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Im lebenden Organismus Bildgebung der neuronalen Aktivität in nicht anästhesierten erwachsenen Drosophila-Fliegen

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DOI:

10.3791/68332

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20. Juni 2025

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1Department of Biology, Georgetown University, 2Interdisciplinary Program in Neuroscience, Georgetown University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Ein wesentliches Hindernis für die Untersuchung der zellulären Aktivität während kognitiver Prozesse wie Lernen und Gedächtnis ist die Verwendung von Anästhetika für die Vorbereitung von In-vivo-Bildgebung . Die Anästhesie beeinträchtigt das Kurzzeitgedächtnis und die Kognition in mehreren Modellen, einschließlich Drosophila. Diese Studie stellt eine einzigartige Methode zur Vorbereitung adulter Drosophila für die In-vivo-Bildgebung ohne Anästhesie vor.

Zusammenfassung

Die In-vivo-Bildgebung ist für die Untersuchung der Neurobiologie in Drosophila von entscheidender Bedeutung, da sie eine Echtzeit-Visualisierung der neuronalen Aktivität, Entwicklung und Plastizität innerhalb der intakten, sich verhaltenden Fliege ermöglicht. Diese Technik bietet unschätzbare Einblicke in dynamische Prozesse, wie z. B. die synaptische Funktion und die Konnektivität von Schaltkreisen, die in festen oder ex vivo-Präparationen nicht genau erfasst werden können. Bei den meisten Techniken zur Fliegenpräparation für die In-vivo-Bildgebung werden die Fliegen kurz vor der funktionellen Bildgebung anästhesiert. Nichtsdestotrotz gibt es zahlreiche Belege dafür, dass die Anästhesie mehrere kognitive und physiologische Prozesse beeinflusst. Aus diesem Grund ist die In-vivo-Bildgebung von adulten Drosophila melanogaster ohne den Einsatz von Anästhetika während der Tierpräparation ein anspruchsvoller, aber äußerst wünschenswerter Ansatz. Das hier vorgestellte Protokoll beinhaltet die Immobilisierung des Kopfes wacher Fliegen, indem der Rüssel in ein kleines Metallröhrchen gesaugt wird, das mit einem Vakuumsystem verbunden ist. Während der Kopf fixiert ist, wird die Fliege für die funktionelle Bildgebung vorbereitet, ohne dass eine Anästhesie erforderlich ist. Dieses Protokoll ist schnell und reproduzierbar und stellt sicher, dass die Fliege nicht geschädigt wird. Der Hauptvorteil dieser Methode liegt in der Vermeidung des Einsatzes von Anästhetika, wodurch die potenziellen komplexen Auswirkungen der Anästhesie auf die neuronale Aktivität berücksichtigt werden. Diese Methode ist sowohl erschwinglich als auch sehr anpassungsfähig und verwendet kostengünstige, anpassbare Tools. Es ermöglicht die erfolgreiche Bildgebung lebender Fliegen und erfasst schnelle Veränderungen der neuronalen Aktivität, die mit dynamischen kognitiven Prozessen verbunden sind.

Einleitung

Jüngste Fortschritte bei genetisch kodierten Aktivitätsreportern haben die Neurowissenschaften revolutioniert, indem sie hochspezifische Echtzeit-Einblicke in die neuronale Aktivität liefern. Diese Reporter, wie z. B. Kalzium- oder Spannungssensoren 1,2,3,4,5,6,7,8,9, ermöglichen es den Forschern, die elektrischen und chemischen Signale innerhalb von Neuronen mit bisher unerreichter zeitlicher Präzision und räumlicher Auflösung zu verfolgen. Indem sie die Überwachung spezifischer, einzelner Neuronen in neuronalen Netzwerken über verschiedene Gehirnregionen hinweg ermöglichen, haben diese Werkzeuge unser Verständnis dafür vertieft, wie neuronale Feuermuster mit kognitiven Prozessen wie Lernen, Gedächtnis oder Entscheidungsfindung zusammenhängen 10,11,12,13,14.

Um diese genetisch kodierten Indikatoren zu nutzen, entwickelten die Forscher fortschrittliche Methoden, um ihren Modellorganismus auf die In-vivo-Bildgebung vorzubereiten. Der erste Bericht über neuronale Plastizität durch funktionelle In-vivo-Bildgebung, der oft als "Gedächtnisspur" bezeichnet wird, wurde im Antennenlappen der Honigbienen nach appetitlicher olfaktorischer Konditionierung entdeckt15. Diese Entdeckung inspirierte die Forschung am genetisch vielseitigen Modellorganismus Drosophila melanogaster, die zur Entwicklung innovativer In-vivo-Bildgebungsverfahren führte 10,16,17,18.

Drosophila dient als hervorragendes Modell für das Verständnis von Lernen und Gedächtnis aufgrund ihrer robusten Fähigkeit, olfaktorische Erinnerungen durch klassische Konditionierung zu bilden, bei der ein Geruch (der konditionierte Stimulus-CS) entweder mit einem aversiven oder einem lohnenden Reiz (dem unkonditionierten Stimulus-US) assoziiert wird19,20,21,22. In Drosophila sind Gerüche im Pilzkörper (MB)23 nur spärlich vertreten, einer kritischen Gehirnregion für das assoziative Gedächtnis, die aus etwa 2.000 Kenyon-Zell-Neuronen (KCs) pro Hemisphärebesteht 24. Geruchsinformationen werden über KC-Axone vom Kelch zu den MB-Lappen übertragen, die sich zu den Lappen bündeln. Während der olfaktorischen Konditionierung wird das US, wie z. B. ein elektrischer Schlag oder eine Zuckerbelohnung, durch unterschiedliche dopaminerge Neuronen (DANs) zu den MB-Lappen transportiert: PPL1-Neuronen für aversive Reize und PAM-Neuronen für belohnende Reize 25,26,27,28,29,30. Es wird angenommen, dass der Gedächtniserwerb die gleichzeitige Aktivierung von CS- und US-Signalwegen beinhaltet, was zu einer synergistischen Erhöhung des zyklischen AMP (cAMP) führt, das den Speicher kodiert31,32. Dieser Prozess induziert Plastizität an den KC→MBON-Synapsen, wodurch ihr synaptisches Gewicht 11,12,13,33,34,35,36,37 verändert wird. Die DAN-vermittelte Plastizität treibt die Pilzkörper-Output-Neuronen (MBONs) letztendlich dazu, entweder eine Annäherung oder ein Vermeidungsverhalten gegenüber dem erlernten Geruch hervorzurufen34. Das aktuelle Modell deutet darauf hin, dass der Informationsfluss von KCs zu den MBONs die Repräsentation des Geruchs von der Geruchsidentität in KCs zu abstrakteren Informationen in den MBONs transformiert, wie z.B. die Wertigkeit eines Geruchs auf der Grundlage früherer Erfahrungen34,38. Im Gegensatz zu KCs haben MBONs eine breit abgestimmte Geruchsreaktion; Jeder gegebene Geruch führt zu einer Reaktion auf die meisten MBONs39. Die Geruchsabstimmung der MBONs wird durch die synaptische Plastizität modifiziert und variiert signifikant zwischen den einzelnen Fliegen, was darauf hindeutet, dass MBONs ihre Reaktion auf Gerüche aufgrund von Erfahrungen ändern. Es gibt 34 MBONs, wobei der Großteil des MBON-Netzwerks scheinbar in zwei sich gegenseitig antagonistische Klassen unterteilt ist, die beide Ansätze des Vermeidungsverhaltens antreiben34. Aus diesem Grund ist die Verwendung von In-vivo-Bildgebung zur Untersuchung des Gedächtnisabrufs durch Aufzeichnung in verschiedenen MBONs weit verbreitet.

Zu den frühen Methoden der funktionellen Bildgebung in vivo gehört die Durchführung von Operationen, bei denen ein Abschnitt der Nagelhaut von der Oberseite der Kopfkapsel entfernt wurde, der dann mit einem kleinen Stück Plastikfolie abgedeckt wurde18. Während dies den Beginn der In-vivo-Bildgebung bei Drosophila markierte, gab es seitdem bedeutende Fortschritte bei den Techniken zur Fliegenvorbereitung und der Abgabe von Reizen unter dem Mikroskop, um Prozesse wie Lernen und Gedächtnis zu untersuchen. Aber auch heute noch beinhalten die meisten Techniken zur Fliegenpräparation für die In-vivo-Bildgebung die Anästhesie der Fliegen. Diese Praxis stellt eine Herausforderung dar, da es umfangreiche Beweise - und ein ganzes Forschungsfeld - gibt, die zeigen, wie sich die Anästhesie auf das Gedächtnis sowie andere kognitive und physiologische Prozesse auswirkt. Zum Beispiel wurde eine Studie durchgeführt, um die Auswirkungen verschiedener Anästhetika zu verstehen, die im Labor sehr häufig verwendet werden (Kohlendioxid, Isofluran, Sevofluran und Kälteschock). Sie fanden heraus, dass je länger die Narkose dauerte, die Erholungszeit zunahm, sich die Bewegungsaktivität veränderte, die Fruchtbarkeit abnahm und sich auf die Wasser- und Lipidspeicher auswirken kann40. Darüber hinaus wurde berichtet, dass eine Kälteschockanästhesie unmittelbar nach dem Training das Kurzzeitgedächtnis vollständig stören kann21. Aus dieser ersten Studie ist nun bekannt, dass es in Drosophila ein unkonsolidiertes Gedächtnis (anästhesieempfindliches Gedächtnis) gibt, das innerhalb von 6-8 h abklingt, und eine Form des konsolidierten Gedächtnisses (anästhesieresistentes Gedächtnis), das nach dem Lernen allmählich gebildet wird und etwa 24 h41 dauern kann. Auf dieser Grundlage kann die Anästhesie die kognitive Verarbeitung und die Aktivität von Neuronen beeinflussen, was schließlich einen ordnungsgemäßen Gedächtnisausdruck ermöglicht.

Die Auswirkungen der Anästhesie auf das Gedächtnis sind nicht auf Drosophila beschränkt. Zahlreiche Studien am Menschen und anderen Säugetieren haben ähnliche Ergebnisse gezeigt. So ergab eine Querschnittsstudie, die in einem Universitätsklinikum durchgeführt wurde, dass das Kurzzeitgedächtnis bei Patienten 24 h nach der Vollnarkose signifikant reduziert war42. Eine andere Studie an Mäusen ergab, dass eine Vollnarkose die Spike-Dynamik, dekorkorkorierte zelluläre Ensembles und eine veränderte Wirbelsäulendynamik in der CA1-Region des Hippocampus stark reduzierte, einem wichtigen Gehirnbereich, der am Lernen und Gedächtnis bei Säugetieren beteiligt ist43. Um diese Schwierigkeiten zu überwinden, ist es das Ziel dieser Studie, ein neuartiges Protokoll bereitzustellen, das die Verwendung von Anästhesie während der Fliegenvorbereitung für die In-vivo-Bildgebung eliminiert und den Körper der Fliege völlig frei lässt. Dieser Ansatz ermöglicht genauere Aufzeichnungen der neuronalen Aktivität, verbessert die Gesundheit der Fliegen bei längeren Aufzeichnungen und eliminiert mögliche Störeffekte der Anästhesie im Vergleich zu anderen Ansätzen. Dieses Protokoll wurde entwickelt, um die Aktivität von Neuronen in Drosophila aufzuzeichnen, insbesondere um zu untersuchen, wie Neuronen während und nach der Lernerfahrung Plastizität zeigen. Das Dissektionsprotokoll ist jedoch vielseitig einsetzbar und kann an verschiedene Anwendungen in der Live-Imaging-Forschung angepasst werden.

Protokoll

Die Einzelheiten der für diese Studie verwendeten Geräte und Reagenzien sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Transgene Fruchtfliegen, Drosophila melanogaster

  1. Kreuzen Sie weibliche Jungfrauen und männliche Fliegen (aufgezogen bei 25 °C bei 60% relativer Luftfeuchtigkeit in einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus), die die gewünschten Gal4- bzw. UAS-Konstrukte tragen, um Fliegen zu produzieren, in denen bestimmte Neuronen von Interesse den gewünschten genetisch kodierten Aktivitätsreporter exprimieren.
  2. Lassen Sie die Nachkommen der obigen Kreuzung altern, bis sie sich im Bereich von 2-5 Tagen nach der Eklosion befinden. Es können sowohl Männer als auch Frauen verwendet werden, da die Bildgebungskammern individuell für beide Geschlechter angefertigt werden.

2. Bau eines Aspirators (5-minütiger Workflow)

  1. Schneide einen 6 mm langen Silikonschlauch mit einer Rasierklinge auf eine Länge von etwa 8 Zoll. Nehmen Sie eine p200 Pipettenspitze und schneiden Sie etwa die Hälfte davon mit einer Rasierklinge für das Mundstück ab (Abbildung 1A). Führen Sie die abgeschnittene Spitze in den Schlauch ein. Schneiden Sie eine p1000-Pipettenspitze so weit ab, dass sich eine Fliege durch sie bewegen kann.
  2. Nehmen Sie ein kleines Stück Watte und decken Sie den Silikonschlauch ab. Damit soll verhindert werden, dass die Fliege in den Mund des Experimentators aspiriert. Legen Sie die abgeschnittene p1000-Spitze auf den mit Watte überzogenen Schlauch.
  3. Decken Sie die Pipettenspitze p1000 mit einer neuen Pipettenspitze p200 ab. Um die geeignete Länge für das Schneiden der p200-Pipettenspitze zu bestimmen, entfernen Sie zuerst die p200-Pipettenspitze und saugen Sie eine Fliege in die p1000-Pipettenspitze ein. Bringen Sie die p200-Spitze wieder an. Blasen und klopfen Sie sanft auf die Fliege, um sie so weit wie möglich in die p200-Spitze zu bewegen.
    1. Wenn sie nicht mehr weiter vorrücken kann, markiere mit einem Präpariermikroskop mit einer Rasierklinge die Stelle, an der der Kopf der Fliege endet und der Thorax beginnt. Aspirieren Sie die Fliege zurück in die Pipettenspitze p1000 und schneiden Sie die Pipettenspitze p200 an der markierten Position ab.

3. Bau des Rüsselsaugers für Metallrohre (5 - 10 Minuten Arbeitsablauf)

  1. Schneiden Sie das 22X Gauge Injektionsmetallrohr mit Dremel-Werkzeugen und einem Diamantsägeblatt auf die gewünschte Größe (~10 cm) zu. Polieren Sie die Enden von Metallrohren mit einer Dremel 420 Trennscheibe, um eine glatte und saubere Öffnung zu schaffen. Diese Öffnung nimmt den Rüssel der Fliege auf.
  2. Wickeln Sie den Schlauch um ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen, um die gewünschte gekrümmte Form zu erhalten (Abbildung 1A). Die Kurve sollte eine hakenartige Form erzeugen, die es dem Körper der Fliege ermöglicht, in einer Linie mit der Kammer zu sein.
  3. Schneiden Sie ein Stück (~7 cm lang) des 12TW Gauge Injektionsschlauchs aus Metall mit Dremel-Werkzeugen ab (dieser Schlauch sollte in eine 2 μl Pipettenspitze passen). Nehmen Sie eine 2-μl-Pipettenspitze und schneiden Sie das Ende mit einer Rasierklinge ab, damit es in den 22X-Gauge-Metallschlauch passt. Stecken Sie den größeren Metallschlauch in das andere Ende der 2-μl-Pipettenspitze.
  4. Mischen Sie eine kleine Menge Harz und einen Härter Epoxidkleber miteinander. Tragen Sie die Mischung dort auf, wo der kleine Metallschlauch auf die Pipettenspitze trifft und wo der größere Metallschlauch mit der Pipettenspitze verbunden ist. Lassen Sie den Klebstoff über Nacht vollständig aushärten, bevor Sie die Baugruppe mit einer Halterung an einem Mikromanipulator verbinden. Passen Sie den Winkel nach Bedarf an.

4. Bau einer Schock- und Geruchspipette für Lern- und Gedächtnisexperimente unter dem Mikroskop (10-minütiger Workflow)

  1. Schneiden Sie mit einem Dremel-Diamantwerkzeug 1 ml in eine 1/100-Glaspipette bei der 3-ml-Markierung. Schneiden Sie ein kleines rechteckiges Stück Acrylplatte mit den Maßen 24,5 mm x 8 mm und einer Dicke von 1/8 Zoll aus.
    HINWEIS: Alternativ kann dieses Teil in 3D gedruckt werden, um das Stoßdämpfergitter besser aufzunehmen (die stl- und obj-Dateien finden Sie in der Zusatzdatei 1 und der Zusatzdatei 2).
  2. Schneide das Kupfer-Schockgitter so zu, dass es auf das rechteckige Acrylstück aus dem vorherigen Schritt passt. Löten Sie zwei elektrische Drähte an gegenüberliegenden Enden des Kupfergitters. Legen Sie das Kupfergitter in das rechteckige Acrylstück und biegen Sie es so, dass der Hinterleib und die Beine der Fliege auf das Schockgitter passen (Abbildung 1I).
  3. Klebe das Kupfergitter mit einem Stück Isolierband auf den rechteckigen Kunststoff. Befestigen Sie die Glaspipette mit einer Heißklebepistole sicher am Schockgitter und stellen Sie sicher, dass es gerade und richtig zentriert ist. Überprüfen Sie mit einem Digitalmultimeter, ob das Kupfergitter funktioniert, um die Beine der Fliege effektiv zu schocken.

5. Montage eines Platinwiderstands zum Schmelzen von Klebstoff (Myristinsäure) (20-minütiger Arbeitsablauf)

  1. Schneiden Sie mit einer Abisolierzange 200 mm Drähte auf die gewünschte Länge ab und isolieren Sie ein Ende beider Drähte ab. Schneiden Sie ca. 60 mm des Platindrahts ab (diese Länge sollte ausreichen, um eine Schlaufe zu erstellen, die zum Schmelzen des Klebers verwendet wird).
  2. Löten Sie mit einer Lötpistole ein Ende des Platindrahtes an den elektrischen Draht. Führen Sie einen Schrumpfschlauch durch das elektrische Kabel und schrumpfen Sie den Schlauch mit einem Bunsenbrenner auf den Draht, um die gelöteten Teile abzudecken.
  3. Schneiden Sie zwei 20-mm-Stücke des Gummischlauchs mit einem Innendurchmesser von 2,55 mm ab und führen Sie sie durch den Platindraht (halten Sie den Platindraht gerade, um diesen Vorgang zu erleichtern). Verwenden Sie die Lötpistole, um das andere Ende des Platindrahtes mit dem anderen elektrischen Draht zu löten. Verwenden Sie einen neuen Schrumpfschlauch, um dieses neue Lötteil abzudecken.
  4. Entfernen Sie den Kolben einer BD tb 1 mL Spritze und führen Sie die Drähte aus den vorherigen Schritten durch den Zylinder. Das Platin sollte aus dem Ende des Spritzenzylinders herausragen. Es sollten keine freiliegenden Drähte vorhanden sein, und die kleinen Gummischläuche sollten den Platindraht bis zum Ende abdecken.
  5. Isolieren Sie mit einer Abisolierzange eine kleine Menge der beiden anderen Enden der elektrischen Drähte ab. Löten Sie jeden Draht mit einer Lötpistole an einen Bananenstecker, bis er fest angeschlossen ist.
  6. Verwenden Sie Epoxidkleber, um die Ober- und Unterseite des Spritzenzylinders zu verkleben, um die Drähte und den Zylinder miteinander zu verkleben. Dadurch werden Spannungen an den Drähten in der Spritze vermieden und eine längere Lebensdauer des Widerstands gewährleistet. Lass den Kleber über Nacht aushärten.
  7. Verbinden Sie den fertigen Widerstand mit der Gleichstromversorgung.

6. Bau der Aufnahmekammer - (2-tägiger Workflow)

  1. Nach der Zusatzdatei 3 schneiden Sie ein schwarzes Unterlegscheibenblech (Dicke 0,0125 Zoll) mit dem Laser. Die Größe der Öffnung in der Mitte der Kammer kann an die Größe der Fliegen angepasst werden (die Größe in der Datei passt in der Regel für Weibchen und Männchen).
  2. Nehmen Sie einen Objektträger aus Glas, der als Basis der Kammer dient. Harz und Epoxidharz miteinander mischen. Nehmen Sie die schwarze Acrylkammer und befestigen Sie mit Epoxidkleber Magnete aus Neodym 3 mm x 2 mm an allen vier Ecken. Es wird empfohlen, jeweils einen Magneten zu kleben und ihn mit einer Büroklammer festzuhalten, während der Kleber aushärtet.
  3. Setzen Sie zwei neue Magnete auf jeden der zuvor auf die Kammer geklebten Magneten. Kleben Sie den zuletzt befestigten Magneten mit Epoxidharz auf einen Objektträger und halten Sie ihn mit Büroklammern fest, während Sie kuratieren.
    HINWEIS: Nachdem der Kleber kuratiert wurde, ist die Kammer fertig und es können weitere Magnete hinzugefügt werden, um die Höhe der Kammer für Experimente anzupassen. Die Zusatzakte 4, die Zusatzakte 5 und die Zusatzakte 6 zeigen die zusammengesetzte Aufnahmekammer.

7. In-vivo-Dissektionsprotokoll ohne Anästhesie - (5 - 7 Minuten Arbeitsablauf)

  1. Entfernen Sie die Pipettenspitze p200 aus dem Aspirator. Setzen Sie den Aspirator in das Fläschchen ein und aspirieren Sie eine einzelne Fliege in die Pipettenspitze p1000. Setzen Sie die Pipettenspitze p200 wieder auf den Aspirator auf. Blasen und schnippen Sie vorsichtig mit dem Aspirator, so dass die Fliege an der Oberseite der p200-Pipettenspitze mit dem Kopf voran immobilisiert ist.
  2. Setzen Sie die Sezierkammer auf den Manipulatorhalter. Schließen Sie das Vakuum an den Fly-Halteschlauch an und stellen Sie den Durchflusspegel nach Bedarf ein (~500 mL/min). Verwenden Sie einen Schnellstecker, um das Vakuum einfach und schnell anzuschließen und zu trennen (Abbildung 1A).
  3. Bewegen Sie den Vakuum-Metallschlauch, um ihn beim Blick durch das Mikroskop im Sichtfeld zu zentrieren. Vergewissern Sie sich, dass die Kammer richtig positioniert ist, sodass sie direkt auf den Metallschlauch passt, wenn Sie bereit sind, die Klappe zu verkleben. Saugen Sie den Rüssel der Fliege vorsichtig in den Vakuumhalter an (Abbildung 1A).
  4. Sobald sich die Fliege in der richtigen Position befindet, bewegen Sie den Manipulator so, dass der Kopf der Fliege mit der Kammeröffnung ausgerichtet ist.
  5. Schalten Sie die Gleichstromversorgung ein. Der Strom sollte auf einen Bereich zwischen 0,40 und 0,50 Ampere eingestellt werden. Höhere Ströme können dazu führen, dass die Myristinsäure so weit schmilzt, dass ihre Viskosität zu niedrig wird, was das Risiko erhöht, dass sich der Klebstoff über den Kopf der Fliege ausbreitet.
  6. Mit dem Platinwiderstand kleben Sie die Seiten der Augen und des Thorax mit geschmolzener Myristinsäure an die Kammer (Abbildung 1B). Um zu verhindern, dass Klebstoff auf die Nagelhaut des Kopfes gelangt, verwenden Sie so wenig Kleber wie möglich, insbesondere beim Verkleben der Seiten der Augen.
  7. Sobald die Augen und der Thorax verklebt sind, trennen Sie den Vakuumschlauch und nehmen Sie mit dem Manipulator die Aufnahmekammer vom Vakuumschlauch ab. Drehen Sie die Kammer auf den Kopf und nutzen Sie den Platinwiderstand, um den Rüssel von unten zu verkleben (Abbildung 1C). Das Verkleben der Ösen von unten ist optional und kann helfen, die Fliege während des Präparierens an Ort und Stelle zu halten, ist aber nicht notwendig.
  8. Sobald alles verklebt ist, schalten Sie die Gleichstromversorgung aus, drehen Sie die Kammer aufrecht und befestigen Sie sie an der Glasseite. Schneiden Sie mit einer Schere ein kleines Stück Klebeband ab und kleben Sie es direkt vor und hinter dem Kopf der Fliege an (Abbildung 1D).
  9. Drehen Sie die Kammer so, dass der Kopf bei 90 zum Experimentator zeigt. Machen Sie mit einer Präpariernadel einen vertikalen Schnitt entlang der Seiten der Augen (Abbildung 1E). Drehen Sie die Kammer so, dass sie horizontal aufgestellt ist. Schneiden Sie mit der Präpariernadel quer durch die Nagelhaut (Abbildung 1E).
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das soeben erstellte "Fenster" der Nagelhaut mit der Präpariernadel angehoben werden kann. Wenn sie sich ohne Widerstand anhebt, setzen Sie die Präpariernadel wieder auf ihre Abdeckung. Kochsalzlösung wird in den Schritten 13 und 14 nicht verwendet, um Lichtbrechung zu verhindern, die eine klare Sicht während der Schnitte behindern könnte.
  10. Geben Sie 100 μl Kochsalzlösung auf den Kopf der Fliege (Abbildung 1F). Entfernen Sie das Fenster vorsichtig mit einer scharfen Pinzette (Abbildung 1G). Entfernen Sie mit der scharfen Pinzette vorsichtig das restliche Fett oder die Luftröhre. Das Gehirn sollte jetzt für die Bildgebung bereit sein (Abbildung 1H-1J).

8. Visualisierung der lerninduzierten Plastizität durch aversive olfaktorische Konditionierung (20-minütiger Workflow)

  1. Platzieren Sie die vorbereitete Fliege mit einem konfokalen Mikroskop, das mit einem Laser und einem Wasserimmersionsobjektiv ausgestattet ist, auf dem Tisch des Mikroskops. Verwenden Sie optional eine Kamera mit einem Makroobjektiv, um auf die Fliege zu fokussieren und sicherzustellen, dass die Fliege gesund ist und sich bewegt.
  2. Stellen Sie die Position des Schockgitters/der Geruchspipette mit einem Mikromanipulator so ein, dass die Fliege auf dem Schockgitter sitzt.
    HINWEIS: Die Fliege sollte sich immer noch frei bewegen können, da das Stoßdämpfergitter nur die Beine und leicht den Bauch berührt (die Fliege sollte in der Lage sein, ihre Beine und ihren Bauch aus dem Gitter zu entfernen, wenn sie eingefahren ist). Die Pipette zur Geruchsabgabe sollte auf die Antennen der Fliege gerichtet sein.
  3. Scannen Sie mit dem groben Z-Einstellknopf durch die Z-Achse des Gehirns und lokalisieren Sie die gewünschte Gehirnregion. Passen Sie die Framegröße auf 512 x 512 px an. Die Abtastfrequenz sollte auf die gewünschte Geschwindigkeit eingestellt werden - mit mindestens 2 Hz. Legen Sie abschließend die Dauer der Aufnahme fest.
  4. Beginnen Sie mit der Aufnahme des interessierenden Neurons mit einem speziell angefertigten oder kommerziellen Geruchsabgabesystem und initiieren Sie gleichzeitig eine "Vortrainings"-Geruchsabgabe (Abbildung 2C). Stellen Sie die Aufnahme auf 2 Minuten ein. Die Geruchspräsentation vor dem Training beginnt mit der Aufzeichnung der Reaktionen auf einen ersten Geruchsimpuls (CS-) von 5 Sekunden, gefolgt von einem zweiten Geruchsimpuls von 5 Sekunden (CS+) mit einem Intervall von 30 Sekunden zwischen den Stimuli.
  5. Warten Sie nach dem Sammeln von Antworten vor dem Training 5 Minuten, bevor Sie ein Trainingsprotokoll im Geruchsabgabesystem starten. In diesem Beispiel wurde während der Schulung nur der CS+ vorgestellt. Der CS+-Geruch wird 1 Minute lang angezeigt, beginnend bei 30 s nach dem Auslösen des Geruchsabgabesystems. Der Schockstimulator ist so programmiert, dass er gleichzeitig 12, 90 V Schocks abgibt, während der Geruch präsentiert wird.
  6. Warten Sie nach dem Training 5 oder 15 Minuten, bevor Sie Antworten nach dem Training erhalten. Zeichnen Sie die Reaktionen nach dem Training auf die gleiche Weise auf, wie die Reaktionen vor dem Training in Schritt 6 aufgezeichnet wurden. Speichern Sie alle Dateien im entsprechenden Format für die spätere Bildanalyse.

9. Bildanalyse

  1. Um Aufzeichnungen zu analysieren, zeichnen Sie einen Region of Interest (ROI) um den Bereich des Neurons. Diese sollte so präzise wie möglich sein, um den Einfluss der Hintergrundfluoreszenz zu begrenzen.
  2. Verwenden Sie das Messwerkzeug, um Daten zur mittleren Fluoreszenzintensität innerhalb des ROI für jedes Frame der Aufzeichnung zu extrahieren. Exportieren Sie diese Daten als CSV-Datei.
  3. Öffnen Sie die Daten in MATLAB oder einem anderen Datenanalyseprogramm, um ΔF/Fo-Werte für jede Geruchsspur zu berechnen. Kombinieren Sie die Daten, um die durchschnittlichen ΔF/Fo-Gesamtaufzeichnungen einzelner Fliegen zu erhalten, und erstellen Sie ein Diagramm der mittleren Geruchsreaktionsspuren vor und nach dem Training (Abbildung 2E,F).

Ergebnisse

Hier wird die in vivo Bildgebung von adulten Drosophila ohne Anästhesie verwendet, um die aversive olfaktorische Konditionierung zu untersuchen, die die Plastizität in einem gut charakterisierten Mushroom Body Output Neuron (MBON γ2α'1)12 induziert. Der Calciumindikator GCaMP6f2 wird zusammen mit dem rot fluoreszierenden Protein TdTom in einem MB-Ausgangsneuron exprimiert, dessen Dendriten das Kompartiment der γ- und α'-Lappen innervieren und genetisch auf das MBON γ2α'1 abzielen, wobei die Split-Gal4-Linie MB077C34 verwendet wird (Abbildung 2A,B).

Um die Plastizität nach der aversiven olfaktorischen Konditionierung zu beobachten, wird die Fliege unter das konfokale Mikroskop gelegt, wobei ihr Hinterleib und ihre Beine in der Mitte des Schockgitters ausgerichtet sind und die Pipette der Geruchsabgabe auf die Antenne der Fliege gerichtet ist. Zuerst wurden Calcium-Geruchsreaktionen auf einen 5-s-Puls von 4-Methylcyclohexanol (MCH) aufgezeichnet, gefolgt von einem 5-s-Puls von 3-Octanol (OCT), getrennt durch ein 30-s-Interstimulus-Intervall. Fünf Minuten später wurden die Fliegen durch die gleichzeitige Präsentation eines 1-minütigen OCT-Impulses (CS+) zusammen mit 12, 90-V-Schocks trainiert. Dieser assoziative Konditionierungsplan erzeugt ein robustes verhaltensaversives Gedächtnis. 5 Minuten und 15 Minuten nach der Konditionierung wurden schließlich die Kalziumreaktionen auf MCH und OCT wie vor dem Training aufgezeichnet. MBON γ2α'1 reagiert vor der Konditionierung robust durch Kalziumtransienten sowohl auf MCH als auch auf OCT (Abbildung 2D-F). Nichtsdestotrotz sind die Calciumreaktionen auf CS+ (OCT) in Übereinstimmung mit früheren Befunden12 Minuten nach der Konditionierung vollständig reduziert (Abbildung 2D-F). Zusätzlich wurden die Reaktionen auf die CS- (MCH) signifikant potenziert. Eine Viertelstunde nach dem Training zeigte ähnliche Ergebnisse, da die Kalziumreaktion auf das CS+ signifikant unterdrückt und CS- potenziert wurde. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die bei beiden Gerüchen beobachtete Gedächtnisspur mindestens 15 Minuten anhält (Abbildung 2D-F). Diese Reaktionen wurden anhand der durchschnittlichen Geruchsreaktion während des 5-s-Pulses quantifiziert und innerhalb der Fliege verglichen. Diese Veränderungen der Geruchsreaktionen können auch durch eine Pseudofarbdarstellung der Veränderung der GCaMP6-Fluoreszenz vor und nach dem aversiven Training visualisiert werden (Abbildung 2E). Im Gegensatz dazu zeigt die Betäubung der Fliege während der Präparation eine verminderte Plastizität sowohl für CS+ als auch für CS-. Bei anästhesierten Tieren wird nur eine partielle Depression von CS+ beobachtet, da die Reaktionen nach dem Training noch vorhanden sind. Darüber hinaus unterscheiden sich die CS-Reaktionen nach dem Training nicht signifikant (Abbildung 2G,H). Um dies besser beobachten zu können, berechneten wir die induzierte Plastizität als Verhältnis von CS+/CS- und zeigten, dass nicht-anästhesierte Fliegen im Vergleich zu anästhesierten Tieren eine signifikant erhöhte Plastizität aufweisen (Abbildung 2I). Diese repräsentativen Ergebnisse deuten darauf hin, dass dieses Protokoll für die Untersuchung von Lernen und Gedächtnis unter dem Mikroskop geeignet ist und die Gesundheit der Fliege während der Bildgebung von Neuronen über einen langen Zeitraum sicherstellt. Dieses Protokoll ist vielseitig genug und kann auf andere Arten der In-vivo-Bildgebung und andere Neuronen von Interesse angewendet werden.

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Abbildung 1: In-vivo-Bildgebung von Drosophila ohne Anästhesie. (A) Oberes Bild: Diagramm, das die Schritte der Aspiratorvorbereitung veranschaulicht. Unterseite: Das Diagramm zeigt die Kammer, die während der Fliegenpositionierung in einem Mikromanipulator gehalten wird. Der Rüssel der Fliege wird an der Öffnung von Metallschläuchen platziert, die mit einem Aspirator mit einem Vakuum von 500 mL/min verbunden sind. Anschließend wird die Kammer über der Flyer positioniert. (B) Die Seiten der Augen und des Thorax werden mit Myristinsäure unter Verwendung eines speziell angefertigten Platinwiderstands verklebt. (C) Der Rüssel der Fliege wird aus dem Metallrohr entfernt und die Kammer wird umgedreht, damit der Rüssel an Ort und Stelle geklebt werden kann, wodurch die Bewegung während der Aufnahme minimiert wird. (D) Die Kammer ist an einem Glasschiebeboden befestigt. Das Klebeband wird an der Oberseite der Kammer, die die Antennen abdeckt, und an der Rückseite angebracht, um ein Auslaufen von Kochsalzlösung zu verhindern. (E) Zwei vertikale Schnitte werden entlang der Kutikula in der Nähe der Facettenaugen gemacht, gefolgt von einem dritten Schnitt durch die Nagelhaut in der Nähe des Thorax, wodurch ein "Fenster" zum Gehirn entsteht. (F) Zwischen 100 und 200 μl Kochsalzlösung werden dem Kopf der Fliege an der Stelle der Schnitte zugesetzt. (G) Das Nagelhautfenster wird mit einer scharfen, feinen Pinzette angehoben, gezogen und gelöst, um das Gehirn freizulegen. (H) Fett und Luftröhrengewebe werden entfernt, um eine klare Visualisierung der Gehirnzellen unter dem Mikroskop zu ermöglichen. (I) Die präparierte Fliege wird unter das Mikroskop gelegt und so positioniert, dass ihr Körper auf dem Schockgitter ausgerichtet ist. (J) Pseudo-Farbbild, das das Expressionsmuster von MBON γ2α′1 zeigt. Der interessierende Bereich ist mit einer gestrichelten Linie umrandet, die den dendritischen Dorn umgibt. Maßstab: 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Lerninduzierte Plastizität in MBON γ2α′1 nach aversiver olfaktorischer Konditionierung. (A) Expressionsmuster des MB077C-splitGal4-Treibers, der GCaMP exprimiert. Die Gehirne wurden präpariert und mit Anti-GFP gefärbt und mit Anti-nc82 gegengefärbt. Maßstabsbalken: 50 μm. (B) Pseudofarbbild von MBON γ2α′1, das den Zellkörper, den Verlängerungsprozess und den dendritischen Dorn hervorhebt. Die dendritische Region stellt den Bereich dar, aus dem die Kalziumreaktionen gesammelt wurden. Maßstabsbalken: 50 μm. (C) Schematische Darstellung des aversiven Trainingsprotokolls. Die Fliegen wurden 5-s-Impulsen von MCH und OCT mit 30 s sauberer Luft dazwischen ausgesetzt. Nach einem 5-minütigen Intervall wurden die Fliegen darauf trainiert, OCT mit zwölf 90-V-Elektroschocks zu assoziieren. Aufzeichnungen der Kalziumreaktionen auf MCH und OCT wurden 5 Minuten und 15 Minuten nach dem Training durchgeführt. (D) Die Spuren der Geruchsreaktion auf MCH (oberes Feld) und OCT (unteres Feld) werden vor dem Training und 5 Minuten und 15 Minuten nach dem Training gezeigt. Dicke schwarze Balken zeigen den Zeitpunkt der Geruchsbildung an. (E) Pseudofarbenbilder des dendritischen Dorns von MBON γ2α′1 vor dem Training und 5 min und 15 min nach dem Training, als Reaktion auf MCH und OCT. Die Potenzierung der Fluoreszenz wird für den CS- (MCH) beobachtet, während die Fluoreszenz für den CS+ (OCT) aufgehoben ist. Skalenbalken: 20 μm. (F) Die mittlere Geruchsreaktion auf MCH ist 5 min und 15 min nach dem Training signifikant potenziert, während die Reaktionen auf OCT (CS+) signifikant unterdrückt werden. Nichtparametrischer Wilcoxon-Paartest, N = 12. (G) Geruchsreaktionsspuren zu MCH (oberes Bild) und OCT (unteres Bild) sind für anästhesierte Fliegen vor und 5 Minuten nach dem Training dargestellt. Dicke schwarze Balken zeigen die Geruchsabgabe an. (H) Bei anästhesierten Tieren zeigen die mittleren Geruchsreaktionen auf MCH nach dem Training keine signifikante Potenzierung, und die Reaktionen auf OCT zeigen im Vergleich zu nicht anästhesierten Tieren nur eine teilweise Suppression. (I) Die trainingsinduzierte Plastizität, berechnet als CS+/CS-Verhältnis, ist bei anästhesierten Fliegen signifikant geringer als bei solchen, die ohne Anästhesie hergestellt wurden. Nichtparametrischer Wilcoxon-Paartest, N = 8-12. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Akte 1: Grid_holder (STL). STL-Datei der kundenspezifischen Komponente, die zur Aufnahme des Stromnetzes verwendet wird. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Zusatzdatei 2: Grid_holder (OBJ). OBJ-Datei der kundenspezifischen Komponente, die zur Aufnahme des Stromnetzes verwendet wird. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Zusatzdatei 3: Chamber_LaserCut. Adobe Illustrator-Datei, die zum Laserschneiden der oberen Komponente der Aufnahmekammern für männliche und weibliche Fliegen verwendet wird. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Zusatzdatei 4: Recording_chamber (SEAF). STL-Datei der speziell entwickelten Aufnahmekammer. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Zusatzdatei 5: Recording_chamber (OBJ). OBJ-Datei der speziell entwickelten Aufnahmekammer. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Zusatzakte 6: Recording_chamber_animation. MP4-Video, das eine Animation der zusammengebauten Aufnahmekammer zeigt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Das Verständnis der neuronalen Schaltkreise hinter Lernen und Gedächtnis ist ein zentrales Ziel im Bereich der Neurowissenschaften. Das in Drosophila verfügbare genetische Toolkit, kombiniert mit der Einfachheit und Vielseitigkeit von Verhaltenstests, macht es zu einem idealen Modellorganismus für die Untersuchung dieser Prozesse. Veröffentlichte Studien aus verschiedenen Labors haben unterschiedliche Protokolle zur Vorbereitung von Fliegen auf die funktionelle Bildgebung ohne Anästhesie beschrieben44,45. Diese Protokolle sind jedoch sehr unterschiedlich und stützen sich oft auf hochspezialisierte, maßgeschneiderte Tools mit begrenzten Anleitungen, wie sie erstellt oder verwendet werden können. In diesem Protokoll wird ein Verfahren zur Durchführung einer funktionellen In-vivo-Bildgebung bei Fliegen vorgestellt, das die verwirrenden Effekte der Vollnarkose vermeidet. Darüber hinaus ermöglicht dieser Ansatz die Erfassung der neuronalen Aktivität in Echtzeit innerhalb derselben Fliege, was einen direkten Vergleich der neuronalen Reaktionen vor und nach der Exposition gegenüber verschiedenen Reizen ermöglicht.

Zu den kritischen Schritten beim Ausfüllen dieses Protokolls gehört die Sicherstellung, dass der Rüssel der Fliege richtig in den Vakuumschlauch eingesetzt wird. Dieser Schritt stellt sicher, dass das anschließende Kleben an den richtigen Stellen erfolgt, und stellt sicher, dass sich der Kopf im richtigen Winkel befindet, um die interessierenden Neuronen zu visualisieren. Ein minimaler Klebstoffauftrag ist unerlässlich, um die Gesundheit der Fliegen zu erhalten. Es ist ideal, die kleinste Menge zu verwenden, die erforderlich ist, um das Außenzelt an Ort und Stelle zu sichern. Dieses Protokoll ermöglicht auch einige Modifikationen, um spezifischen Bedürfnissen gerecht zu werden, wie z. B. nur die Seiten der Augen zu kleben, damit der gesamte Körper frei ist. In ähnlicher Weise kann eine Perfusionskammer an der Oberseite der Aufnahmekammer angebracht werden, um die Ringerperfusion oder die Wirkstoffabgabe zu erleichtern. Schließlich kann ein rotierendes schwebendes Laufband, wie bereits berichtet, unterhalb der Fliege platziert werden, was die Analyse der Bewegungsrichtungermöglicht 46,47.

Dieses Protokoll weist einige Einschränkungen auf, einschließlich des Stresses, dem die Fliegen während der Mikrochirurgie ausgesetzt sind, um die Fliegen auf die Live-Bildgebung vorzubereiten. Der Umgang mit den kleinen Fliegen, das sparsame Auftragen von Klebstoff und das vorsichtige Öffnen der Kopfkapsel, ohne Hirngewebe oder Körper zu beschädigen, erfordert viel Fachwissen, das nur durch akribisches Üben und Wiederholen erworben werden kann. Während diese Methode besonders vorteilhaft für die Untersuchung kognitiver Prozesse auf zellulärer Ebene ist, hat die In-vivo-Bildgebung im Vergleich zu elektrophysiologischen Aufzeichnungen noch einige Einschränkungen. Darüber hinaus vermeidet unser Protokoll zwar die Verwendung einer Anästhesie vor der Bildgebung, aber die Fliege ist immer noch an eine physische Kammer gebunden, die die zellulären Reaktionen immer verändern kann. Nichtsdestotrotz bietet unsere Methodik den besten Weg, um die Gesundheit der Fliege für eine optimale In-vivo-Bildgebung zu erhalten. Im Vergleich zu bestehenden Methoden, die eine Anästhesie verwenden und die Fliege einschränken, zielt unsere Methode darauf ab, die Fliege so frei wie möglich zu bewegen und gleichzeitig in der Lage zu sein, Bilder von Zellen mit minimaler Bewegung zu machen.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde vom National Institute for General Medical Science für 1R01GM147917-01A1 und der Brain and Behavior Research Foundation für 30442 unterstützt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,102 mm PlatindrahtSurepure Chemetals2690
0,25 AD, 0,125 ID, platingehärteter SilikonschlauchVWR89068-474
0,3 mm ID Silikonschlauch Fisher Scientific11-189-14
BananensteckerAmazon
Schwarze Acrylplatte für Kammer 0,0125 ZollPrecision Brand44250
CalciumchloridSigma-Aldrich746495
Kupfer-StoßgitterMaßgeschneidertes
Gleichstromnetzteil für PlatinwiderstandFisher ScientificS35740
Dremel Werkzeug 3000-1Dremel3000-N/18
Drosophila melanogaster / ;; uas-tdtomBDSC36328
Drosophila melanogaster / ; UAS-GCAMP6F;BDSC42747Diese UAS-Linie wurde kombiniert mit ;; uas-td-tom zur Erzeugung eines Bestands, der beide Insertionen
enthält Drosophila melanogaster/ ;; MB077C-gal4BDSC68287
Epoxid-Kleber  Gorilla4200102
Gas-Durchflussmesser 1,5 LPMAmazonB01N0UWZ2T
Glas 1 mL serologische PipetteFisher Scientific50-232-9516
ObjektträgerFisher Scientific 12-550-A3
GlukoseSigma-AldrichG7528
HEPESSigma-AldrichH4034
Injektionsschlauch 12TW GaugeMicrogroup316H12TW
Underdermic 22X Gauge SchlauchMicrogroup304H22X
Magnesiumchlorid HexahydratSigma-AldrichM9272
MyristinsäureAcros Organics156961000
Neodym-Magnete 3X2 mmAmazonB0CXSQ387M
P1000 SpitzenGenesee Scientific 23-165RL
P200 SpitzenGenesee Scientific 23-150RL
Pneumatischer Steckanschluss 6mm ADAmazonB07ZHG8Y1Y
KaliumchloridSigma-AldrichP3911
PTFE-Schlauch 6mm ADAmazon
Rasierklingen AmazonB08LYD6645
NatriumbicarbonatSigma-AldrichS5761
NatriumchloridFisher ScientificS271-500
Natriumphosphat DibasischSigma-AldrichS0876
SaccharoseSigma-AldrichS9378
TrehaloseSigma-AldrichT0167

Referenzen

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