Methodenartikel

Analyse der Photorezeptordegeneration und -konservierung in einem Retinitis pigmentosa Mausmodell

618 Ansichten

⸱

DOI:

10.3791/68324

⸱

22. Juli 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Neural Development and Regeneration Laboratory, Department of Neurobiology, Science and Biotechnology Graduate Program, Institute of Biology, Fluminense Federal University, 2Neural Development and Regeneration Laboratory, Department of Neurobiology, Neuroscience Graduate Program, Institute of Biology, Fluminense Federal University, 3Instituto Estadual de Hematologia Arthur de Siqueira Cavalcanti (HEMORIO)

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt optimierte Techniken zur Analyse der Photorezeptordegeneration und -konservierung in einem Mausmodell der Retinitis pigmentosa, einschließlich intravitrealer Arzneimittelverabreichung, Kryostatenschnitt und Immunfluoreszenz. Die Methode stellt die Integrität der Netzhaut sicher und liefert quantitative Daten über die Wirksamkeit therapeutischer Eingriffe.

Zusammenfassung

Retinopathien betreffen Hunderte von Millionen Menschen weltweit und sind wichtige Ursachen für Sehbehinderungen und Blindheit. Unter diesen Krankheiten ist die Retinitis pigmentosa (RP) eine erbliche Augenerkrankung, die durch eine fortschreitende Netzhautdegeneration gekennzeichnet ist und weltweit etwa 1,5 bis 2 Millionen Menschen betrifft. Proof-of-Concept-Studien in Tiermodellen hereditärer Netzhautdystrophien bilden eine wichtige Evidenzgrundlage für Studien zu pathophysiologischen Mechanismen der Erkrankung, zur Wirksamkeit und Sicherheit der Behandlung. Die intravitreale Injektion bei Mäusen und die Kryostatensektion sind weit verbreitete Techniken zur Untersuchung von Arzneimittelwirkungen in RP-Modellen, da sie eine präzise Abgabe von Substanzen in den Glaskörper und die Vorbereitung hochwertiger histologischer Proben für die detaillierte Analyse von Netzhautveränderungen ermöglichen. Auch die Zellzählung durch Immunfluoreszenz unter Verwendung von Antikörpern gegen Recoverin, ein kalziumabhängiges Protein, das in retinalen Photorezeptoren exprimiert wird, wurde kürzlich eingesetzt, um zelluläre Veränderungen im Zusammenhang mit Netzhautdegeneration in RP-Modellen zu untersuchen, da dieser Ansatz die Bewertung des Photorezeptorverlusts und der potenziellen Zellkonservierung nach therapeutischen Eingriffen erleichtert. Die intravitreale Injektion wurde optimiert, um die Integrität der Augen und zuverlässige Ergebnisse zu gewährleisten, wobei eine feine Nadel verwendet wird, um die Lösung in die Glaskammer zu verabreichen. Nach einem vordefinierten Zeitraum zur Beurteilung der Arzneimittelwirkungen wird eine histologische Verarbeitung durchgeführt, bei der die Proben mit einem Kryostaten bei einer Dicke von 10 μm geschnitten werden, gefolgt von einer Immunfluoreszenzmarkierung mit Recoverin-Antikörpern. Schließlich wird eine Zellzählung durchgeführt, um zu beurteilen, ob die Behandlung mit Medikamenten eine schützende Wirkung ausübt, was durch die Konservierung der Photorezeptoren belegt wird. Obwohl diese Techniken in der Retinopathie-Forschung ausgiebig eingesetzt wurden, um konsistente Daten zu generieren, bestehen nach wie vor Herausforderungen bei der Erzielung einer präzisen Gewebehandhabung und Verarbeitungsqualität. Dieses Protokoll bietet einen standardisierten Ansatz zur Optimierung jedes Schritts, von der intravitrealen Injektion bis zur Vorbereitung histologischer Schnitte, um reproduzierbare und qualitativ hochwertige Ergebnisse zu gewährleisten.

Einleitung

Das Sehen ist einer der komplexesten Sinne des sensorischen Systems, der für die Erfassung visueller Reize aus der Umwelt und deren Übersetzung in elektrochemische Signale unerlässlich ist, die im Gehirn zu Bildern verarbeitet werden. Verschiedene biologische Faktoren wie Alterung, genetische Defekte und Krankheiten können das Sehvermögen beeinträchtigen und die Lebensqualität und die täglichen Aktivitäten erheblich beeinträchtigen.

Das menschliche Auge besteht aus drei Hauptkammern. Die äußere Schicht, die aus der Hornhaut und der Sklera besteht, bietet dem Augapfel strukturelle Unterstützung. Die Zwischenschicht umfasst die Iris, den Ziliarkörper und die Aderhaut, wobei letztere für die Blutversorgung der Photorezeptoren verantwortlich sind. Die innere Schicht schließlich umfasst die Netzhaut, eine Struktur, die für die Verarbeitung von Lichtreizen und die Umwandlung von Licht in elektrische Signale verantwortlich ist, die zur Bilderzeugung an das Gehirn gesendet werden 1,2.

Die neuronale Netzhaut besteht aus mehreren zellulären Schichten, darunter spezialisierte Zellen wie Photorezeptoren, Bipolarzellen, horizontale Zellen, Amakrinzellen und Ganglienzellen. Darüber hinaus enthält die Netzhaut Gliazellen wie Mikroglia, Astrozyten und Müller-Zellen sowie pigmentierte Epithelzellen. Letzteres, das sich im nicht-neuronalen Teil der Netzhaut befindet, spielt eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der strukturellen Integrität, des Schutzes und der Unterstützung der Photorezeptoren 3,4. Der neuronale Teil beherbergt sensorische und neuronale Zellen, die direkt an der Lichteinfang und -verarbeitung beteiligt sind 5,6,7.

Da die Netzhaut für das Sehvermögen unerlässlich ist, ist sie oft von Pathologien betroffen, die zur Erblindung führen können. Unter diesen Erkrankungen ist die Retinitis pigmentosa (RP) eine der wichtigsten erblichen Retinopathien, mit mehr als 80 Genen, die mit ihrer Ätiologie verbunden sind 8,9. RP ist eine heterogene Erkrankung, die überwiegend autosomal-dominant oder rezessiv vererbt wird, aber auch X-chromosomal oder aufgrund spontaner Mutationen auftreten kann10.

Mit einer weltweiten Prävalenz zwischen 1 von 3.000 und 1 von 7.000 Personen, abhängig von der Bevölkerung und der geografischen Region11,12, manifestiert sich RP in der Regel in der Adoleszenz oder im frühen Erwachsenenalter, mit ersten Symptomen wie verminderter Nachtsicht und peripherem Gesichtsfeldverlust. Mit fortschreitender Erkrankung wird das zentrale Sehvermögen beeinträchtigt, was zur vollständigen Erblindung führenkann 9,13.

Obwohl es noch keine Heilung für RP gibt, haben verschiedene Therapien in der Entwicklung das Potenzial gezeigt, das Fortschreiten der Krankheit zu verlangsamen oder umzukehren. Zu diesen Ansätzen gehören genetische, zelluläre und pharmakologische Therapien sowie elektronische Geräte. Um das Verständnis der RP zu verbessern und neue Interventionen zu evaluieren, wurden häufig Mausmodelle der Netzhautdegeneration verwendet. Diese Modelle, die oft als rd (retinale Degeneration) bezeichnet werden, sind wertvolle Werkzeuge, um die molekularen Grundlagen und Therapien für RP zu untersuchen. Unter den verschiedenen Modellen, die bei der Untersuchung von Retinitis pigmentosa verwendet werden, weist der Mausstamm Pde6βrd10/rd10 (rd10) eine Missense-Mutation im Gen auf, das für die stäbchenspezifische β Untereinheit der Phosphodiesterase14 kodiert, die eine langsame Degeneration der Photorezeptoren aufweist, ähnlich wie beim Menschen15.

Die intravitreale Verabreichung von Arzneimitteln wurde in verschiedenen Studien häufig eingesetzt 16,17,18. Dieses Protokoll eignet sich für Forscher, die die Auswirkungen von Medikamenten auf die Netzhaut untersuchen, insbesondere im Hinblick auf das Überleben von Photorezeptorzellen. Auf diese Weise besteht das Hauptziel dieses Protokolls darin, die Wirkstoffabgabe durch intravitreale Injektion in einem Mausmodell der Retinitis pigmentosa (RP) zu optimieren und das Überleben von Photorezeptoren mithilfe von Immunfluoreszenz für Recoverin, einen Photorezeptorzellmarker, zu bewerten. Die intravitreale Injektion ermöglicht die lokalisierte Verabreichung von Arzneimitteln, minimiert systemische Nebenwirkungen, erhöht die Bioverfügbarkeit der Netzhaut und reduziert Nebenwirkungen in anderen Organen. Auf der anderen Seite ermöglicht die Immunfluoreszenz für Recoverin eine spezifische Analyse des Überlebens von Photorezeptoren und stellt ein wirksames Instrument zur Bewertung der Wirksamkeit dieser therapeutischen Strategie dar. Ihre Anwendbarkeit hängt jedoch von Faktoren wie der Auswahl des Tiermodells, der Injektionsgenauigkeit und der Behandlungsdauer ab, die bei der Anpassung dieser Methode an andere experimentelle Settings berücksichtigt werden sollten.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

Das Projekt und alle darin durchgeführten Protokolle folgen den Tierhaltungsrichtlinien des Nationalen Rates für die Kontrolle von Tierversuchen und wurden von der Ethikkommission für die Verwendung von Tieren (CEUA - UFF) unter der Nummer 1464280219 genehmigt.

1. Tiere

  1. Verwenden Sie den murinen Stamm rd10, der eine Photorezeptordegeneration erfährt, und den Stamm C57 Black/6 (Hintergrund von rd10). Halten Sie diese Stämme unter einem Hell-Dunkel-Zyklus von 12 Stunden/12 Stunden mit ad libitum Zugang zu Wasser und Nahrung.

2. Anästhesie

  1. Führen Sie eine intraperitoneale Injektion mit einem Anästhetikum durch, das in einer Dosis von 80 mg/kg Ketamin und 8 mg/kg Xylazin hergestellt und in destilliertem Wasser verdünnt wurde. Ketamin wirkt als N-Methyl-D-Aspartat-Rezeptor (NMDA)-Rezeptor-Inhibitor und wirkt analgetisch, während Xylazin als anästhetisches Beruhigungsmittel wirkt.
  2. Berechnen Sie für die intraperitoneale Injektion das zu injizierende Volumen als 10 μl x Gewicht (g).
  3. Halten Sie die Maus fest, um einen freien Zugang zum Bauch zu gewährleisten. Reinigen Sie den unteren rechten Quadranten der Bauchhöhle mit 70% Alkohol, wo die Nadel mit der Fase nach oben eingeführt werden sollte.
  4. Um das Fehlen eines Schmerzreflexes zu bestätigen, kneifen Sie vorsichtig den Schwanz oder die Pfote des Tieres. Wenn es keine Reaktion gibt, bedeutet dies, dass das Tier richtig betäubt ist.

3. Intravitreale Injektion

  1. Nachdem die Tiere betäubt sind, legen Sie die Augen frei und identifizieren Sie mit einem binokularen stereoskopischen Mikroskop mit einer 10-fachen Vergrößerung den Limbusbereich, ein graues Band zwischen Hornhaut und Sklera, wo die Injektion durchgeführt wird.
  2. Um die Injektion durchzuführen, ist die Hilfe einer anderen Person erforderlich. Unter einem binokularen stereoskopischen Mikroskop muss eine Person das Tier halten und die Nadel einführen, während der Assistent den Spritzenkolben drückt, um die Substanz in das Auge einzuführen.
  3. Verwenden Sie zunächst eine ultrafeine Spritze mit einer festen Nadel (31 G x 6 mm), um eine Punktion in der Limbusregion vorzunehmen, und achten Sie darauf, die Nadel nicht zu tief einzuführen. Es genügt, nur die Hälfte der Fase einzusetzen.
  4. Führen Sie dann die vorsterilisierte Mikrospritze (Stärke 26 S ohne Fase), die 1 μl der gewünschten Flüssigkeit/des betreffenden Arzneimittels enthält, in die Punktion ein, die von der Insulinspritze vorgenommen wird.
  5. Lassen Sie den Assistenten den Spritzenkolben langsam drücken, um sicherzustellen, dass das gesamte Volumen über einen Zeitraum von ca. 30 s verabreicht wird.
  6. Wiederholen Sie den Vorgang für das andere Auge desselben Tieres und notieren Sie die Zeit.
  7. Wenn es mehr als eine Versuchsgruppe gibt, markieren Sie das Ohr des Tieres, um eine korrekte Identifizierung der einzelnen Gruppen zu gewährleisten.
  8. Verwenden Sie 1 Tropfen 0,01 M PBS-Lösung in jedem Auge des Tieres, um ein Austrocknen zu verhindern.
  9. Legen Sie die Tiere nach diesen Eingriffen auf ein Heizkissen mit einer Temperatur von 37 °C, bis sie aufwachen. Es kann 1-2 Stunden dauern. Überwachen Sie die Tiere kontinuierlich, während sie betäubt sind, und bringen Sie sie, sobald sie wach sind, bis zum Zeitpunkt der Analyse in ihre Käfige zurück.
  10. Führen Sie eine erste Schulung mit einem sichtbaren Farbstoff wie Trypanblau durch, um den Bedienern zu helfen, ihre intravitreale Injektionstechnik bei Mäusen zu verfeinern.
    HINWEIS: Der Farbstoff erleichtert die Visualisierung des Nadelwegs und ermöglicht eine präzise Einstellung der Tiefe und des Winkels der Injektion, wodurch das Risiko einer Schädigung der Augenstruktur verringert und die Sicherheit des Verfahrens erhöht wird.

4. Euthanasie und Augenvorbereitung

  1. Nach einer bestimmten Behandlungsdauer nach der Injektion werden die Tiere durch Inhalation einer Überdosis von 5 % Isofluran eingeschläfert. Setzen Sie die Exposition bis mindestens 1 Minute nach dem Atemstillstand fort. Um den Tod zu gewährleisten, halten Sie das Tier am Nacken fest und üben Sie festen Zug auf den Schwanz aus, bis eine Gebärmutterhalsluxation erreicht ist.
  2. Markieren Sie vor dem Entfernen der Augen den Schläfenpol. Tragen Sie den Marker oder die heiße Nadel/Nadel vorsichtig auf den Schläfenbereich der Sklera auf und stellen Sie sicher, dass die Markierung sichtbar und präzise ist. Dieser Schritt dient als Referenzpunkt für die Orientierung während des Schnittvorgangs.
  3. Als nächstes legen Sie die Augen frei und schneiden mit einem sterilen Skalpell und einer Iridektomieschere das umgebende Gewebe, um Binde- und Muskelgewebe zu trennen und den Augapfel freizulegen. Bei Mäusen sollten Sie die Augenmuskeln vorsichtig präparieren, da dies eine Herausforderung sein kann. Um den Eingriff zu erleichtern, machen Sie mit einem sterilen Skalpell einen seitlichen Schnitt an beiden Ecken der Augenhaut.
  4. Entfernen Sie mit einer gekrümmten Pinzette mit mittlerer Spitze vorsichtig die Augenhöhle, indem Sie sie am Sehnerv festhalten, und fixieren Sie das Gewebe sofort 5 Minuten lang in einer 4%igen Paraformaldehyd (PFA)-Lösung bei Raumtemperatur (RT).
  5. Nach der Fixierung in PFA-Lösung werden die Augen mit einer gekrümmten Pinzette mit mittlerer Spitze auf eine Glasplatte übertragen. Diese Platte fungiert als Dissektionsplattform und stellt sicher, dass sie einen Phosphatpuffer in einer Konzentration von 0,1 M pH 7,4 enthält.
  6. Legen Sie dann die Platte unter ein binokulares stereoskopisches Mikroskop mit einer 10-fachen Vergrößerung und machen Sie mit einem Skalpell einen kleinen Schnitt knapp über dem Limbus (Hornhautrand). Anschließend führen Sie mit einer Mikroiridektomieschere einen umlaufenden Schnitt nach dem Limbus durch, um die Hornhaut zu trennen.
  7. Entfernen Sie die Hornhaut, zusammen mit der Iris und der Linse, mit einer Dumont #5 Pinzette. Zum Schluss fixieren Sie die Augen wieder für 55 min in der Lösung aus 4% PFA. Waschen Sie danach die Augen dreimal mit Phosphatpuffer 0,1 M, pH 7,4.

5. Kryokonservierung und Einfrieren

HINWEIS: Die Kryostatenschnitte des Netzhautgewebes wurden wie zuvor beschrieben mit einigen Anpassungen durchgeführt19.

  1. Kryokonservieren Sie die Augen mit einem Saccharosegradienten von 10 %, 20 % und 30 %, verdünnt in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,4. Tauchen Sie die Augen nacheinander in die Saccharoselösungen, beginnend mit der niedrigsten Konzentration (10%) und allmählich bis zur höchsten (30%) steigernd. Jeder Schritt dauert so lange, bis sich die Augen am Boden des Behälters absetzen, was darauf hinweist, dass die nächste Konzentration verwendet werden kann. In der Endkonzentration die Augen ca. 12 h bei 4 °C lagern.
  2. Entfernen Sie am nächsten Tag die überschüssigen 30% Saccharose und legen Sie die Augen in einen runden Aluminiumbehälter mit einem Durchmesser von 2 cm, der nach den Versuchsgruppen angeordnet ist.
    HINWEIS: Stellen Sie einen Behälter aus Aluminiumfolie in der entsprechenden Größe entsprechend der Anzahl der Versuchsgruppen her.
  3. Entfernen Sie unter einem binokularen stereoskopischen Mikroskop mit einer 10-fachen Vergrößerung die überschüssige Saccharose von der Innenseite und um den Augapfel mit einer Pipette oder einem Filterpapier und achten Sie darauf, die Gewebestruktur nicht zu beschädigen.
  4. Betten Sie die Augen in ein Gefriermedium mit optimaler Schnitttemperatur (OCT) ein, achten Sie darauf, dass sich keine Blasen in oder um die Augen bilden, und lassen Sie sie 1 Stunde lang bei RT.
  5. Positionieren Sie die Augen nach 1 h im OCT mit dem zuvor markierten Referenzpunkt nach oben. Stellen Sie den Alufolienbehälter zum Einfrieren auf eine geeignete Aluminiumplatte in eine kleine Styroporbox.
  6. Gießen Sie vorsichtig flüssigen Stickstoff auf die Aluminiumplatte um den Folienbehälter herum. Stellen Sie sicher, dass sich der Stickstoff gleichmäßig über die Oberfläche verteilt. Dies fördert ein gleichmäßiges Einfrieren des Gewebes. Achten Sie darauf, dass der flüssige Stickstoff nicht in direkten Kontakt mit den Augen im Inneren des Folienbehälters kommt. Fahren Sie dann mit dem Schneiden der Augen mit einem Kryostaten fort.

6. Vorbereitung der Folien

  1. Poly-L-Lysin (200 μg/ml) auf die Objektträger mit Milchkand verteilen.
  2. Warten Sie 12 Stunden, bis die Objektträger getrocknet und einsatzbereit sind.

7. Kryostat-Schnitte

  1. Positionieren Sie den gefrorenen Block auf einem Kryostaten auf der Plattform.
  2. Drehen Sie das Handrad, um Profile mit einer Dicke von 10 μm herzustellen.
  3. Passen Sie die Position des Blocks an, um sicherzustellen, dass alle Augen gleichmäßig im Schnitt vorhanden sind.
  4. Fahren Sie mit dem Schneiden fort, bis der Sehnerv mit einem Hellfeldmikroskop identifiziert ist.
  5. Sammeln Sie die Schnitte auf den mit Poly-L-Lysin vorbehandelten Objektträgern.
  6. Lagern Sie die Objektträger bis zur Analyse bei -20 °C.

8. Immunfluoreszenz

HINWEIS: Die Immunfluoreszenz wurde wie zuvor beschrieben mit einigen Anpassungen durchgeführt19,20.

  1. Die Objektträger aus dem Schnitt im Kryostaten werden mit 100 μl 0,5 % Triton X-100 in 0,01 M PBS für 15 min bei RT inkubiert, um die Zellplasmamembran zu permeabilisieren.
  2. Waschen Sie die Objektträger zweimal mit 0,01 M PBS für jeweils 5 min bei RT, um überschüssiges Triton X-100 zu entfernen.
  3. Inkubieren Sie mit 100 μl 1 % Rinderserumalbumin (BSA) in 0,01 M PBS für 30 min bei RT, um unspezifische Antikörperbindungsstellen zu blockieren.
  4. Nach der Blockierung werden die Schnitte über Nacht bei 4 °C (Kühlschrank) mit 100 μl Anti-Recoverin in einer Konzentration von 1:1500 inkubiert, verdünnt in BSA 1 %, um Photorezeptorzellen zu markieren.
  5. Am folgenden Tag werden die Schnitte mit 100 μl polyklonalem Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper 488 oder polyklonalem Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper 568 1:500, verdünnt in BSA 1%, für 2 h bei RT inkubiert.
  6. Waschen Sie die Objektträger zweimal mit 0,01 M PBS für jeweils 5 min bei RT.
  7. Inkubieren Sie die Schnitte mit 100 μl DAPI 1 mg/ml (4',6-Diamidino-2-phenylindol) für 2-3 min bei RT.
  8. Waschen Sie den Objektträger einmal mit 0,01 M PBS für 5 min bei RT.
  9. Zum Schluss werden die Schnitte mit einem Einbettmedium behandelt, das 2,5 g n-Propylgallat in 40 ml Glycerin in 0,1 M Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,4 enthält. Sie dienen als Anti-Fade-Reagenz und Einbettmedium und konservieren die Proben. Legen Sie ein Deckglas (24 mm 50 mm) auf die Objektträger und versiegeln Sie die Abschnitte mit Nagellack. Fahren Sie danach mit der Betrachtung der Proben unter dem Mikroskop fort.

9. Fluoreszenzmikroskopische Mikrofotografie

  1. Um Bilder der Zellen aufzunehmen, die mit der immunhistochemischen Technik markiert wurden, verwenden Sie ein Fluoreszenzmikroskop, das mit blauen, grünen und roten Filtern ausgestattet ist. Befestigen Sie zusätzlich eine Kamera für die Dia-Mikrofotografie. Um die Mikroaufnahmen zu erhalten, verwenden Sie einen Computer mit der Software LAS V3.7 (Leica) (Bildgebungssoftware), der für die gleichzeitige Visualisierung mit dem Mikroskop geöffnet sein muss.
  2. Legen Sie den Objektträger auf den Mikroskoptisch. Verwenden Sie zunächst das Objektiv mit der geringsten Vergrößerung und den Blaufilter.
  3. Stellen Sie den Fokus mit den Grob- und Feinfokusknöpfen ein, bis die Netzhaut mit den blau markierten Zellen (Zellkerne) deutlich sichtbar ist.
  4. Wählen Sie den gewünschten Bereich der Netzhaut für die Bildgebung aus. Erhöhen Sie die Vergrößerung allmählich auf das 40-fache des Objektivs und passen Sie den Fokus nach Bedarf an.
  5. Ziehen Sie nach dem Einstellen des Fokus am Bypass-Stift, um das Mikroskopbild an die Bildgebungssoftware zu übertragen. Wählen Sie die gewünschten Filter aus (A4 (blau), L5 (grün) und TX2 (rot)). Passen Sie die folgenden Parameter an: Belichtung, Verstärkung und Gamma, um sicherzustellen, dass das Bild klar und so nah wie möglich an dem ist, was unter dem Mikroskop beobachtet wird.
  6. Bei 400× Vergrößerung erfassen Sie vier Felder mit einer Fläche von 113 × 113 μm und folgen dabei einer Ausrichtung von der Peripherie zur Mitte der Netzhaut. Stellen Sie sicher, dass zwei dieser Felder den peripheren Bereich und zwei den zentralen Bereich der Netzhaut darstellen.
  7. Um Mikroaufnahmen des peripheren Feldes zu erhalten, nehmen Sie Bilder in einem Abstand von etwa 50 μm von den Rändern des Auges auf. Für Mikroaufnahmen des zentralen Feldes wählen Sie benachbarte Bereiche aus, die 50 μm vom Sehnerv entfernt sind, und nehmen Sie die Bilder auf. Verwenden Sie sowohl das rechte als auch das linke Auge für die Quantifizierung, was zu insgesamt acht analysierten Feldern pro Behandlung führt.
  8. Nachdem Sie alle Mikroaufnahmen abgeschlossen haben, fahren Sie mit der manuellen Quantifizierung der immunmarkierten Zellen fort.

10. Quantifizierung der Zellen

  1. Öffnen Sie das Programm ImageJ v.1.54g. Klicken Sie im Programm auf Datei, dann auf Öffnen und wählen Sie das auf dem Computer gespeicherte Bild aus.
  2. Wenn das Bild bereits geöffnet ist, klicken Sie auf Multipoint. Verwenden Sie dieses Werkzeug, um die Zellen zu quantifizieren, indem Sie mit der linken Maustaste auf jede zu zählende Zelle klicken.
  3. Quantifizieren Sie die kolokalisierten Zellen, d.h. positiv für Recoverin und DAPI, in der äußeren Kernschicht (ONL).
  4. Wenn die Zählung abgeschlossen ist, doppelklicken Sie mit der linken Maustaste, um die Gesamtzahl der markierten Zellen anzuzeigen.
  5. Nachdem Sie die Anzahl der wiedergewonnenen Zellen bestimmt haben, geben Sie die Anzahl der Zellen in die Excel-Quantifizierungstabelle ein und fahren Sie mit der nächsten Mikroaufnahme fort.
  6. Wiederholen Sie alle Schritte für die 8 Felder, die jedem Tier entsprechen.
  7. Berechnen Sie den Durchschnitt dieser acht Felder, was einem einzigen Experimentierpunkt für die gesamte Netzhaut entspricht (n= 1). Verwenden Sie für das Diagramm der peripheren Netzhaut den Durchschnitt der peripheren Felder, insgesamt vier Felder: zwei vom linken Auge und zwei vom rechten Auge. Dieser Mittelwert entspricht einem experimentellen Punkt für die periphere Netzhaut (n= 1). Erstellen Sie den Mittelpunkt des Netzhautdiagramms auf die gleiche Weise wie das periphere Diagramm, wobei Sie nur den Bereich ändern.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Die Immunfluoreszenztechnik zur Markierung von Photorezeptoren, Recoverin-positiven Zellen, ermöglichte es uns, das Degenerationsmuster der Photorezeptoren bei rd10- und C57Bl6-Tieren zu beobachten, wobei letztere als gesund eingestuft wurden (Abbildung 1). Wie zu sehen ist, ist die Markierung von Recoverin-positiven Zellen ausschließlich auf die äußere Kernschicht (ONL) beschränkt, in der sich Photorezeptoren befinden, einschließlich der Markierung von Segme...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Die Netzhaut ist ein empfindliches Gewebe, das schwer zugänglich ist. Daher muss die Technik in Betracht gezogen werden, die zur Durchführung einer pharmakologischen Behandlung verwendet werden soll, die auf dieses Gewebe abzielt. Die intravitreale Injektion ist eine etablierte und weit verbreitete Technik zur direkten Verabreichung von Arzneimitteln an die Netzhaut, insbesondere bei der Behandlung von Augenerkrankungen wie altersbedingter Makuladegeneration21, di...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte anzugeben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde im Rahmen eines Forschungsstipendiums durchgeführt, das vom Nationalen Rat für wissenschaftliche und technologische Entwicklung (CNPq), der Carlos Chagas Filho Foundation for Research Support des Bundesstaates Rio de Janeiro (FAPERJ) unterstützt wurde, und wurde teilweise auch von der Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasilien (CAPES) - Finanzcode 001 finanziert.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,3 % Triton-X-100Sigma-AldrichT8787Lösung zur Blockierung des Puffers
1 % BSASigma-AldrichA4503Lösung zur Blockierung des Puffers
1 % Human BD Fc BlockBD Biosciences564220Fc Block zur Blockierung des Puffers
erforderlich 150 W LED-LampeAmazonB07VH3CVSF LED-Lichtquellefür die Photobestrahlung des Gewebes
1x PBS Gibco10010-023Lösung zum Blockieren von Puffer- und Waschschritten
20 Gallonen VorratsbehälterAmazonB001B1C4G0Behälter für den Photobestrahlungsprozess
40 W RGBW Flut LED-Lampe AmazonB08QFPJSMD RGB-Lichtquellefür die Photobestrahlung von Geweben
Ag85BAbcamab43019/NAAntikörper für die IBEX-Bildgebung. Siehe Tabelle 1.
Alpha-glatte Muskulatur Aktin DyLight 755Novus BiologicalsNBP2-345221R/NAAntikörper für die IBEX-Bildgebung. Siehe Tabelle 1.
Avidin/Biotin Blocking KitAbcamab64212Avidin- und Biotin-Blockierungslösung
BD Cytofix/CytopermBD Biosciences554714Fixierungslösung
BOND EntwachsungslösungLeica BiosystemsNC0221076Entparaffinierungslösung
BOND Epitop-Rückhollösung 1Leica BiosystemsNC0235529Citrat-basierte pH-6-Epitop-Rückgewinnungslösung ( ER1)
BOND Epitop-Entnahmelösung 2Leica BiosystemsNC0235530EDTA-basierte pH-9-Epitop-Rückgewinnungslösung (ER2)
BOND Research Detection SystemLeica BiosystemsNC0396648Automatisiertes Forschungsfärbereagenz
BOND RX Research StainerLeica BiosystemsNAAutomatisierte Forschungsfärbeplattform
BOND Wash SolutionLeica BiosystemsNC0221077Waschpuffer
CD15BD Biosciences347420/AB_400298Antikörper für die IBEX-Bildgebung. Siehe Tabelle 1.
CD20 eFluor 660Thermo Fisher Scientific50-0202-82/AB_11150959Antikörper für die IBEX-Bildgebung. Siehe Tabelle 1.
CD4 Alexa Fluor 488R& DSystems FAB8165G/AB_2728839Antikörper für die IBEX-Bildgebung. Siehe Tabelle 1.
CD45 Phycoerythrin (PE)Novus BiologicalsNBP2-34528PE/NAAntikörper für die IBEX-Bildgebung. Siehe Tabelle 1.
CD68 iFluor 594Caprico Biotechnologies1064135/AB_2892745Antikörper für die IBEX-Bildgebung. Siehe Tabelle 1.
Esel Anti-Ziegen-IgG Alexa Fluor Plus 488Thermo Fisher ScientificA32814/AB_2762838Antikörper für die IBEX-Bildgebung. Siehe Tabelle 1.
Esel Anti-Maus IgG Alexa Fluor Plus AF647Thermo Fisher ScientificA32787/ AB_2762830Antikörper für die IBEX-Bildgebung. Siehe Tabelle 1.
Esel Anti-Maus IgM Alexa Fluor 488Jackson ImmunoResearch715-545-020/AB_2340844Antikörper für die IBEX-Bildgebung. Siehe Tabelle 1.
Esel Anti-Kaninchen IgG Alexa Fluor Plus AF555Thermo Fisher ScientificA32794/AB_2762834Antikörper für die IBEX-Bildgebung. Siehe Tabelle 1.
EasyDip FärbesystemNewcomer Supply5300KITObjektträger-Färbesystem
Fluoromount-GThermo Fisher Scientific00-4958-02Eindeckmedium
HoechstBiotium40046Kernfärbemittel für die IBEX-Bildgebung. Siehe Tabelle 1.
Imaris File Converter x64 10.2.0Imaris Oxford InstrumentsKostenloser Dateikonverter
ImarisViewer Software x64 10.2.0Imaris Oxford InstrumentsKostenlose Bildbearbeitungssoftware
ImmEdge PenVector LaboratoriesH-4000Hydrophober Barrierestift
Lithiumborhydrid (1 Gramm)STREM Chemicals93-0397Chemikalie zur Farbstoffinaktivierung, kaufen Sie kleine Aliquots dieser Chemikalie (1 Gramm)
Lumican BiotinR& D SystemsBAF2846Antikörper für die IBEX-Bildgebung. Siehe Tabelle 1.
Micro Cover GläserVWR48393-241Glas-Objektträgerabdeckungen
Pan-Cytokeratin Alexa Fluor 750Novus BiologicalsNBP2-33200AF750/AB_2868569Antikörper für die IBEX-Bildgebung. Siehe Tabelle 1.
PELCO BioWave Pro MikrowellensystemTed Pella Inc36500-230Wissenschaftliche Mikrowelle ohne Erwärmung
PELCO SteadyTemp ProTed Pella Inc50062Vollautomatische Temperaturregelung für wissenschaftliche
Mikrowellen SimpleITKOpen-Source-SoftwareRegistrierungs- und Kanalverarbeitungssoftware
Streptavidin Alexa Fluor 594Thermo Fisher ScientificS11227Markierungsreagenz für die IBEX-Bildgebung. Siehe Tabelle 1.
WeitfeldmikroskopLeica MicrosystemsNALeica Microsystems THUNDER Imager mit LED8-Lichtquelle und LAS X Software (3.7.1.21655). Für die Fluoreszenzbildgebung wurde ein spezieller Quad-Band-Filter mit externem Filterrad (PN: 11536075) mit zwei zusätzlichen Einzelbandfiltern (PN: 8118215) verwendet, um sieben Farbkanäle pro Durchgang abzubilden. Die Filteranregungs-, dichroitischen und Emissionslinien sind (1) Quad-Band-Würfel: dichroitisch bei 391/32, 479/33, 554/24, 638/31, keine Anregungs- oder Emissionsfilter; (2) Außenfilterrad Position 1: 434/32, Position 2: 520/40, Position 3: 585/20, Position 4: 720/60, Position 5: Durchlauf; (3) Einzelband 1– 585/22 Anregung, 594 dichroitisch, 625/30 Emission; (4) Single-Band 2– 635/20 Anregung, 647 dichroitische, 667/30 Emission.
Zeiss Optical Lens CleanerAmazonB00GPVQVCOMikroskop Objektivreiniger
Antikörper
Ag85BAbcamab43019Polyklonales Kaninchen IgG, Zyklus 1
Alpha-glatte Muskelmasse Aktin DyLight 755Novus BiologicalsNBP2-345221R1A4/asm-1, Zyklus 1
CD4 Alexa Fluor 488R&;D SystemeFAB8165GPolyklonales Ziegen-IgG, Zyklus 1
CD8 Alexa Fluor 647BioLegend372906C8/144B, Zyklus 1
CD68 iFluor 594Caprico Biotechnologies1064135KP1, Zyklus 1
Esel Anti-Ziegen-IgG Alexa Fluor Plus 488Thermo Fisher ScientificA32814Polyklonaler Esel, Zyklus 1
Esel Anti-Maus-IgG Alexa Fluor Plus AF647Thermo Fisher ScientificA32787Polyklonaler Esel, Zyklus 1
Esel Anti-Kaninchen IgG Alexa Fluor Plus AF555Thermo Fisher ScientificA32794Polyklonaler Esel, Zyklus 1
HoechstBiotium40046Nukleare Markierung, Zyklus 1
CD15BD Biosciences347420MMA, Zyklus 2
CD20 eFluor 660Thermo Fisher Scientific50-0202-82L26, Zyklus 2
CD45 Phycoerythrin (PE)Novus BiologicalsNBP2-34528PE2B11 + PD7/26, Zyklus 2
Esel Anti-Maus IgM Alexa Fluor 488Jackson ImmunoResearch715-545-020Polyklonaler Esel, Zyklus 2
Lumican BiotinR& D SystemsBAF2846Polyklonales Ziegen-IgG, Zyklus 2
Pan-Cytokeratin Alexa Fluor 750Novus BiologicalsNBP2-33200AF750AE-1/AE-3, Zyklus 2
Streptavidin Alexa Fluor 594Thermo Fisher ScientificS11227N/A, Zyklus 2
HoechstBiotium40046Zyklus 2
Solutions
Blocking Buffer (Cycle 1)
Triton-X-100Sigma-AldrichT87870,3 Vol.-%
BSASigma-AldrichA45031 Vol.-%
Human BD Fc BlockBD Biosciences5642201 Vol.-%
1x PBSGibco10010-02397,7 Vol.-%
Primärantikörper-Färbelösung #1 (Zyklus 1)Blocking-Puffer
(Zyklus 1)Siehe obenNach Zugabe von Antikörpern auf Volumen auffüllen
HoechstBiotium400461:5000
CD8 AF647BioLegend3729061:10
Primary Antibody Staining Solution #2 (Zyklus 1)
Blocking Buffer (Zyklus 1)Siehe obenNach Zugabe von CD4
nbsp; AF488R& D SystemsFAB8165G1:10
Ag85BAbcamab43019/NA1:100
Sekundärantikörper-Färbelösung #1 (Zyklus 1)
Blocking Buffer (Zyklus 1)Siehe obenNach Zugabe von Antikörpern auf Volumen auffüllen
Donkey Anti-Goat AF Plus 488Thermo Fisher ScientificA32814/AB_27628381:100
Donkey Anti-Rabbit AF Plus 555Thermo Fisher ScientificA32794/AB_27628341:100
Donkey Anti-Mouse AF Plus 647Thermo Fisher ScientificA32787/AB_27628301:50<
strong>Primary Antibody Staining Solution #3 (Zyklus 1)
Blocking Buffer (Zyklus 1)Siehe obenNach Zugabe auf Volumen auffüllen Antikörper
CD68 iF594Caprico Biotechnologies10641351:10
a-SMA DL755Novus BiologicalsNBP2-345221R/NA1:30
BSA-freier Blockierungspuffer (Zyklus 2)
Triton-X-100Sigma-AldrichT87870,3 Vol.-%
BD Fc BlockBD Biosciences5642201 Vol.-%
1x PBS Gibco10010-02398,7 Vol.-%
Primäre Antikörper-Färbelösung #4 (Zyklus 2)BSA-freier
Blockierungspuffer (Zyklus 2)Siehe obenNach Zugabe von Antikörpern auf Volumen
auffüllen CD15BD Biosciences3474201:30
Lumican BiotinR& D SystemsBAF28461:100
CD45 PENovus BiologicalsNBP2-34528PE1:20
CD20 eFluor 660Thermo Fisher Scientific50-0202-821:10
Pan-Cytokeratin AF750Novus BiologicalsNBP2-33200AF7501:10
Sekundärantikörper-Färbelösung #2 (Zyklus 2)
BSA-freier Blockierungspuffer (Zyklus 2)Siehe obenNach Zugabe von Antikörpern auf Volumen auffüllen
Esel Anti-Maus IgM AF488Jackson ImmunoResearch715-545-020/AB_23408441:100
Strepavidin AF594Thermo Fisher ScientificS112271:200
: & Human

Referenzen

  1. Kels, J., et al. Anatomy and physiology of the retina: a comprehensive review. Retinal J. 21, 75-92 (2015).
  2. Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiol Rev. 85 (3), 845-881 (2005).
  3. Tsang, S. H., Sharma, T. Retinal degeneration and gene therapy: present and future approaches. Prog Retin Eye Res. 67, 93-120 (2018).
  4. Gasparini, S. J., Favretto, F., La Greca, C. Biology of the retina: structure, function, and dysfunction. J Biomed Sci. 19 (3), 289-300 (2019).
  5. Masland, R. Neuronal diversity in the retina. Curr Opin Neurobiol. 11 (4), 431-436 (2001).
  6. Masland, R. H. The neuronal organization of the retina. Neuron. 76 (2), 266-280 (2012).
  7. Hoon, M., et al. Functional architecture of the retina: development and disease. Prog Retin Eye Res. 42, 44-84 (2014).
  8. Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. Retinitis pigmentosa. Lancet. 368 (9549), 1795-1809 (2006).
  9. Liu, W., et al. Retinitis pigmentosa: progress in molecular pathology and biotherapeutical strategies. Int J Mol Sci. 23 (9), 4883(2022).
  10. Hamel, C. Retinitis pigmentosa. Orphanet J Rare Dis. 1, 40(2006).
  11. Verbakel, S. K., et al. Non-syndromic retinitis pigmentosa. Prog Retin Eye Res. 66, 157-186 (2018).
  12. O'Neal, T. B., Tripathy, K., Luther, E. E. Retinitis Pigmentosa. , StatPearls Publishing. Treasure Island, FL. (2025).
  13. Arango-Gonzalez, B., et al. Identification of a common non-apoptotic cell death mechanism in hereditary retinal degeneration. PLoS One. 9 (11), e112142(2014).
  14. Chang, B., et al. Two mouse retinal degenerations caused by missense mutations in the beta-subunit of rod cGMP phosphodiesterase gene. Vision Res. 47 (5), 624-633 (2007).
  15. Jae, S. A., et al. Electrophysiological and histologic evaluation of the time course of retinal degeneration in the rd10 mouse model of retinitis pigmentosa. Korean J Physiol Pharmacol. 17 (3), (2013).
  16. Strettoi, E., et al. Inhibition of ceramide biosynthesis preserves photoreceptor structure and function in a mouse model of retinitis pigmentosa. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (43), 18706-18711 (2010).
  17. Rösch, S., Johnen, S., Mataruga, A., Müller, F., Pfarrer, C., Walter, P. Selective photoreceptor degeneration by intravitreal injection of N-methyl-N-nitrosourea. Investig Ophthalmol Vis Sci. 55 (3), 1711-1723 (2014).
  18. Kellish, P. C., et al. Intravitreal injection of a rationally designed AAV capsid library in non-human primate identifies variants with enhanced retinal transduction and neutralizing antibody evasion. Mol Ther. 31 (12), 3441-3456 (2023).
  19. Molday, L. L., Cheng, C. L., Molday, R. S. Cell-Specific Markers for the Identification of Retinal Cells and Subcellular Organelles by Immunofluorescence Microscopy. Retinal Degeneration. , Humana Press. New York. (2019).
  20. Cheng, C. L., Djajadi, H., Molday, R. S. Cell-Specific Markers for the Identification of Retinal Cells by Immunofluorescence Microscopy. Retinal Degeneration. , Humana Press. Totowa, NJ. (2012).
  21. Girgis, S., Lee, L. R. Treatment of dry age-related macular degeneration: a review. Clin Exp Ophthalmol. 51 (8), 835-852 (2023).
  22. Lee, J. Y., et al. Superoxide dismutase 3 prevents early stage diabetic retinopathy in streptozotocin-induced diabetic rat model. PLoS One. 17 (1), e0262396(2022).
  23. Isiegas, C., et al. Intravitreal injection of proinsulin-loaded microspheres delays photoreceptor cell death and vision loss in the rd10 mouse model of retinitis pigmentosa. Investig Ophthalmol Vis Sci. 57 (8), 3610-3618 (2016).
  24. Doshi, R. R., Bakri, S. J., Fung, A. E. Intravitreal injection technique. Semin Ophthalmol. 26 (3), 104-113 (2011).
  25. Kim, H. M., Woo, S. J. Ocular drug delivery to the retina: current innovations and future perspectives. Pharmaceutics. 13 (1), 108(2021).
  26. Jones, B. W., Marc, R. E., Pfeiffer, R. L. Retinal Degeneration, Remodeling and Plasticity. Webvision: The Organization of the Retina and Visual System. , University of Utah Health Sciences Center, Salt Lake City. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK482309/"K482309 (2016).
  27. Roche, S. L., Wyse-Jackson, A. C., Byrne, A. M., Ruiz-Lopez, A. M., Cotter, T. G. Alterations to retinal architecture prior to photoreceptor loss in a mouse model of retinitis pigmentosa. Int J Dev Biol. 60, 127-139 (2016).
  28. Ladha, R., Caspers, L. E., Willermain, F., de Smet, M. D. Subretinal therapy: technological solutions to surgical and immunological challenges. Front Med. 9, 846782(2022).
  29. Varela-Fernández, R., et al. Drug delivery to the posterior segment of the eye: biopharmaceutic and pharmacokinetic considerations. Pharmaceutics. 12 (3), 269(2020).
  30. Bussing, D., et al. Pharmacokinetics of monoclonal antibody and antibody fragments in the mouse eye following intravitreal administration. J Pharm Sci. 112 (8), 2276-2284 (2023).
  31. Roberge, F. G., de Kozak, Y., Utsumi, T., Faure, J. P., Nussenblatt, R. B. Immune response to intraocular injection of retinal S-antigen in adjuvant. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 227 (1), 67-71 (1989).
  32. Ishikawa, T., Hokama, H., Katagiri, Y., Goto, H., Usui, M. Effects of intravitreal injection of tacrolimus (FK506) in experimental uveitis. Curr Eye Res. 30 (2), 93-101 (2005).
  33. Ramos-Vara, J. A., Miller, M. A., et al. When tissue antigens and antibodies get along: revisiting the technical aspects of immunohistochemistry: the red, brown, and blue technique. Vet Pathol. 51 (1), 42-87 (2014).
  34. Gargini, C., Terzibasi, E., Mazzoni, F., Strettoi, E. Retinal organization in the retinal degeneration 10 (rd10) mutant mouse: a morphological and ERG study. J Comp Neurol. 500 (2), 222-238 (2007).
  35. Haverkamp, S., Wässle, H. Immunocytochemical analysis of the mouse retina. J Comp Neurol. 424, 1-23 (2000).
  36. Haverkamp, S., Ghosh, K. K., Hirano, A. A., Wässle, H. Immunocytochemical description of five bipolar cell types of the mouse retina. J Comp Neurol. 455, 463-476 (2003).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

Intravitreale InjektionKryostat SchnitttechnikImmunfluoreszenzmarkierungRecoverin Antik rperRetina KonservierungZellz hlungNetzhauthistologie
Video demnächst verfügbar

Verwandte Artikel