Methodenartikel

Erforschung der sequentiellen zellulären Ereignisse der durch Godanti Bhasma ausgelösten Phagozytose in Säugetierzellen

DOI:

10.3791/68321

⸱

11. Juli 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Shobhit Institute of Engineering & Technology

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Studie klärt die phagozytäre Prozessierung von Godanti Bhasma (GB)-Partikeln in Säugetierzellen auf und charakterisiert deren zelluläre Aufnahme, Vakuolendynamik, Versauerung und Abbau. Diese Erkenntnisse verbessern nicht nur unser Verständnis grundlegender Phagozytose-Mechanismen, sondern etablieren GB auch als vielversprechendes Modellsystem für die Entwicklung neuartiger therapeutischer Strategien.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Phagozytose ist ein lebenswichtiger zellulärer Mechanismus, durch den Zellen Fremdpartikel, Krankheitserreger oder Ablagerungen verschlingen und abbauen, und spielt eine Schlüsselrolle bei der Immunabwehr und der Aufrechterhaltung der Gewebehomöostase. Störungen in diesem Prozess sind mit verschiedenen Krankheiten verbunden. Um die komplexen Vorgänge im Zusammenhang mit dem Phagozytose-Signalweg zu erforschen, sind fortschrittliche intelligente Partikel und effektive Überwachungstechniken unerlässlich. Godanti Bhasma (GB), ein traditionelles indisches Arzneimittel, das aus bioaktiven Calciumsulfatpartikeln besteht, wird durch Phagozytose in Säugetierzellen schnell internalisiert und induziert eine signifikante zytoplasmatische Vakuolierung. Hier wurden die Schlüsselstadien der GB-induzierten Phagozytose mittels Durchflusszytometrie (FC), Lebendzellbildgebung und spezifischen Färbetechniken untersucht. Die durchflusszytometrische Analyse zeigte die Bildung von phagozytären becherartigen Strukturen, die mit der Partikelinternalisierung verbunden sind. Die Bildgebung von lebenden Zellen ermöglichte die Echtzeitbeobachtung phagozytärer Prozesse, einschließlich der Partikelaufnahme, der Vakuolenbildung, des Abbaus von verschlungenen Materialien und des vakuolären Umsatzes. Die Färbung mit Neutralrot und Acridinorange wurde verwendet, um die vakuoläre Versauerung zu beurteilen. Interessanterweise führte die Behandlung mit dem lysosomalen Inhibitor BFA1 in GB-behandelten Zellen nicht zu einer Vakuolierung, was durch das Fehlen einer neutralen Rotaufnahme belegt wird, was die Notwendigkeit eines sauren Milieus für die Vakuolisierung unterstreicht. Diese Ergebnisse unterstreichen das Potenzial der GB-induzierten Phagozytose als Modell zur Aufklärung der sequentiellen zellulären Ereignisse, die an diesem Prozess beteiligt sind, was für das Verständnis von Wirt-Pathogen-Interaktionen, den intrazellulären Transport und die Entwicklung innovativer therapeutischer Strategien für Erkrankungen im Zusammenhang mit Phagozytose von entscheidender Bedeutung ist.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Phagozytose ist ein essentieller zellulärer Prozess, der von im Gewebe ansässigen professionellen Phagozyten wie Makrophagen und dendritischen Zellen sowie von nicht-professionellen Phagozyten wie Epithelzellen und Fibroblasten durchgeführt wird, die Fremdpartikel verschlingen und abbauen. Diese Zellen internalisieren und eliminieren Fremdpartikel, Krankheitserreger oder Zelltrümmer und tragen so wesentlich zur Immunabwehr und Gewebehomöostase bei1. Dieser Prozess beginnt mit der Erkennung von Krankheitserregern, Ablagerungen oder Partikeln durch Mustererkennungsrezeptoren (PRRs), wie z. B. Toll-like-Rezeptoren (TLRs), die an pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) binden2. Diese Erkennung löst die Bildung eines phagozytischen Bechers aus, bei dem sich Plasmamembranvorsprünge um das Zielteilchen3 erstrecken. Aktinfilamente spielen in diesem Schritt eine entscheidende Rolle und treiben den Membranumbau voran, der für das Particle Engulfmenterforderlich ist 4. Sobald das Partikel in einem Phagosom eingeschlossen ist, bildet sich ein membrangebundenes Vesikel. Das Phagosom durchläuft eine Reifung, die durch die Fusion mit frühen, dann späten Endosomen gekennzeichnet ist, gefolgt von dem Einbau von Lysosomen, die hydrolytische Enzyme enthalten5. Diese Enzyme, wie Cathepsine, Lysozyme und Nukleasen, werden durch Ansäuerung innerhalb des Phagosoms aktiviert, die durch vakuoläre ATPase (V-ATPase) erreicht wird und den pH-Wert auf 4,5-5,5 senkt. Der Abbauprozess endet mit der Exozytose von Resten aus der Zelle. Funktionsstörungen in diesem dynamischen und komplexen Prozess können zu erheblichen Immunproblemen führen 6,7,8.

Um den komplexen zellulären Prozess der Phagozytose genau zu bewerten, besteht ein Bedarf an verbesserten und einfachen Methoden zur Überwachung der wichtigsten zellulären Ereignisse der Phagozytose. Traditionell umfassen Überwachungsmethoden zur Phagozytose-Quantifizierung Techniken wie das Fixieren von Phagozyten in vorgegebenen Zeitintervallen für die mikroskopische Visualisierung, das Messen der Internalisierung von farbstoffmarkierten Zielen durch Bildgebung oder Durchflusszytometrie oder das Zählen der Anzahl der Zielzellen, die nach einer bestimmten Dauer der Phagozytose verbleiben. Diese Methoden erfassen jedoch nicht die minutiösen Fluktuationen, die während des Phagozytoseprozesses auftreten9. Darüber hinaus können Methoden, die sich auf indirekte Indikatoren wie die Farbstoffaufnahme stützen, aufgrund eines möglichen passiven Farbstofftransfers die tatsächlichen phagozytischen Ereignisse möglicherweise nicht genau widerspiegeln10.

Jüngste Fortschritte in der Bildgebung lebender Zellen, der Durchflusszytometrie und Färbetechniken haben unsere Fähigkeit revolutioniert, die Phagozytose mit hoher räumlich-zeitlicher Präzision zu überwachen. Die Bildgebung von lebenden Zellen ermöglicht beispielsweise die kontinuierliche Beobachtung dynamischer Prozesse mit sequenzieller Ereignisverfolgung11. Die Durchflusszytometrie wird in der klinischen Forschung häufig zur Analyse von Säugetierzellen und zum Nachweis von Biomarkern eingesetzt12. Traditionelle FC-Methoden sind jedoch nicht in der Lage, die morphologischen und räumlichen Eigenschaften einzelner Zellen zu bewerten12. Die bildgebende Durchflusszytometrie (IFC) stellt eine robuste Alternative dar, die es ermöglicht, detaillierte Informationen aus einzelnen Zellen zu sammeln. IFC kombiniert die analytischen Möglichkeiten der Durchflusszytometrie mit hochauflösender Bildgebung und ermöglicht so die Analyse einzelner Zellen mit morphologischen und räumlichen Details. Verschiedene Partikel, darunter fluoreszierende Latexkügelchen, Zymosan-APC und synthetische Nanopartikel, werden häufig zur Untersuchung der Phagozytose verwendet und geben Einblicke in die Rezeptorbindung, die Phagosomenbildung und Immunreaktionen12.

Im Gegensatz zu herkömmlichen biochemischen Techniken, die in der Regel auf einer Endpunktanalyse beruhen, ermöglicht die Lebendzell-Bildgebung eine kontinuierliche, dynamische Überwachung zellulärer Prozesse. Diese Methode bietet eine hohe räumlich-zeitliche Auflösung und die Möglichkeit, sequentielle Ereignisse bei der Phagozytose zu beobachten. Daher ist es ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung des komplexen Prozesses der Phagozytose, das genauere und detailliertere Einblicke in zelluläre Verhaltensweisen und Mechanismen ermöglicht13.

Zusätzlich zu den Fortschritten bei bildgebenden Systemen besteht ein Bedarf an intelligenten phagozytären Partikeln, die phagozytische Ereignisse deutlich hervorheben können, insbesondere die Abbauschritte, die innerhalb des Phagosoms ablaufen. In Phagozytose-Studien werden häufig Partikel wie Latexkügelchen, Zymosan, Bakterien, apoptotische Zellen und synthetische Nanopartikel verwendet, um Mechanismen wie Rezeptorbindung, Phagosomenbildung und Immunreaktionen zu untersuchen. Diese Partikel liefern zwar wertvolle Einblicke, haben aber Einschränkungen bei der Verfolgung des gesamten Abbauprozesses oder der direkten Beurteilung der Phagosomenreifung. Zum Beispiel sind Latexkügelchen nicht biologisch abbaubar und können keinen Abbau nachweisen, während Zymosan und Bakterien oft eine komplexe Markierung erfordern und möglicherweise keine konsistenten Abbauprofile ergeben14,15.

Unsere vorherige Studie zeigte die Nützlichkeit von GB, einer traditionellen ayurvedischen Formulierung, die hauptsächlich aus Calciumsulfat besteht, als ideales Partikel für die Untersuchung der Reifung und des Abbaus von Phagosomen16. GB löst sich mit der Zeit im sauren Milieu des Phagosoms auf, was eine klare Visualisierung des Partikelabbaus ermöglicht. Darüber hinaus erleichtert die Fähigkeit von GB, eine robuste Vakuolenbildung zu induzieren, die Untersuchung verschiedener Stadien der Phagosomenreifung, von der frühen Bildung über die Versauerung bis hin zur endgültigen Auflösung. Im Gegensatz zu anderen Partikeln macht GB eine externe Markierung überflüssig und bietet ein autarkes System zur Untersuchung des gesamten Lebenszyklus von Phagosomen, was es zu einem idealen Modell für das Verständnis der Dynamik der Phagozytose und der damit verbundenen Störungen macht16.

Diese Studie stellt ein standardisiertes und reproduzierbares Protokoll vor, das entwickelt wurde, um die partikelinduzierte Phagozytose und Vakuolenbildung mit Godanti Bhasma (GB) sowohl in professionellen (RAW 264.7) als auch in nicht-professionellen (HeLa und 3T3-L1) phagozytären Zelllinien zu bewerten. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, eine robuste Plattform für die Untersuchung der zellulären Aufnahmemechanismen, der vakuolären Biogenese und der intrazellulären Partikelverarbeitung über verschiedene Zelltypen hinweg bereitzustellen. GB wurde in einer Konzentration von 10 mg/ml in DMEM suspendiert, und um die Gleichmäßigkeit zu gewährleisten, ließ man größere Partikel absetzen, während die obere Fraktion für experimentelle Zwecke aufgefangen wurde. Für Durchflusszytometrie-Assays wurden die Zellen mit einer Dichte von 2 x 105 Zellen pro Vertiefung in 12-Well-Platten ausgesät, und 300 μl der GB-Arbeitssuspension wurden in jede Vertiefung gegeben. Für bildgebende Analysen wurden 5.000 bis 10.000 Zellen pro Well in 96-Well-Platten oder auf Kammerobjektträger ausgesät. Diese Methode etabliert GB als zuverlässiges Modell für die Untersuchung der Vakuolenbildung und Partikelinternalisierung in verschiedenen zellulären Typen.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Zellkultur und Aussaat

  1. Bereiten Sie das komplette DMEM-Medium vor, das mit 10 % hitzeinaktiviertem FBS und Antibiotika (100 μg/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin) ergänzt wird. Sterilisieren Sie alle Reagenzien und Geräte vor der Verwendung.
  2. Kultivieren Sie die 3T3-L1-, HeLa- und RAW-264,7-Zellen in 25-cm-Kolben und 35-mm-Kulturschalen mit DMEM. Halten Sie die Kulturen bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2 und wechseln Sie das Medium alle 48 h.
  3. Für die Subkultivierung waschen Sie die Zellen 2x mit PBS, lösen Sie dann die adhärenten Zellen mit 500 μl Trypsin-EDTA und inkubieren Sie sie 5 Minuten lang. Fügen Sie 1 ml DMEM hinzu, um die Trypsin-EDTA-Lösung zu neutralisieren, pipettieren Sie, um eine Einzelzellsuspension herzustellen, und stellen Sie das Volumen mit frischem DMEM auf 10 ml ein. Zentrifugieren Sie 5 Minuten lang bei 300 x g und resuspendieren Sie das Pellet in 1 mL frischem Medium.
  4. Mischen Sie 10 μl Zellsuspension mit 0,4 % Trypanblau (1:1), zählen Sie lebensfähige Zellen mit einem Hämozytometer, berechnen Sie die Dichte als Zellen/ml = Durchschnittliche Anzahl x 104 x 2.
  5. Für 96-Well-Platten: Geben Sie 100 μl der Zellsuspension (mit 10.000 Zellen) in jede Vertiefung. Für Cavity Slides säen Sie 50 μl der Zellsuspension (mit 5000 Zellen) in zwei Cavitäten, wobei der mittlere Cavity leer bleibt. Geben Sie 50 μl DMEM in jede der ausgesäten Kavitäten.
  6. Inkubieren Sie die Platten und Objektträger bei 37 °C in 5 % CO2 für 24 Stunden, um die Zelladhärenz und -stabilisierung zu ermöglichen. Untersuchen Sie die Zellen unter einem inversen Mikroskop bei 20-facher Vergrößerung, um Morphologie, Konfluenz und Kontamination zu beurteilen, bevor Sie mit den Experimenten fortfahren.

2. Zubereitung der GB-Stammlösung/des GB-Cocktails für die Zellkultur

  1. Besorgen Sie sich GB und wiegen Sie 100 mg des Pulvers genau ab. Suspendieren Sie das Pulver in 10 ml DMEM, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) und 1 % Penicillin-Streptomycin.
  2. Wirbeln Sie die Suspension vor und lassen Sie sie 1 Minute stehen, damit sich größere Partikel absetzen können. Übertragen Sie dann die oberen 5 mL der Suspension in ein steriles Zentrifugenröhrchen.
  3. Bezeichnen Sie diese 5 mL vorbereitete GB-Suspension als Stammlösung für nachfolgende Zellkulturexperimente. Die Suspension gründlich vortexen, um eine gleichmäßige Verteilung der Partikel zu gewährleisten, bevor sie den Zellen zugesetzt wird.

3. Durchflusszytometrische Analyse

  1. RAW 264.7-, HeLa- oder 3T3-L1-Zellen durch Trypsinisierung ernten, mit vollständigem DMEM neutralisieren, 5 min bei 300 x g zentrifugieren, in 1 mL frischem Medium resuspendieren, 10 μl mit 0,4 % Trypanblau (1:1) mischen, lebensfähige Zellen mit einem Hämozytometer zählen, Dichte berechnen und auf 2 x 105 Zellen/ml einstellen.
  2. 2 x 105 Zellen pro Well in eine 12-Well-Platte säen und 24 h lang kultivieren. Inkubieren bei 37 °C mit 5 % CO2.
  3. Behandeln Sie die Zellen mit GB-Suspension (300 μl pro Well) für verschiedene Zeiträume: 30 Minuten, 1 h und 12 Stunden. Waschen Sie die Zellen nach der Behandlung 5x mit PBS, um überschüssige Partikel zu entfernen.
  4. Trypsinisieren Sie die Zellen wie in Schritt 1.3 und waschen Sie sie gründlich mit PBS. Laden Sie die vorbereitete Suspension in den Probenanschluss des Durchflusszytometers. Starten Sie die Software und wählen Sie die entsprechenden Erfassungseinstellungen aus. Wählen Sie für die Bildgebung den Hellfeldmodus .
  5. Starten Sie die Datenerfassung, indem Sie in der Software auf Ausführen klicken. Erfassen Sie Daten für mindestens 10.000 Ereignisse, während das System Bilder von einzelnen Zellen aufnimmt, die die Durchflusszelle passieren.
  6. Verwenden Sie Streudiagramme mit dem Flächen- und Seitenverhältnis, um einzelne intakte Zellen zu begrenzen. Dies hilft, Dubletten und Cluster auszuschließen. Zeigen Sie die entsprechenden Bilder in der Bildbibliothek an. Sammeln Sie einzelne Zellbilder aus der Software-Bildbibliothek, um die durch die Behandlung induzierten morphologischen Veränderungen zu untersuchen.
  7. Für die Partikelanalyse 2 x 105 Zellen pro Well in 12-Well-Platten säen und 24 Stunden lang kultivieren. Behandeln Sie die Zellen mit GB-Suspension (300 μl pro Well) für unterschiedliche Zeiträume: 1 h, 7 h, 14 h und 24 h.
  8. Schütteln Sie die Kulturplatte nach der Behandlung vorsichtig 1 Minute lang und sammeln Sie das Nährmedium in 1,5-ml-Röhrchen. Waschen Sie die Zellen 5x mit PBS, um alle extrazellulären Partikel zu entfernen.
  9. Fügen Sie 500 μl RIPA-Puffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,5; 150 mM NaCl; 0,1 % Triton X-100; 1 % Natriumdesoxycholat) hinzu, um die Zellen vollständig zu lysieren.
  10. Lassen Sie das Kulturmedium und die lysierten Zellproben, die Partikel enthalten, getrennt durch das Durchflusszytometer. Laden Sie die Proben in den Probenanschluss des Systems. Starten Sie die Software und wählen Sie die entsprechenden Erfassungseinstellungen aus. Wählen Sie den Hellfeldmodus für die Partikelanalyse.
  11. Starten Sie die Datenerfassung, indem Sie in der Software auf Ausführen klicken. Erfassen Sie Daten für mindestens 20.000 Ereignisse, während das System Bilder von einzelnen Partikeln aufnimmt, die die Durchflusszelle passieren.
  12. Verwenden Sie Streudiagramme für das Flächen- und Seitenverhältnis, um alle Partikel zu begrenzen. Verwenden Sie die Streudiagramm-Werkzeuge, um die Partikelanzahl zu analysieren.

4. Zeitraffer-Mikroskopie

  1. Kultivieren Sie 3T3-L1-Zellen (3,0 x 104) in einer 35-mm-Schale mit 2 mL DMEM bei 37 °C in einem 5 % CO2 -Gehalt, bis sie eine Konfluenz von 70 % erreichen.
  2. Mischen Sie gründlich 300 μl GB-Suspension in das vorgewärmte, frische 2-ml-Kulturmedium und stellen Sie dann die Kulturschale mit den Zellen und GB auf den bildgebenden Mikroskoptisch.
  3. Wählen Sie das 10-fache Ziel aus. Schalten Sie die Hellfeldbeleuchtung mit der Taste Hell ein. Klicken Sie auf die Schaltfläche Film , um den Zeitraffermodus aufzurufen. Stellen Sie die Intervallzeit auf 5 Minuten ein. Starten Sie die Aufnahme, indem Sie auf die Schaltfläche Aufnahme klicken.
  4. Nehmen Sie Bilder in 5-Minuten-Intervallen für 16 bis 24 Stunden auf, um eine kontinuierliche Bildgebung unter Standardbedingungen in einem CO2 -Inkubator zu gewährleisten.
  5. Verwenden Sie die ImageJ-Software, um die aufgenommenen Bilder zu einem Zeitraffervideo zusammenzustellen. Diese Technik ermöglicht die Unterscheidung verschiedener Stadien der Phagozytose, von der Internalisierung bis zum vollständigen Abbau der Partikel.

5. Neutralrote Färbung

  1. Nach 24 Stunden Zellwachstum in 96-Well-Platten und Cavity-Objektträgern mischen Sie das GB-Partikelsuspensionsmaterial gründlich und geben Sie 30 μl der Suspension in jede Vertiefung oder Kavität.
  2. Bei 37 °C mit 5 % CO2 24 h inkubieren, um die Vakuolenbildung zu induzieren. Verwenden Sie unbehandelte Vertiefungen oder Kavitäten als Negativkontrollen.
  3. Für die Neutralrotfärbung (NR) bereiten Sie eine 0,5 mg/ml NR-Lösung in serumfreiem DMEM vor und filtrieren Sie sie durch einen 0,2-μm-Filter.
  4. Für die Bildgebung von Vakuolen in 96-Well-Platten und Cavity-Objektträgern: Entfernen Sie das Medium, fügen Sie 60 μl NR-Farbstoff hinzu und inkubieren Sie 15 Minuten lang bei 37 °C. 3x mit PBS waschen, um überschüssigen Farbstoff zu entfernen, und dann mit der mikroskopischen Bildgebung fortfahren.
  5. Untersuchen Sie die Vakuolen unter einem Mikroskop mit dem 20-fachen Objektiv, um Größe, Morphologie und Anzahl der Vakuolen zu beurteilen.

6. Behandlung mit Bafilomycin A1 zur Vakuolenbildung und Hemmung der Übersäuerung

  1. Bereiten Sie eine Stammlösung von Bafilomycin A1 (BFA1) in einer Konzentration von 100 μg/ml (160,5 nM) her, indem Sie 100 μg BFA in 50 μl DMSO lösen und anschließend in 950 μl DMEM verdünnen. 1 μl dieses Stoffes wird in 1,6 ml DMEM verdünnt, um eine Arbeitslösung von 0,1 nM zu erhalten.
  2. Gründlich mischen und 100 μl der Arbeits-BFA-Lösung in die Vertiefungen mit Zellen in den 96-Well-Platten geben. Fügen Sie außerdem 30 μl GB-Partikelsuspension hinzu, um die Hemmung der Vakuolen- und Phagosomenbildung zu beurteilen.
  3. Um die Versauerung der Phagosomen zu hemmen, geben Sie 100 μl der Arbeits-BFA-Lösung in Vertiefungen mit vorgeformten Vakuolen (zuvor mit GB-Partikeln behandelt). Alle Vertiefungen bei 37 °C mit 5 % CO2 24 h inkubieren.
  4. Geben Sie 60 μl Neutralrot (NR)-Farbstoff in jede Vertiefung, inkubieren Sie weitere 15 Minuten und analysieren Sie die Vakuolenbildung und -versauerung.

7. Färbung von Acridinorange (AO)

  1. Die in Cavity-Objektträgern kultivierten Zellen werden mit 50 μl GB behandelt und über Nacht unter experimentellen Standardbedingungen inkubiert.
  2. Nach der Behandlung werden die Zellen 15 Minuten lang bei 37 °C mit Acridinorange-Lösung (1 mg/ml) inkubiert, um eine selektive Färbung von Vakuolen und sauren vesikulären Organellen zu ermöglichen.
  3. Waschen Sie die Zellen 3x mit steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), um ungebundenen Farbstoff zu entfernen und die Hintergrundfluoreszenz zu minimieren.
  4. Analysieren Sie die Objektträger schnell mit einem Fluoreszenzmikroskop, das mit einem 20-fachen Objektiv und einem blauen Anregungsfilterbereich von 450-492 nm ausgestattet ist, um die zelluläre Morphologie und die Acridin-Orange-Aufnahme zu beurteilen, was Einblicke in die Vakuolendynamik liefert.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Studie unterstreicht die wichtigsten zellulären Reaktionen auf GB-Partikel in Säugetierzellen. Wir verwendeten ein bildgebendes Durchflusszytometer, um die Internalisierung von GB-Partikeln in 3T3-L1-Zellen zu untersuchen (Abbildung 1). Die Zellen wurden für eine Dauer von 30 min bis 12 h Partikeln ausgesetzt. Nach 30 Minuten beobachteten wir die Partikel auf der Zelloberfläche (Abbildung 1B), und die Zellmembran begann sich an den Anheftungsstellen nach inn...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Phagozytose dient als wichtiger Mechanismus der Immunabwehr, der die Verschlingung und anschließende Eliminierung von Partikeln, Krankheitserregern und apoptotischen Zellen ermöglicht. Um die Prozesse der Phagosomenbildung und -reifung zu verstehen, sind intelligente biokompatible Partikel in Kombination mit fortschrittlichen bildgebenden Verfahren unerlässlich, um dynamische Ereignisse wie die vakuoläre Progression, die Versauerung und den Abbau von verschlungenen Materialien zu unt...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Forschung wurde durch das Science & Engineering Research Board (SERB) Core Research Grant (CRG/2022/009045), Department of Science and Technology, Government of India, unterstützt.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
25 cm2 KulturflaschenNEST, Indien707001
96- und 6-Well-PlattenTarsons India Pvt. Ltd., Kalkutta, Indien; Thermo Scientific, Indien980040; 140675
Acridin-OrangeSRL, Indien82407
Antibiotika und Trypsin-EDTA-LösungHigh Media, Indien628242; 655111
Zelllinien - HeLa, 3T3-L1 und RAW-264.7Nationales Zentrum für Zellwissenschaft (NCCS), Pune, Maharastra
Kulturschalen (35mm) SPL Lifesciences, Indien101350
Dulbecco' s modifiziertes Eagle Medium (DMEM)MP Biomedicles, Indien1033126
Fötales Rinderserum (FBS)High Media, Indien651257
DurchflusszytometerMillipore, USAAmnisAmnis bildgebende Durchflusszytometer,
Fluorzzierendes MikroskopDiGi Lab, IndienModell: DiGi 110 Infinity
Godanti BhasmaPatanjali Ayurved240002
Neutralroter FarbstoffCDH, Indien593630
Zeitraffer-MikroskopNanoEnTek Inc.  Seoul, Korea.JuLiJuLi intelligenter Fluoreszenzzellanalysator,
Zeitraffer-MikroskopLEEDZ MICRO IMA. Vereinigtes KönigreichS.No. LIM225552358A58EA PRIME Inverses Mikroskop

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Stuart, L. M., Ezekowitz, R. A. B. Phagocytosis and comparative innate immunity: learning on the fly. Nat Rev Immunol. 8 (2), 131-141 (2008).
  2. Underhill, D. M., Goodridge, H. S. Information processing during phagocytosis. Nat Rev Immunol. 12 (7), 492-502 (2012).
  3. Gordon, S. Phagocytosis: An immunobiologic process. Immunity. 44 (3), 463-475 (2016).
  4. Flannagan, R. S., Jaumouillé, V., Grinstein, S. The cell biology of phagocytosis. Annu Rev Pathol Mech Dis. 7, 61-98 (2012).
  5. Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. Phagosome maturation: Going through the acid test. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (10), 781-795 (2008).
  6. Segal, A. W. How neutrophils kill microbes. Annu Rev Immunol. 23, 197-223 (2005).
  7. Huynh, K. K., Grinstein, S. Regulation of vacuolar pH and its modulation by some microbial species. Microbiol Mol Biol Rev. 71 (3), 452-462 (2007).
  8. Méresse, S., Gorvel, J. P., Chavrier, P. The rab7 GTPase resides on a vesicular compartment connected to lysosomes. J Cell Sci. 112 (21), 3195-3204 (1999).
  9. Caponegro, M. D., Thompson, K. K., Tayyab, M., Tsirka, S. E. A Rigorous Quantitative Approach to Analyzing Phagocytosis Assays. Bio Protoc. 10 (15), e3698(2020).
  10. de Neergaard, T., Sundwall, M., Wrighton, S., Nordenfelt, P. High-Sensitivity Assessment of Phagocytosis by Persistent Association-Based Normalization. J Immunol. 206 (1), 214-224 (2021).
  11. Chu, C. C., et al. High-resolution quantification of discrete phagocytic events by live cell time-lapse high-content microscopy imaging. J Cell Sci. 133 (5), jcs237883(2020).
  12. Park, Y., et al. Imaging Flow Cytometry Protocols for Examining Phagocytosis of Microplastics and Bioparticles by Immune Cells of Aquatic Animals. Front Immunol. 11, 203(2020).
  13. Kapellos, T. S., et al. A novel real time imaging platform to quantify macrophage phagocytosis. Biochem Pharmacol. 116, 107-119 (2016).
  14. Li, Q., Jagannath, C., Rao, P. K., Singh, C. R., Lostumbo, G. Analysis of phagosomal proteomes: from latex-bead to bacterial phagosomes. Proteomics. 10 (22), 4098-4116 (2010).
  15. Blum, J. S., Wearsch, P. A., Cresswell, P. Pathways of antigen processing. Annu Rev Immunol. 31, 443-473 (2013).
  16. Das, S. K., et al. Godanti bhasma (anhydrous CaSO4) induces massive cytoplasmic vacuolation in mammalian cells: A model for phagocytosis assay. Methods. 230, 158-168 (2024).
  17. Huss, M., et al. Proton translocation by V-ATPase: molecular mechanism and target for inhibition by Bafilomycin A1. J Bioenerg Biomembr. 34, 243-250 (2002).
  18. Méndez-Alejandre, A., Raymond, B. B. A., Trost, M., Marín-Rubio, J. L. Bi-functional particles for real-time phagosome acidification and proteolysis multiplex assay in macrophages. Front Immunol. 14, 1204223(2023).
  19. Lancaster, C. E., et al. Phagosome resolution regenerates lysosomes and maintains the degradative capacity in phagocytes. J Cell Biol. 220 (9), e202005072(2021).
  20. Krendel, M., Gauthier, N. C. Building the phagocytic cup on an actin scaffold. Curr Opin Cell Biol. 77, 102112(2022).
  21. Barger, S. R., et al. Membrane-cytoskeletal crosstalk mediated by myosin-I regulates adhesion turnover during phagocytosis. Nat Commun. 10 (1), 1249(2019).
  22. Ghosh, M., et al. Quantitative determination of phagocytosis using pH-sensitive fluorescent bioparticles. J Vis Exp. (125), e56093(2017).
  23. Rashidfarrokhi, A., Richina, V., Tafesse, F. G. Visualizing the Early Stages of Phagocytosis. J Vis Exp. (120), e54646(2017).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

PhagozytosewegPartikelinternalisierungVakuolenbildungDurchflusszytometrieLive Cell ImagingNeutralrot F rbungAcridinorange F rbungPhagosomreifung

Verwandte Artikel