Peak-Calling-Algorithmen (WonderPeaks und PeakStream) als Werkzeuge für eine verbesserte ChIP-seq und transkriptomische Analyse in pilzlichen Krankheitserregern

Zusammenfassung

In diesem Bericht wird WonderPeaks vorgestellt, ein neuartiges Computerwerkzeug zur Analyse von RNA-seq- und ChIP-seq-Daten. Dieses Tool identifiziert erfolgreich Peaks (Read Pileups) in Sequenzierungsdaten und ermöglicht so die Charakterisierung von nicht translatierten Regionsgrenzen in RNA-seq und den Nachweis von Chromatinanreicherung in ChIP-seq, was wertvolle Erkenntnisse für die Erforschung von Pilzpathogenen liefert.

Zusammenfassung

Die Charakterisierung von Veränderungen der Genexpression durch Transkriptomik und die Aktivität von Transkriptionsregulatoren ist zu einem grundlegenden Ansatz geworden, um die vielfältigen Reaktionen zu verstehen, die an der Pathogenese von Pilzen beteiligt sind. In diesem Artikel werden zwei computergestützte Werkzeuge vorgestellt, die entwickelt wurden, um die wichtigsten Herausforderungen bei der Untersuchung der Transkriptionsregulation in pilzlichen Krankheitserregern zu bewältigen, insbesondere in Nicht-Modellen mit begrenzter genomischer Annotation. Zunächst stellen wir WonderPeaks vor, einen neuartigen Peak-Calling-Algorithmus, der die erste Ableitung von kartierten genomischen Daten aus Next-Generation-Sequencing-Experimenten (NGS) nutzt, um angereicherte Peaks in der Chromatin-Immunpräzipitation zu identifizieren, gefolgt von einer Sequenzierung (ChIP-seq). Zweitens stellen wir PeakStream vor, eine Erweiterung von WonderPeaks zur Annotation von 3'-untranslatierten Regionen (UTRs) in Transkriptomdaten, die mit Hilfe der Poly(A)-primed Library Preparation generiert wurden. Zusammen bieten diese Tools eine End-to-End-Datenanalyse-Pipeline und bieten eine benutzerfreundliche Lösung für Forscher, die die Transkriptionsregulation in Pilzen untersuchen. Wir demonstrieren ihre Wirksamkeit mit Daten des Pilzerregers Candida albicans, indem wir erfolgreich verifizierte Peaks in ChIP-seq-Daten identifizieren und validierte UTRs durch den Vergleich mit Gesamt-RNA-Sequenzierungsdaten unter gleichen Bedingungen annotieren. Wir diskutieren auch die Einschränkungen von WonderPeaks für ChIP-seq-Daten im Vergleich zu aktuellen Methoden und schlagen Richtungen für zukünftige Verbesserungen vor. Letztendlich bietet diese Arbeit praktische Anleitungen und leistungsstarke Ressourcen für die Untersuchung der Transkriptionsregulation, mit unmittelbarer Relevanz für pathogene Pilze und potenziellen Anwendungen in breiteren genomischen Studien.

Einleitung

Pilzpathogene sind ein wachsendes globales Gesundheitsproblem, da die Zahl der Infektionen in den letzten Jahren zugenommen^{hat 1}. Viele dieser Erreger weisen eine hohe Antimykotikaresistenz auf und sind mit signifikanten Mortalitätsraten verbunden². Im Vergleich zu Modellpilzorganismen sind viele pathogene Pilze jedoch nach wie vor schlecht charakterisiert, was den Bedarf an weiterer Erforschung ihrer Pathogenitätsmechanismen unterstreicht. Next-Generation-Sequencing-Techniken (NGS) wie die Chromatin-Immunpräzipitationssequenzierung (ChIP-Seq) und die RNA-Sequenzierung (RNA-Seq) spielen eine entscheidende Rolle bei der Aufdeckung der molekularen Mechanismen der Genexpression, die der Pilzpathogenität zugrunde liegen.

Die Qualität der aus NGS-Daten abgeleiteten Erkenntnisse hängt stark von der Genauigkeit der Software ab, die für die Rohdatenanalyse verwendet wird. Zu den größten Herausforderungen bei der NGS-Datenanalyse gehört das Peak Calling – die genaue Identifizierung von Regionen mit angereicherten NGS-Reads – was aufgrund der Vielzahl von Bibliotheksvorbereitungs- und Sequenzierungstechniken besonders komplex ist und eine universelle Lösung unpraktisch macht. Der MACS-Algorithmus³, einschließlich seiner neueren Version, MACS3, gilt weithin als Goldstandard für die Analyse von ChIP-seq-Datensätzen. MACS stützt sich jedoch auf benutzerdefinierte Parameter – wie z. B. die minimale Peaklänge und den maximalen Abstand –, die möglicherweise nicht universell anwendbar sind und vor der Analyse oft schwer zu bestimmen sind. Bemerkenswert ist, dass die neueste MACS3-Version eine Cut-off-Analysefunktion enthält, mit der Benutzer Parameter vor dem Peak-Call schätzen können. Um die Leistung zu verbessern, können Benutzer auch eine Liste von genomischen Regionen auf der "schwarzen Liste" bereitstellen, von denen bekannt ist, dass sie aufgrund der Chromatinstruktur oder der Variation der Kopienzahl zu Verzerrungen führen. Obwohl MACS nach wie vor das am häufigsten verwendete und vertrauenswürdigste Peak-Calling-Tool für ChIP-seq-Daten ist, stehen nur wenige alternative Algorithmen zur Verfügung, insbesondere für Fälle, in denen hochgradig maßgeschneiderte Parametereinstellungen erforderlich sind.

RNA-Seq ist eine unschätzbare Technik zur Untersuchung der Genexpressionsreaktionen pathogener Pilze während des In-vivo-Wachstums, z. B. in Gewebekultur- oder Mausinfektionsmodellen 4,5,6,7. Für eine genaue differentielle Expressionsanalyse unter diesen Bedingungen ist eine hohe Sequenzierungstiefe erforderlich, die kosten- und ressourcenintensiv sein kann ^8,9. Methoden zur Bibliotheksvorbereitung wie die Polyadenylierung (Poly(A))-Priming-Sequenzierung (3'RNA-Seq), bei der Primer verwendet werden, die so konzipiert sind, dass sie für die cDNA-Erzeugung an den Poly(A)-Schwänzen der mRNA annealieren, können dazu beitragen, die für die Genexpressionsanalyse erforderliche Sequenzierungstiefe zu reduzieren¹⁰. Dieser Ansatz stützt sich jedoch auf qualitativ hochwertige Genomannotationen, insbesondere von 3' Untranslated Regions (UTRs), bei denen die Peaks von Poly(A)-Priming-Ereignissen typischerweise^{bei 11} liegen. Die Genomannotationen vieler wenig untersuchter Pilzpathogene enthalten keine UTR-Annotationen, was den Einsatz von 3'RNA-Seq in diesen Organismen erschwert. Darüber hinaus kann die UTR-Länge für ein einzelnes Gen über verschiedene Wachstumsbedingungen und Zelltypen hinweg dynamisch sein^12,13. Während eine Reihe neuer Analysewerkzeuge entwickelt wurden, um UTRs zu identifizieren und zu annotieren, sind viele von ihnen für Säugetierdatensätze konzipiert, deren Genorganisation sich stark von der von Pilzen unterscheidet, oder erfordern Daten aus unabhängigen Sequenzierungsexperimenten, wie z. B. Einzelzell- oder reverser mRNA-Sequenzierung, was den Zeit- und Kostenaufwand für einen Forscher erhöhen kann, der eine Transkriptomanalyse durchführen möchte^{12, 14,15}.

In diesem Artikel stellen wir WonderPeaks vor, eine neuartige Peak-Calling-Software, die auf den Prinzipien der ersten Ableitung basiert und zum dynamischen Aufrufen von Peaks in NGS-Datensätzen verwendet werden kann (Abbildung 1). WonderPeaks identifiziert Peaks, indem es die erste Ableitung des Abdeckungssignals berechnet und diesen Wert - die Steigung des Peaks - verwendet, um potenzielle Peaks zu definieren. Der Algorithmus sucht nach Fällen, in denen die erste Ableitung ein lokales Maximum über einem vom Benutzer bereitgestellten oder von Daten abgeleiteten Steigungsschwellenwert aufweist (was auf ein steigendes Signal hinweist), gefolgt von einem lokalen Minimum über demselben Schwellenwert (was auf ein abnehmendes Signal hinweist), wodurch alle Kandidatenpeaks im Datensatz erkannt werden. Für ChIP-seq-Anwendungen vergleicht WonderPeaks alle Kandidaten-Peaks zwischen Test- und Kontrollproben, um einzigartig angereicherte Peaks zu identifizieren. Durch die Anwendung von WonderPeaks auf einen zuvor veröffentlichten ChIP-seq-Datensatz eines Transkriptionsfaktors im Pilzerreger Candida albicans¹⁶ haben wir seine Fähigkeit demonstriert, Peaks stromaufwärts von Schlüsselgenen, die in der ursprünglichen Studie hervorgehoben wurden, erfolgreich zu identifizieren, während wir gleichzeitig die aktuellen Einschränkungen des Algorithmus in dieser Anwendung diskutierten.

Wir stellen auch PeakStream vor, ein Software-Tool, das WonderPeaks nutzt, um Peaks in 3'RNA-Seq-Datensätzen zu identifizieren. 3'RNA-Seq-Bibliotheken sind auf genaue 3'-UTR-Annotationen angewiesen, da Reads, die durch Poly(A)-Priming erzeugt werden, oft über das Stoppcodon der kodierenden Sequenzen (CDS) von Genen hinausgehen und daher bei der Verwendung von Standardannotationen, die sich ausschließlich auf kodierende Regionen konzentrieren, nicht gezählt werden. Die PeakStream-Analysepipeline wurde entwickelt, um neue Genomannotationen unter Verwendung von 3'-RNA-Seq-Daten zu erstellen, wobei der Schwerpunkt auf Regionen liegt, die den Regionen der Gencodierungssequenz (CDS) nachgelagert sind. PeakStream ordnet diese Peaks Genen zu und generiert eine neue Genomannotation für die Verwendung in nachgelagerten Lesezählprogrammen. Wir zeigen, dass die Verwendung von PeakStream nachgeschaltete Poly(A)-generierte Peaks genau identifizieren und dem richtigen Gen in einem 3'RNA-Seq C. albicans-Datensatz zuordnen kann. PeakStream kommentiert auch Peaks, die wahrscheinlich nicht mit aktuellen Genannotationen in Verbindung gebracht werden, und erleichtert so die Entdeckung möglicher neuer Transkripte. Zusammen stellen PeakStream und WonderPeaks eine leistungsstarke Suite benutzerfreundlicher Tools für die Peak-Erkennung in Next-Generation-Sequencing-Datensätzen (NGS) dar.

Abbildung 1: Übersichtsabbildung des Peak-Calling durch WonderPeaks und PeakStream. Links: Peaking-Calling mit der ersten Ableitung. Oben rechts: Peak-Calling auf ChIP-Seq-Datensätzen mit WonderPeaks. Unten rechts: Peak-Calling auf RNA-Seq-Datensätzen mit PeakStream. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Protokoll

1. Installation (überspringen, wenn abgeschlossen)

1. Voraussetzungen
   1. Installieren Sie Anaconda oder Minconda, um die Anforderungen zum Ausführen der Vorverarbeitung (Abschnitt 5) und WonderPeaks (Abschnitt 6 oder Abschnitt 7) zu laden.
      HINWEIS: Eine Bedienungsanleitung für Anaconda finden Sie in der Referenz¹⁶.
   2. Python installieren: Python innerhalb von Anaconda oder Miniconda.
   3. Installieren Sie Jupyter Notebooks, um alle Funktionen dieser Methode auszuführen.
      HINWEIS: Ein Einsteiger-Benutzerhandbuch für Jupyter Notebooks finden Sie in der Referenz¹⁷.
      VORSICHT: Stellen Sie für Pilzgenome (≤100 Mbit/s) eine Computerumgebung mit mindestens 20 Kernen, 8 GB RAM und 30 GB verfügbarem Festplattenspeicher sicher.
2. Installieren Sie Vorverarbeitungsfunktionen.
   1. Führen Sie im Terminal Folgendes aus: conda create -n WP_preprocessing
   2. Führen Sie im Terminal Folgendes aus: conda activate WP_preprocessing
   3. Führen Sie im Terminal Folgendes aus: conda env update --file environment.yml --name
      HINWEIS: Bei der environment.yml handelt es sich um eine Datei, die alle Paketabhängigkeiten enthält und von https://github.com/mgarber21/WonderPeaks_preprocessing.git heruntergeladen werden sollte.
   4. Führen Sie im Terminal Folgendes aus: pip install WonderPeaks-preprocessing
   5. Führen Sie im Terminal Folgendes aus: conda deactivate WP_preprocessing
3. Installieren Sie die WonderPeaks-Funktionen:
   1. Führen Sie im Terminal Folgendes aus: conda create -n WonderPeaks
   2. Führen Sie im Terminal Folgendes aus: conda activate WonderPeaks
   3. Führen Sie im Terminal Folgendes aus: conda env update --file environment.yml --name
      HINWEIS: Die environment.yml ist eine Datei, die alle Paketabhängigkeiten enthält und von https://github.com/mgarber21/WonderPeaks.git heruntergeladen werden sollte.
   4. Führen Sie im Terminal Folgendes aus: pip install WonderPeaks
   5. Führen Sie im Terminal Folgendes aus: conda deactivate WonderPeaks
      HINWEIS: Die Schritte 1.2 und 1.3 bewirken Folgendes: Sie erstellen eine dedizierte Conda-Umgebung für die Vorverarbeitung (Abschnitt 5) und WonderPeaks (Abschnitte 6 und 7), wobei Abhängigkeiten isoliert werden, um Konflikte mit anderer Software zu vermeiden. Sie aktivieren die Umgebung und richten sie für die Installation und Ausführung WP_preprocessing oder WonderPeaks-spezifischen Funktionen ein. Sie installieren die Software-Abhängigkeiten und Tools, die für die Vorverarbeitung der Daten erforderlich sind. Sie deaktivieren die Umgebung, wenn sie nicht verwendet wird, um versehentliche Änderungen zu verhindern und Systemressourcen freizugeben.
4. Laden Sie Jupyter Notebooks und Vorlagen aus dem WonderPeaks GitHub-Repository herunter. Laden Sie die WonderPeaks-Downloads auf das Betriebssystem hoch, das die Rohdaten enthält (das Verzeichnis wird in Abschnitt 2 erstellt).
   HINWEIS: Die Jupyter Notebooks enthalten vorgefertigte Skripte und Vorlagen, die für die Ausführung von Vorverarbeitung, WonderPeaks und PeakStream-Workflows erforderlich sind. Durch das Hochladen auf dasselbe System wie die Rohdaten wird sichergestellt, dass die Pfade und Verzeichnisse korrekt ausgerichtet sind.

2. Erstellen Sie ein Datenverzeichnis

HINWEIS: WonderPeaks- und PeakStream-Workflows erfordern, dass alle Daten (roh und verarbeitet) im selben Verzeichnis gespeichert werden. In diesem Schritt wird erläutert, wie Sie dieses neue Verzeichnis erstellen ({data_directory} = /Pfad/zum/Ihre/Daten) und wie Sie experimentelle Rohdaten (unverarbeitete Sequenzierungslesevorgänge) in einen Ordner innerhalb dieses Verzeichnisses mit dem Namen raw_data verschieben.

1. Erstellen Sie ein Datenverzeichnis.
   1. Führen Sie im Terminal mkdir {data_directory} aus (z. B. mkdir /pfad/zu/ihren/daten)
2. Erstellen Sie ein Rohdaten-Unterverzeichnis für unverarbeitete Sequenzierungslesevorgänge.
   1. Führen Sie im Terminal mkdir {data_directory}/raw_data aus (z.B. mkdir /path/to/your/data /raw_data)
3. Verschieben Sie die nicht verarbeiteten Sequenzierungslesevorgänge in das Rohdatenverzeichnis.
   1. Führen Sie im Terminal mv {current_path_to_raw_data}/*fastq* {data_directory}/raw_data aus (z. B. mv current/data/path/*fastq* /path/to/your/data /raw_data

3. Erstellen Sie die Benutzereingabedatei (NGS_user_input.csv)

HINWEIS: Die Eingabedatei gibt die vom Benutzer erstellten Konfigurationen für die Ausführung der Vorverarbeitung und von WonderPeaks an.

1. Laden Sie die Vorlagen NGS_user_inputs.csv aus dem WonderPeaks GitHub-Repository herunter.
2. Aktualisieren Sie Felder in NGS_user_inputs.csv. Aktualisieren Sie die Felder wie folgt:
   Datenverzeichnis: /Pfad/zu/Ihren/Daten
   Genom-Verzeichnis: /Pfad/zum/Ihrem/Genom
   Genom fasta: genome.fasta
   Genom-Annotation: genome_annotation.gtf (geben Sie den Dateinamen der Genom-Annotation im GTF-Format an)
3. Speichern Sie die aktualisierten NGS_user_inputs.csv in dem in Abschnitt 2 erstellten Datenverzeichnis.
   ACHTUNG: Ändern Sie nicht den Dateinamen. WonderPeaks erkennt diese Datei nur, wenn sie den Namen NGS_user_input.csv hat.

4. Metadatendatei erstellen (NGS_user_metadata.csv)

HINWEIS: Die Metadatendatei wird verwendet, um alle für das Experiment relevanten Informationen zu speichern. Zusätzliche Spalten können hinzugefügt werden, um die Bedingungen des Experiments zu beschreiben, aber diese wirken sich nicht auf die nachfolgenden Schritte aus.

1. Laden Sie die Vorlagen NGS_user_metadata.csv aus dem WonderPeaks GitHub-Repository herunter.
2. Aktualisieren von Feldern in NGS_user_metadata.csv Die Felder lauten wie folgt:
   1. file: Stellen Sie sicher, dass der Dateiname keine Leerzeichen enthält, das Dateihandle (z. B. fastq, fastq.gz) und den absoluten Pfad nicht enthält.
   2. bedgraph: Geben Sie an, ob die Datei in PeakStream aufgenommen werden soll, indem Sie dieses Feld auf TRUE oder FALSE setzen.
      1. Legen Sie das Feld bedgraph auf FALSE fest, wenn die Datei vernünftigerweise von der PeakStream-Analyse ausgeschlossen werden kann. Legen Sie z. B. in einem RNAseq-Experiment den Bedgraph-Parameter bedgraph=FALSE für Mutanten oder andere Fälle fest, in denen UTR-Unterschiede zwischen den Proben nicht erwartet werden. Stellen Sie jedoch sicher, dass Sie das Feld bedgraph für alle Kontrolldateien in einem RNAseq-Experiment und für alle Dateien in einem ChIPseq-Experiment auf TRUE setzen.
   3. DesignFaktor
      1. Designfactor1: Geben Sie einen Designfaktor an, der für das Versuchsdesign relevant ist (z. B. Behandlung oder sample_type).
      2. designfactor2: Geben Sie einen zweiten Designfaktor an, der für das experimentelle Design relevant ist (z. B. Dehnung oder Epitop). Für ein RNAseq-Experiment sollten Behandlung und Stamm als typische Designfaktoren einbezogen werden. In der Spalte "Behandlung" sind die angewendeten Behandlungen aufgeführt (z. B. Kontrolle, Medikament1), und in der Spalte "Stamm" werden Informationen zum Stamm (z. B. Wildtyp, Mutante) aufgeführt. Schließen Sie für ein ChIPseq-Experiment sample_type und Epitop als typische Designfaktoren ein. In der Spalte sample_type wird angegeben, ob das Protein markiert oder nicht markiert wurde, und in der Spalte Epitop wird der Name des verwendeten Epitops aufgeführt.
         HINWEIS: Designfaktoren sind Attribute, die für den Versuchsplan spezifisch sind.
         WonderPeaks ist entweder mit nicht getaggten Steuerelementen oder Eingabesteuerelementen als Basis kompatibel.
      3. Stellen Sie sicher, dass die Spalten des Designfaktors keine eindeutige Replikatnummer enthalten (z. B. sample_type: [tagged, tagged, untagged_control untagged_control] nicht sample_type: [tagged_1, tagged_2 untagged_control _1, untagged_control _2]. Das Angeben eindeutiger Replikatnummern führt während der Ausführung zu einem Fehler.
      4. Achten Sie darauf, Unterstriche (_) anstelle von Leerzeichen in den Namen von Designfaktoren zu verwenden.
      5. Stellen Sie für die ChIPseq-Anwendung sicher, dass die Spalte sample_type (oder benutzerdefinierter Name) in der Metadatendatei Begriffe enthält, die die Wörter Tag und Steuerelement enthalten.
         HINWEIS: Gültige Einträge können z. B. "tagged und untagged_control" enthalten. Das Angeben einer sample_type Spalte ohne diese Begriffe führt während der Ausführung zu einem Fehler.
         VORSICHT: Für die ChIP-Anwendung muss der Benutzer zwei Designfaktoren angeben.
      6. Fügen Sie der entsprechenden Zeile von NGS_user_inputs.csv Designfaktoren hinzu. Stellen Sie sicher, dass die Spaltennamen, die für Designfaktoren verwendet werden, als durch Semikolons getrennte Zeichenfolge aufgeführt werden (z . B. treatment; Belastung oder sample_type; Epitop).
         ACHTUNG: Die Konstruktionsfaktoren in NGS_user_inputs.csv müssen genau mit den Spalten NGS_user_metadata.csv übereinstimmen. Jede nicht übereinstimmende Ausführung führt während der Ausführung zu einem Fehler (Abbildung 2, Ergänzende Tabelle S1 und Ergänzende Tabelle S2).

Abbildung 2: Beispiel NGS_user_input.csv und NGS_user_metadata.csv. Beispiele für die NGS_user_input.csv (oberer Bereich) und den NGS_user_metadata.csv (unterer Bereich), die die Übereinstimmung zwischen den Spalten designfactor und designfactor mit rosa oder blauem Text und Pfeilen hervorheben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

5. Vorverarbeitung von NGS-Daten

HINWEIS: Fahren Sie mit Abschnitt 5 oder 6 fort, wenn Sie eine benutzerdefinierte Vorverarbeitung verwenden.

1. Öffnen Sie die NGS-Vorverarbeitung Jupyter Notebook (NGS_Preprocessing.ipynb).
2. Aktivieren Sie WP_preprocessing Umgebung (erstellt in Schritt 1.2) in der oberen rechten Ecke der Notebook-Oberfläche.
3. Führen Sie die erste Zelle aus, indem Sie die Umschalttaste gedrückt halten und dann die Eingabetaste (Umschalt+Eingabetaste) drücken.
4. Aktualisieren Sie in der zweiten Zelle des Jupyter Notebook den Verzeichnispfad, indem Sie Directory = "path/to/your/data" festlegen, wobei path/to/your/data/ das in Abschnitt 2 erstellte Verzeichnis ist.
5. Generieren von Achsdateien. Die Vorverarbeitungsfunktionen führen das Trimmen mit FastP¹⁸ durch. Qualitätskontrolle mit FastQC¹⁹ und MultiQC²⁰; Ausrichtung mit STAR²¹. Die ausgegebenen Ausrichtungsdateien werden in einem Unterverzeichnis mit dem Namen startout innerhalb des Datenverzeichnisses gespeichert (z. B. path/to/your/data/starout); Filtern (oderptional) mit samtools view²², filtern Sie die Ausrichtungsdatei so, dass nur Lesevorgänge über einem in NGS_user_inputs.csv angegebenen Schwellenwert gespeichert werden.
   HINWEIS: Diese Funktionen verarbeiten jeweils nur einzelne Lesevorgänge (z. B. R1) des Datensatzes. Benutzer können Ausführungsoptionen für FastP und STAR in der NGS_user_inputs.csv festlegen (z. B. FastP: adapter_sequence (optional); STAR: genomeDir, genomeFastaFiles, sjdbGTFfil).
6. Führen Sie Vorverarbeitungsfunktionen in der zweiten Zelle mit Shift + Enter aus.
   HINWEIS: Die Ausführung der Aufgaben in der zweiten Zelle kann mehrere Stunden dauern. Wenn die Ausführung unterbrochen wird, wiederholen Sie die Schritte 5.3 bis 5.6, um die Ausführung neu zu starten. Der Fortschritt aus den vorherigen Schritten wird nicht überschrieben, und der Prozess wird an der Stelle fortgesetzt, an der er aufgehört hat.
7. Generieren Sie Trace-Dateien des Achs-Coverages mit BamCoverage²³ (siehe Schritte 5.7.1 und 5.7.2).
   HINWEIS: Für ChIPseq benötigt WonderPeaks einzelne Bedgraph-Dateien, die eine Abdeckung sowohl für Vorwärts- als auch für Rückwärtslesevorgänge enthalten. Für RNAseq mit Poly(A)-Priming benötigt PeakStream zwei Bedgraph-Dateien, eine für Forward-Reads (_fwd.bedgraph) und eine für Reverse-Reads (_rev.bedgraph). Vorwärts- und Rückwärtslesevorgänge werden mit dem Parameter filterRNAstrand in BamCoverage²³ generiert.
   1. ChIPseq mit den folgenden Parametern: outfilfeformat="bedgraph", strand=None, binsize=20, smoothLength=60, minMappingQuality=255, normalizeUsing="CPM".
      HINWEIS: Ausgabe: Erzeugt einzelne Bedgraph-Dateien, die eine Abdeckung sowohl für Vorwärts- als auch für Rückwärtslesevorgänge enthalten. Die Ausgabe wird in /path/to/your/data/bedgraphout gespeichert (Abbildung 3).
      1. Führen Sie die Funktion BamCoverage in der dritten Zelle mit Umschalt + Eingabetaste aus.
   2. RNAseq mit den folgenden Parametern: outfilfeformat="bedgraph", strand="forward" oder "reverse", binsize=20, smoothLength=60, minMappingQuality=255, normalizeUsing="CPM".
      VORSICHT: Stellen Sie sicher, dass Sie die Funktion zweimal ausführen, wobei der Strang entweder auf vorwärts oder rückwärts gesetzt ist, um Dateien für Lesevorgänge in beide Richtungen zu generieren.
      HINWEIS: Ausgabe: Erzeugt zwei Bedgraph-Dateien: eine für Forward Reads (_fwd.bedgraph) und eine für Reverse Reads (_rev.bedgraph). Die Ausgabe wird in /path/to/your/data/ bedgraphout gespeichert (Abbildung 3).
      1. Führen Sie die Funktion BamCoverage in der dritten Zelle mit Umschalt + Eingabetaste aus.

Abbildung 3: Dateiorganisation für WonderPeaks. Ein Screenshot des Datenordners mit den bedgraph-Dateien im Verzeichnis bedgrapghout/normalizeUsingCPM. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

6. WonderPeaks für ChIPseq

1. Vorab-Prüfung
   1. Vergewissern Sie sich, dass sich alle bedgraph-Dateien mit dem Dateihandle .bedgraph in einem Unterverzeichnis innerhalb des Datenverzeichnisses mit dem Namen bedgraphout befinden (Abbildung 3).
   2. Vergewissern Sie sich, dass die Designfaktoren in user_inputs Datei (NGS_user_inputs.csv) (Abbildung 2) mit den Spalten in der Metadatendatei (NGS_user_metadata.csv) übereinstimmen und dass die Zeilen der Designfactor-Spalten nicht eindeutig sind (siehe Vorsicht in Schritt 4.2.4).
2. Öffnen Sie die NGS-Vorverarbeitung Jupyter Notebook (WP4ChIP.ipynb).
3. Aktivieren Sie WonderPeaks (die in Schritt 1.3 erstellte Umgebung) in der oberen rechten Ecke der Notebook-Benutzeroberfläche.
4. Führen Sie die Zellen mit UMSCHALT+EINGABETASTE bis zum Haltepunkt aus, um Spitzenaufrufe auszuführen. Sobald der Vorgang abgeschlossen ist, wird eine Aufzeichnung der verarbeiteten Daten in einem Unterverzeichnis innerhalb des Datenverzeichnisses namens WonderPeaks gespeichert und gespeichert
   1. Achten Sie auf WOnder_init.csv: eine Verkettung der gesamten Rohabdeckung und der Ergebnisse aus der Berechnung der ersten Ableitung.
   2. Hinweis WOnder_unfiltered_peaks.csv: eine Verkettung aller ungefilterten Peaks, die auf der Grundlage der ersten Ableitung aufgerufen werden.
   3. Observe bedgraph_summary.csv: eine Zusammenfassung der Score-Statistiken nach dem Gruppieren der einzelnen Dateien und Chromosomen.
5. Definieren Sie die Ausführungsparameter:
   1. Führen Sie die 1^. Zelle unterhalb des Markdown-Haltepunkts aus.
      HINWEIS: Es wird ein Diagramm angezeigt, in dem die Rohdaten getrennt nach den angegebenen Bemessungsfaktoren und eine Tabelle mit den Bemessungsfaktoren angezeigt werden. Verwenden Sie die Tabelle und das Diagramm, um die Werte in den nachfolgenden Schritten zu bestimmen (Abbildung 4).
   2. Geben Sie in der nächsten Zelle die Werte für score_cut, fold_change und Designfactor an (Abbildung 4).
      1. score_cut ist der Schwellenwert, der verwendet wird, um zu bestimmen, ob ein Peak in der Ausgabe berücksichtigt werden soll. Um den score_cut zu bestimmen, beobachten Sie das Diagramm und wählen Sie einen Wert nahe dem Median der getaggten Daten (siehe Hash-Linie, Abbildung 4). Geben Sie diesen Wert wie folgt ein: score_cut= Wert.
      2. fold_change ist der Schwellenwert für die Verhältniswerte von tagged:untagged der verwendet wird, um zu bestimmen, ob ein Peak als real angesehen wird. Um den fold_change zu bestimmen, beobachten Sie das Diagramm, und wählen Sie einen Wert aus, der über dem Verhältnis der Mediane der nicht getaggten und der getaggten Daten liegt. Geben Sie diesen Wert wie folgt ein: fold_change= Wert.
      3. designfactor_value wird im Rahmen des Versuchsdesigns spezifiziert. Mögliche Bemessungsfaktoren sind in der gedruckten Tabelle rot aufgeführt. Um den Konstruktionsfaktor zu bestimmen, wählen Sie einen der rot aufgeführten Werte aus. Geben Sie diesen Wert zwischen Anführungszeichen wie folgt ein: designfactor_value ="{ Wert}".
6. Führen Sie die nächsten Zellen mit Umschalt + Eingabetaste aus, um die Spitzenfilterung und -zuordnung auszuführen. Die Daten und Zusammenfassungsdiagramme werden in einem Unterverzeichnis innerhalb des Datenverzeichnisses namens WonderPeaks gespeichert.
   1. Observe {designfactor_value}_taggedVuntagged.csv: Eine Pivot-Tabelle aller überlappenden Peaks mit einer Spalte für jede der getaggten und nicht getaggten Proben.
   2. Hinweis {designfactor_value}_all_tagged_peaks.csv: Eine Übersichtstabelle aller tatsächlichen Peaks, basierend auf Benutzerparametern (Schritt 6.5).
   3. Observe {designfactor_value}_peaks2gtf.csv: Eine Zuordnung der realen Peaks, basierend auf Benutzerparametern (Schritt 6.5), zu Genen in der benutzerdefinierten Annotationsdatei.
7. Optional: Schalten Sie die Parameter in Schritt 6.5 um, indem Sie die Schritte 6.5-6.6 erneut ausführen. Wenn die gleiche designfactor_value verwendet wird, werden die erzeugten Dateien, wie in Schritt 6.6 beschrieben, überschrieben.

Abbildung 4: Screenshot der designfactor_value und benutzerdefinierten Schwellenwerte in WonderPeaks für ChIP-seq. Screenshot des WonderPeaks Jupyter Notebooks, der die möglichen designfactor_value Optionen aus der angezeigten Tabelle hervorhebt und zeigt, wie die designfactor_value in der nächsten Zelle implementiert wird. Der obere schwarze Pfeil zeigt auf eine Tabelle, in der mögliche designfactor_value Einträge angezeigt werden. Der Op-Wert wird eingekreist und als ausgewählte Benutzereingabe für designfactor_value in der Zelle Optionen (schwarzer Pfeil unten) angezeigt. In der Grafik zeigen durchgezogene und gestrichelte Linien die ungefähren mittleren Spitzenwerte für markierte bzw. nicht markierte Proben in den undurchsichtigen Zellexperimenten an. Diese Mediane werden verwendet, um die Parameter score_cut (markierter Median) und fold_change (das Verhältnis von markierten zu nicht getaggten Medianen) zu definieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

7. PeakStream für 3'RNAseq

1. Vorab-Check:
   1. Vergewissern Sie sich, dass sich alle bedgraph-Dateien in einem Unterverzeichnis innerhalb des Datenverzeichnisses mit dem Namen bedgraphout befinden (Abbildung 2).
   2. Öffnen der NGS-Vorverarbeitung Jupyter Notebook (PeakStream.ipynb)
   3. Aktivieren Sie WonderPeaks (die in Schritt 1.3 erstellte Umgebung) in der oberen rechten Ecke der Notebook-Benutzeroberfläche.
2. Führen Sie die Zellen mit UMSCHALT+EINGABETASTE bis zum Haltepunkt aus, um den Spitzenaufruf und die Spitzenzuordnung auszuführen. Sobald der Vorgang abgeschlossen ist, wird eine neue Anmerkungsdatei mit vorhergesagten 3'-UTRs und FeatureCounts 24-Leseanzahldateien gespeichert und in einem Unterverzeichnis innerhalb Ihres Datenverzeichnisses namens PeakStream gespeichert (Abbildung 5).
   HINWEIS: Standardmäßig enthält die Ausgabedatei nur Anmerkungen für proteinkodierende Biotypen, dies kann jedoch mit der Option biotype umgeschaltet werden.

Abbildung 5: Dateiorganisation für PeakStream. Ein Screenshot des Datenordners mit den bedgraph-Dateien im Verzeichnis bedgrapghout. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergebnisse

WonderPeaks
Nach der Durchführung eines ChIP-seq-Experiments verwenden Forscher häufig Peak-Caller wie MACS³, um genomische Regionen zu identifizieren, die mit einem Epitop-markierten DNA-bindenden Protein angereichert sind. Wir haben WonderPeaks als benutzerfreundlichen Peak-Caller entwickelt, der entwickelt wurde, um Peaks mit der oben beschriebenen Methode zu identifizieren.

WonderPeaks identifiziert Peaks, indem es zunächst die erste Ableitung de...

Diskussion

Next-Generation-Sequencing-Techniken (NGS) bieten einen beispiellosen Einblick in die Genregulation und -expression in pilzlichen Krankheitserregern. Daher müssen die Berechnungswerkzeuge sowohl umfassend sein – sie erfassen alle in einem Experiment generierten Daten – als auch für allgemeine Nutzer, insbesondere für Laborwissenschaftler, zugänglich sein. In diesem Bericht haben wir zwei Tools, WonderPeaks und PeakStream, vorgestellt, die diese Anforderungen von Forschern an Pilzpathogen...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
CORALL Total RNA-seq V1 Kit	Lexogen	095	Nasslabormaterial
Filament-Pilze riboPOOL	siTOOLs	dp-P096-6	Nasslabormaterial
Hochempfindliches RNA-ScreenTape	Agilent	5067-5579	Nasslabormaterial
Hochempfindliche RNA ScreenTape Leiter	Agilent	5067-5581	Nasslabormaterial
Hochempfindlicher RNA-ScreenTape-Probenpuffer	Agilent	5067-5580	Nasslabormaterial
			Liste der Abhängigkeiten für WonderPeaks
https://github.com/mgarber21/WonderPeaks_preprocessing/blob/main/environment.yml			Liste der Abhängigkeiten für WonderPeaks_preprocessing
Monarch Spin RNA Cleanup Ki	NEB	T2040L	Nasslabormaterial
pygenometracks (3.9)
QuantSeq 3′ mRNA-Seq FWD Library Prep Kit V1	Lexogen	015	Nasslabormaterial
Qubit RNA High Sensitivity (HS) Assay Kit	Invitrogen	Q32852	Nasslabormaterial
RNA reinigen & Konzentrator-5	Zymo Research	R1016	Nasslabormaterial
TURBO DNA-freies Kit	ThermoFisher	AM1907	Nasslabormaterial
WonderPeaks(0.1.14)
WonderPeaks_preprocessing(0.2.3)