Isolierung und durchflusszytometrische Bewertung neuroimmuner Interaktionen in einem Mini-Schlaganfall-Mausmodell

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll zur Beurteilung der Immunzellfunktion nach ischämischem Schlaganfall mittels durchflusszytometrischer Analyse in einem Mini-Schlaganfallmodell vor. Diese Methode ermöglicht eine detaillierte Untersuchung der neuroimmunen Interaktionen und kann für die Untersuchung anderer neurodegenerativer Erkrankungen angepasst werden, um unser Verständnis der Immunantworten in der Schlaganfallpathologie zu verbessern.

Zusammenfassung

Schlaganfall ist weltweit eine der häufigsten Todesursachen und langfristigen Behinderungen, wobei ischämischer Schlaganfall die Mehrheit der Fälle ausmacht. Nach einem ischämischen Schlaganfall werden residente und infiltrierende Immunzellen aktiviert, was zu weiteren neuronalen Schäden beiträgt. Die Rolle des Immunsystems bei der Pathologie des ischämischen Schlaganfalls ist jedoch nicht vollständig verstanden, was vor allem auf die komplexe und dynamische Regulation der Immunantworten als Reaktion auf Veränderungen in der Mikroumgebung während der Neuroinflammation zurückzuführen ist. Daher ist es wichtig, die Aktivierung von residenten und infiltrierenden Immunzellen im Laufe der Zeit nach einem ischämischen Schlaganfall zu überwachen und zu analysieren. In dieser Studie stellen wir ein Protokoll zur Beurteilung der Funktion dieser Immunzellen nach ischämischem Schlaganfall mittels durchflusszytometrischer Analyse in einem Mini-Schlaganfallmodell vor. Wir präparieren das infarzierte Hirngewebe zu bestimmten Zeitpunkten und dissoziieren es dann sowohl mit mechanischen als auch mit enzymatischen Methoden in eine Einzelzellsuspension. Die Zellen werden durch ein 70-μm-Zellsieb geleitet und mit fluoreszenzmarkierten Antikörpercocktails markiert, bevor sie durch durchflusszytometrische Analyse quantifiziert werden. Während dieser Assay speziell für die Untersuchung neuroimmuner Interaktionen nach ischämischem Schlaganfall entwickelt wurde, kann er auch leicht angepasst werden, um neuroimmune Mechanismen bei anderen neurodegenerativen Erkrankungen wie Multipler Sklerose, Parkinson und Alzheimer zu untersuchen.

Einleitung

Der Schlaganfall ist weltweit eine der vorherrschenden Ursachen für Mortalität und langfristige Behinderung, wobei der ischämische Schlaganfall die überwiegende Mehrheit der Fälle ausmacht ^1,2,3. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, unser Verständnis der neuroimmunen Interaktionen, die nach einem ischämischen Schlaganfall auftreten, zu verbessern, indem sie einen verfeinerten Ansatz zur Bewertung der Aktivierung sowohl residenter als auch infiltrierender Immunzellen in einem Mini-Schlaganfall-Mausmodell bietet....

Protokoll

Alle Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Beijing Friendship Hospital der Capital Medical University genehmigt. Wir empfehlen, alle Lösungen einer Sterilfiltration zu unterziehen und alle verwendeten Röhrchen steril zu halten.

1. Vorbereitung der Reagenzien und des Puffers

1. Verdauungsenzym-Mix: Kollagenase IV auflösen, um eine Konzentration von 0,25 % zu erhalten, und DNase I verdünnen, um eine Endkonzentration von 2 U/ml zu erreichen.
2. MACS-Puffer (Magnetic Activated Cell Sorting (MACS): Lösen Sie Rinderserumalbumin (BSA) und E....

Ergebnisse

In dieser Studie stellen wir ein verfeinertes Protokoll zur Bewertung der Funktionalität von Immunzellen nach ischämischem Schlaganfall vor, das eine durchflusszytometrische Analyse innerhalb eines Mini-Schlaganfallmodells verwendet. Der Mini-Schlaganfall wurde durch die permanente Ligatur des distalen Astes der rechten mittleren Hirnarterie (MCA) induziert, gefolgt von einem 7-minütigen Verschluss der bilateralen Arteria carotis communis (CCAs). Diese Methode führt zu einem milden Schlaganfall, der sich durch kleine, ko.......

Diskussion

In dieser Studie stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Beurteilung der Funktion von Immunzellen nach ischämischem Schlaganfall vor, wobei wir eine durchflusszytometrische Analyse in einem Mini-Schlaganfallmodell verwenden. Zu den kritischen Schritten dieses Protokolls gehören die Etablierung eines fokalen ischämischen Schlaganfalls über die permanente Ligatur des distalen Astes der rechten mittleren Hirnarterie (MCA) sowie ein siebenminütiger Verschluss der bilateralen Arteria caro.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen	NEST	615601	Material für das Labor
1&mal; PBS	Corning	21-040-CM	Reagenz
96-Well-Mikrotiterplatte mit klarem Rundboden, TC-behandelt	Corning	3799	Material für das Labor
APC Anti-Maus CD19	Biolegende	152410	Antikörper
APC/Cyanin7 Anti-Maus CD45	Biolegende	103116	Antikörper
Avertin (1,25 %)	Nanjing Aibei Biotechnologie	Nr. M2920	Reagenz
BD FACSAria II	BD	642510	Ausrüstung
Brilliant Violet 421 Anti-Maus CD4	Biolegende	100437	Antikörper
Brilliant Violet 605 Anti-Maus / Mensch CD11b	Biolegende	101237	Antikörper
BSA	Sigma-Aldrich	Nr. A1933-1G	Chemisch
Kollagenase IV	Sigma-Aldrich	Nr. C4-28-100MG	Enzym
DNase I	Neuengland Biolabore	M0303L	Enzym
EDTA	Sigma-Aldrich	EDS-100G	Chemisch
Falcon 5 mL Reagenzgläser aus Polystyrol mit rundem Boden	Corning	352052	Material für das Labor
Falke  Konische 15-ml-Zentrifugenröhrchen	Corning	352095	Material für das Labor
FlowJo V10	BD		Software
GLAST (ACSA-1) Antikörper, PE	Miltenyi Biotec	130-118-344	Antikörper
Isofluran	RWD Biowissenschaften	Nr. R510-22-10	Reagenz
PE/Cyanin7 Anti-Maus CD3	Biolegende	100220	Antikörper
PE/Dazzle 594 Anti-Maus NK-1.1	Biolegende	156518	Antikörper
TRIzol Reagenz	Thermo Fisher Scientific Inc.	15596026	Reagenz
Ultrareines DNase/RNase-freies destilliertes Wasser	Thermo Fisher Scientific Inc.	10977015	Reagenz
Vetbond Tissue-Klebstoffe	3M	1469SB	Material für das Labor
Zombie Aqua Reparierbares Lebensfähigkeitsset	Biolegende	423102	Amin-reaktiver Fluoreszenzfarbstoff