Technik der Bindehautbiopsie und direkten Immunfluoreszenz zur Diagnose von Schleimhaut-Pemphigoiden

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll für die Entnahme und Verarbeitung einer Bindehautbiopsie zur Identifizierung von Schleimhautpemphigoiden vor.

Zusammenfassung

Das Pemphigoid der Augenschleimhaut (MMP) stellt sich als chronisch vernarbende Konjunktivitis dar, die unbehandelt zur Erblindung führen kann. Eine rechtzeitige Diagnose und immunsuppressive Therapie verhindern ein Fortschreiten der Erkrankung. Die direkte Immunfluoreszenzfärbung (DIF) der Bindehautbiopsie zur Immunkomplexablagerung in der Basalmembran ist diagnostisch für MMP. Die Biopsie-Positivitätsrate hängt von den Biopsiemerkmalen, der Lateralität, dem Alter und der Krankheitsaktivität ab. Das vorliegende Methodenpapier beschreibt die Technik der Entnahme der Bindehautbiopsie und der Verwendung von mediumgefüllten Kartuschen mit optimaler Schnitttemperatur für den Probentransfer und die Blockvorbereitung. Eine Biopsie wird an einer nicht vernarbten, nicht oder relativ weniger betroffenen Region der Bindehaut in beiden Augen durchgeführt. Die übliche Biopsiegröße ist 4-5 mm lang, 2-3 mm breit und sollte winziges darunter liegendes subkonjunktivales Gewebe aufweisen, damit die Basalmembran nicht übersehen wird. Wir empfehlen, eine periodische saure Schiff-Färbung durchzuführen, um das Vorhandensein der Basalmembran zu bestätigen. Unter Verwendung eines festgelegten Protokolls werden die Kryoschnitte aus Biopsien mit fluoreszenzkonjugierten Antikörpern IgG, IgM, IgA und den Komplementfaktoren C3c und C4c gefärbt. Eine positive Biopsie zeigt die grün positive Fluoreszenz in der Basalmembran, und selbst wenn einer der Antikörper positiv ist, ist er MMP-positiv. Eine negative Biopsie schließt ein Pemphigoid nicht aus; eine positive Bestätigung bestätigt jedoch das MMP und unterscheidet es von der medikamenteninduzierten vernarbenden Konjunktivitis oder dem Pseudopemphigoid.

Einleitung

Das Schleimhautpemphigoid (MMP) ist eine chronisch vernarbende Bindehauterkrankung mit autoimmuner Ätiologie und betrifft die Schleimhäute im Körper ^1,2. Die chronisch vernarbende Konjunktivitis hat unterschiedliche Ätiologien, und die Unterscheidung von MMP von SJS, Sarkoidose, okulärer Plattenepithelneoplasie und Pseudopemphigoid ist notwendig, da erstere eine systemische Immunsuppression erfordert ^3,4. Darüber hinaus handelt es sich bei MMP um eine potenziell erblindende Krankheit, bei der die Patienten oft spät vorstellig werden und zunächst falsch diagnostiziert werden ^1,2,5. Nur eine okuläre Beteiligung ohne systemische Beteiligung ist bei 27,4 % der okulären MMP-Patienten zu beobachten⁶. Die Diagnose einer MMP erfordert eine Bindehautbiopsie, um das Vorhandensein von Autoantikörpern in der Basalmembran zu zeigen ^2,5. Die direkte Immunfluoreszenz (DIF) ist ein zentrales diagnostisches Instrument zur Identifizierung von Autoimmunerkrankungen, die die Bindehaut betreffen, wie z. B. MMP. DIF hilft beim Nachweis der in-situ-Ablagerung von Immunglobulinen und Komplementkomponenten in der Basalmembranzone (BMZ), einer Eigenschaft von MMP. Die DIF-Positivitätsraten schwanken zwischen 30 % und 80 %^1,5. Bei einigen Patienten kann es jedoch zu einer negativen Biopsie kommen, insbesondere bei Patienten mit rein okulärer MMP, aber die klinische Dokumentation des Krankheitsverlaufs wird ähnlich behandelt wie bei biopsiepositiven okulären MMP-Fällen ^7,8. Daher betonten Dart et al. die Notwendigkeit separater diagnostischer Kriterien für MMP⁸ nur mit Augen.

Die vermuteten Gründe für die niedrige Positivitätsrate in allen Studien sind eine fortgeschrittene Erkrankung mit ausgedehnter Vernarbung der Augenoberfläche, unzureichende Gewebeaufbereitungs- oder Färbetechniken und eine biopsienegative Krankheitsvariante 8,9,10,11. Eine retrospektive Analyse von Biopsien von 27 Patienten mit Verdacht auf okuläre MMP ergab nur eine Positivitätsrate von 30 % und 63,7 % hatten nur eine okuläre Beteiligung¹². DIF erfordert ein spezifisches Protokoll; Nicht jedes diagnostische Labor ist darauf eingestellt. Es gibt Unterschiede hinsichtlich der Biopsiestelle, ob eine Biopsie von einem oder beiden Augen durchgeführt werden soll, und der Probentransferlösungen 13,14,15. In einer retrospektiven Analyse der konjunktivalen Biopsien in unserem Zentrum lag die DIF-Positivitätsrate bei 54,1 %, wobei die bilateralen Biopsien (59 % vs. 45 %) positiver ^waren8. Obwohl eine Biopsie von entscheidender Bedeutung ist, tragen klinische Symptome und eine fortschreitende Vernarbung der Augenoberfläche dazu bei, die Diagnose einer MMP zu klären. Es ist einfacher zu diagnostizieren, wenn eine extraokulare Stelle betroffen ist, wie z. B. oral oder Haut, die bei 40 % bzw. 18 % der Patienten berichtet wurde⁵.

Es gibt Variationen in der vorhandenen Literatur, und das hier vorgestellte Protokoll kann als Referenzhandbuch dienen, wobei Modifikationen eingeführt wurden, um den Bedarf an einem einzigartigen Übertragungsmedium¹⁴ zu verringern. Die Biopsien werden in ein Medium mit optimaler Schneidtemperatur (OCT) übertragen und im Pathologielabor in derselben Transferkartusche schockgefroren, wodurch ein zusätzliches Transfermedium überflüssig wird. Die vorliegende Arbeit beschreibt die Methodik für die DIF-Färbung von Bindehautgewebe, die Gewebeentnahme und das Probentransferprotokoll.

Protokoll

Das Protokoll folgt den Richtlinien der Ethikkommission für Humanforschung des LV Prasad Eye Institute, der Ethikkommission für die Humanforschung.

1. Technik der Bindehautbiopsie

1. Planen Sie die Biopsie von beiden Augen des Patienten mit Verdacht auf Pemphigoid unter topischer oder örtlicher Betäubung und Operationsmikroskop.
2. Holen Sie die Einverständniserklärung des Patienten ein und listen Sie mögliche Nebenwirkungen von Blutungen, Narbenbildung und die Notwendigkeit auf, nach der Operation mit topischen Steroiden zu beginnen.
3. Geben Sie 1-2 Tropfen 0,5% Proparacain in beide Augen und warten Sie 5 Minuten, bevor Sie mit dem Eingriff beginnen.
4. Stellen Sie sicher, dass der Patient keine Schmerzen verspürt, wenn er die Bindehaut mit einer feinen Pinzette berührt. Wenn der Patient nach der Anwendung von topischem Proparacain immer noch Schmerzen verspürt, injizieren Sie 0,2 ml subkonjunktivales 2% Lidocain mit einer 1 ml-Tuberkulinspritze.
5. Platzieren Sie ein Spekulum im rechten oder linken Auge, je nachdem, was zuerst gewählt wird.
6. Untersuchen Sie die Augenoberfläche auf Bereiche mit Narbenbildung und Verhornung. Wählen Sie den Biopsiebereich aus, der nicht beteiligt und nicht vernarbt oder verhornt ist.
   HINWEIS: In dieser Studie wird die obere bulbäre Bindehaut weg vom Limbus als Biopsiestelle bevorzugt, gefolgt von der unteren bulbären Bindehaut.
7. Heben Sie die Sklera mit Lims Pinzette von der Bindehaut ab und exzitieren Sie sie linear mit einer Westcott-Schere, die 4-5 mm lang und 2-3 mm breit ist.
8. Übertragen Sie die gesamte Biopsie sofort auf ein optimales Schneidmedium (OCT).
   HINWEIS: Biopsien können in normaler Kochsalzlösung oder einem Michel-Transportmedium übertragen werden.
9. Nehmen Sie eine Kartusche und eine Plastikform mit einer Vertiefung in der Mitte, reinigen Sie sie mit Kochsalzlösung und trocknen Sie sie an der Luft.
10. Füllen Sie die Patrone separat mit OCT-Medium für das rechte und linke Auge. Tauchen Sie das exzidierte Bindegewebe in das OCT-Medium und senden Sie es an die Pathologie.
11. Wiederholen Sie die ähnlichen Schritte auch für die kontralaterale Seite.

2. Übertragung des Gewebes

1. Betten Sie die Biopsieproben der Bindehaut in ein OCT-Medium ein, um die Gewebearchitektur und Antigenität zu erhalten, wenn sie in Michels Transportmedium oder normaler Kochsalzlösung erhalten werden.
2. Die eingebetteten Proben werden mit flüssigem Stickstoff oder Trockeneis eingefroren und über Nacht bei -80 °C gelagert.

3. Vorbereitung und Gewebeschnitt

1. Schneiden Sie das gefrorene Gewebe mit einem Kryostaten bei -20 °C bis -25 °C in 4-6 μm große Scheiben (7 an der Zahl).
2. Montieren Sie die Schnitte auf positiv geladene polylysinbeschichtete Objektträger, um die Haftung zu gewährleisten, und lagern Sie sie bei -80 °C, bis sie in Aluminiumfolie verfärben.

4. Immunfluoreszenz-Färbung

1. Tauen Sie die Objektträger 10 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT) auf und fixieren Sie sie 10 Minuten lang in kaltem Aceton (100 %), um Antigene zu erhalten und Gewebeschäden zu vermeiden.
2. Spülen Sie dreimal mit 1x PBS, jedes Mal für 5 Minuten, um überschüssiges OCT-Medium und Aceton zu entfernen.
3. Tragen Sie konjugierte Antikörper Anti-IgG, Anti-IgA, Anti-IgM und Anti-C3 verdünnt (Fibrinogen-1:10 [Positivkontrolle], IgG-1:10, IgA-1:10, IgM-1:10, C3-1:5, C4-1:10) auf Objektträger auf.
   HINWEIS: Antikörper werden in 1x PBS verdünnt.
4. Bei Negativkontrollen überspringen Sie die Anwendung von konjugierten Antikörpern und befolgen Sie die verbleibenden unten genannten Schritte.
5. Befolgen Sie die Herstellerrichtlinien zur Verdünnung der Antikörper und standardisieren Sie mit bekannten Positiv- und Negativkontrollen.
6. Inkubieren Sie die Objektträger in einer befeuchteten Kammer bei 37 °C für 45-60 Minuten.
7. Waschen Sie die Objektträger mit PBS (3× für jeweils 5 Minuten), um ungebundene Antikörper zu entfernen.
8. Gegenfärbung mit DAPI (4',6-diamidino-2-phenylidol)-haltigem Einbettmedium zur nuklearen Visualisierung.
9. Legen Sie ein Deckglas über die Objektträger und lassen Sie sie 20 Minuten aushärten.
10. Untersuchen Sie die Objektträger mit einem Fluoreszenzmikroskop, das mit entsprechenden Filtern für die verwendeten Fluorophore ausgestattet ist (Anregungsgrünfilter für 488 nm).
11. Dokumentieren Sie die Befunde mit digitalen Schliffbildern.

5. Schnelle periodische Säure - Schiff-Färbung

1. Zubereitung von periodischer Säure Schiff (PAS)
   1. 1 g basisches Fuschin in 100 ml heißem destilliertem Wasser auflösen.
   2. Fügen Sie 10 ml Salzsäure und 2 g Kaliumdisulfit hinzu, um den Farbstoff zu entfärben.
   3. Nach dem Abkühlen 0,5 g Aktivkohle hinzufügen, umrühren und die Lösung filtrieren, um eine klare periodische Säure zu erhalten, das Schiff-Reagenz. In einer dunklen Flasche aufbewahren.
      HINWEIS: Um auf Schiff's Reagenz zu testen, gießen Sie 10 ml 37% Formalin in ein Uhrglas und fügen Sie ein paar Tropfen Schiff's hinzu, die getestet werden sollen. Ein gutes Schiff-Reagenz färbt sich schnell rot-violett. Ein sich verschlechterndes Schiff-Reagenz führt zu einer verzögerten Reaktion, und das Produkt wird tiefblau-violett.
2. PAS-Färbetechnik
   1. Hydratisieren Sie die Objektträger mit Wasser.
   2. In 0,5%iger periodischer saurer Lösung 5 min oxidieren.
   3. In destilliertem Wasser abspülen.
   4. 15 Minuten lang in das Reagenz von Schiff geben (die Abschnitte sehen bei diesem Schritt hellrosa aus)
   5. 5 min in lauwarmem Leitungswasser waschen (Abschnitte färben sich dunkelrosa).
   6. Gegenfärbung in Mayer's Hämatoxylin für 1 min.
   7. 5 Min. in Leitungswasser waschen.
   8. Dehydrieren Sie die Objektträger in den folgenden Lösungen: Einmal 1 Minute lang in 80 % Ethylalkohol, zweimal 1 Minute lang in 90 % Ethylalkohol, zweimal 1 Minute lang in 100 % Ethylalkohol.
   9. Dörren Sie die Objektträger dreimal für jeweils 1 min in Xylol.
   10. Legen Sie ein Deckglas mit einem synthetischen Eindeckmedium (z. B. DPX-Eindeckmittel) über die Objektträger
   11. Beobachten Sie die PAS-Ergebnisse unter dem Hellfeldmikroskop.

Ergebnisse

Die Interpretation des DIF erfordert die Bestätigung des Vorhandenseins der Basalmembran in den Gewebeschnitten (Abbildung 1). In den PAS-gefärbten Objektträgern erscheint die Basalmembran als hellrosa Membran, die sich im basalen Bereich des Bindehautepithels befindet (Abbildung 1C). Auch die Kontinuität und Architektur der Basalmembran ist zu kommentieren. Die DIF-Positivität wird als hellgrünes BM (Abbildung 1B) dargestellt, was ...

Diskussion

Die hier beschriebene Technik der Bindehautbiopsie verwendet OCT-Medium als Transfermedium, wodurch die Notwendigkeit eines zusätzlichen Transfermediums vermieden wird und die Biopsiehandhabung für die Übertragung auf das OCT-Medium für die Kryosektion vermieden wird. Eine mit Medium und Biopsie gefüllte Kunststoffkartuschenform wird direkt eingefroren, um Gewebeblöcke herzustellen, und dann geschnitten. Die Vorteile der OCT bestehen darin, dass sie schnell und mit minimaler Schädigung d...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1 N Salzsäure	Finar  Chemie Limited	7647-01-0
Aceton	Qualifikationen	Frage 33517
Albumin	DAKO	Nr. F0117
Grundlegendes Fuchsin	Qualifikationen	Frage 39402
C3c	Diagnostische Biosysteme	Nr. F003
C4c	Diagnostische Biosysteme	Nr. F005
Patrone	Polywissenschaften	25376-500
Aktivkohle aktiviert	Sigma	Nr. C-5260
Kryostat	Leica	CM1860UV
Kryotom-Klingen	Leica	818
DAPI	Abcam	Artikel-Nr.: 104139
Fibrinogen	Diagnostische Biosysteme	Nr. F006
Fluoreszenzmikroskop	Olymp	CX43
Pinzette	Joja chirurgisch	JS1528A
Feuchtigkeitskammer	Diagnostische Biosysteme	SM365
IgA	Diagnostische Biosysteme	Nr. F007
IgG	Diagnostische Biosysteme	Nr. F008
Igm	Diagnostische Biosysteme	Nr. F009
IHC Selbstklebende Glasobjektträger	Tomo	33140455
Lim-Zange	Speedway	Nr. S-7223
Michels Tansport Medium	Fisher Scinitics	NC0253304
Mikroskopisch kleines Deckglas	Blauer Stern	https://www.bluestarslides.com
ÜLG Mittel	Kryomatrix	6769006
PBS	DAKO	Nr. DM831
Periodische Säure	Sigma	375810-25G
Kaliumdisulfit	Sigma	Nr. P2522-500G
Proparacain 0,5%	Sunway Privat	G/1118A
Westcotts Schere	Pillig Chirurgische Instrumente	423480