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RNA-Seq enthüllt den Differenzierungsweg der Th17-Zellen als Mechanismus der strahleninduzierten Hirnschädigung

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DOI:

10.3791/68322

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20. Juni 2025

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1Beijing Institute of Radiation Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Ziel dieser Studie ist es, die Aktivierung des Th17-Zelldifferenzierungswegs bei Mäusen mit strahleninduzierter Hirnschädigung zu untersuchen.

Zusammenfassung

Die Strahlentherapie ist eine weit verbreitete therapeutische Modalität für bösartige Erkrankungen des Kopfes und des Halses. Sie führt jedoch ausnahmslos zu einer strahleninduzierten Schädigung des normalen Hirngewebes, die in einer strahleninduzierten Hirnschädigung (RBI) gipfelt. Trotz umfangreicher Forschung zur strahleninduzierten Neuroinflammation ist der Zusammenhang zwischen RBI und dem Differenzierungsweg der Th17-Zellen nach wie vor unzureichend verstanden. C57BL/6-Mäuse wurden einer einmaligen Verabreichung von 30 Gy Schädelbestrahlung unterzogen, um das RBI-Modell zu entwickeln. Die kognitive Funktion wurde durch das Morris-Wasserlabyrinth (MWM), den Freifeldtest, den neuartigen Objekterkennungstest und den Rotarod-Test bewertet. Histopathologische Veränderungen im Hirngewebe wurden mittels Hämatoxylin- und Eosin (H&E)-Färbung analysiert. Die Immunfluoreszenzfärbung wurde eingesetzt, um die Aktivierung von Mikroglia (IBA-1) und Astrozyten (GFAP) zu beurteilen. RNA-Sequenzierung wurde durchgeführt, um differentiell exprimierte Gene zu identifizieren, während Simple Western und qPCR verwendet wurden, um wichtige Signalmoleküle zu untersuchen, die an der Differenzierung von Th17-Zellen beteiligt sind. RBI-Mäuse zeigten ausgeprägte kognitive Defizite, insbesondere beim räumlichen Lernen und bei der Gedächtniserhaltung. Die histologische Untersuchung zeigte eine Aktivierung von Mikroglia und Astrozyten im Kortex und Hippocampus von bestrahlten Mäusen. Die RNA-Sequenzierungsanalyse identifizierte eine signifikante Anreicherung des Th17-Zelldifferenzierungswegs im Kortex der RBI-Gruppe. Eine weitere Validierung durch Simple Western- und qPCR-Analysen bestätigte die Hochregulation von TGF-β, IL-6, RORγt, IL-17 und P-STAT3 im Kortex von RBI-Mäusen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass der Differenzierungsweg der Th17-Zellen eine zentrale Rolle bei der Pathogenese strahleninduzierter Hirnverletzungen spielt. Neuroinflammation, die durch Th17-Zellen vermittelt wird, könnte ein kritischer Mechanismus sein, der der strahleninduzierten kognitiven Dysfunktion zugrunde liegt.

Einleitung

Die Strahlentherapie ist eine wichtige Behandlung sowohl für primäre als auch für metastasierende Kopf- und Halstumoren, aber eine strahleninduzierte Hirnverletzung (RBI) kann als schwere Komplikation auftreten, die durch eine Schädigung des Zentralnervensystems gekennzeichnet ist. Die RBI-Inzidenz variiert je nach Tumorart und Behandlungsmethode, wobei die berichteten Raten zwischen 28 % und 50 % nach stereotaktischer Strahlentherapie bei Meningeomen1, 1,9 % bis 5 % bei Nasopharynxkarzinomen 2,3, 1 %-24 % bei niedriggradigen Gliomen 4,5 und 8 %-20 % bei Hirnmetastasen liegen 6,7. RBI wird in akute, früh verzögerte und spät verzögerte Typen eingeteilt, wobei kognitive Dysfunktionen, insbesondere Gedächtnisstörungen, und Lerndefizite in der spät verzögerten Form im Vordergrund stehen. Die strahleninduzierte kognitive Dysfunktion (RICD), von der 50 bis 90 % der Langzeitüberlebenden von Kopf- und Halskrebs betroffen sind, beeinträchtigt die Lebensqualität erheblich8, doch ihre Pathogenese ist nach wie vor wenig verstanden, und es fehlen wirksame präventive und therapeutische Strategien.

Neuroinflammation ist ein zentrales pathologisches Merkmal der RBI, das die Störung der Blut-Hirn-Schranke verschlimmert und die Neurogenese im Hippocampus behindert. Th17-Zellen, eine Untergruppe von CD4+ T-Zellen, die für die Produktion des proinflammatorischen Zytokins IL-179 bekannt ist, wurden mit verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen in Verbindung gebracht, darunter Multiple Sklerose und Parkinson10,11. Diese Zellen können unter bestimmten entzündlichen Bedingungen die Blut-Hirn-Schranke überwinden und zur Neuroinflammation beitragen12. Seit ihrer Entdeckung im Jahr 2005 haben Th17-Zellen Aufmerksamkeit für ihre Rolle sowohl bei der Immunantwort gegen Krankheitserreger als auch bei ihrer Beteiligung an entzündlichen Erkrankungen erregt, was sie zu einem potenziellen Ziel für die Untersuchung der Mechanismen der RBI und der damit verbundenen kognitiven Dysfunktion macht13.

In dieser Studie wurden nur männliche Mäuse verwendet. Der Ausschluss von Frauen zielte darauf ab, mögliche Störeffekte zu vermeiden, die sich aus dem Östruszyklus-assoziierten neuroinflammatorischen Fluktuationen ergeben, da der Progesteronspiegel in verschiedenen Phasen des Zyklus um das bis zu Zehnfache variieren kann14. Darüber hinaus wurde unser experimentelles Modell so konzipiert, dass es den klinischen Kontext der Strahlentherapie bei Kopf- und Halskrebs widerspiegelt, bei dem etwa 72 % der Patienten männlich15 Jahre alt sind. In Übereinstimmung damit haben die meisten veröffentlichten Studien, die die Mechanismen der strahleninduzierten Hirnverletzung (RBI) untersuchten, männliche Nagetiere verwendet, um pathologische Ausgangsmerkmale zu ermitteln16.

Während verschiedene Modelle zur Untersuchung der RBI eingesetzt wurden, stoßen traditionelle Methoden wie histopathologische Färbung und einfaches Western Blotting auf Einschränkungen in Bezug auf Sensitivität, Durchsatz und Genauigkeit17. Jüngste Fortschritte wie die RNA-Sequenzierung (RNA-Seq) und die Hochdurchsatz-Proteomik haben robustere Einblicke in die molekularen Mechanismen geliefert, die RBI18 zugrunde liegen. Diese Technologien ermöglichen ein umfassendes Verständnis von Veränderungen der Genexpression und Proteinveränderungen und liefern genauere Daten als frühere Methoden19. Insbesondere Simple Western ist eine neuartige und automatisierte Technik, die die Vorteile der Kapillarelektrophorese mit der Proteindetektion mittels Chemilumineszenz kombiniert und so eine Hochdurchsatzanalyse mit minimalem Probenvolumen und erhöhter Reproduzierbarkeit ermöglicht20. Im Vergleich zum herkömmlichen Western-Blotting macht Simple Western den Membrantransfer überflüssig und liefert quantitative Proteinexpressionsdaten, was mehrere Vorteile in Bezug auf Sensitivität und Reproduzierbarkeit bietet, insbesondere bei der Proteindetektion mit geringer Abundanz21,22.

Praktische Richtlinien für die RNA-Extraktion und -Aufbereitung sind entscheidend für den Erfolg einer qualitativ hochwertigen Sequenzierung und Quantifizierung. Für eine optimale RNA-Extraktion empfehlen wir, hochwertige RNA-Isolationskits zu verwenden und sicherzustellen, dass die Konzentration im Bereich von 100-1000 ng/μl liegt, mit einer RNA-Integritätszahl (RIN) über 7,0, um einen Abbau zu vermeiden. Bei der Durchführung von Proteinanalysen mit Simple Western ist es wichtig sicherzustellen, dass die Proteinproben ordnungsgemäß denaturiert und in einer Konzentration von ca. 1-5 μg pro Kapillare geladen werden. Verwenden Sie für die qPCR-Validierung hochwertige cDNA, die aus mindestens 1 μg RNA synthetisiert wurde, um konsistente Bedingungen für die reverse Transkription zu gewährleisten. Häufige Fallstricke bei der RNA-Vorbereitung, wie z. B. die Kontamination mit genomischer DNA oder der RNA-Abbau, sollten vermieden werden, indem RNAse-freie Geräte verwendet und die Phasentrennung umgehend durchgeführt werden, um einen RNA-Abbau zu verhindern.

Durch die Einbeziehung dieser Methoden soll in dieser Studie untersucht werden, ob der Th17-Zelldifferenzierungsweg in murinen Modellen der RBI aktiviert ist und wie er zur Pathogenese der strahleninduzierten kognitiven Dysfunktion beiträgt.

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Protokoll

Die hier durchgeführten experimentellen Verfahren orientieren sich strikt an den ANARRIVE-Richtlinien (Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments). Die Zulassung erfolgte durch das Institutional Animal Care and Use Committee des Beijing Institute of Radiation Medicine (Zulassungs-Nr. AF/SC-08/02; Datum: 25. Februar 2024).

1. Schädelbestrahlung von Mäusen

  1. In der Studie wurden insgesamt 10 männliche C57BL/6-Mäuse im Alter von 6-8 Wochen verwendet, wobei fünf Tiere der RBI-Gruppe und fünf der Kontrollgruppe zugeteilt wurden, wobei die Kontrollgruppe aus blinden Kontrollmäusen besteht, die keine RBI erhielten. Halten Sie die Mäuse unter kontrollierten Umgebungsbedingungen, einschließlich regulierter Temperatur, Luftfeuchtigkeit und einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus. Akklimatisieren Sie die Mäuse 1 Woche lang, bevor Sie mit dem Experiment beginnen.
  2. Betäuben Sie die Tiere mit einer intraperitonealen Injektion von 1 % Pentobarbital-Natrium bei 50 mg/kg Körpergewicht. Bestätigen Sie die richtige Anästhesie, indem Sie überprüfen, ob es keine reflexartige Reaktion auf ein festes Kneifen der Pfote gibt. Tragen Sie unmittelbar nach Beginn der Anästhesie eine veterinärmedizinische Augensalbe auf beide Augen auf, um ein Austrocknen der Hornhaut zu verhindern.
  3. Positionieren Sie die Tiere in Bauchlage mit einer speziellen Rückhaltevorrichtung aus Holz und decken Sie die nicht zielgerichteten Bereiche des Körpers mit einer 3 mm dicken Abschirmplatte aus Blei (Pb) (99,9 % Reinheit) ab, um eine lokale Bestrahlung zu gewährleisten.
  4. Kollimieren Sie das 2 x 2 cm2 große Bestrahlungsfeld mit inhärenter Filterung (1,5 mm Al + 0,25 mm Cu). Richten Sie das Feld mit integriertem Laserfadenkreuz (λ = 635 nm ± 0,5 mm Genauigkeit) auf die kraniale Mittellinie aus und verifizieren Sie die Positionierung in Echtzeit mit einem integrierten CMOS-Kamerasystem und IR-Hintergrundbeleuchtung. Bestrahlen Sie die Schädelregion mit einer einzigen Röntgendosis von 30 Gy bei 1,325 Gy/min unter Verwendung eines X-RAD 320-Systems unter folgenden Parametern: 320 kVp/12,5 mA, SSD = 50 cm.
  5. Führen Sie eine wöchentliche Dosiskalibrierung mit einer rückführbaren Ionisationskammer durch, die im Isozentrum positioniert ist. Halten Sie die Strahlparameter bei 320 kVp/12,5 mA mit 3,2 mm Cu HVL-Filterung, um eine Dosisleistung von 1,325 Gy/min (± 3 % Abweichung) zu erreichen. Überprüfen Sie die Gleichmäßigkeit des Strahls täglich (> 95 % im Feld) mit Gafchromic EBT3-Folie.
  6. Verabreichen Sie Meloxicam (1-2 mg/kg, subkutan) einmal täglich für 3 Tage, um postoperative Schmerzen zu behandeln. Setzen Sie die Tiere in eine vorgewärmte Aufwachkammer und überwachen Sie sie kontinuierlich, bis sie wieder bei vollem Bewusstsein sind und das Brustbein halten können. Lassen Sie die Tiere während der Erholungsphase nicht unbeaufsichtigt.
  7. Zeichnen Sie das Körpergewicht aller Mäuse während der gesamten Studie wöchentlich auf. Beobachten Sie die Mäuse insgesamt 4 Wochen lang, einschließlich 1 Woche Akklimatisierung und 3 Wochen nach der Bestrahlung.

2. Analyse des Tierverhaltens

  1. Führen Sie Verhaltensexperimente 3 Wochen nach der RBI durch.
  2. Morris Wasserlabyrinth
    1. Füllen Sie ein rundes Becken (Durchmesser: 120 cm, Höhe: 50 cm) mit undurchsichtigem Wasser (20-22 °C) und verwenden Sie Milchpulver, um die untergetauchte Plattform zu verdecken. Platzieren Sie eine versteckte Plattform (Durchmesser: 10 cm) 1 cm unter der Wasseroberfläche in einem festen Quadranten.
    2. Akklimatisieren Sie die Mäuse vor den Versuchen mindestens 30 Minuten lang im Testraum. Beginnen Sie die Trainingsphase, indem Sie jede Maus von einem von vier pseudozufällig ausgewählten Startpunkten (N, S, E, W) ins Wasser setzen.
    3. Lassen Sie die Maus bis zu 60 Sekunden lang schwimmen, um die versteckte Plattform zu finden. Wenn die Maus die Plattform nicht innerhalb von 60 s findet, führe sie zur Plattform und lasse sie dort 15 s lang verharren.
    4. Führen Sie vier Versuche pro Tag und Maus mit einem Intervall von 15 Minuten zwischen den Versuchen durch. Trocknen Sie jede Maus zwischen den Versuchen gründlich mit einem warmen Handtuch ab, um Unterkühlung zu vermeiden. Setzen Sie das Training an 5 aufeinanderfolgenden Tagen fort, um den Lernerwerb zu bewerten.
    5. Entfernen Sie am Tag der Sondenprobe die Plattform und lassen Sie die Maus 60 s lang frei schwimmen. Zeichnen Sie Parameter wie die im Zielquadranten verbrachte Zeit, Plattformüberquerungen und Schwimmwege auf.
    6. Verfolgen und analysieren Sie alle Versuche mit einem automatisierten Video-Tracking-System, wobei die Experimentatoren für die Gruppenzuordnung blind sind.
  3. Offener Feldtest
    1. Akklimatisieren Sie die Mäuse mindestens 30 Minuten vor dem Experiment im Testraum. Verwenden Sie ein Freifeldgerät (50 cm x 50 cm x 40 cm) aus undurchsichtigem Kunststoff. Beleuchten Sie die Arena gleichmäßig (typischerweise 25-30 Lux), um starke Schatten zu vermeiden und Stress zu minimieren.
    2. Reinigen Sie die Arena mit 70 % Ethanol, bevor Sie jedes Tier testen, um Geruchsreize zu beseitigen. Platzieren Sie die Maus vorsichtig in der Mitte des offenen Feldes, um den Test zu starten. Lassen Sie die Maus die Arena 10 Minuten lang frei erkunden.
    3. Erfassen Sie die Aktivität und Position der Fortbewegung mit einem automatisierten Tracking-System. Definieren Sie die mittlere Zone als die inneren 20 % bis 25 % der Gesamtfläche. Messen Sie die in der zentralen Zone verbrachte Zeit und die insgesamt zurückgelegte Strecke.
    4. Bringen Sie die Maus nach der Sitzung wieder in ihren Käfig und reinigen Sie das Gerät gründlich.
  4. Neuartiger Objekterkennungstest
    1. Akklimatisieren Sie die Mäuse mindestens 30 Minuten vor dem Experiment im Testraum. Verwenden Sie eine Freifeldarena (50 cm x 50 cm x 40 cm) mit gleichmäßiger Beleuchtung (20-30 Lux). Reinigen Sie die Arena gründlich mit 70% Ethanol zwischen den Tieren, um Geruchsreize zu beseitigen.
    2. Lege jede Maus in die leere Arena und lass sie 10 Minuten lang frei erkunden. Platzieren Sie in dieser Phase keine Gegenstände.
    3. Platzieren Sie nach 24 Uhr zwei identische Gegenstände (A und A′) in gegenüberliegenden Ecken der Arena (mindestens 8 cm von den Wänden entfernt). Platzieren Sie die Maus vorsichtig in der Mitte der Arena und lassen Sie sie 10 Minuten lang erkunden.
    4. Zeichnen Sie Objektinteraktionen mit einem automatisierten Videosystem auf. Definieren Sie die Objekterkundung so, dass sich die Schnauze der Maus innerhalb von 2 cm um das Objekt befindet, während sie auf das Objekt ausgerichtet ist.
    5. Setze die Maus nach der Prüfung wieder in ihren Heimatkäfig zurück und reinige die Arena und die Objekte.
    6. Platzieren Sie nach einem Retentionsintervall von 1 Stunde ein bekanntes Objekt (A) und ein neues Objekt (B) an denselben Positionen. Bring die Maus zurück in die Arena und lasse sie 5 Minuten lang erkunden.
    7. Erfassen Sie die Zeit, die Sie für die Erkundung jedes Objekts aufgewendet haben, anhand der gleichen Kriterien wie zuvor. Berechnen Sie den Anerkennungsindex wie folgt:
      Erkennungsindex (%) = [Zeit auf einem neuartigen Objekt / (Zeit auf einem neuartigen + vertrauten Objekt)] x 100
  5. Rotarod-Test
    1. Akklimatisieren Sie die Mäuse vor dem Test mindestens 30 Minuten lang im Testraum. Verwenden Sie ein motorisiertes Rotarod-Gerät mit einem Stabdurchmesser von ~3 cm und einer Höhe von ~30 cm über der Basis.
    2. Stellen Sie den Rotationsmodus auf Beschleunigungsgeschwindigkeit ein (von 4 U/min auf 40 U/min über 5 min). Reinigen Sie die Oberfläche des Stabs mit 70 % Ethanol, bevor Sie jede Maus platzieren.
    3. Platzieren Sie die Maus vorsichtig in der Mitte des rotierenden Stabs mit dem Blick nach vorne. Starten Sie die Drehung und beginnen Sie sofort mit der Zeitmessung.
    4. Zeichnen Sie die Latenz auf, die vom System automatisch abfällt. Fangen Sie die Maus sicher auf, wenn sie fällt, um Verletzungen zu vermeiden. Planen Sie zwischen den Versuchen eine Ruhephase von mindestens 15 Minuten ein, um Ermüdung zu vermeiden.
    5. Führen Sie 3 aufeinanderfolgende Versuche pro Maus und Tag durch und mitteln Sie die Latenz als Endergebnis. Stellen Sie sicher, dass alle Tests von verblindeten Experimentatoren unter gleichbleibenden Bedingungen durchgeführt werden. Bringen Sie die Maus nach dem Test wieder in ihren Heimatkäfig zurück und desinfizieren Sie das Gerät gründlich.

3. Euthanasie von Tieren und Probenvorbereitung

  1. Sammeln Sie Gewebeproben 5 Wochen nach der RBI.
  2. Bereiten Sie Natrium-Pentobarbital (100 mg/kg) und eine sterile Spritze vor. Injizieren Sie Natrium-Pentobarbital intraperitoneal. Warten Sie, bis die Maus aufhört zu atmen und der Herzschlag aufhört, um den Tod zu bestätigen.
  3. Enthaupten Sie schnell am okzipitalen Übergang und schneiden Sie die Schädelnähte mit einer feinen Schere sagittal, dann heben Sie die beidseitigen Schädellappen vorsichtig mit einer gebogenen Pinzette an, während Sie die meningeale Integrität bewahren, bevor Sie die neuronalen Verbindungen durchtrennen.
  4. Das intakte Gehirn wird innerhalb von 60 s in eine vorgekühlte Matrix für die mittelsagittale Bisektion mit sterilen Rasierklingen überführt. Erfassen Sie sofort die anteroposterioren Abmessungen (8,2 ± 0,3 mm), die mediolaterale Breite (4,5 ± 0,2 mm) und die Gewebemasse (112 ± 8 mg) mit Präzisionsinstrumenten.
  5. Präparieren Sie das kortikale und das Hippocampusgewebe auf Eis. Schockfrosten der linken Hemisphäre in flüssigem Stickstoff für RNA-Sequenzierung, qPCR und Simple Western.
  6. Fixieren Sie die rechte Hemisphäre mit 4 % Paraformaldehyd (PFA) für die Histologie. Dehydrieren Sie das fixierte Gehirn in abgestuftem Ethanol von 70 % auf 100 %, wobei jeder Schritt 30 Minuten dauert.
  7. Reinigen Sie das Gehirn 2 Stunden lang mit Xylol. Infiltrieren Sie das Gewebe 4 h lang mit geschmolzenem Paraffin bei 60°C. Betten Sie die gereinigten Gehirne in Paraffinblöcke ein und lassen Sie sie bei Raumtemperatur erstarren. Koronale Schnitte mit einer Dicke von 5 μm mit einem Mikrotom schneiden.

4. Hämatoxylin- und Eosin-Färbung

  1. Entparaffinieren Sie Gewebeschnitte, indem Sie die Objektträger 3x lang 5 min lang in Xylol tauchen. Rehydrieren Sie die Abschnitte durch eine abgestufte Ethanolserie: 100 %, 95 %, 70 % und destilliertes Wasser für jeweils 5 Minuten.
  2. Die Schnitte je nach gewünschter Färbeintensität 5 min lang mit Hämatoxylin färben. Spülen Sie die Abschnitte 5 Minuten lang mit fließendem Leitungswasser ab, um überschüssiges Hämatoxylin zu entfernen.
  3. Differenzieren Sie die Abschnitte in 1% Salzsäure in Ethanol für einige Sekunden, um den gewünschten Kontrast zu erzielen. Nochmals 5 min unter fließendem Leitungswasser spülen. Die Abschnitte 1 Min. mit Eosin einfärben.
  4. Spülen Sie die Abschnitte kurz in destilliertem Wasser ab. Dehydrieren Sie die Abschnitte durch eine abgestufte Ethanolserie: 70 %, 95 % und 100 % für jeweils 5 Minuten.
  5. Reinigen Sie die Abschnitte 3x lang 5 Minuten lang mit Xylol. Montieren Sie die Abschnitte mit einem Deckglas mit einem Montagemedium. Nehmen Sie Bilder mit einem Nikon Eclipse Ni-U-Mikroskop mit einem 20-fach-Objektiv auf.

5. Immunfluoreszenz

  1. Fixieren Sie das Gewebe, indem Sie die Objektträger 15 Minuten lang bei Raumtemperatur in 4% PFA tauchen. Waschen Sie die Objektträger 3x lang in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), um überschüssiges PFA zu entfernen.
  2. Permeabilisieren Sie das Gewebe, indem Sie Objektträger mit 0,3 % Triton X-100 in PBS für 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Blockieren Sie die unspezifische Bindung, indem Sie die Objektträger 1 h lang bei Raumtemperatur mit 5 % normalem Serum inkubieren.
  3. Inkubieren Sie mit den Primärantikörpern IBA-1 und GFAP, verdünnt in einem Blockierungspuffer bei einer Verdünnung von 1:2000, über Nacht bei 4 °C, abhängig von den Antikörperspezifikationen. Waschen Sie die Objektträger 3x lang in PBS, um ungebundene Primärantikörper zu entfernen.
  4. Inkubieren Sie mit einem Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-Sekundärantikörper, der an Alexa Fluor 488 konjugiert ist, verdünnt bei 1:1000 für 1 h bei Raumtemperatur im Dunkeln. Waschen Sie die Objektträger 3x lang 5 Minuten lang in PBS, um überschüssige Sekundärantikörper zu entfernen.
  5. Montieren Sie die Objektträger mit einem Antifading-Einbettmedium, das DAPI enthält. Versiegeln Sie das Deckglas mit klarem Nagellack.
  6. Erfassen Sie Fluoreszenzbilder mit einem konfokalen Mikroskopsystem mit einem 20-fach-Objektiv.
  7. Quantifizieren Sie die Fluoreszenzintensität mit ImageJ. Führen Sie quantitative Analysen mit dem Analyze Particles-Tool von ImageJ mit Größenschwellenwerten von 50-200 μm2 (Mikroglia) und 100-500 μm2 (Astrozyten) durch. Subtrahieren Sie den Hintergrund mit dem Rolling-Ball-Algorithmus (Radius = 50 Pixel).

6. qPCR-Analyse

  1. Extrahieren Sie Gesamt-RNA aus Gewebe mit einem RNA-Extraktionskit. Befolgen Sie das Protokoll des Herstellers für Homogenisierung, Lyse und RNA-Aufreinigung.
  2. Quantifizieren Sie die extrahierte RNA mit einem Spektralphotometer, um die Konzentration zu messen und die Reinheit zu beurteilen (A260/A280-Verhältnis). Stellen Sie sicher, dass die RNA-Konzentration für die cDNA-Synthese geeignet ist (100-500 ng/μl).
  3. Beurteilen Sie die Qualität der RNA mit einem Bioanalysator. Stellen Sie sicher, dass die RNA keinen Abbau aufweist (scharfe Banden für 18S und 28S rRNA) und eine RNA-Integritätszahl (RIN) über 7 aufweist.
  4. Bereiten Sie ein 20-μl-Reaktionsgemisch mit 1 μg RNA, reversem Transkriptionspuffer, Oligo-dT, dNTPs, RNase-Inhibitor und reverser Transkriptase vor.
  5. Inkubieren Sie 60 Minuten lang bei 42 °C, um cDNA zu synthetisieren. 5 min auf 85 °C erhitzen, um die reverse Transkriptase zu inaktivieren.
  6. Kombinieren Sie cDNA, Mastermix, Forward-Primer, Reverse-Primer (Tabelle 1) und nukleasefreies Wasser in einer 96-Well-PCR-Platte. Verwenden Sie 2 μl cDNA pro 20 μl Reaktion und stellen Sie eine endgültige Primerkonzentration von 200 nM sicher. Versiegeln Sie die Platte mit einer optischen Klebefolie, um eine Verdunstung zu verhindern.
GenPrimer-Sequenz (5'-3', vorwärts/rückwärts)
TGF-β1CCACCTGCAAGACCATCGAC
CTGGCGAGCCTTAGTTTGGAC
TGF-β3GGACTTCGGCCACATCAAGAA
TAGGGGACGTGGGTCATCAC
IL-6CTGCAAGAGACTTCCATCCAG
AGTGGTATAGACAGGTCTGTTGG
RORγtTCCACTACGGGGTTATCACCT
AGTAGGCCACATTACACTGCT
IL-17ATCAGCGTGTCCAAACACTGAG
CGCCAAGGGAGTTAAAGACTT
IL-17FTGCTACTGTTGATGTTGGGAC
CAGAAATGCCCTGGTTTTGGT
GAPDHAGGTCGGTGTGAACGGATTTG
GGGGTCGTTGATGGCAACA

Tabelle 1: qPCR-Sequenz-Primer.

  1. Platzieren Sie die Reaktionsplatte in einem real-time PCR-Gerät und programmieren Sie den Thermocycler. Es sind folgende Zyklusbedingungen zu verwenden: anfängliche Denaturierung bei 95 °C für 3 min, gefolgt von 40 Zyklen bei 95 °C für 15 s und 60 °C für 30 s.
  2. Normalisieren Sie die Expression der Zielgene zu GAPDH. Berechnen Sie die relativen Expressionsniveaus mit der ΔΔCt-Methode und stellen Sie die Daten als Faltungsänderungen im Vergleich zur Kontrollgruppe dar.

7. Analyse der RNA-Sequenzierung

  1. Betäuben und euthanasieren Sie die Maus gemäß den Protokollen der institutionellen Tierpflege. Sofort mit kaltem PBS durchbluten, um zirkulierendes Blut zu entfernen.
  2. Sezieren Sie das Gehirn auf Eis. Isolieren Sie die Großhirnrinde mit sterilen Dissektionswerkzeugen. Minimieren Sie die Dissektionszeit, um die RNA-Integrität zu erhalten.
  3. Schockfrosten Sie das kortikale Gewebe in flüssigem Stickstoff. Bei -80 °C lagern, wenn die RNA-Extraktion nicht sofort durchgeführt wird.
  4. Homogenisieren Sie den gefrorenen Kortex (30-50 mg) in 1 ml RNA-Extraktionsreagenz mit einem motorisierten Homogenisator, bis keine sichtbaren Fragmente mehr übrig sind.
  5. Führen Sie eine Chloroform-Phasentrennung durch. 200 μl Chloroform zugeben, 15 s kräftig schütteln, 2-3 min bei Raumtemperatur inkubieren, dann bei 12.000 x g für 15 min bei 4 °C zentrifugieren.
  6. Übertragen Sie die obere Schicht in ein neues Röhrchen, fügen Sie ein gleiches Volumen von 70 % Ethanol hinzu und fahren Sie mit der RNA-Aufreinigung mit einem auf Kieselsäuresäulen basierenden Kit fort.
  7. Verwenden Sie den DNase-Verdau in der Säule, um genomische DNA während der RNA-Aufreinigung zu entfernen. Sammeln Sie die Gesamt-RNA in 30-50 μl und bewahren Sie sie zur sofortigen Verwendung auf Eis auf.
  8. Verwenden Sie ein Spektralphotometer, um die RNA-Konzentration und -Reinheit zu quantifizieren. Bestätigen Sie das A260/A280-Verhältnis von ~2,0. Analysieren Sie 1 μl RNA auf einem Bioanalysator. Stellen Sie sicher, dass die RIN für die Sequenzierung größer als 8,0 ist.
  9. Verwenden Sie ein Poly(A)-Auswahlprotokoll und ein Vorbereitungskit für gestrandete Bibliotheken. Befolgen Sie das Protokoll des Herstellers, um Bibliotheken mit 300 bis 400 bp zu generieren. Reinigen Sie Bibliotheken mit einem kommerziellen Kit.
  10. Verwenden Sie einen Bioanalysator, um die Fragmentgröße zu bestätigen und mit einem Pool von Bibliotheken äquimolal zu quantifizieren. Führen Sie eine Paired-End-Sequenzierung (2x, 150 bp) mit einer Illumina-Plattform durch.
  11. Trimmen Sie Adapter mit Trim Galore, bewerten Sie die Qualität mit FastQC, richten Sie Reads mit STAR an das Mausgenom (GRCm39) ab und quantifizieren Sie die Genexpression mit featureCounts. Identifizieren Sie differentiell exprimierte Gene mit DESeq2.
  12. Verwenden Sie die Ausgabe von DESeq2 und filtern Sie nach signifikant differentiell exprimierten Genen DEGs (angepasster p-Wert < 0,05 und |log2FC| > 1). Führen Sie eine GO- und KEGG-Signalanreicherungsanalyse mit Phyper auf der Grundlage des hypergeometrischen Tests durch. Identifizieren Sie Pfade mit korrigiertem P-Wert ≤ 0,05 als statistisch signifikant.

8. Einfache westliche Analyse

  1. Homogenisieren Sie die Großhirnrinde der Maus in RIPA-Puffer mit Protease- und Phosphatase-Inhibitoren und zentrifugieren Sie sie dann 10 Minuten lang bei 4 °C bei 12.000 x g , um Ablagerungen zu entfernen. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration mit einem BCA-Assay.
  2. Denaturieren Sie die Proteinproben, indem Sie sie mit Probenpuffer mischen und 5 Minuten lang bei 95 °C inkubieren, um eine vollständige Denaturierung zu gewährleisten.
  3. Laden Sie 3 μl denaturierte Proteinproben in die Simple Western Kapillaren. Stellen Sie sicher, dass die Proben ordnungsgemäß geladen sind, um ein Überlaufen zu verhindern. Setzen Sie die Kapillaren in das einfache westliche Instrument ein.
  4. Inkubieren Sie die getrennten Proteine mit 1:50 verdünnten Primärantikörpern, einschließlich p-STAT3, STAT3, RORγt, TGF-β, IL-6 und IL-17, für 30 Minuten.
  5. Waschen Sie das Kapillarsystem mit Waschpuffer für drei Waschgänge von jeweils 5 Minuten, um ungebundene Primärantikörper zu entfernen. Den HRP-konjugierten Sekundärantikörper, verdünnt in Blockierungspuffer, zugeben und 30 Minuten inkubieren.
  6. Führen Sie 3 Waschgänge à 5 Minuten mit Waschpuffer durch, um überschüssige Sekundärantikörper zu entfernen. Führen Sie das Detektionsprogramm auf dem Simple Western-System aus, um die Proteine automatisch mithilfe der Chemilumineszenz zu erkennen.
  7. Analysieren Sie die Daten mit der Software Compass for Simple Western. Quantifizieren Sie die Proteinexpression, indem Sie die relativen Peakbereiche im Elektropherogramm vergleichen. Normalisieren Sie die Daten auf das GAPDH-Protein.

9. Statistische Auswertung

  1. Öffnen Sie GraphPad Prism 9.0.0. Software. Klicken Sie auf Datei > Daten zum Laden der Daten importieren . Präsentieren Sie die Daten als Mittelwerte ± SD. Verwenden Sie den ungepaarten t-Test für Vergleiche zwischen zwei Gruppen.
  2. Beurteilen Sie die Normalität mit dem Shapiro-Wilk-Test. Wenn die Normalverteilung verletzt wird (p < 0,05), wenden Sie den Mann-Whitney-U-Test für Vergleiche zwischen den Gruppen an. Wenn die Normalverteilung erfüllt ist (p ≥ 0,05), führen Sie einen unabhängigen Stichproben-t-Test durch, um die Gruppenunterschiede zu bewerten.
  3. Melden Sie Ergebnisse mit p-Werten. Betrachten Sie p < 0,05 als statistisch signifikant. Verwenden Sie die folgende Schreibweise: n.s. für nicht signifikant, * für p < 0,05, ** für p < 0,005, *** für p < 0,0005 und **** für p < 0,0001.

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Ergebnisse

Kognitive Beeinträchtigung bei RBI-Mäusen
Nach der Exposition gegenüber einer Ganzhirnbestrahlung von 30 Gy wurde das Körpergewicht der Mäuse wöchentlich überwacht. Die kognitive Funktion wurde in der 4. Woche bewertet (Abbildung 1A). Erste Messungen zeigten, dass die Körpergewichte der Kontroll- und der RBI-Gruppe ähnlich waren. Zwischen 1 und 3 Wochen nach der Bestrahlung zeigte die RBI-Gruppe jedoch eine signifikante Abnahme ...

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Diskussion

Kritische Schritte innerhalb des Protokolls
Dieses Protokoll beinhaltet die Induktion von RBI bei Mäusen, gefolgt von umfassenden Bewertungen der Neuroinflammation und des Th17-Zelldifferenzierungswegs (Abbildung 6). Ein kritischer Schritt ist die kraniale Bestrahlung von C57BL/6-Mäusen mit einer Dosis von 30 Gy, ein gut etabliertes Modell für RBI1. Eine genaue Dosiskalibrierung mit Hilfe von Ionisationskammern gew...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte anzugeben.

Danksagungen

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
12-230 kDa Separation Module, 8 x 25 KapillarpatronenProteinSimpleSM-W004für SimpleWestern
Anti-GAPDH AntikörperProteintechHRP-600041:500 Verdünnung/Antikörper für SimpleWestern
Anti-GFAP AntikörperAbcamab72601:2000 Verdünnung/Antikörper für Immunfluoreszenz
Anti-IBA-1 AntikörperAbcamab1788461:2000 Verdünnung/Antikörper für Immunfluoreszenz
anti-IL-17 A/F AntikörperThermoMA5-237481:10 Verdünnung/Antikörper für SimpleWestern
anti-IL-1β AntikörperCST122421:50 Verdünnung/Antikörper für SimpleWestern
anti-IL-6 AntikörperThermoMA5-238001:5 Verdünnung/Antikörper für SimpleWestern
Anti-Maus DetektionsmodulProteinSimpleDM-002Sekundärantikörper für SimpleWestern
Anti-P-STAT3 (Try705) AntikörperThermoMA5-151931:2 Verdünnung/Antikörper für SimpleWestern
Anti-Kaninchen-DetektionsmodulProteinSimpleDM-001Sekundärantikörper für SimpleWestern
Anti-ROR & gamma; t AntikörperThermo14-6988-821:5 Verdünnung/Antikörper für SimpleWestern
Anti-STAT3 AntikörperThermo7100771:20 Verdünnung/Antikörper für SimpleWestern
Anti-TGF β-1,2,3 AntikörperThermoMA5-237951:10 Verdünnung/Antikörper für SimpleWestern
BAC AssayThermoA55860Proteinassays
EZ Standard Pack 1 12-230 kDaProteinSimplePS-ST01EZ-8für SimpleWestern
Ziege Anti-Kaninchen IgG H& LAbcamab150077:1000 Verdünnung/Antikörper für Immunfluoreszenz
RNeasy KitQiagen74134RNA-Extraktion
SuperScript IV ErststrangsynthesesystemThermo Fisher Scientific18091050Reverse Transkription
SYBR Green Master MixTakara Bio RR820AQ-PCR
TRIzol ReagenzInvitrogen15596026RNA-Extraktion
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Referenzen

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