Methodenartikel

Isolierung und durchflusszytometrische Bewertung neuroimmuner Interaktionen in einem Mini-Schlaganfall-Mausmodell

DOI:

10.3791/68308

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20. Juni 2025

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1Experimental and Translational Research Center, Beijing Friendship Hospital, Capital Medical University, 2Department of Neurology, Beijing Friendship Hospital, Capital Medical University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier stellen wir ein Protokoll zur Beurteilung der Immunzellfunktion nach ischämischem Schlaganfall mittels durchflusszytometrischer Analyse in einem Mini-Schlaganfallmodell vor. Diese Methode ermöglicht eine detaillierte Untersuchung der neuroimmunen Interaktionen und kann für die Untersuchung anderer neurodegenerativer Erkrankungen angepasst werden, um unser Verständnis der Immunantworten in der Schlaganfallpathologie zu verbessern.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Schlaganfall ist weltweit eine der häufigsten Todesursachen und langfristigen Behinderungen, wobei ischämischer Schlaganfall die Mehrheit der Fälle ausmacht. Nach einem ischämischen Schlaganfall werden residente und infiltrierende Immunzellen aktiviert, was zu weiteren neuronalen Schäden beiträgt. Die Rolle des Immunsystems bei der Pathologie des ischämischen Schlaganfalls ist jedoch nicht vollständig verstanden, was vor allem auf die komplexe und dynamische Regulation der Immunantworten als Reaktion auf Veränderungen in der Mikroumgebung während der Neuroinflammation zurückzuführen ist. Daher ist es wichtig, die Aktivierung von residenten und infiltrierenden Immunzellen im Laufe der Zeit nach einem ischämischen Schlaganfall zu überwachen und zu analysieren. In dieser Studie stellen wir ein Protokoll zur Beurteilung der Funktion dieser Immunzellen nach ischämischem Schlaganfall mittels durchflusszytometrischer Analyse in einem Mini-Schlaganfallmodell vor. Wir präparieren das infarzierte Hirngewebe zu bestimmten Zeitpunkten und dissoziieren es dann sowohl mit mechanischen als auch mit enzymatischen Methoden in eine Einzelzellsuspension. Die Zellen werden durch ein 70-μm-Zellsieb geleitet und mit fluoreszenzmarkierten Antikörpercocktails markiert, bevor sie durch durchflusszytometrische Analyse quantifiziert werden. Während dieser Assay speziell für die Untersuchung neuroimmuner Interaktionen nach ischämischem Schlaganfall entwickelt wurde, kann er auch leicht angepasst werden, um neuroimmune Mechanismen bei anderen neurodegenerativen Erkrankungen wie Multipler Sklerose, Parkinson und Alzheimer zu untersuchen.

Einleitung

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Der Schlaganfall ist weltweit eine der vorherrschenden Ursachen für Mortalität und langfristige Behinderung, wobei der ischämische Schlaganfall die überwiegende Mehrheit der Fälle ausmacht 1,2,3. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, unser Verständnis der neuroimmunen Interaktionen, die nach einem ischämischen Schlaganfall auftreten, zu verbessern, indem sie einen verfeinerten Ansatz zur Bewertung der Aktivierung sowohl residenter als auch infiltrierender Immunzellen in einem Mini-Schlaganfall-Mausmodell bietet 4,5. Das komplizierte Zusammenspiel zwischen diesen Immunzellen und der neuronalen Mikroumgebung ist entscheidend für das Verständnis der Pathophysiologie des ischämischen Schlaganfalls. Die genauen Mechanismen, die diesen neuroimmunen Interaktionen zugrunde liegen, sind jedoch nach wie vor wenig geklärt, was vor allem auf die dynamische und vielschichtige Natur der Immunantworten zurückzuführen ist, die durch Neuroinflammation ausgelöst werden6. Diese Technik zielt darauf ab, die komplexe Dynamik von Immunantworten im Zusammenhang mit Neuroinflammation und deren anschließende Auswirkungen auf neuronale Schäden und Genesungsergebnisse aufzuklären.

Der Grund für die Entwicklung dieser Technik ergibt sich aus der entscheidenden Rolle, die Immunzellen bei der Verschlimmerung neuronaler Schäden und der Beeinflussung der Genesung nach einem ischämischen Ereignis spielen. Traditionellen Methoden zur Untersuchung dieser Wechselwirkungen fehlt oft die Auflösung, die erforderlich ist, um die zeitlichen und räumlichen Nuancen der Immunzellaktivierung zu erfassen. Durch die Anwendung der durchflusszytometrischen Analyse von Einzelzellsuspensionen, die aus mikrodissektioniertem Hirngewebe gewonnen wurden, bietet dieses Protokoll eine detailliertere und dynamischere Bewertung der Immunzellprofile im Laufe der Zeit 7,8. Dieser Ansatz ermöglicht die Identifizierung spezifischer Immunzellpopulationen und ihrer funktionellen Zustände, die für das Verständnis der Pathophysiologie des ischämischen Schlaganfalls von entscheidender Bedeutung sind.

Im Vergleich zu alternativen Techniken wie der histologischen Färbung oder der Bulk-RNA-Sequenzierung, die möglicherweise nur begrenzte Einblicke in die einzelnen Beiträge von Immunzelltypen liefern, bietet diese durchflusszytometrische Methode mehrere Vorteile. So haben frühere Studien gezeigt, dass die Durchflusszytometrie eine Hochdurchsatzanalyse mehrerer Marker gleichzeitig ermöglicht, was eine umfassendere Charakterisierung der Phänotypen und Funktionen von Immunzellen ermöglicht 9,10,11,12,13. Darüber hinaus zeigt die Fähigkeit dieser Methode, sich an eine Vielzahl von neurodegenerativen Erkrankungen anzupassen - wie Multiple Sklerose, Parkinson und Alzheimer - ihre Vielseitigkeit und Relevanz in der breiteren Literatur, die sich mit neuroimmunen Interaktionen befasst.

Für Forscher, die die Anwendung dieser Methode in Betracht ziehen, ist es wichtig, die spezifischen Ziele ihrer Studie zu bewerten. Diese Technik eignet sich besonders für Untersuchungen, die eine detaillierte zeitliche Analyse von Immunantworten im Rahmen eines ischämischen Schlaganfalls oder verwandter neurodegenerativer Erkrankungen erfordern. Es wird empfohlen, dass die Benutzer über ein grundlegendes Verständnis der Durchflusszytometrie und Erfahrung mit Mausmodellen verfügen, um dieses Protokoll effektiv zu implementieren und die resultierenden Daten zu interpretieren. Indem sie einen robusten Rahmen für die Untersuchung neuroimmuner Interaktionen bietet, trägt diese Methode wesentlich zu den laufenden Bemühungen bei, die Komplexität der Immunbeteiligung bei der Schlaganfallpathologie zu beschreiben.

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Protokoll

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Alle Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Beijing Friendship Hospital der Capital Medical University genehmigt. Wir empfehlen, alle Lösungen einer Sterilfiltration zu unterziehen und alle verwendeten Röhrchen steril zu halten.

1. Vorbereitung der Reagenzien und des Puffers

  1. Verdauungsenzym-Mix: Kollagenase IV auflösen, um eine Konzentration von 0,25 % zu erhalten, und DNase I verdünnen, um eine Endkonzentration von 2 U/ml zu erreichen.
  2. MACS-Puffer (Magnetic Activated Cell Sorting (MACS): Lösen Sie Rinderserumalbumin (BSA) und Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) auf, um Konzentrationen von 0,5 % bzw. 2 mM in 1x PBS zu erreichen.

2. Modell des fokalen ischämischen Schlaganfalls

HINWEIS: C57BL/6 J-Mäuse (8-10 Wochen alt) wurden verwendet, um ein fokales ischämisches Schlaganfallmodell zu etablieren, wie zuvor beschrieben14. Mäuse können alternativ mit einer Lösung von 1,25% Avertin in einer Dosierung von 0,2 ml pro 10 g Körpergewicht anästhesiert werden.

  1. Betäuben Sie die Mäuse mit 3 % Isofluran und halten Sie eine Dosierung von 1,5 % mit einem Gasanästhesiegerät aufrecht. Halten Sie die Körpertemperatur während des gesamten Eingriffs mit einem Heizkissen auf 37 °C.
    HINWEIS: Diese Studie unterstreicht, wie wichtig es ist, das Erreichen der chirurgischen Ebene vor Beginn des Eingriffs zu überprüfen. Dieser Schritt ist entscheidend, um einen optimalen Zugang zum Zielbereich zu gewährleisten und mögliche Komplikationen während der Operation zu minimieren.
  2. Schneide das Fell im Bereich zwischen dem rechten Auge und dem rechten Ohr mit einem Elektrorasierer ab. Erstellen Sie unter einem Präpariermikroskop einen vertikalen Schnitt in dem dafür vorgesehenen Bereich neben den Augen.
  3. Trennen Sie vorsichtig alle Gewebe, um den Schädel freizulegen und den distalen Ast der rechten mittleren Hirnarterie (MCA) zu identifizieren, der durch eine vertikale "Y"-förmige Gefäßstruktur gekennzeichnet ist. Verwenden Sie eine elektrische Bohrmaschine, um in den Schädel einzudringen, und achten Sie darauf, ihn vorsichtig zu entfernen.
  4. Schneiden Sie die Hirnhäute vorsichtig mit einer Mikrozange heraus.
  5. Legen Sie den distalen Ast der rechten mittleren Hirnarterie (MCA) frei und führen Sie dann eine dauerhafte Ligatur des distalen Astes der rechten MCA mit einer 10-0-Naht durch.
  6. Bringen Sie das Gewebe wieder in seinen ursprünglichen Zustand und verschließen Sie den Schnitt in der Gesichtshaut mit Gewebekleber.
  7. Positioniere die Maus in Rückenlage und trimme das Fell im Nackenbereich mit einem Elektrorasierer.
  8. Legen Sie einen horizontalen Schnitt im Halsbereich an und ziehen Sie die Unterkieferdrüsen vorsichtig auseinander.
  9. Präparieren Sie die Halsschlagaderscheide vorsichtig mit einer Mikrozange, identifizieren Sie die Arteria carotis communis und trennen Sie sie vom Vagusnerv.
  10. Fädeln Sie eine Naht 4-0 durch die Halsschlagader und befestigen Sie sie mit einem Schlupfknoten.
  11. Wiederholen Sie Schritt 10 an der kontralateralen Arteria carotis. Vorübergehender Verschluss der bilateralen Arteria carotis communis (CCAs) für 7 Minuten.
  12. Bringen Sie das Unterkieferdrüsengewebe wieder in seine ursprüngliche Position und verschließen Sie den Halsschnitt mit Gewebekleber.
    HINWEIS: Die Scheinoperationsgruppe wurde Eingriffen unterzogen, die mit denen der Schlaganfallgruppe identisch waren, mit der einzigen Ausnahme, dass die distale MCA und CCA unligiert blieben.
  13. Überwachen Sie die Maus während und nach dem chirurgischen Eingriff, einschließlich ihrer Atmung und Körpertemperatur. Halten Sie die Maus auf ein Wärmekissen, bis sie vollständig wach ist.

3. Perfusion und Dissektion des Gehirns

  1. Bereiten Sie eine 50-ml-Spritze vor und befestigen Sie eine 26-g-Nadel an ihrem Ende. Füllen Sie die Spritze mit Kochsalzlösung.
  2. Verabreichen Sie eine doppelte Dosis von 1,25% Avertin, um eine tiefe Anästhesie bei der Maus zu erreichen.
    HINWEIS: Es sollte gründlich bestätigt werden, dass die Maus vollständig anästhesiert ist, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.
  3. Positionieren Sie die Maus in Rückenlage auf einer Schaumstoffplatte, strecken Sie die Vorder- und Hintergliedmaßen aus und befestigen Sie sie mit 26-G-Nadeln.
  4. Sobald die Maus gründlich betäubt ist, fassen Sie die Bauchhaut mit einer Augenzange und machen Sie einen seitlichen Schnitt, um die Leber freizulegen. Schneide an beiden Seiten der Rippen entlang, um das Herz freizulegen.
  5. Führen Sie die 26-G-Nadel in die linke Herzkammer ein, durchtrennen Sie die Ohrmuschel und drücken Sie dann die Spritze nieder, damit das Blut abfließen kann.
  6. Setzen Sie den Perfusionsprozess fort, bis das aus der Ohrmuschel abfließende Blut klar erscheint.
  7. Enthaupten Sie die Maus direkt über dem Rückenmark mit einer geraden chirurgischen Schere.
  8. Erstellen Sie einen hinteren und vorderen Schnitt in der Haut des Kopfes, um den Schädel freizulegen. Machen Sie zwei seitliche Schnitte an der Verbindungsstelle der Seitenwände und der Schädelbasis.
  9. Schneiden Sie den Schädel entlang der sagittalen Naht durch und machen Sie einen Schnitt zwischen den Augenhöhlen.
  10. Verwenden Sie eine Pinzette, um den Schädel zu entfernen, der jede Hemisphäre bedeckt, wodurch das Gehirn freigelegt wird, und übertragen Sie ihn in eine Gehirnmatrix aus Mausstahl. Anschließend wird das Gehirn in aufeinanderfolgende 2 mm dicke koronale Schnitte geschnitten.

4. Verdauung von kortikalem Gewebe in Einzelzellsuspension und Antikörperfärbung für die Durchflusszytometrie

  1. Geben Sie 500 μl der Verdauungsenzymmischung in jede Vertiefung einer 12-Well-Platte.
  2. Das Infarktgewebe vorsichtig abtrennen und mit einer Mikrozange in das Verdauungsenzymgemisch überführen (Abbildung 1).
  3. Das Gewebe mit einer Augenschere minutiös in kleinstmögliche Stücke fragmentieren und bei 37 °C für 20 min inkubieren.
  4. Mit einer P1000-Pipette die Lösung 10 Mal vorsichtig aspirieren und dosieren, um das Gewebe in einzelne Zellen zu dissoziieren, und dann die Lösung durch ein 70-μm-Zellsieb leiten. Spülen Sie sowohl die 12-Well-Platte als auch das Zellsieb kontinuierlich mit eiskaltem HBSS, das Calcium und Magnesium enthält.
  5. Bei 500 × g bei 4 ΰC 5 min zentrifugieren, dann den Überstand vorsichtig entsorgen.
    HINWEIS: Da die erzeugten Pellets ziemlich locker sind und sich leicht lösen lassen, sollten Sie sie nicht stören, um einen Zellverlust zu vermeiden.
  6. Resuspendieren Sie das Pellet in 1 mL 1x PBS und wiederholen Sie Schritt 5. Anschließend wird das Pellet in 150 μl 1x PBS resuspendiert und die Suspension in eine 96-Well-Platte mit rundem Boden überführt. Anschließend erneut bei 500 × g bei 4 °C für 5 min zentrifugieren.
  7. Fassen Sie die 96-Well-Platte fest an und drehen Sie sie schnell um, um den Überstand zu entsorgen.
  8. Verdünnen Sie den Fluoreszenzfarbstoff für die Zellviabilität in einem Verhältnis von 1:100 in 1x PBS und resuspendieren Sie das Pellet dann in einem 150 μL Aliquot. 10 min bei Raumtemperatur (RT) inkubieren, lichtgeschützt inkubieren.
  9. Bei 500 × g bei 4 ΰC 5 min zentrifugieren und den Überstand verwerfen. Verdünnen Sie den Antikörpercocktail auf der Zelloberfläche in MACS-Puffer. Ohne die Zellen zu waschen, den Zelloberflächen-Antikörper-Cocktail zugeben und weitere 15-20 Minuten bei 4 °C inkubieren.
  10. Bei 500 × g bei 4 ΰC 5 min zentrifugieren und den Überstand verwerfen. Resuspendieren Sie das Pellet in 150 μl MACS-Puffer.
  11. Schritt 4.10 wiederholen und die Suspension in 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen oder 5-ml-Reagenzgläser aus Polystyrol mit rundem Boden überführen.

5. Durchflusszytometrische Analyse und Sortierung

  1. Entwerfen Sie ein mehrfarbiges Durchflusszytometrie-Panel gemäß der Gerätekonfiguration, wobei Sie entweder manuelle Techniken oder ein Online-Designtool verwenden, um die Auswahl von Fluorophoren, die an Antikörper konjugiert sind, zu optimieren und spektrale Überlappungen zu minimieren.
    HINWEIS: Bei der Gestaltung eines mehrfarbigen Durchflusszytometrie-Panels müssen mehrere entscheidende Überlegungen berücksichtigt werden. Zunächst ist es wichtig, sich vor Beginn mit der Konfiguration des verwendeten Instruments, einschließlich der Laser und Filter, vertraut zu machen. Zweitens, verwenden Sie helle Fluorophormarkierungen auf Antikörpern für Antigene mit geringer Abundanz, während Sie sich für schwache Fluorophormarkierungen auf Antikörpern entscheiden, die auf stark exprimierte Antigene abzielen. Schließlich ist es zwingend erforderlich, einen Zellviabilitätsfarbstoff in das Panel aufzunehmen, um nicht lebensfähige Zellen und Ablagerungen effektiv aus den Daten auszuschließen. Um ein angemessenes Gating von Antigenen mit geringer Abundanz oder schlecht charakterisierter Antigene zu gewährleisten, sollten insbesondere Fluoreszenz-Minus-Eins-Kontrollen (FMO) verwendet werden15. Die FMO-Kontrollen umfassen alle Abstammungsmarker mit Ausnahme des interessierenden Markers, was eine präzise Abgrenzung zwischen positiv und negativ gefärbten Zellenermöglicht 16.
  2. Passen Sie die Einstellungen der Forward-Scatter- (FSC) und Side-Scatter-Detektoren (SSC) an, um sicherzustellen, dass die interessierenden Zellen angemessen auf der Skala angezeigt werden und bei Bedarf mit einem Gated versehen werden können.
  3. Passen Sie FSC und SSC akribisch an, um Schmutz oder Fremdgeräusche zu eliminieren. Unterscheiden Sie Dubletten von einzelnen Zellen in einem Punktdiagramm, das sowohl die Fläche als auch die Höhe der FSC veranschaulicht. Isolieren Sie lebensfähige Zellen basierend auf dem negativen Signal für die Zellviabilität, Fluoreszenzfarbstoff.
    HINWEIS: Die Einstellungen für verschiedene Instrumente können geringfügige Abweichungen aufweisen. Zum Beispiel verwenden einige Zellsortierer die Breite und Höhe von FSC, um Dubletten von einzelnen Zellen zu unterscheiden, während andere die Fläche und Höhe von FSC für den gleichen Zweck verwenden.
  4. Passen Sie die Kompensation für jeden Kanal an.
    HINWEIS: Sowohl zelluläre Proben als auch im Handel erhältliche Kompensationsbeads können zum Zwecke der Fluoreszenz-Spillover-Kompensation verwendet werden.
    1. Vergleichen Sie die Autofluoreszenzkontrolle (ungefärbte Zellen) mit den Positivkontrollen gefärbter Zellen, um sicherzustellen, dass die gefärbten Zellen für jeden Parameter angemessen skaliert werden. Darüber hinaus können Sie die Kompensation feinabstimmen, indem Sie mehrfarbige Zellproben analysieren, 2-farbige Punktdiagramme überwachen und die Kompensationseinstellungen nach oben oder unten anpassen, um sicherzustellen, dass die Zellpopulationen entweder vertikal oder horizontal zueinander ausgerichtet sind.
    2. Verwenden Sie CD45- und CD11b-Signale, um zwischen Lymphozyten (CD11b-CD45hoch), Mikroglia (CD11b+CD45int), myeloischen Zellen (CD11b+CD45hoch) und Astrozyten (CD11b-CD45-GLAST+)17,18 zu unterscheiden.
    3. Verwenden Sie Scheinhirngewebe als Autofluoreszenzkontrolle und als Referenz für die Unterscheidung von Lymphozyten. Wenn ein bestimmtes Ziel untersucht wird, verwenden Sie eine FMO-Kontrolle mit Hirngewebe nach einem Schlaganfall.
  5. Beginnen Sie mit der Erfassung von Kontroll- und Stichprobendaten, und stellen Sie sicher, dass sie gespeichert werden.
    HINWEIS: Angesichts der Tatsache, dass das hier beschriebene Mini-Schlaganfallmodell zu einem kleinen Infarkt führt, werden in der Regel weniger Zellen entnommen als beim Modell des Verschlusses der mittleren Hirnarterie (MCAO). Im Allgemeinen ergibt die Entnahme von 5 × 105 Zellen etwa 5 × 103 Mikroglia bzw. 1 × 105 Astrozyten.
  6. Wählen Sie die gewünschten Zellpopulationen aus und sortieren Sie sie in 5-ml-Reagenzgläser aus Polystyrol mit rundem Boden oder konische 15-ml-Zentrifugenröhrchen.
    HINWEIS: Fügen Sie 500 μl PBS hinzu und spülen Sie das Röhrchen sorgfältig aus, um die Lebensfähigkeit der Zellen sicherzustellen und die Bildung des Zellpellets zu unterstützen.

6. Analyse der Genexpression in ausgewählten Zellpopulationen

HINWEIS: Die Gesamt-RNA-Extraktion kann alternativ mit kommerziellen Kits gemäß den Richtlinien des Herstellers durchgeführt werden.

  1. Die Zellen aus Schritt 5.6 bei 500 × g bei 4 ΰC werden 3 min lang zentrifugiert, dann wird der Überstand verworfen. Resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml TRIzol-Reagenz.
    HINWEIS: Die Anzahl der sortierten Zellen ist im Vergleich zu kultivierten Zellen oder Gewebe erheblich geringer. Folglich kann eine höhere Zentrifugationsgeschwindigkeit dazu beitragen, ein kompakteres Zellpellet zu bilden. Die aus diesem Schritt gewonnenen Zellen können für nachfolgende Anwendungen verwendet werden, wie z. B. Zellkulturen oder Einzelzell-RNA-Sequenzierungspipelines.
  2. Lassen Sie die Probe 5 Minuten lang bei RT stehen, um die Dissoziation der Nukleoproteinkomplexe zu erleichtern.
  3. Geben Sie 0,2 ml Chloroform in die Probe und befestigen Sie das Röhrchen. Schütteln Sie die Röhrchen 15 s lang kräftig und inkubieren Sie sie dann 2 Minuten lang bei RT.
  4. Die Proben werden bei 10.000 g für 15 min bei 4 °C zentrifugiert. Die RNA verbleibt ausschließlich in der oberen wässrigen Phase.
  5. Übertragen Sie die obere wässrige Phase vorsichtig in ein sauberes Röhrchen, wobei Sie darauf achten müssen, die Grenzfläche nicht zu stören.
    HINWEIS: Das Volumen der wässrigen Phase sollte ca. 500 μl betragen.
  6. Die RNA aus der wässrigen Phase ausfällen, indem 0,5 ml Isopropanol zugeführt und durch mehrmaliges Umdrehen des Röhrchens vorsichtig gemischt werden. Inkubieren Sie die Proben 10 Minuten lang bei RT.
  7. Zentrifugieren Sie die Proben bei 10.000 g für 10 min bei 4 °C, um die RNA zu sammeln.
  8. Dekantieren Sie den Überstand und entfernen Sie die Restflüssigkeit gründlich durch Aspiration.
  9. Waschen Sie das RNA-Pellet einmal mit 75 % Ethanol und fügen Sie mindestens 1 ml 75 % Ethanol hinzu. Die Probe gründlich mischen und dann bei 7500 × g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren.
  10. Beseitigen Sie alle Spuren von Ethanol. Trocknen Sie das RNA-Pellet 5 Minuten lang an der Luft.
  11. Löse die RNA in 10 μl RNasefreiem Wasser auf, indem du auf und ab pipettierst.
  12. Fahren Sie mit der Durchführung der Echtzeit-PCR gemäß den Anweisungen des Herstellers fort.

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Ergebnisse

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In dieser Studie stellen wir ein verfeinertes Protokoll zur Bewertung der Funktionalität von Immunzellen nach ischämischem Schlaganfall vor, das eine durchflusszytometrische Analyse innerhalb eines Mini-Schlaganfallmodells verwendet. Der Mini-Schlaganfall wurde durch die permanente Ligatur des distalen Astes der rechten mittleren Hirnarterie (MCA) induziert, gefolgt von einem 7-minütigen Verschluss der bilateralen Arteria carotis communis (CCAs). Diese Methode führt zu einem milden Schlaganfall, der sich durch kleine, ko...

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Diskussion

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In dieser Studie stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Beurteilung der Funktion von Immunzellen nach ischämischem Schlaganfall vor, wobei wir eine durchflusszytometrische Analyse in einem Mini-Schlaganfallmodell verwenden. Zu den kritischen Schritten dieses Protokolls gehören die Etablierung eines fokalen ischämischen Schlaganfalls über die permanente Ligatur des distalen Astes der rechten mittleren Hirnarterie (MCA) sowie ein siebenminütiger Verschluss der bilateralen Arteria caro...

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden Interessen bestehen.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (Nr. 82201622) und der Natural Science Foundation of Inner Mongolia (Nr. 2020MS03017) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1,5 mL MikrozentrifugenröhrchenNEST 615601Material für das Labor
1&mal; PBSCorning21-040-CMReagenz
96-Well-Mikrotiterplatte mit klarem Rundboden, TC-behandeltCorning3799Material für das Labor
APC Anti-Maus CD19Biolegende152410Antikörper
APC/Cyanin7 Anti-Maus CD45Biolegende103116Antikörper
Avertin (1,25 %)Nanjing Aibei Biotechnologie Nr. M2920Reagenz
BD FACSAria IIBD642510Ausrüstung
Brilliant Violet 421 Anti-Maus CD4Biolegende100437Antikörper
Brilliant Violet 605 Anti-Maus / Mensch CD11bBiolegende101237Antikörper
BSASigma-AldrichNr. A1933-1GChemisch
Kollagenase IVSigma-AldrichNr. C4-28-100MGEnzym
DNase INeuengland BiolaboreM0303LEnzym
EDTASigma-AldrichEDS-100GChemisch
Falcon 5 mL Reagenzgläser aus Polystyrol mit rundem BodenCorning352052Material für das Labor
Falke  Konische 15-ml-ZentrifugenröhrchenCorning352095Material für das Labor
FlowJo V10BDSoftware
GLAST (ACSA-1) Antikörper, PEMiltenyi Biotec130-118-344Antikörper
IsofluranRWD BiowissenschaftenNr. R510-22-10Reagenz
PE/Cyanin7 Anti-Maus CD3Biolegende100220Antikörper
PE/Dazzle 594 Anti-Maus NK-1.1Biolegende156518Antikörper
TRIzol ReagenzThermo Fisher Scientific Inc.15596026Reagenz
Ultrareines DNase/RNase-freies destilliertes WasserThermo Fisher Scientific Inc.10977015Reagenz
Vetbond Tissue-Klebstoffe3M1469SBMaterial für das Labor
Zombie Aqua Reparierbares LebensfähigkeitssetBiolegende423102Amin-reaktiver Fluoreszenzfarbstoff

Referenzen

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