Röntgenvisualisierung einer intraduktalen ethanolbasierten ablativen Infusion zur Prävention von Brustkrebs in Kaninchenmodellen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll stellt ein Verfahren zur bildgesteuerten Infusion in das duktale Baumsystem der Milchdrüse des Kaninchens vor. Wir demonstrieren die kontrollierte Infusion einer Röntgenkontrastmittel-haltigen ethanolbasierten ablativen Lösung in alle Zitzenöffnungen mittels Fluoroskopie-Echtzeitbildgebung.

Zusammenfassung

Brustkrebs ist die zweithäufigste krebsbedingte Todesursache bei Frauen. Während es nur wenige proaktive Interventionen für Frauen mit durchschnittlichem Risiko gibt, ist die prophylaktische Mastektomie die effektivste und risikoreduzierendste Intervention für Frauen mit hohem Risiko. Die prophylaktische Mastektomie ist jedoch ein invasiver Eingriff, bei dem alle Brustepithelzellen zusammen mit dem umgebenden Stroma, Fettgewebe und/oder der Muskulatur entfernt werden. Unser übergeordnetes Forschungsziel ist es, ein nicht-invasives intraduktales (ID) Verabreichungsverfahren zu entwickeln, das die Brustepithelzellen lokal abtötet, indem der gesamte duktale Baum mit einer ablativen Lösung gefüllt wird. Wir haben bereits gezeigt, dass die ID-Abgabe von Ethanol als ablative Lösung in Nagetiermodellen (Mäusen und Ratten) wirksam ist. Dieses Protokoll stellt eine ID-Abgabe von 10-70%iger Ethanollösung, die Iohexol (90-300 mg/ml) als Röntgenkontrastmittel enthält, in das multiduktale Baumsystem der Milchdrüse des Kaninchens dar. Die Brustdrüse eines Kaninchens (Oryctolagus cuniculus) mit einem Mehrkanalsystem ähnelt der menschlichen Brust mehr als die anderer großer Tiere (z. B. Kühe, Schafe). Dieses Kaninchenprotokoll adressiert die technischen Herausforderungen der Skalierbarkeit, der Echtzeit-Bildgebung und der ID-Lieferung in ein multiduktales Baumsystem in einem Großtier-Zwischenmodell. Dieses Protokoll etabliert eine fluoroskopiegesteuerte Mehrkanal-ID-Abgabe mit Instrumenten, Materialien und Reagenzien, die direkt in der Klinik angewendet werden können. Die Gewebeanalyse ermöglicht die Optimierung der Ethanolkonzentration für eine maximale Epithelablation und minimale kollaterale Gewebeschäden als Ausgangspunkt für die zukünftige First-in-Human-Evaluierung dieses ablativen Verfahrens zur Primärprävention von Brustkrebs.

Einleitung

Brustkrebs (BC) ist der häufigste und der zweithäufigste krebsbedingte Todesfall bei Frauen in den Vereinigten Staaten. Prognosen für 2025 gehen davon aus, dass es 316.950 neue Brustkrebserkrankungen geben wird und 42.170 Frauen an BC¹ sterben werden. Derzeit ist die bilaterale prophylaktische Mastektomie das effektivste Verfahren zur Vorbeugung von BC. Dabei handelt es sich jedoch um einen hochinvasiven Eingriff, bei dem die Epithelzellen, aus denen das Mammakarzinom entsteht, und das umliegende Gewebe vollständig entfernt werden. Aufgrund seiner Invasivität sowie der psychologischen und sozialen Auswirkungen dieses Verfahrens unterziehen sich weniger als 50 % der Hochrisikofrauen einer risikoreduzierenden Mastektomie². Wir und andere haben intraduktale (ID) Verabreichungsverfahren für die Primärprävention und/oder lokale Behandlung von Brustkrebs in Nagetiermodellen^{entwickelt 2,3} als Alternative zu den derzeitigen Präventionen und Behandlungen. Ethanol (EtOH) hat ein niedriges Toxizitäts- und Sicherheitsprofil, das gut etabliert ist und in mehreren klinischen Anwendungen eingesetzt wird, z. B. als Sklerosierungsmittel zur Behandlung venöser Fehlbildungen und als Ablativum zur lokalen Behandlung einiger Krebsarten³. In der Regel werden bei diesen klinischen Verfahren mehrere Milliliter EtOH infundiert oder in einer Konzentration von 90-100 % verabreicht. In unserer früheren Arbeit war die Verabreichung von 70% EtOH direkt in das duktale Baumsystem von Maus- und Rattenmodellen wirksam bei der chemischen Ablation von Brustepithelzellen mit begrenzter Schädigung des angrenzenden normalen Gewebes und bei der Verhinderung der Bildung von Brusttumoren 4,5,6,7. Da dieses Verfahren auf das größere duktale Baumsystem eines Kaninchens mit einem größeren Verhältnis von luminalem Volumen zu luminaler Epithelzelloberfläche hochskaliert wird, untersuchen wir die ablativen Eigenschaften einer Lösung mit einem geringeren Anteil an EtOH (10% bis 70%). Mit Blick auf die klinische Umsetzung kommen wir zu dem Schluss, dass der niedrigste Prozentsatz an Ethanol, der bei der Ablation von Epithelzellen wirksam ist, am besten verträglich ist und das beste Sicherheitsprofil aufweist.

Die Bestätigung einer vollständigen duktalen Baumfüllung ist erforderlich, um sicherzustellen, dass die ablative Lösung in direkten Kontakt mit Brustepithelzellen gekommen ist. In unseren früheren Studien an Nagetiermodellen wurde nach dem Eingriff eine Röntgenvisualisierung von infundierten duktalen Bäumen mittels microCT-Bildgebung verwendet. Aufgrund der erforderlichen Zeitspanne für die Anästhesie, den Transfer, das Fixieren und die Positionierung des Tieres für die Bildgebung waren das von der FDA zugelassene Omnipaque (Iohexol) oder ähnliche jodhaltige, schnell diffundierende Kontrastmittel nicht für die duktale Baumvisualisierung bei Nagetieren geeignet ^6,8. Wir fanden heraus, dass Nanopartikel-basierte Kontrastmittel, insbesondere solche, die Tantaloxid-Nanokristalle enthalten, langsamer diffundieren und besser für die Visualisierung von duktalen Bäumen bei Nagetieren geeignet sind 6,7,8,9. Diese nachträgliche Bestätigung durch die MikroCT-Bildgebung erlaubt es uns jedoch nicht, die Menge des infundierten Volumens zu überwachen oder zu kontrollieren und weicht von klinisch etablierten diagnostischen Verfahren, wie z.B. der Duktographie^10,11, für die Visualisierung des duktalen Baumes ab. Ein wichtiger Schritt zur Etablierung der technischen Machbarkeit der Übertragung dieses ID-Verfahrens auf den Menschen besteht daher darin, die Echtzeit-Fluoroskopie-Visualisierung des infundierten duktalen Baums in einem Tiermodell mit zunehmender Größe und Komplexität seiner Brustdrüsen zu demonstrieren. Dieses Protokoll skaliert dieses ablative Verfahren von Nagetieren ^4,5 auf Kaninchenmodelle. Evolutionär, anatomisch und physiologisch sind die Brustdrüsen von Kaninchen den menschlichen Brüsten ähnlicher als denen von Nagetieren oder anderen Großtiermodellen wie Kühen und Schafen 12,13,14. Weibliche Kaninchen haben vier Paare von Milchdrüsen mit jeweils vier duktalen Bäumen, während Nagetiere nur einen duktalen Baum pro Milchdrüse haben. Kaninchensauger können mit einem Verfahren kanüliert werden^15,16, das der ID-Verabreichung von Kontrastmittel in der klinischen Duktographie in der ersten klinischen Forschung am Menschen ähnelt. Daher stellen Kaninchen ein praktisches und relevantes intermediäres Großtiermodell für die translationale Anwendung dieses ID-ablativen Verfahrens beim Menschen dar. Dieses Protokoll adressiert technische Herausforderungen bei der ID-Übermittlung und der In-vivo-Bildgebung eines multiduktalen Baumsystems, die in Nagetiermodellen nicht hätten berücksichtigt werden können. Dieses Protokoll verwendet Instrumente, Reagenzien und Materialien, die mit der aktuellen klinischen Praxis für die Visualisierung von duktalen Bäumen kompatibel sind. Somit könnte das beschriebene Verfahren zur fluoroskopiegesteuerten Infusion von iohexolhaltiger ethanolbasierter ablativer Lösung ohne weiteres implementiert und in klinischen Studien am Menschen evaluiert werden.

Diese Methode wurde in unserem Labor implementiert, um bei einem Kaninchen in einer einzigen Sitzung alle vier duktalen Bäume einer oder mehrerer Brustdrüsen erfolgreich zu kanülieren und sequentiell mit einer ablativen Lösung auf Ethanolbasis zu infundieren, die ein Kontrastmittel enthält (Abbildung 1, Abbildung 2, Abbildung 3). Bei dieser Methode wird die ablative Lösung mit einer 27 G stumpfen Nadel eines Kaninchens (4 Monate jungfräulich) auf einem Durchleuchtungstisch direkt in die kanülierte Zitzenöffnung infundiert. Dieses Verfahren wird an einem Tier unter Vollnarkose (Isofluran) mit entzündungshemmender Behandlung während und nach dem Eingriff (Ketoprofen, nichtsteroidales entzündungshemmendes Medikament) durchgeführt. Die Fluoroskopie-Bildgebung ermöglicht es uns, die Füllung des duktalen Baumes in Echtzeit zu überwachen, die Geschwindigkeit und Menge des abgegebenen Volumens zu kontrollieren und/oder zu bestimmen, wie erfolgreich die ID-Abgabe in jedem einzelnen Baumsystem ist (Abbildungen 1, Abbildung 2, Abbildung 3). Diese Fluoroskopietechnik kommt der beabsichtigten klinischen Anwendung für die Bildführung der ablativen Behandlung näher und kann dazu beitragen, die dem Patienten auferlegte Gesamtstrahlendosis zu begrenzen. Dieses Protokoll zeigt, dass das von der FDA zugelassene Omnipaque (Iohexol) ein geeignetes Kontrastmittel ist, um die anfängliche Füllung des Kaninchen-Milchbaums sichtbar zu machen (Abbildung 3). Beobachtungen durch grobe Untersuchung und histologische Analyse zeigen, dass eine Ethanolkonzentration von 70 % eine schnelle Gewebeschädigung innerhalb und außerhalb des duktalen Baumes und über die Brustdrüsenstruktur hinaus verursacht (Abbildung 3). Eine Ethanolkonzentration im Bereich von 10-40 % bietet eine adäquate Epithelablation mit geringerer Kollateralgewebeschädigung als 70 % Ethanol (Abbildung 4). Längsschnittstudien unter Verwendung dieses Verfahrens mit einer entsprechend aussagekräftigen Gruppengröße pro ablativer Lösung und zeitgesteuerten Gewebeentnahmen sind erforderlich, um optimale Parameter der ablativen Lösung für ihre klinische Bewertung an menschlichen Patienten zu ermitteln.

Protokoll

Alle beschriebenen Versuche wurden im Rahmen von Protokollen durchgeführt, die vom Institutional Animal Care and Use Committee an der Michigan State University genehmigt wurden. Kaninchen (Oryctolagus cuniculus) wurden in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren und dem USDA Animal Welfare Act in einer AAALAC-akkreditierten Einrichtung gepflegt.

HINWEIS: Diese Methode wurde an jungfräulichen (nulliparen) und pensionierten Züchtern (mehrgebären) neuseeländischen weißen Tieren im Alter (4 Monate bis > 1 Jahr) und Gewicht (2,6 bis 4,2 kg) durchgeführt, die aus kommerziellen Quellen erworben wurden. Unserer Erfahrung nach ist die Größe des Tieres, die durch das Gewicht bestimmt wird, zuverlässiger als das Alter des Tieres, um die Größe der Zitzen vorherzusagen. In der Regel weisen Tiere, die mehr als 3,3 kg wiegen, geeignete Zitzen für die Kanülierung auf. Das unten beschriebene Protokoll konzentriert sich auf jungfräuliche Tiere im Alter von 4-5 Monaten und einem Gewicht von mehr als 3,3 kg, da sie für Langzeitstudien zur Wirksamkeit, Wundheilung, Toxizität und Sicherheit besser geeignet sind.

1. Präoperative Vorbereitung

1. Akklimatisierung der Tiere in der neuen Einrichtung für mindestens 1 Woche nach der Ankunft, insbesondere für Tiere, die für Genesungsverfahren und Langzeitstudien bestimmt sind. Überwachen/kontrollieren Sie die Kaninchen in dieser ersten Woche täglich und geben Sie ihnen Leckerlis, eine Nährstoffanreicherung, wie von den institutionellen Richtlinien empfohlen, um den Eingewöhnungsprozess zu unterstützen.
2. Erwerben Sie das Kaninchen (~ 4 Monate altes New Zealand White) aus der zugelassenen Haltungseinrichtung. Notieren Sie vor dem Eingriff das Körpergewicht.
   HINWEIS: Das Körpergewicht kann am Tag vor dem Eingriff aufgezeichnet werden, um die erforderlichen Berechnungen für die Anästhesie vorzubereiten. Pensionierte Züchter (> 1 Jahr > 3,5 kg) können ebenfalls verwendet werden, da sie größere Zitzen haben und eine einfachere Kanülierung einzelner Kanäle ermöglichen (Abbildung 3). Aus diesen Gründen können pensionierte Züchter in ersten Versuchen eingesetzt werden, um sich mit dem intraduktalen Verfahren vertraut zu machen und es zu optimieren.
3. Injizieren Sie 35 mg/kg Ketamin und 5 mg/kg Xylazin intramuskulär 20 Minuten vor der Verabreichung von Isofluran, um das Tier zu sedieren.
   HINWEIS: Die Anästhesie wird basierend auf dem Gewicht des Kaninchens verabreicht und die Bereiche für jedes Medikament sind wie folgt: 15-35 mg/kg für Ketamin und 2-5 mg/kg für Xylazin. Stellen Sie sicher, dass das Tier sediert ist, bevor Sie mit der Haarentfernung und Intubation fortfahren. Dies dient dem Wohlergehen und der Sicherheit der Tiere und des Personals. Nach Bestätigung der Sedierung kann das Kaninchen dann dorsal auf den Bildgebungs-/Operationstisch gelegt werden.
4. Injizieren Sie 5 mg/kg Ketoprofen subkutan zur Analgesie, nachdem klinische Anzeichen einer Sedierung gezeigt wurden (d. h. ruhiges Auftreten und teilweise geschlossene und rosa gefärbte Augen).
   HINWEIS: Die Analgesie wird basierend auf dem Gewicht des Kaninchens verabreicht und der Bereich für Ketoprofen liegt bei 2-5 mg/kg.
5. Intubieren Sie das Kaninchen mit der entsprechenden Ausrüstung (z. B. Endotrachealtubus oder supraglottisches Atemwegsgerät) und schließen Sie es an ein Isoflurangerät (1-2 % Isofluran, 1,0 l/min Sauerstoff) an, das ausreichend getestet und zertifiziert wurde, um das Kaninchen zu betäuben. Überwachen Sie die Atmung des Tieres sorgfältig, um sicherzustellen, dass die Anästhesie bei 1-2 % Isofluran gehalten wird. Überwachen Sie das Kaninchen während des gesamten Eingriffs auf Sauerstoffsättigung über SpO₂, Herzfrequenz, Atemfrequenz und Temperatur.
   HINWEIS: Die Größe des Intubationsschlauchs richtet sich nach dem Gewicht und der Größe des Kaninchens. Der Größenbereich ist jedoch nicht immer genau, daher ist es hilfreich, eine Vielzahl von Größen zu haben, um zu sehen, welche am besten zu diesem bestimmten Kaninchen passt. Eine Nasenkonusmaske kann auch anstelle eines Endotrachealtubus zu Anästhesiezwecken¹⁷ verwendet werden, wobei zu beachten ist, dass diese Maske keinen Schutz der Atemwege des Tieres bietet, der durch die Intubation gewährleistet wird. 37 °C eingestellte Warmwasser-Zirkulationsdecken (Wärmedecken) werden unter Handtücher gelegt, um die Körpertemperatur des Kaninchens zu halten.
6. Legen Sie einen 25-G-Venenkatheter in die marginale Ohrvene und befestigen Sie ihn, um eine Notfallverabreichung des Medikaments zu ermöglichen.
   HINWEIS: Je nach Größe der Kaninchenvene kann ein Messbereich von 24 bis 26 verwendet werden.
7. Tragen Sie Augenschmiermittel auf beide Augen auf, um Augenreizungen und Hornhautaustrocknung zu vermeiden.
8. Rasieren Sie das Fell um das zweite und dritte Saugerpaar mit einem Elektrorasierer. Verwenden Sie einen Applikator mit Wattespitze, um die Haarentfernungscreme auf den Saugerbereich aufzutragen. Lassen Sie die Creme 15 s lang mit der Stelle in Kontakt kommen.
   HINWEIS: Es ist äußerste Vorsicht geboten, um keine Zitzen mit dem Rasierer zu beschädigen. Ein kabelloser Staubsauger kann auch verwendet werden, um einen sauberen Eingriffsbereich zu erhalten.
9. Befeuchten Sie ein Mullkissen mit steriler Kochsalzlösung und verwenden Sie es, um die Creme abzuspülen und das Fell des Tieres nach 15 s Anwendung der Haarentfernungscreme zu lösen. Vergewissern Sie sich für eine gute Sicht und einen guten Zugang zu dem Bereich des Saugers, aus dem das Fell entfernt wurde. Wiederholen Sie den Vorgang bei Bedarf.
   HINWEIS: Die Creme sollte so kurz wie möglich zwischen 10 und 30 s auf dem Kaninchen verbleiben und vollständig entfernt werden, um Verätzungen auf der Haut zu vermeiden.

2. Intraduktale Infusion

1. Bereiten Sie eine ablative Lösung her, indem Sie geeignete Volumina aus Stammlösungen unter sterilen Bedingungen in einer BSL2-Gewebekulturhaube mischen.
   HINWEIS: Iohexol (350 mg Jod/ml) sollte aufgrund der Lichtempfindlichkeit an einem dunklen Ort gelagert werden. Während dieses Experiments wurde eine Reihe von EtOH-Konzentrationen verwendet. Um andere Prozentsätze von EtOH zu testen, verdünnen Sie die Stammlösungen auf die erforderliche Konzentration der ablativen Lösung. Um die gleiche Jodkonzentration in einer ablativen Lösung mit unterschiedlichen Anteilen an EtOH aufrechtzuerhalten, kann PBS oder steriles Wasser verwendet werden, um die Volumendifferenz aufzufüllen.
2. Bereiten Sie für dieses Beispiel eine frische ablative Lösung aus 10 % EtOH, 280 mg Jod/ml Iohexol und 1 % Lebensmittelfarbstoff in einer 5-ml-Tube vor. Für ein Endvolumen von 5 ml fügen Sie 4 ml Iohexol-Stamm (350 mg Jod/ml), 500 μl 100 % EtOH (200 Proof), 450 μl PBS und 50 μl blaue Lebensmittelfarbe hinzu.
   HINWEIS: Jeder duktale Baum kann mit bis zu 400 μl gefüllt werden, in der Regel jedoch mit 250-350 μl für Tiere unter 3,5 kg. Anstelle von Lebensmittelfarbe kann Evans Blue bis zu 0,2 % verwendet werden. Evans Blue kann eine bevorzugte Option sein, wenn Ganztier- oder andere Gewebeanalysen unmittelbar nach der Infusion(en) durchgeführt werden sollen.
3. Entfernen Sie abgestorbene Hautschüppchen, die die Kanalöffnungen bedecken, mit einer feinen spitzen Pinzette.
   HINWEIS: Kaninchen können einen keratinisierten Pfropfen haben, der aus dem Sauger herausragt und eine erfolgreiche Kanülierung verhindern kann, wenn er nicht entfernt wird. Topisches Lidocain kann auch um den Sauger herum aufgetragen werden, um die Reizung an der Injektionsstelle zu minimieren (Tabelle 1).
4. Wischen Sie die Infusionsstelle mit Chlorhexidin-Mullpads ab.
   HINWEIS: Chlorhexidin wird als Reinigungsmittel zur Desinfektion der Injektionsstelle vor der Kanülierung verwendet (Tabelle 1).
5. Führen Sie die Fase einer 28-G-Nadel (Länge: 12,7 mm) in die Seite des Saugers ein und injizieren Sie langsam 200 μl 0,9 % Kochsalzlösung mit einer Geschwindigkeit von 200 μl/min. Dies ermöglicht eine bessere Visualisierung der duktalen Öffnungen.
   HINWEIS: Möglicherweise müssen nicht alle 200 μl Kochsalzlösung in den Sauger injiziert werden. Stoppen Sie die Injektion, sobald Sie sehen, dass die Kochsalzlösung aus einer oder mehreren Duktusöffnungen austritt.
6. Aspirieren Sie 1 ml der vorbereiteten ablativen Lösung mit einer 1 ml-Luer-Lock-Spritze. Befestigen Sie die Spritze am weiblichen, "geflügelten" Ende der 12-Zoll-Verlängerungsleitung zwischen Mann und Buchse. Befestigen Sie vorsichtig eine 27 G stumpfe Nadel (Länge: 12,7 mm) am männlichen Ende der Verlängerungslinie. Grundieren Sie die Linie mit der Lösung. Wischen Sie die Nadel mit einem Alkohol-Mullpad sauber. Achten Sie auch darauf, die Spritze nicht mit der ablativen Lösung zu befüllen, da sich dadurch Luftblasen bilden können.
   HINWEIS: Dies sind empfohlene Volumina, die darauf abzielen, den/die duktalen Baum(e) vollständig zu füllen: bis zu 300 μl in jedem Baum und bis zu 1,2 ml pro Gebärmutterhals- und/oder Leistendrüsen (1^{. und 4.} Paar), bis zu 400 μl in jedem Baum und bis zu 1,6 ml pro Brust- und/oder Bauchdrüsen (2^{. und 3. Paar).} Für andere Anwendungen kann es sinnvoll sein, kleinere oder größere Volumina zu verwenden, basierend auf experimentellen Anforderungen und/oder Fluoroskopie-Anleitungen, um eine Überfüllung des Duktalbaums zu vermeiden. Die Verlängerungsleitung ermöglicht eine bessere Kontrolle der Flussrate und die gleichzeitige Infusion und Live-Fluoroskopie-Bildgebung. Zum Vergleich betragen die empfohlenen Volumina der intraduktalen Infusion im Alter von 9 bis 12 Wochen bei Mausmodellen⁴: bis zu 30 μl in Gebärmutterhals- und Leistendrüsen und bis zu 50 μl in Brust- und Bauchdrüsen, und Rattenmodelle⁵: bis zu 100 μl bei Gebärmutterhals- und Leistendrüsen und bis zu 300 μl bei Brust- und Bauchdrüsen.
7. Verwenden Sie eine 10-fache Vergrößerungslampe, um die Kanalöffnungen zu lokalisieren. Halten Sie den Sauger vorsichtig mit den Fingern fest und kanülieren Sie die Nadel in die Kanalöffnung. Führen Sie die 27 g stumpfe Nadel vorsichtig weiter ein, bis die Spitze vollständig im Sauger ist. Um die Nadel in den Sauger zu stecken, führe den Sauger nach oben zur Nadel, anstatt die Nadel nach unten in den Sauger zu schieben. Achten Sie darauf, dem Verlauf der Kanalöffnung zu folgen.
   HINWEIS: Bei einigen Kaninchen kann es zu einem Widerstand kommen, wenn Sie versuchen, die Nadel in die Zitzenöffnung(en) einzuführen. Üben Sie vorsichtig leichten Druck aus, um die oberste Epithelzellschicht zu durchbrechen. Nach unserer Erfahrung ist eine Vergrößerungsvorrichtung erforderlich, um die duktale Öffnung für die Kanülierung eindeutig zu identifizieren. Dabei kann es sich um eine Lupenlampe, ein Objektiv, eine Lupe oder ein ähnliches Gerät handeln.
8. Ziehen Sie langsam 300 μl der Lösung mit einer konstanten Geschwindigkeit von ca. 200 μl/min ein, sobald die Nadel vollständig eingeführt ist. Warten Sie 30 s nach der Infusion, um die Nadel vom kanülierten Baum zu entfernen; Dadurch wird sichergestellt, dass das injizierte Volumen im duktalen Baum verbleibt, und die Wahrscheinlichkeit einer Leckage verringert.
   HINWEIS: In der Regel gibt es einen Forscher, der die Nadel kanüliert und hält, während ein zweiter Forscher die Spritze hält und den Kolben mit der gewünschten Geschwindigkeit drückt. Eine Spritzenpumpe kann verwendet werden, um eine kontrolliertere Durchflussrate zu erreichen, da abrupte Änderungen der Infusionsrate die Kanalbäume platzen oder beschädigen können.
9. Reinigen Sie verschüttete Lösung mit angefeuchteter Gaze oder einem EtOH-Tuch, um Fremdkontrastlösung auf Bildern zu vermeiden.

3. Fluoroskopie-Bildgebung

1. Machen Sie Durchleuchtungsbilder, nachdem jeder Duktalbaum infundiert wurde. Die Parameter der Durchleuchtung sind: 30 fps, 67 kV und 17,3 mA auf einem Durchleuchtungs-Röntgengerät. Passen Sie diese jedoch je nach Experiment und Bildgebungsanforderungen an.
2. Verwenden Sie die Durchleuchtungsbilder, um festzustellen, ob zusätzliches Volumen erforderlich ist, um den Ductalbaum vollständig zu füllen.
   HINWEIS: Die Fluoroskopie-Bildgebung kann live zur gleichen Zeit wie die Infusion der ablativen Lösung erfolgen. Eine Metall- oder Kunststoffzange kann verwendet werden, um den Sauger während der Bildgebung zu halten, um das Personal vor schädlichen Röntgenstrahlen zu schützen. Dies ermöglicht die Überwachung der Füllung des/der duktalen Baumes/Duktbäume. Die Lebendfluoroskopie kann anhand des erhöhten Volumens an den Alveolenenden bestimmen, wann die Infusion gestoppt werden muss. Eine Durchleuchtung nach der Infusion kann bestätigen, ob der Ductalbaum vollständig gefüllt war oder ob eine Leckage vorlag. Eine konfirmatorische Durchleuchtung wird in der Regel nach Infusion jedes Gangs innerhalb derselben Brustdrüse durchgeführt.

4. Postoperative Pflege und Genesung

1. Unterbrechen Sie den Fluss von Isofluran nach der letzten intraduktalen Infusion.
2. Injizieren Sie 0,5 mg/kg Atipamezol intramuskulär.
   HINWEIS: Die Erholungszeit ist von Tier zu Tier unterschiedlich, aber das Kaninchen sollte 5-20 Minuten nach der Injektion Anzeichen einer Genesung zeigen.
3. Bieten Sie dem Tier kontinuierliche Wärmeunterstützung auf einer wärmenden Decke, bis es sich vollständig von der Narkose erholt hat. Halten Sie den Sauerstofffluss bis zu 5 Minuten lang aufrecht, bevor Sie die Anästhesie entfernen.
   HINWEIS: Zu den Anzeichen einer Genesung gehören Mundbewegungen wie Kauen, Husten, Nasenzucken und/oder Augenbewegungen. Kaninchen sollten einen Aufrichtreflex haben und in der Lage sein, sich in sternaler Position zu halten, bevor sie wieder in die Bergebox gesetzt werden. Das Regenerationsmittel wird basierend auf dem Gewicht des Kaninchens mit einem Bereich von 0,1-1 mg/kg Atipamezol verabreicht.
4. Injizieren Sie 5 mg/kg Ketoprofen subkutan.
5. Entfernen Sie den intravenösen Katheter, sobald das Kaninchen sich in einer sternalen Position halten kann. Halten Sie ein Mullkissen an die Stelle, an der der Katheter entfernt wurde, um übermäßige Blutungen zu stoppen.
   HINWEIS: Die Entfernung des Katheters kann erfolgen, wenn sich das Kaninchen in der Transportbox befindet.
6. Transportieren Sie das Kaninchen zurück in die entsprechende Haltungseinrichtung.
7. Setzen Sie die subkutane Injektion von 5 mg/kg Ketoprofen für mindestens 3 Tage nach dem Eingriff fort.
8. Überwachen Sie das Kaninchen einmal täglich auf Anzeichen von Unwohlsein, Stress, Schmerzen und Selbstverstümmelung für mindestens 3 Tage nach dem Eingriff. Wenn das Kaninchen eines dieser klinischen Symptome zeigt, kann die Behandlung mit Ketoprofen verlängert werden. Erfassen und überwachen Sie das Körpergewicht, um Anzeichen von Magersucht zu erkennen.
   HINWEIS: Ketoprofen wird basierend auf dem Gewicht des Kaninchens mit einem Bereich von 2-5 mg/kg verabreicht. Es kann alle 24 Stunden für bis zu 5 Tage nach der intraduktalen Infusion verabreicht werden, um Entzündungen zu reduzieren und die Narbenbildung zu minimieren. Um unerwünschte Ereignisse wie Hautgeschwüre oder andere Probleme im Zusammenhang mit der Wundheilung zu minimieren, tragen Sie Lidocain topisch auf die Injektionsstelle auf. Jedes Tier, das nach einer Ketoprofen-Behandlung anhaltende Anzeichen von Beschwerden, Beschwerden, Schmerzen oder Verletzungen zeigt, sollte euthanasiert werden.

5. Gewebeanalyse

1. Euthanasielösung (Pentobarbital-Natrium und Phenytoin-Natrium) intravenös in einer Dosis von 100 mg/kg verabreichen. Nach 60 s auf Lebenszeichen durch Einklemmen der Zehen/Ohren, Anzeichen von Atmung oder Herzschlag, Hornhautreflex und/oder Pupillenstimulation prüfen.
2. Führen Sie eine Autopsie durch, um das Gewebe der Brustdrüsen zu gewinnen, und verfahren Sie nach 24-36 Stunden das routinemäßige Paraffineinbettungsverfahren in 10 % neutral gepuffertem Formalin¹⁸. Führen Sie dann eine standardmäßige Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&E) und/oder eine immunhistochemische Färbung mit zelltypspezifischen Markern durch, um die gewünschten Analyseergebnisse zu unterstützen¹⁸. Entsorgen Sie den Schlachtkörper durch das ordnungsgemäße Entsorgungsprotokoll (z. B. Verbrennung).
3. Analysieren Sie das Brustdrüsengewebe in Absprache mit einem Pathologen. Verwenden Sie ein Computersoftwareprogramm, um die Quantifizierung der Ablationsrate und der kollateralen Gewebeschäden zu unterstützen.
   HINWEIS: Die Gewebeanalyse wurde an 4 Monate alten neuseeländischen Weißen Kaninchen innerhalb einer Stunde nach der Infusion durchgeführt (Abbildung 4) mit der QuPath Open Software for Bioimage Analysis (https://qupath.github.io/). Diese Analyse basiert nur auf H&E-gefärbten Geweben. QuPath oder eine ähnliche Computersoftware erfordert eine Eingabe und Kalibrierung durch einen Pathologen. Einige Zellen können nur anhand morphologischer Merkmale falsch klassifiziert werden (Abbildung 4). Die Verwendung von zelltypspezifischen Markern wie Cytokeratinen und Aktin der α-glatten Muskulatur kann zur Verbesserung der computergestützten Klassifikation genutzt werden⁶. Letztendlich muss die Zellklassifikationsanalyse von einem Pathologen kuratiert und validiert werden.

Ergebnisse

Jede der 8 Brustdrüsen eines weiblichen Kaninchens enthält 4 duktale Bäume, die sich an unabhängigen Zitzenöffnungen öffnen (Abbildung 2). Aufgrund des Unterschieds in der Größe und Anzahl der Ductalbäume pro Milchdrüse zwischen Nagetieren (nur 1 Ductus pro Milchdrüse) sind Kaninchen ein gutes Zwischenmodell für die menschliche Translation. Wir können bis zu 400 μl 10-70%ige EtOH-Lösung infundieren, um den gesamten Gangbaum jeder Milchdrüse von 4 Monate alten neuseeländischen weißen Kaninchen zu füllen (Abbildung 1, Abbildung 2, Abbildung 3, Abbildung 4 ^4,8,9). Wir können bis zu 4 duktale Bäume in bis zu 8 Brustdrüsen in einer einzigen Sitzung mit der ablativen Lösung infundieren. Ein typisches Versuchsdesign besteht darin, 2-3 duktale Bäume innerhalb einer einzigen Brustdrüse in bis zu 4 Brustdrüsen mit einer speziellen ablativen Lösung zu infundieren, die jodbasiertes Röntgenkontrastmittel enthält (Abbildung 2,  Abbildung 3). Bei iohexolhaltiger (90-300 mg Jod/ml) ablativer Lösung wird während und/oder nach jeder Infusion eine Fluoroskopie durchgeführt, um den individuellen Erfolg der Infusion jedes duktalen Baumes mit einer teilweisen oder vollständigen Menge der infundierten Lösung zu bestimmen (Abbildung 2, Abbildung 3). Die Entnahme des Brustdrüsengewebes ermöglicht eine Beurteilung, wie sich Änderungen in der Formulierung auf die Zerstörung von Brustepithelzellen auswirken (Abbildung 4). Diese bildgebenden Analysen liefern Informationen, um die am besten geeignete Lösung zu verstehen, um eine maximale Ablation zu erreichen und gleichzeitig die Schädigung des umgebenden Gewebes zu minimieren. Wir stellten fest, dass eine 10%ige EtOH-Lösung eine vergleichbare Ablativrate bietet wie ablative Lösungen mit einem höheren Anteil an EtOH (Abbildung 4).

Abbildung 1: Ablauf des intraduktalen Verfahrens. Die wichtigsten Schritte des ID-Verfahrens werden hervorgehoben. Weitere Informationen finden Sie im Video. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Wichtige Schritte der intraduktalen Kanülierung und Infusion. (A) Injektion von Kochsalzlösung senkrecht zum Sauger, um die duktalen Öffnungen für die Kanülierung zu erweitern (Ansicht in der mittleren Ebene). (B) Die Kanülierung und Füllung eines duktalen Baumes (D1) kann mit blauem Farbstoff in der ablativen Lösung verfolgt werden (Ansicht in der Medianebene). (C) Die Echtzeit-Fluoroskopie-Bildgebung ermöglicht eine präzise und hochauflösende Überwachung der duktalen Baumfüllung (D1) mit Iohexol in der ablativen Lösung (Ansicht der dorsalen Ebene). Die Öffnungen des duktalen Baums sind von links nach rechts nummeriert, beginnend im oberen Quadranten (D1, linker oberer Quadrant) und endend im unteren Quadranten (D4, rechter unterer Quadrant). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Zitzengröße und erfolgreiche Abgabe der ablativen Lösung an mehrere Kanäle. Typische Darstellung der Zitzengrößen bei neuseeländischen weißen Kaninchen. Die Zitzengröße variiert je nach Gewicht und Alter des Kaninchens. Die Brustdrüsen sind von links oben (L1, links zervikal) bis rechts unten (R8, rechtes Leistentuch) nummeriert. Alle Bilder werden in der dorsalen Ebene angezeigt. (A) 2,8 kg jungfräuliches Kaninchen (oben) mit kleineren Zitzen, schwer zu kanülieren, 3,5 kg jungfräuliches Kaninchen (Mitte) mit geeigneten Zitzen für die Kanülierung und 4,1 kg multipares Kaninchen (unten) mit größeren Zitzen, viel einfacher zu kanülieren. (B) Blaue Lebensmittelfarbe in der aufgegossenen Lösung kann als In-vivo-Nachweis für die intraduktale Verabreichung und die duktale Baumfüllung verwendet werden. Eine erfolglose Infusion ist mit einer roten Umrandung (Fettpolster-Abgabe, oben) und erfolgreiche Infusionen mit einer blauen Kontur (intraduktale Infusion, Mitte und unten) gekennzeichnet. Eine 70%ige EtOH-Lösung schädigt die Haut (Erythem) Minuten nach der Infusion (dunkelblau, mittlere Platte) im Vergleich zu einer 10%igen Lösung (hellblau, untere Platte). (C) Die Fluoroskopie liefert in vivo den Nachweis einer intraduktalen Verabreichung. Erfolglose Infusion (Abgabe von Fettpolstern, obere Platte). Erfolgreiche sequentielle Infusion von D1 duktalem Baum zuerst und D2 duktalem Baum an zweiter Stelle (unten links). Die Live-Fluoroskopie bietet eine Bildführung für die Füllung (weiße Pfeile) des D3-Duktalbaums (unteres rechtes Bild); Zu sehen sind auch die mit Iohexol-haltiger Ablativlösung gefüllte Verlängerungslinie und die Pinzette zum Halten des Saugers. Maßstabsbalken entsprechen 1 cm in Bildern mit unterschiedlicher Vergrößerung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Gewebeanalyse der Brustdrüsen bei neuseeländischen weißen Kaninchen nach intraduktalem Verfahren mit einer ablativen Lösung auf Ethanolbasis. (A-B) Repräsentative H&E-Färbung einer rechten leistenalen Brustdrüse eines 4 Monate alten Tieres ohne ablative Behandlung im Vergleich zu einer rechten leistenuellen Brustdrüse eines anderen Tieres mit 10%iger ablativer EtOH-Behandlung. Die Gewebeschnitte werden entlang der Medianebene geschnitten, so dass D1 und D3 (linke duktale Bäume) auf denselben Gewebeschnitten dargestellt sind. Die Ganzgewebeansicht (A) und die Ansicht mit hoher Vergrößerung (B) zeigen die morphologischen und chromatischen Auswirkungen der EtOH-Ablation auf die H&E-Färbung (obere Felder) und abgeleitete Epithel- und Stromazellklassen auf der Grundlage eines computergestützten trainierten Klassifikators (untere Felder). Der schwarze Maßstabstab entspricht 1 mm in A und der weiße Maßstabstab 100 μm in B. (C) Der Diagrammbalken zeigt die Verteilung der Zellklassen in duktalen Bäumen (n > 4 pro Gruppe), die mit unterschiedlichen EtOH-Konzentrationen behandelt oder unbehandelt gelassen wurden. Sternchen zeigen den p-Wert des ungepaarten Welch-t-Tests jeder Zellklasse pro Gruppe im Vergleich zur passenden Zellklasse in der 10 % EtOH-behandelten Gruppe an (* <0,05, ** < 0,01, **** <0,0001). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

In unseren früheren Studien haben wir gezeigt, dass eine ID-Abgabe von 70% EtOH die Brustepithelzellen abliert, während das umgebende Gewebe bei Nagetieren nur minimal geschädigt^{wird 6,7}. In diesem Verfahren haben wir gezeigt, dass eine ID-Infusion einer ablativen Lösung auf ein Kaninchenmodell hochskaliert werden kann. Insbesondere zeigen wir in diesem größeren Modell mit einem multiduktalen Baumsystem, dass die sequentielle Infusion aller Kanäle innerhalb einer Brustdrüse erfolgreich infundiert werden kann. Dies ist der nächste Schritt, um dieses ablative Verfahren in eine praktikable Alternative zur prophylaktischen Mastektomie zur Primärprävention bei Hochrisikopersonen zu überführen.

Das von der FDA zugelassene jodbasierte Röntgenkontrastmittel Omnipaque (iohexol) ermöglicht es uns, den Erfolg der Infusion zu beurteilen, indem wir den Prozess der Lösungsabgabe durch den duktalen Baum live visualisieren. Die Verwendung der Fluoroskopie zur Visualisierung der infundierten Brustdrüse stimmt eng mit den Geräten und Instrumenten überein, die wahrscheinlich eingesetzt werden, um dieses bildgesteuerte Verfahren in die Klinik zu bringen^10,11. Diese bildgebende Modalität wird es uns ermöglichen zu wissen, wann die Infusion gestoppt werden muss, was die Lebendfluoroskopie zu einer Schlüsselkomponente der klinischen Umsetzung dieses ablativen Verfahrens macht. Wir haben die Skalierbarkeit dieses Verfahrens von Nagetieren bis hin zu Kaninchen-Milchbäumen festgestellt, aber es sind weitere Untersuchungen erforderlich, um den Prozentsatz von EtOH zu bestimmen, der die Brustepithelzellen am besten abträgt und gleichzeitig die umgebenden Gewebeschäden in diesem größeren Tiermodell minimiert. Dieses Protokoll konzentrierte sich auf die Machbarkeit einer intraduktalen Infusion und Gewebeanalyse unmittelbar nach dem Eingriff. Strategien zur Problembehandlung und nützliche Tipps sind in Tabelle 1 aufgeführt. Während der Schwerpunkt dieses Protokolls auf der Verabreichung von ablativen Lösungen auf Ethanolbasis liegt, kann dieses Protokoll in anderen Anwendungen verwendet werden, um andere bildgebende Reagenzien, genmodifizierende Systeme wie CRISPR/Cas9, lentivirale Vektoren, siRNAs, Wachstumsfaktoren und/oder Karzinogene ^2,3 lokal zu verabreichen, um andere Aspekte der Brustdrüsenentwicklung und Onkogenese bei Kaninchen zu untersuchen.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Protokoll die Forschungsinstrumente bereitstellt, die für eine systematische und longitudinale Studie der lokalen und systemischen Wirkungen verschiedener ablativer Lösungen erforderlich sind. Diese Informationen bestimmen die Sicherheit dieses Verfahrens und zeigen etwaige Bedenken im Zusammenhang mit der weiteren Entwicklung und klinischen Bewertung in klinischen Erststudien am Menschen auf.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
10X Lupe mit Licht und Klemme, großer Schwanenhals	Amazonas	B0D982JCZ2	Für die Zitzenvisualisierung
Exel International Insulinspritzen	Fisher Scientific	14-841-31	Zur periduktalen Injektion von Kochsalzlösung
Lose stumpfe Nadeln Feinheit 27 Länge 0,5	SAI Infusionstechnologien	B27-50 100 Schüttgut	Für die intraduktale Kanülierung
Evans blau	Sigma	E2129-50G	Zur Visualisierung der Brustdrüse
Durchleuchtungs-Röntgen-Bildgebungssystem	GE HealthCare	DT-C31-01	Für die Fluroskopie-Bildaufnahme
HotDog Veterinär-Wärmedecke	Hotdog	WC71V	Für intraduktale Eingriffe/präoperative Präparate
Stecker-Buchse Verlängerungsleitungen, Länge 12 Zoll	SAI Infusionstechnologien	EXT-12	Für intraduktale Eingriffe
Omnipaque 500 mL (350 mg Jod/ml)	GE Gesundheitswesen	0407-1414-72	Kontrastmittel für die Röntgenvisualisierung (Durchleuchtung)
Sterile blaue Lebensmittelfarbe	Mccormick	930641	Zur Visualisierung der Brustdrüse
Sterile phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	ThermoFisher	14190250	Zur Lösungsvorbereitung
Spritzen	BD	309659	Zur intraduktalen Infusion
V-Gel	Docsinnovent	Nr. D30001 - 30006	Für die Intubation (Katalognummer hängt von der Größe des V-Gels ab)
Ketoprofen	Covetrus	#005488	Zur Analgesie
Ketamin	Covetrus	71069	Zur Analgesie
Topisches Lidocain	Covertus	70859	Zur Analgesie
Xylazin	Covetrus	80907	Für die Anästhesie
Euthasol	Covetrus	#009444	Für die Euthanasie
Gleitgel für die Augen	Covetrus	75848	Für die Anästhesie
Atipamezol	Covetrus	82124	Für die Anästhesie
Bananenchips	Bio-Serv	#F7161	Zur Akklimatisierung
Furity-Edelsteine	Bio-Serv	#F5136-1	Zur Akklimatisierung
Joghurt-Tropfen	Bio-Serv	#F7200-1	Zur Akklimatisierung