unten beschrieben.
    1. Versorgen Sie die Ay-Mäuse mit der westlichen Nahrung, die reich an Fett und Saccharose ist (Adjusted calories Western Diet Inotiv TD.88137) ad libitum.
    2. Bereiten Sie eine Lösung vor, die Fruktose (23 g/L) und Glukose (19 g/L) im Trinkwasser enthält. Sterilisieren Sie die Lösung durch Filtration durch einen 0,2-μm-Filter und lagern Sie sie in sterilen Flaschen. Nach dem Öffnen die Lösung im Kühlschrank aufbewahren.
    3. Geben Sie den Mäusen die Fruktose- und Glukoselösung zum Trinken in sterilen Trinkflaschen. Tauschen Sie die Lösung und die Flaschen mindestens wöchentlich aus und überprüfen Sie auf das Wachstum von Mikroorganismen.
    4. Verwenden Sie Käfigeinstreu ohne Nährwert (z. B. Holzspäne).
  5. Füttern Sie Kontrollmäuse mit einer fett- und fruktosearmen Ernährung, wie unten beschrieben.
    HINWEIS: Die Art der zu verwendenden Kontrollmäuse hängt vom Studiendesign ab: Wenn Ay-HFFD-Mäuse verwendet werden, um die Wirkung von Arzneimitteln zu bewerten, können die Kontrollmäuse Ay-HFFD-Mäuse sein, die mit einem Placebo behandelt wurden. Wird das Modell verwendet, um die Wirkung einer genetischen Veränderung auf die Entwicklung der Fibrose zu untersuchen, können Ay-HFFD-Mäuse ohne die genetische Veränderung als Kontrollen verwendet werden. Wenn Steuerelemente ohne MASH gewünscht werden, führen Sie die hier beschriebenen Schritte aus.
    1. Verwenden Sie Wildtyp-Mäuse, die Wurfgeschwister der Ay-Mäuse sind. Sie sind an ihrer schwarzen Fellfarbe zu erkennen.
    2. Füttern Sie die Mäuse ab dem gleichen Alter mit einer Kontrolldiät (Low Fat Control Diet Inotiv TD.08485; bezeichnet als Low Fat and Fructose Diet, LFFD). Stellen Sie den Mäusen regelmäßig Trinkwasser zur Verfügung.
  6. Überwachen Sie die Entwicklung von Fettleibigkeit, indem Sie die Mäuse wöchentlich wiegen, indem Sie die wachen Tiere in einem tarierten Behälter auf eine Laborwaage legen und ihr Gewicht aufzeichnen.
  7. Stellen Sie sicher, dass die Mäuse jederzeit ausreichend Futter und Trinklösung haben. Überwachen und protokollieren Sie den Verbrauch von Nahrungs- und Trinklösung, um die Kalorienaufnahme zu schätzen, falls gewünscht.
  8. Sammeln Sie Gewebe wie unten beschrieben.
    1. Führen Sie die Gewebeentnahme nach 16 Wochen mit der HFFD-Diät durch. Euthanasieren Sie die Maus durch Inhalation von Kohlendioxid (oder andere Methoden, die von der IACUC der Institution zugelassen sind).
      HINWEIS: Nach 16 Wochen haben Ay-Mäuse, die mit der HFFD-Diät gefüttert wurden, in der Regel eine Fibrose im Stadium 1; Eine Verlängerung der Zeit führt zu einer stärkeren Fibrose, die nach 9 bis 12 Monaten in das Stadium 3 übergeht.
    2. Wiegen Sie die Maus und notieren Sie das Gewicht19.
    3. Entnehmen Sie bei Bedarf Blut. Nehmen Sie dazu nach dem Öffnen des Bauches und vor der Präparation der Leber mit einer 1-ml-Spritze und einer 27-G-Nadel Blut aus der unteren Hohlvene ab (oder verwenden Sie eine andere von der IACUC zugelassene Methode).
    4. Präparieren Sie die Leber, indem Sie den Bauch mit einem Mittellinienschnitt öffnen, die Leber mit einer Pinzette am Hilum festhalten und die Bänder, die die Leber mit dem Zwerchfell und dem Retroperitoneum verbinden, mit einer Schere durchtrennen. Wiegen Sie die Leber und notieren Sie das Gewicht.
    5. Die Leber in eiskalter, phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) abspülen. Fotografieren Sie die Leber und fügen Sie ein Lineal oder einen anderen Gegenstand als Größenreferenz in das Bild ein. Legen Sie die Leber in eine Petrischale, die auf Eis gelegt wird.
    6. Präparieren Sie Proben (ca. 100 bis 150 mg pro Probe) mehrerer Lappen, einschließlich des Medianlappens, des linken Lappens und des rechten Lappens. Stellen Sie sicher, dass die Proben eine Dicke von nicht mehr als 4 mm haben, um die Fixierung zu erleichtern. Legen Sie sie für 24 Stunden in eine Fixierlösung (Formalin 10% oder Formaldehyd 4%) und bereiten Sie sie für die histopathologische Analyse auf (siehe unten).
    7. Präparieren Sie weitere Proben von mehreren Lappen. Legen Sie sie in Röhrchen (1,5 oder 2 ml), frieren Sie sie ein, indem Sie sie in flüssigen Stickstoff tauchen, und lagern Sie sie bei -80 °C. Diese Proben werden zur Messung des Hydroxyprolingehalts verwendet.
    8. Sammeln Sie auf Wunsch Proben von anderen Organen (Fettgewebe, Muskeln, etc.)

2. Histochemische Kollagenfärbung und morphometrische Quantifizierung

HINWEIS: Die Schritte, die die Verwendung von gefährlichen und/oder flüchtigen Chemikalien erfordern, sollten in einem Abzug durchgeführt werden. Alle Objektträger sollten parallel mit Färbeschalen und Objektträgerhaltern bearbeitet werden.

  1. Bereiten Sie Leberschnitte wie unten beschrieben vor.
    1. Fixieren Sie das Lebergewebe, indem Sie es 24 Stunden lang bei Raumtemperatur in Formalin (oder Formaldehyd) aufbewahren. Verwenden Sie ein Volumen des Fixiermittels, das 20-mal größer ist als das Gewebevolumen. Übertragen Sie als nächstes das Gewebe auf 70% Ethanol. Das Protokoll kann an dieser Stelle pausiert werden.
      HINWEIS: Gewebe können in Histologiekassetten gelegt werden, die dann in einen Behälter mit Fixiermittel oder alternativ in einzelne Behälter oder Schläuche gegeben werden.
    2. Gewebe in Paraffin einbetten. Dies wird in der Regel von einer histopathologischen Kerneinrichtung oder einem histopathologischen Dienst durchgeführt.
    3. Es werden Schnitte mit einer Dicke von 0,5 μm auf Objektträger montiert (ungeladene Objektträger sind ausreichend). Lassen Sie die Abschnitte trocknen, indem Sie sie Raumluft aussetzen. Eine histopathologische Kerneinrichtung oder ein histopathologischer Dienst tut dies in der Regel. Das Protokoll kann an dieser Stelle pausiert werden.
  2. Entparaffinieren und rehydrieren Sie die Abschnitte wie unten beschrieben.
    1. Entparaffinieren Sie die Abschnitte, indem Sie sie jeweils 5-15 Minuten lang in zwei Wechsel der Entparaffinierungs-/Reinigungslösung (Xylol oder Citrisolv) tauchen.
    2. Rehydrieren Sie, indem Sie die Objektträger nacheinander 5 Minuten lang in 100 % Ethanol, 95 % Ethanol, 70 % Ethanol und Wasser tauchen.
  3. Färben Sie Abschnitte mit Picro-Sirius-Rot, wie unten beschrieben.
    1. Die Schnitte werden 1 h lang in einer Lösung von Siriusrot (Direktrot 80) 1 g/l in Pikrinsäure 1,3 % getaucht. Färben Sie nicht viel länger, da direktes Rot andere Strukturen als Kollagen (z. B. Zellkerne) verfärben kann. Geben Sie der Färbelösung schnelles Grün (1 g/L), wenn eine Gegenfärbung gewünscht ist26. Alternativ können die Zellkerne mit Weigerts Hämatoxylin27 gefärbt werden.
    2. Geben Sie die rote Picro-Sirius-Lösung zur Aufbewahrung in einen geschlossenen, dunklen Glas- oder Kunststoffbehälter zurück. Die Lösung kann mehrfach wiederverwendet werden (mindestens 20 Jahrelang 27).
  4. Tauchen Sie die Proben 5 Minuten lang in Ethanol (100 %), um sie zu dehydrieren. Wiederholen Sie den Vorgang mit einem zweiten Wechsel von Ethanol.
  5. In Reinigungslösung (Xylol oder Citrisolv) tauchen, bis sie einzeln zum Einbetten entfernt werden.
  6. Entfernen Sie einen Objektträger nach dem anderen aus der Reinigungslösung und entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit, indem Sie sie auf Papiertücher tupfen. Fügen Sie Einbettmedium (ca. 50 bis 100 μl) hinzu. Decken Sie den Bereich mit einem Deckglas ab und drücken Sie das Deckglas vorsichtig nach unten, um Luftblasen zu entfernen. An der Luft trocknen lassen.
    HINWEIS: Das Protokoll kann an dieser Stelle pausiert werden.
  7. Betrachten Sie Schnitte mit einem Lichtmikroskop mit Hellfeldbeleuchtung und Objektiven von 4x bis 20x - Kollagen erscheint rot auf einem hellgelb-orangefarbenen Hintergrund. Erfassen Sie interessante Bereiche mit einer Farbkamera gemäß den Anweisungen der Kamera.
  8. Führen Sie die Bildgebung mit Polarisationslichtmikroskopie wie unten beschrieben durch.
    1. Schalten Sie die Polarisations- und Analysatorfilter orthogonal ein und stellen Sie sie ein, um sicherzustellen, dass Kollagen sichtbar ist und das Hintergrundsignal minimal ist. Kollagen ist als weiß, gelb oder orange auf dunklem Hintergrund sichtbar. In Abschnitten mit geringer oder keiner Fibrose ist Kollagen in den Blutgefäßwänden sichtbar. Behalten Sie die Einstellungen, einschließlich der Beleuchtungsintensität, für alle zu vergleichenden Proben bei.
    2. Bild mit einer Monochrom-Kamera oder im Monochrom-Modus in einer Farbkamera. Verwenden Sie ein Objektiv mit 4-facher Vergrößerung. Nehmen Sie mehrere Bilder pro Abschnitt auf. Vermeiden Sie Bereiche in der Nähe des Hilums, wenn sie große Blutgefäße haben. Verwenden Sie die gleichen Einstellungen für alle Bilder, die verglichen werden sollen.
  9. Führen Sie die morphometrische Quantifizierung mit Photoshop (Alternative a) durch, wie unten beschrieben.
    1. Quantifizieren Sie die weiße Fläche in den Bildern, die Kollagen entspricht. Klicken Sie in Photoshop auf > Farbbereich auswählen, wählen Sie dann "Lichter" aus und passen Sie die Parameter "Unschärfe" und "Bereich" an, um weiße Pixel auszuwählen, die Kollagen entsprechen. Wählen Sie anschließend Fenster > Histogramm > Erweiterte Ansicht und notieren Sie die Anzahl der ausgewählten Pixel, die neben dem Parameter Pixel angezeigt wird. Verwenden Sie die gleichen Parameter für alle Bilder, die verglichen werden sollen.
    2. Quantifizieren Sie die Gesamtfläche des Bildes. Klicken Sie in Photoshop auf "> Alles auswählen" und notieren Sie dann die Gesamtzahl der Pixel wie zuvor.
    3. Berechnen Sie den Prozentsatz des Bildbereichs, der Kollagen entspricht, indem Sie die Anzahl der weißen Pixel durch die Anzahl der Gesamtpixel dividieren. Die Werte werden in der Regel als Flächenprozentsätze ausgedrückt.
  10. Führen Sie die morphometrische Quantifizierung mit ImageJ (Alternative b) durch, wie unten beschrieben.
    1. Wählen Sie in den Bildern weiße Bereiche aus, die Kollagen entsprechen. Öffnen Sie das Schwellenwert-Werkzeug, indem Sie auf Bild klicken > > Schwellenwert anpassen (oder drücken Sie Umschalt + T). Legen Sie den Schwellenwertbereich so fest, dass nur kollagengefärbte Bereiche (weiße Bereiche) rot hervorgehoben werden (z. B. minimaler Schwellenwert 64; maximaler Schwellenwert: 255), und klicken Sie auf Anwenden. Dadurch wird das Bild binarisiert, wobei die Kollagenregion in Schwarz und der Hintergrund in Weiß umgewandelt wird.
    2. Messen Sie den gesamten Bildbereich, indem Sie auf Analysieren klicken > Messungen festlegen. Überprüfen Sie Bereich und Anzeigebeschriftung. Klicken Sie auf OK. Klicken Sie auf Analysieren > Messen (oder drücken Sie M auf der Tastatur). Im Ergebnisfenster wird der gesamte Bildbereich angezeigt.
    3. Um die Kollagenfläche und den Prozentsatz zu messen, aktivieren Sie zunächst die Option Auf Schwellenwert begrenzen, indem Sie auf Analysieren > Messungen festlegen klicken. Überprüfen Sie die Fläche, den Flächenanteil (ImageJ berechnet den Kollagenanteil automatisch), die Begrenzung auf den Schwellenwert und die Anzeigebeschriftung. Klicken Sie auf OK. Klicken Sie dann auf Analysieren > Messen (oder drücken Sie M). Das Ergebnisfenster zeigt an: Kollagenfläche (absolute Pixelanzahl) und Flächenfraktion (Kollagen % des Gesamtbildes).
    4. Speichern Sie die Ergebnisse, indem Sie Speichern unter auswählen, oder kopieren Sie sie in die Zwischenablage und fügen Sie sie in eine Tabelle ein.

3. Quantifizierung von Hydroxyprolin in der Leber

HINWEIS: Die Schritte, die die Verwendung von starken Basen und Säuren erfordern, sollten mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung durchgeführt werden.

  1. Die in Schritt 1.8.7 vorbereiteten Leberproben werden gewogen und die Gewichte notiert. Die Gewebealiquote werden in ein für die Homogenisierung geeignetes Röhrchen gegeben. Fügen Sie deionisiertes Wasser mit einem Wasser-zu-Gewebe-Verhältnis von 900 μl Wasser pro 100 mg Gewebe hinzu.
  2. Homogenisieren Sie durch Bead-Beating oder eine andere Methode gemäß den Anweisungen des Herstellers, bis das Gewebe vollständig homogenisiert ist, wie durch visuelle Beobachtung beurteilt. Das Protokoll kann an dieser Stelle pausiert werden, und Homogenate können bei -20 °C gelagert werden.
  3. Führen Sie die Proteinfällung wie unten beschrieben durch. Die folgenden Schritte werden bei Raumtemperatur durchgeführt, es sei denn, es wird eine andere Temperatur angegeben.
    1. Übertragen Sie ca. 500 μl bis 1000 μl Homogenat in 1,5 mL Zentrifugenröhrchen. Übertragen Sie für alle Proben das gleiche Volumen.
    2. Trichloressigsäure bis zu einer Endkonzentration von 12 % zugeben (z. B. 120 μl Trichloressigsäure zu 880 μl Homogenat hinzufügen)28. Zum Mischen kurz vorziehen.
    3. Inkubieren Sie die Proben 30 Minuten lang in einem Eis-/Wasserbad. Zentrifugieren bei 6.000 x g bei 4 °C für 10 min. Es bildet sich ein Niederschlag, der das Protein enthält. Überstand durch Aspiration entfernen. Halte die Röhren auf Eis.
    4. Fügen Sie 1 ml eiskaltes Ethanol (100%) hinzu, um das Pellet zu waschen. Resuspendieren Sie das Pellet durch Ultraschall (oder eine andere Methode) und überprüfen Sie visuell, ob das Material resuspendiert ist. Bei 6.000 x g bei 4 °C für 10 min zentrifugieren und den Überstand durch Aspiration entfernen. Verwenden Sie die Beschallungseinstellungen gemäß den Geräteanweisungen (z. B. bei Verwendung eines Branson SFX 150-Sonifikators mit einer Mikrospitze mit einem Durchmesser von 3,2 mm ist eine Amplitude von 70 % für 10 s für die meisten Proben wirksam). Waschen 2x wiederholen.
    5. Lassen Sie das Pellet 10 Minuten an der Luft trocknen, bei Bedarf auch länger.
  4. Führen Sie die Proteinhydrolyse wie unten beschrieben durch.
    1. 800 μl 6 N Salzsäure werden in die Röhrchen gegeben, die den Proteinniederschlag enthalten. Resuspendieren Sie das Pellet durch Ultraschall (oder eine andere Methode) mit den gleichen Einstellungen wie in Schritt 3.3.4.
    2. Übertragen Sie die Proteinsuspension auf Glasröhrchen oder Fläschchen mit Schraubverschluss; Fest verschließen. Die Röhrchen im Ofen bei 110 °C 22 ± 2 h29 inkubieren.
    3. Zentrifugenröhrchen bei 16.000 x g für 10 min; Partikel bilden ein Pellet. Dies erfordert in der Regel die Übertragung des Hydrolysats aus den Glasfläschchen in Zentrifugenröhrchen vor der Zentrifugation.
    4. Übertragen Sie den Überstand, der Hydroxyprolin enthält, in 1,5-ml-Röhrchen. Das Protokoll kann an dieser Stelle pausiert werden. Hydrolysate können bei 4 °C gelagert werden.
  5. Bereiten Sie eine Standardkurve für die Hydroxyprolinkonzentration vor. Für Leberproben mit Fibrose der Stadien 1 bis 3 sind unter Verwendung der in diesem Protokoll angegebenen Gewebemengen Standardkonzentrationen von bis zu 125 μg/ml ausreichend (z. B. serielle Verdünnungen von 125, 62,5, 31,3, 15,6, 7,81, 3,91, 1,95 und 0 μg/ml). Bereiten Sie die Standards vor, indem Sie Hydroxyprolin in 6 N Salzsäure verdünnen.
  6. Übertragen Sie 40 μl jeder Probe und jedes Standards in 1,5 mL markierte Zentrifugenröhrchen. Je 10 μl 10 N Natriumhydroxid zugeben und kurz verrühren.
  7. Führen Sie die Oxidation von Hydroxyprolin wie unten beschrieben durch.
    1. Bereiten Sie Acetat-Citrat-Puffer mit Essigsäure 1,2 % v/v, Zitronensäure 46 g/l, Natriumacetattrihydrat 120 g/l und Natriumhydroxid 34 g/l in deionisiertem Wasser vor und stellen Sie den pH-Wert des Puffers auf 6,5 ein.
    2. Bereiten Sie eine Lösung von 12,7 g/l Chloramin T in Wasser:n-Propanol:Acetat-Citrat-Puffer (1:1:8 v:v:v) vor. Zuerst lösen Sie Chloramin T durch Mischen in Wasser auf, fügen Sie dann n-Propanol hinzu, mischen Sie und fügen Sie dann Acetat-Citrat-Puffer hinzu und mischen Sie.
    3. Geben Sie 450 μl Chloraminlösung in Röhrchen mit Proben und Standards. Durch Vortexen mischen. Bei Raumtemperatur 25 min30 inkubieren.
  8. Bereiten Sie das Ehrlich-Reagenz mit 1 M 4-(Dimethylamino)-benzaldehyd in Perchlorsäure:Propanol 1:2 (v/v) vor. Geben Sie 500 μl Ehrlich-Reagenz zu Proben und Standards. Durch Vortexen mischen.
  9. Inkubieren Sie bei 65 °C für 20 Minuten in einem Heizblock, Wasserbad oder Inkubator. Wenn die Inkubation beendet ist, lassen Sie Proben und Standards auf Raumtemperatur abkühlen.
  10. Messen Sie die Extinktion von Proben und Standards bei einer Wellenlänge von 550 nm mit einem Spektralphotometer.
  11. Plotten Sie die Absorption im Vergleich zu den Standardbeträgen und verwenden Sie eine lineare Regression, um eine Standardkurve zu erstellen. Verwenden Sie die Parameter aus der Standardkurve, um die Konzentration von Hydroxyprolin in den Proben zu berechnen.
  12. Berechnen Sie die Menge an Hydroxyprolin in den Leberproben auf der Grundlage des Gesamtvolumens des Hydrolysats (Schritt 3.4) und normalisieren Sie sie um die Gewebemasse, die dem für die Proteinfällung verwendeten Homogenatvolumen entspricht (Schritt 3.3.1). Geben Sie die Ergebnisse als ng Hydroxyprolin pro mg Gewebe an. Alternativ kann die Proteinkonzentration in Homogenaten gemessen und die Ergebnisse als Masse von Hydroxyprolin pro Proteinmasse ausgedrückt werden.

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Ergebnisse

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Ay-Mäuse, die mit der HFFD gefüttert werden, nehmen stärker an Gewicht zu als Wildtyp-Mäuse, die mit der LFFD gefüttert werden, und entwickeln Fettleibigkeit (Abbildung 1A). Sie nehmen in den ersten 4 Wochen der HFFD-Fütterung schneller zu und nehmen etwa 3-4 g/Woche zu. Nach 8 Wochen nehmen sie ähnlich schnell an Gewicht zu wie Kontrollmäuse (ca. 0,6 g/Woche)19. Nach 16 Wochen wiegen die Ay-Mäuse, die mit dem HFFD gefüttert wurden, e...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll beschreibt ein Mausmodell der MASLD mit Leberfibrose, das die Krankheit beim Menschen repliziert 5,6. Die Mäuse entwickeln eine Lebersteatose, wie eine gemischte mikro- und makrovesikuläre Steatose in der Histologie und ein erhöhter hepatischer Triacylglyceringehalt zeigen19. Die Mäuse entwickeln auch Fettleibigkeit, Hypertriglyceridämie, Glukoseintoleranz und es wurde berichtet, dass sie ...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt offenzulegen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Institutes of Health K22CA178098, R03DK101863 sowie R15DK131627- und Startkapital des Brooklyn College (an das JMC) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
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4-(Dimethylamino)BenzaldehydSigma-AldrichD2004
EssigsäureVerschiedeneNA
Kalorienangepasste Diät Westliche ErnährungInotivTD.88137Die Ernährung enthält Fett (42 % kcal) und Saccharose (34 % w/w). Andere Anbieter bieten Diäten mit derselben Zusammensetzung an
B6. Cg-Ay/JDas Jackson-Labor000021Der Stamm hat die Agouti-Mutation lethal yellow und einen C57BL6/J-Hintergrund. Derzeit hat das Jackson Laboratory den Stamm cryproserviert.
C57BL/6JDas Jackson-Labor000664
ZentrifugeVerschiedeneNAMit Rotor für 1,5-mL-Röhren, gekühlt, in der Lage, 16.000 xg zu erreichen.
ZentrifugeVerschiedeneNA
Chloramin-T-HydratSigma-Aldrich857319
ZitronensäureVerschiedeneNA
Direct Red 80Sigma365548-5G
EthanolDekontaminationslabore2701
Formalinlösung, neutral gepuffertSigmaHT501128
FruktoseSigma-AldrichF0127
GlukoseSigma-AldrichG8270
Histologie-VerarbeitungsgeräteNANAEinbettung und Sektionierung können im Untersuchungslabor oder in einer externen Einrichtung erfolgen
HomogenisatorVerschiedeneNAPerlenklopfer sind effizient, um mehrere Proben zu verarbeiten. Andere Homogenisierungsmethoden können verwendet werden
SalzsäureVerschiedeneNA
HydroxyprolinSigmaH5534
Fettarme KontrolldiätInotivTD.08485Kontrolldiät, fettarm (13 % kcal) und Saccharose (12 % w/w)
Mikroskop ausgestattet für polarisierte LichtmikroskopieVerschiedeneNA
N-PropanolVerschiedeneNA
PerchlorsäureVerschiedeneNA
Permount-MontagemediumFisher ScientificSP15-100
Pikrinsäure, gesättigte wässrige Lösung, SpektrumFisher18612375
NatriumacetattrihydratVerschiedeneNA
NatriumhydroxidVerschiedeneNA
SonicatorVerschiedeneNASonicator ist nützlich, um Pellets in Schritt 2.5 wieder zu suspendieren, aber nicht unbedingt notwendig
TrichloressigsäureVerschiedeneNA
VWR Micro Cover Glasses, rechteckigVWR 48393-081
VWR Premium Superfrost Plus Mikroskop-Objektträger | VWRVWR 48311-703
Wasser, deionisiertVerschiedeneNADeionisiertes Wasser aus einem Wasseraufbereitungssystem oder bei einem Lieferanten gekauft.
XylenesFisher ScientificX3FCitrisolv Clearing Agent  (Fisher 22-143-975) wird als umweltfreundliche Alternative verkauft

Referenzen

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