Methodenartikel

Wiederverwendbares Leberbildgebungsgerät: Ein wiederverwendbares 3D-gedrucktes Werkzeug für die hepatische intravitale Mikroskopie

DOI:

10.3791/68337

⸱

17. März 2026

 ,  ,  , 
1Cavendish Laboratory, Department of Physics, University of Cambridge, 2Thoracic and GI Malignancies Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, 3Facultad de Ciencias Físicas, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, 4Programa de Pós-Graduação em Ciências de Materiais, Centro de Ciências Exatas e da Natureza, Universidade Federal de Pernambuco

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll führt ein hochmodernes, wiederverwendbares hepatisches Bildgebungsinstrument (RHIT) für die intravitale Mikroskopie (IVM) lebender Mäuse ein, das die Gewebestabilität für schnelle und akute Experimente verbessert. Das 3D-gedruckte Design des RHIT bietet kosteneffiziente Produktion, Skalierbarkeit und Vielseitigkeit und ermöglicht eine längere Beobachtung der Stoffwechselprozesse bei Mäusen unterschiedlicher Größe.

Zusammenfassung

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Die Leberfunktion und -dysfunktion können durch direkte Visualisierung der dynamischen Prozesse der Leber mittels einer konfokalbasierten intravitalen Mikroskopie (IVM) beurteilt werden. Insbesondere kann bei der Extraktion sowohl qualitativer als auch quantitativer Informationen eine ausgezeichnete räumliche und zeitliche Präzision erreicht werden. Im Mikroskopstadium bleibt es eine Herausforderung, physiologische Gewebebedingungen aufrechtzuerhalten und gleichzeitig Stabilität und Wiederholbarkeit zu erreichen. Erhöhtes Gewicht und der Leberfettgehalt haben einen nachteiligen Einfluss auf diesen Prozess in Tiermodellen von Typ-II-Diabetes (T2D) und nicht-alkoholischer Fettlebererkrankung (MAFLD). Um diese Einschränkungen zu überwinden, haben wir RHIT geschaffen, ein revolutionäres Bildgebungsinstrument-Design, das den Zugang zu Gewebe und die Stabilität verbessert. RHIT ist ein wiederverwendbares, skalierbares Leberbildgebungsgerät, das mit 3D-Druck in einer effizienten Ein-Schritt-Methode hergestellt wird. Seine Maße können angepasst werden, um Mäuse unterschiedlicher Größe zu passen. Kurz gesagt: RHIT ist ein 3D-gedrucktes Gerät zur Positionierung und Stabilisierung von Labortieren während der intravitalen Lebermikroskopie, das nach einer kurzen chirurgischen Vorbereitung eingesetzt wird, um Handhabung, Stress und Variabilität zu minimieren. Sein wiederverwendbares, standardisiertes Design lässt sich leicht produzieren und anpassen und unterstützt eine Vielzahl von Größen und potenziellen experimentellen Designs. Erste Ergebnisse zeigen eine deutliche Verbesserung der Stabilität und Zuverlässigkeit der intravitalen Leberbildgebung, was eine detaillierte Visualisierung subzellulärer Strukturen wie Lipidtröpfchen ermöglicht. Diese verbesserte Präzision erleichtert metabolische und physiologische Studien mit besserer Klarheit, Reproduzierbarkeit und Potenzial für longitudinale Designs. Das Protokoll bietet einen standardisierten, zugänglichen Ansatz, der langjährige technische Herausforderungen der Leber-IVM adressiert.

Einleitung

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Die Intravitalmikroskopie ist ein leistungsstarkes Werkzeug, um biologische Prozesse in vivo dynamisch 1,2,3 zu visualisieren – im Gegensatz zur traditionellen Immunfluoreszenz-Histologie mit fixiertem Gewebe oder lebenden Zellen sowie Flowzytometrieanalyse isolierter Zellen. Für die Leberinspektion wurde IVM eingesetzt, um die Gallensekretion und -fluss 4,5, die Glukosemobilisation 6,7, nichtparenchymale Zellen 8,9,10 und Lebererkrankungen 11,12 zu untersuchen. Darüber hinaus ermöglicht die IVM im Hinblick auf die Untersuchung der Lipidansammlung Echtzeitinformationen über die Dynamik der Bildung von Lipidtröpfchen, -wachstum und -abbau in lebenden Geweben, wie die Visualisierung und Quantifizierung von Lipidtröpfchen mit hoher räumlicher Auflösung sowie die direkte Korrelation der Lipidtröpfchenansammlung mit anderen zellulären und physiologischen Prozessen13. Trotz dieser Vorteile ist IVM immer noch technisch herausfordernd: Sie erfordert spezielle Geräte und Fachwissen14, kann Gewebeschäden verursachen, das Zellverhalten verändern und invasive Eingriffe erfordern. Traditionelle Studien, die auf Verhaltensbeobachtung, physiologischer Überwachung und genetischer Analyse basieren, liefern wertvolle Informationen, fehlen jedoch die räumliche und zeitliche Auflösung, die eine intravitale Mikroskopie bietet.

Die erste große Herausforderung bei IVM ist die Kontrolle der Instabilität der Artefakte, die durch Herzschlag und Atmung des untersuchten Tieres verursacht werden, was die Bildqualität beeinträchtigen kann und zu verdeckten oder verzerrten Bildernder beobachteten biologischen Prozesse führt. Versuche, dies mit Bildverarbeitung zu korrigieren, führen oft dazu, dass wichtige räumliche und zeitliche Informationen verloren gehen oder fortschrittliche chirurgische Geräte und Wartung erforderlichsind 16,17. Zweitens sind Mausmodelle für Lebererkrankungsstudien, wie MAFLD und T2D, oft fettleibig und daher aufgrund ihrer größeren Größe und ihres Gewebefettgehalts16,18 schwerer zu stabilisieren. In fettleibigen NAFLD- und T2D-Mausmodellen stellt die erhöhte Körpermasse mechanische Herausforderungen für die intravitale Bildgebung dar, da sie die Lastkapazität der Standard-Mikroskopstufen überschreitet und die Stabilisierung von Tierenerschwert 19. Dieses zusätzliche Gewicht erhöht das Risiko von Bewegungsartefakten und Gewebekompression, die beide die Bildgenauigkeitbeeinträchtigen.

Gleichzeitig erhöht ein erhöhter Leberlipidgehalt die Gewebeopazität und die Lichtstreuung, was die Bildauflösung und den Kontrast verschlechtert. Diese Effekte werden oft durch metabolische Komorbiditäten wie veränderte Perfusion und Entzündung verstärkt, was die Farbstoffverteilung und die Signalklarheitweiter reduziert. Schließlich kann es schwierig sein und die Wiederholbarkeit beeinträchtigen, während der Bildgebung eine konstante Körpertemperatur aufrechtzuerhalten, um die Gewebephysiologie und biologische Aktivitäten aufrechtzuerhalten. Darüber hinaus ist eine stabile Positionierung der Leber im Mikroskopstadium während der IVM entscheidend, um mechanische Belastungen oderGewebeschäden zu verhindern. Die Freilegung des Lebergewebes ist ein sensibles Verfahren, das technische Präzision erfordert, um schwere Blutungen und Schäden am Leberparenchymzu verhindern 7. Um Bewegungsartefakte zu reduzieren, wurde der Brustkorb der Maus zuvor mit Pappe aus dem Mikroskopstadium angehoben, sodass die Schwerkraft die Leber vom Restdes Körpers wegzieht. Obwohl dieser Ansatz bei der Erzeugung quantifizierbarer Daten erfolgreich war, ist das Pappmaterial nicht nachhaltig, da es seine Form verliert und schwer zu reinigen ist. Außerdem ist es schwierig, die Abmessungen des Pappeinsatzes an fettleibige Mausmodelle anzupassen.

In den letzten Jahren sind mehrere fortschrittliche hepatische intravitale Mikroskopietechniken entstanden, darunter die Rasterlichtfeldmikroskopie und rechnertechnisch verbesserte optische Systeme, die Verbesserungen in der raumzeitlichen Auflösung23, reduzierter Phototoxizität24, größerer Bildtiefe25,26 und Bewegungsartefaktunterdrückung27 gezeigt haben. Diese Entwicklungen, wie in aktuellen Studien 28,29,30 gezeigt, stellen einen bedeutenden technologischen Fortschritt in diesem Bereich dar. Dieses Papier stellt das wiederverwendbare hepatische Bildgebungswerkzeug (RHIT) vor, ein innovatives Werkzeug zur IVM der Mausleber. RHIT trägt zu dieser sich entwickelnden Landschaft bei, indem es ein skalierbares und wiederverwendbares Werkzeug anbietet, das die mechanische Stabilität und die Gewebezugänglichkeit in verschiedenen Tiermodellen, einschließlich solcher mit Stoffwechselerkrankungen, verbessert. Sein Design adressiert die anhaltenden Herausforderungen von Bewegung, Variabilität und Aufbaukomplexität, indem anatomische Passform, Staging-Reproduzierbarkeit und Benutzerfreundlichkeit integriert werden. Die Kompatibilität von RHIT mit sowohl konventionellen als auch fortschrittlichen bildgebenden Verfahren erweitert den Nutzen dieser neuen Techniken und fördert eine zuverlässige und physiologisch stabile intravitale Leberbildgebung.

Obwohl verschiedene Ansätze zur Stabilisierung des Gewebes während der IVM vorgeschlagen wurden, wie ein chirurgisches Fenster 9,31,32,33,34,35,36 und ein individuell zusammengestelltes Acryl-Stadium 6,37, bringen diese Methoden auch zahlreiche Einschränkungen und Komplexitäten in Bezug auf Skalierbarkeit, Reproduzierbarkeit und chirurgische Fähigkeiten mit sich. Im Vergleich dazu ist RHIT funktional in seinem Zweck und Design eigenständig. Es ist nicht auf direkte Kompression oder gelbasierteEinbettung 38 angewiesen. Stattdessen dient RHIT als skalierbares, wiederverwendbares, anatomisch konturiertes Werkzeug, das die Leberisolation durch gravitative Positionierung unterstützt und die physiologische Ausrichtung aufrechterhält, ohne das Gewebe einzuschränken oder zu verzerren. Entscheidend ist, dass RHIT die Reproduzierbarkeit der Daten, die Bildgenauigkeit und die prozedurale Konsistenz über eine Vielzahl von Mausgrößen hinweg verbessert. Sie eliminiert die Notwendigkeit von Gelen, Klebstoffen oder komplexen chirurgischen Schnittstellen und vereinfacht gleichzeitig die Gewebeausrichtung und Temperaturkontrolle. Darüber hinaus ist RHIT ein spezialisiertes Werkzeug, das die Schnittstelle zwischen Tier und Mikroskop überbrückt und so entwickelt wurde, dass es sowohl die physiologische Unterstützung als auch die bildgebende Präzision unterstützt.

RHIT adressiert direkt die mechanischen und optischen Herausforderungen metabolisch beeinträchtigter Modelle durch seine skalierbare Geometrie, die größere Tiergrößen berücksichtigt und gleichzeitig das Gewicht gleichmäßig verteilt, um die Plattforminstabilität zu minimieren. Die zurückgezogene Leberöffnung stabilisiert das Gewebe mittels Schwerkraft ohne Druckkraft, ermöglicht einen gleichmäßigen Zugang und reduziert die Bewegung während der Bildgebung. Sein wiederverwendbares, chemisch inertes Design gewährleistet die Kompatibilität mit biologischen Geweben und unterstützt gleichzeitig die hygienische Wiederverwendung. Durch die Möglichkeit einer konsistenten Positionierung, der Minimierung von Bewegungsartefakten und der Erhaltung der Gewebeintegrität bietet RHIT einen grundlegenden Fortschritt in den Workflows der intravitalen Mikroskopie. Seine Anpassungsfähigkeit und Open-Source-Verfügbarkeit fördern zudem den breiten Nutzen in Laboren und Tiermodellen und setzen einen neuen Standard für Bildgebungswerkzeuge, die sowohl die Probe als auch das Bildgebungssystem unterstützen.

Darüber hinaus erfordern kommerziell erhältliche beheizte Mikroskopstufen möglicherweise fortschrittliche Mikroskop-Setups und dieHandhabung von 39. Sie sind nicht auf das Exemplar skalierbar und in der Regel teurer, was sie für viele Forscher weniger zugänglich macht. Daher ist ein wiederverwendbarer, skalierbarer Einsatz wichtig, um IVM für verschiedene Tiermodelle zu standardisieren. 3D-gedruckte Technologie, auch als additive Fertigung bezeichnet, ist inwissenschaftlichen Laboren immer beliebter geworden und hat die Protokolle der Biochemie, Physik und Biologie grundlegend verändert. Für IVM wurde 3D-Technologie verwendet, um leichte bildgebende optische Fenster41,42 herzustellen, die Gewebezugänglichkeitzu verbessern 43 sowie die Gewebereparatur und -rekonstruktionzu erleichtern. Daher bietet ein maßgeschneidertes Werkzeug zur Gewebestabilisierung, das nach unserem Wissen noch nicht beschrieben wurde, eine ausgezeichnete Gelegenheit, 3D-Druck einzusetzen, um einige der Herausforderungen der hepatischen IVM zu überwinden.

RHIT wird mit einer einstufigen 3D-Druckmethode entwickelt und verbessert die Gewebestabilisierung über einen längeren Zeitraum erheblich. RHIT ist sehr zugänglich und eignet sich für akute IVM-Experimente, die nur minimale chirurgische Expertise erfordern. Außerdem ist RHIT leicht auf Tiergröße skalierbar und hat niedrige Produktionskosten. Abschließend zeigen wir, dass RHIT eine stabile Zeitraffer-Fluoreszenzbildgebung ermöglicht und die Gewebestabilität im Vergleich zum zuvor verwendeten Pappeinsatz verbessert. RHIT vereinfacht die IVM der hepatischen Lipidhomöostase ohne direkten Kontakt oder messbaren Einfluss auf physiologische Bedingungen. Daher bietet RHIT einen Wettbewerbsvorteil als beschleunigter, wiederverwendbarer und anpassungsfähiger Beitrag zu IVM 34,36,45.

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Abbildung 1: RHIT-Design. (A) Design und Abmessungen eines 3,0 mm RHIT, maßstabsgetreu für eine fettleibige Maus. Die Enface-Ansicht (links) zeigt die Abmessungen, Positionierung und Größe der Gewebeöffnung sowie die Ausrichtung der Maus während der Bildgebung. Die Seitenansicht (rechts) enthält die Maße und zeigt die Position des Wärmepads und des Temperatursondeneinsatzes an. Skalierungsparameter für verschiedene Mausgrößen sind in Tabelle 1 angegeben. (B) 3D-Enface-Ansicht von RHIT, erzeugt aus der Open-Source-STL-Datei, die zeigt, wo der rektale Sondendraht durch den benutzerdefinierten Port eingefügt wird (oben rechts mit den Dimensionen des rektalen Probe-Einsatzes gekennzeichnet). (C) Technische Montage von RHIT, die die Integration des Heizgeräts und der maßgeschneiderten strukturellen Einsätze für verschiedene RHIT-Größen zeigt; der Draht wird in den rektalen Sondeneinsatz für den Zugang zur Temperatursonde eingesetzt. Abkürzung: RHIT = Wiederverwendbares Leberbildgebungsgerät. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

RHIT wurde ursprünglich als Einzelteil-Baugruppe mit ABS (Acrylonitril-Butadien-Styrol), einem weit verbreiteten thermoplastischen Polymer in der Fused Deposition Modeling 3D-Printing45, entwickelt. ABS bietet für diese Anwendung mehrere Vorteile: Es ist leicht, hitzebeständig (Schmelzpunkt ~200 °C) und hat eine gute Aufprallbeständigkeitvon 46, 47, 48. Das Design von RHIT nutzt die abstimmbare Dichte von ABS, sodass es physiologische Bewegungen wie Herzschlag und Atmung aufnehmen kann. Eine erhöhte Infill-Dichte verbessert die Bewegungsdämpfung, was zu größerer Bildqualität und besserer Bildqualität führt.

RHIT ist darauf ausgelegt, Bewegungen durch Anpassungen der Dichte eines chemisch inerten Materials wie ABS zu absorbieren. In diesem Zusammenhang bezieht sich die Dichte speziell auf den beim 3D-Druck verwendeten Infill-Prozentsatz, der die Steifigkeit und die Fähigkeit der Plattform beeinflusst, Vibrationen 49,50,51 zu dämpfen. Eine Erhöhung der ABS-Dichte wurde beobachtet, dass sie die durch Herzschlag und Atmung verursachte Bewegungsübertragung reduziert, was zu einer stabilen Bildgebungsplattform und einer verbesserten Bildqualität führt. Wir testeten RHIT-Konstrukte mit unterschiedlichen inneren Fülldichten (20–100 %) und beobachteten qualitativ, dass höher-dichte-Konfigurationen zu sichtbar reduzierten Bewegungsartefakten während der intravitalen Leberbildgebung bei Mäusen führten. Eine formale Quantifizierung wurde nicht durchgeführt, da die hochdichte Konfiguration über alle getesteten RHIT-Größen hinweg ausreichend robust und wirksam war und unter routinemäßigen Bildgebungsbedingungen zuverlässig eine zuverlässige Leistung bot. Für die meisten Nutzer ist diese Standarddichte ohne weitere Anpassungen geeignet. Für Experimente mit spezifischen mechanischen Eigenschaften können jedoch die Fülldichte und Designparameter angepasst werden, und vollständige 3D-Druckanleitungen wurden bereitgestellt, um eine solche Anpassung zu unterstützen.

Alternative Materialien können zum Drucken verwendet werden; ABS ist jedoch das bevorzugte Material für die RHIT-Fertigung, da es mehrere wichtige Vorteile bietet. Es ist chemisch inert, minimiert das Risiko von Wechselwirkungen mit Gewebe oder Körperflüssigkeiten und ist in Wasser unlöslich, was eine effiziente Reinigung, Lagerung und Wiederverwendung ermöglicht. Diese Eigenschaften machen ABS zu einer zuverlässigen und langlebigen Wahl für experimentelle Anwendungen. Wenn der Zugang zu einem Fusionsmodellierdrucker eingeschränkt ist, können andere 3D-Drucktechniken und -materialien verwendet werden. Stereolithographie, selektives Lasersintern und Multi-Jet-Fusion sind geeignete Optionen mit Materialien wie Nylon, Photopolymerharzen oder Verbundpulvern. Nylon bietet Haltbarkeit und Flexibilität, während stereolithografische Harze eine hohe Auflösung für Anwendungen bieten, die feine strukturelle Details erfordern. Das RHIT-Design lässt sich leicht an die Toleranzen und Einschränkungen verschiedener Materialien anpassen und ist damit mit verschiedenen Druckplattformen kompatibel. Nutzer sollten Materialien basierend auf mechanischer Stabilität, Biokompatibilität, Kompatibilität mit Bildverarbeitungs-Workflows und verfügbaren Druckressourcen auswählen.

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Protokoll

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Alle Tierversuche wurden in den Tiereinrichtungen der National Institutes of Health unter Einhaltung der vom Ethikausschuss für Tierversuche autorisierten Richtlinien und Protokolle durchgeführt (Protokoll Nr. LCMB-037). Alle Mitarbeiter müssen ordnungsgemäß geschult sein, bevor sie mit den folgenden Protokollen fortfahren. Der Umgang mit Tieren erfolgte in Übereinstimmung mit den institutionellen Vorgaben.

Das RHIT-Protokoll beschreibt die Herstellung von wiederverwendbaren hepatischen Bildgebungswerkzeugen (RHITs) für den Einsatz in intravitalmikroskopischen (IVM)-Experimenten. Die experimentellen Verfahren werden in einem sterilisierten Mikroskopraum oder einer Haube durchgeführt und umfassen eine Reihe von Schritten: zunächst das Drucken von RHIT, die Anästhesie und die fluoreszierende Markierung der Maus, dann das Einrichten des Mikroskops, anschließend der chirurgische Eingriff und schließlich die Anwendung der RHIT-unterstützten IVM. Abbildung 1 und Abbildung 2 zeigen die erforderlichen Komponenten für die Bildgebung lebender Proben mit einem konfokalen Mikroskop, darunter ein Metalleinsatz 5,6,7 (Mikroskopadapter für die Bildgebung lebender Proben) zur Platzierung von RHIT sowie RHITs für den Einsatz bei fortgeschrittener oder kontrollierter Steatose. Zur Untersuchung des Systems wurden männliche C57BL/6J Mus Musculus im Alter von 6-10 Wochen entnommen und 8-10 Wochen lang mit einer Standard- oder Western-Diät gefüttert, bevor das Experiment begann.

1. Entwicklung von RHIT mit Modifikationen

  1. Um RHIT nachzubilden, verwenden Sie 3D-Produktdesignsoftware (siehe Materialtabelle). Öffnen Sie die Designsoftware und erstellen Sie ein neues Standardteil. Speichere die Datei mit einer passenden Beschreibung.
  2. Erstellen Sie die Skizze von RHIT auf der Frontebene mit der Funktion Create 2D Sketch .
    1. Klicken Sie auf das Rechteck-Symbol und platzieren Sie dessen untere linke Ecke am Ursprung der Skizzenebene.
    2. Zeichnen Sie ein zweites Rechteck innerhalb des ersten, um das Bildfenster von RHIT darzustellen.
    3. Fügen Sie beiden Rechtecken mit der Funktion Dimension Dimensionen hinzu, wobei sichergestellt wird, dass alle Längen und Breiten auf den Ursprung und relativ zueinander bezogen sind.
    4. Passen Sie die RHIT-Maße entsprechend der Mausgröße an.
    5. Fügen Sie RHIT Dicke hinzu, indem Sie nur das äußere Rechteck auswählen und auf Extrudieren klicken. Wenn ein Popup erscheint, wähle die Skizze mit dem Extrudierungswerkzeug aus, um eine Öffnung in der Mitte zu lassen.
    6. Wählen Sie die untere Seite des extrudierten RHIT aus und starten Sie eine neue 2D-Skizze mit der Funktion Start 2D Sketch .
  3. Zeichne ein Rechteck, um die Tasche für das Wärmekissen zu definieren. Wenden Sie die erworbenen Dimensionen mit der Dimension Feature an.
    1. Verlasse die 2D-Skizze und führe eine Materialentfernung mit dem Werkzeug Cut Extrude durch, um eine tiefe Höhlung für das Wärmepad zu schaffen.
  4. Beginne eine neue Skizze für die Temperatursonde auf derselben Seite wie die Höhle. Klicken Sie auf Start eine 2D-Skizze und wählen Sie das Kreissymbol aus. Platzieren Sie den Kreis auf die ebene Fläche und dimensionieren Sie ihn entsprechend. Verlasse den Skizzenmodus .
    1. Klicken Sie auf Extrude und wählen Sie die Skizze des Kreises aus. ImE-Xtrusion-Modus klicken Sie auf "Schneiden extrudieren" und warten Sie darauf, dass ein Popup mit der Option zum Entfernen von Material erscheint. Klick OK. Beenden Sie den Extrusionsmodus .
    2. Füge Abfiltungen an den Rändern des Fensters hinzu, indem du auf das Abfilet-Symbol klickst und alle acht scharfen Kanten auswählst. Füge die Fillet-Größe hinzu und verlasse den Fillet-Modus .
      HINWEIS: Wenn zusätzliche Bewegungsabsorption gewünscht ist, können Nutzer während der 3D-Druckvorbereitung die innere Fülldichte erhöhen.
  5. Bereiten Sie das Modell für den 3D-Druck vor, indem Sie zum Reiter Umgebung navigieren und den Reiter 3D-Druck auswählen.
    1. Verwenden Sie die Funktion Set Orientation , um sicherzustellen, dass das Modell flach auf dem Druckbett liegt und nicht vertikal ausgerichtet ist.
    2. Klicken Sie auf Druckoptionen , um die Einheiteneinstellungen zu konfigurieren und gegebenenfalls die Skala anzupassen.
    3. Speichere das endgültige Modell darin. STL-Format mit der STL-Exportfunktion .
    4. Verlasse den Umgebungs-Tab und klicke auf Speichern, um RHIT als soliden Teil zu speichern.
  6. Schließe das Designprogramm.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Drucker mit dem kompatibel ist. STL-Dateiformat oder in das entsprechende Format konvertieren, wie es die 3D-Druckersoftware verlangt.

2. Hochladen und Drucken von RHIT aus STL-Dateien

  1. Importieren Sie die .stl-Datei aus Abbildung 1A oder Supplemental-Datei 1 in eine 3D-Computer-Aided Design (CAD)-Software, indem Sie auf Import klicken und die .stl-Datei auswählen. Klicken Sie auf die Schaltfläche Bereiten, um das Modell in dünne Schichten für den 3D-Druck zu schneiden.
  2. Wählen Sie den entsprechenden 3D-kommerziellen Drucker aus und klicken Sie auf Drucken. Anschließend überwachen Sie den Druckfortschritt und entfernen und reinigen Sie das 3D-gedruckte Objekt, sobald der Druck abgeschlossen ist.
MausgrößeMaus-Körpergewicht (g)RHIT-Dicke (mm)Bildfenstergröße L X W (mm)
Klein (S)17-201.517 x 17
Mittel (M)22-252.521 x 21
Groß (L)35-40326 x 26

Tabelle 1: Skalierung der Mausgröße auf RHIT. Das Mausgewicht wird auf die Dicke von RHIT skaliert, wobei ein Gewicht von mehr als 30 g (Pfeilspitze) dem größten RHIT (3,0 mm) entspricht. Die leichteste Maus entspricht dem dünnsten RHIT, und die fettleibigen Mäuse werden durch den dicksten RHIT repräsentiert. Diese Maße können in CAD-Software angepasst werden. RHIT-Länge und Bildöffnung können je nach Organstandort der verwendeten Probe variieren; konstante Länge und Bildöffnung für alle drei RHITS waren für diese Studie geeignet. Abkürzungen: RHIT = Reusable Hepatic Imaging Tool; CAD = computergestütztes Design.

3. Mikroskopvorbereitung und Nutzung von RHIT

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Abbildung 2: IVM der Leber mit der RHIT-Technik. (A) Schaltplan des invertierten konfokalen Mikroskops mit einer betäubten Maus. (B) Ein Metallmikroskopadapter (Einsatz) wurde verwendet, um die Maus auf der Mikroskopstufe für Live-Aufnahmen zu positionieren. (C) Das 3D-gedruckte RHIT wurde mit einem Mullstreifen verwendet, um Leberparenchym leicht zu manipulieren. (D) Bild der vorexteriorisierten Leber vor der RHIT-Positionierung. Der Nasenkegel wurde für die Anästhesie vor und während der Operation verwendet. (E) Bild der äußeren Leber vor der RHIT-Positionierung während eines akuten Eingriffs. Rasieren war nicht erforderlich. (F) Bild der umgekehrten Maus in der finalen verdeckten Position auf dem RHIT zur Bildgebung. (G) RHIT ist sicher an der Mikroskopbühne befestigt. (H) Eine Maus, die auf RHIT und Metalladapter positioniert ist. (I) Magere (blauer Pfeil) und fettleibige (grüner Pfeil) Mäuse, die mit jeweils schuppigen RHIT-Einsätzen in J-L gezeigt werden, zeigen grobe anatomische Darstellungen der fettleibigen bzw. schlanken Leber. Die hochauflösende IVM zeigt M,N der Leber von fettleibigen und schlanken Mäusen, die mit BODIPY (grün, durch einen rosa Pfeil dargestellt) gekennzeichnet sind, um Lipidtröpfchen zu kennzeichnen, und Hoechst 33342 (weiß, dargestellt durch einen cyanfarbenen Pfeil) zur Markierung der Kerne. Abkürzungen: RHIT = Reusable Hepatic Imaging Tool; IVM = intravitale Mikroskopie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

  1. Bereiten Sie ein herkömmliches invertiertes konfokales Mikroskop für die Leber-IVM vor, wie in Abbildung 2 gezeigt.
    1. Setzen Sie einen Stufenadapter ein, um die Probe aufzunehmen. Um diesem Protokoll zu folgen, verwenden Sie einen maßgefertigten Metalleinsatz mit einer 35-mm-Rundöffnung und einem 40-mm-Deckglas.
    2. Reinigen Sie beide Seiten des Deckglases vor und nach jeder Bildaufnahme gründlich mit 70 % Ethanol bei Bedarf.
  2. Sichern Sie den passenden RHIT basierend auf Mausgröße (Tabelle 1) mit Klebeband (optional), indem Sie die RHIT-Blende mit dem Objektivobjektiv ausrichten und parallel über dem Bildabdecker (Abbildung 2G) auf dem Metalleinsatz mit Klebeband über dem Abdeckungsglas legen.
  3. Wählen Sie ein Objektiv für die Bildgebung basierend auf der Flächengröße, der räumlichen Auflösung und der Bildzeit, zum Beispiel ein 25x/0,95 Wasserobjektiv.
    HINWEIS: Während eine höhere Vergrößerung die Auflösung verbessert, erhöht sie auch die Wahrscheinlichkeit von Bewegungsartefakten.
    1. Richte das Objektiv nahe an das Deckglas aus.
  4. Befestigen Sie einen Mullstreifen (etwa 1 x 8 cm, Abbildung 2C, D) mit Klebeband über dem RHIT-Fenster, um das Gewebe zu positionieren und von anderen Bauchorganen zu trennen (Abbildung 2C).
  5. RHIT vorwärmen mit einer Wärmematte, die in den Schlitz eingesetzt wird, und befestigen Sie die Wärmesonde neben dem RHIT (Abbildung 2G, H), um die Körpertemperatur der Maus während der Bildgebung aufrechtzuerhalten.

4. Fluoreszierende Markierung und Mausanästhesie

  1. Reduzieren Sie den Stress der Maus, indem Sie die Induktionskammer des Anästhetikums desinfizieren, um die letzten Spuren des Tiergeruchs zu entfernen.
  2. Schalten Sie den Sauerstoffkondensator, ein Umweltschutzsystem (EPS) und den Isofluran-Verdampfer ein.
  3. Setzen Sie die Maus in die Induktionskammer und betäuben Sie sie mit 2–3 % Isofluran für etwa 3–5 Minuten oder bis das Tier stabile Atmung und Verlust von Auf- und Pedalreflexen zeigt.
    1. Nach der Betäubung werden die Maus auf das Heizkissen übertragen und die Anästhesie mit 1–2 % Isofluran, das über den Nasenkegel abgegeben wird (Abbildung 2D) abgegeben, wobei die Narkose bei Bedarf angepasst wird, um während des gesamten Eingriffs eine stabile chirurgische Anästhesieebene zu gewährleisten.
    2. Beurteilen Sie die Tiefe der Anästhesie durch einen Zehenkneiftest, um jede willkürliche Bewegung zu beobachten.
  4. Um lipidreiche Strukturen zu kennzeichnen, wird 200 nmol BODIPY 665/676 in PBS (Gesamtvolumen 200 μL) über die Schwanzvene mit einer 31-G-Insulinspritze injiziert.
    1. Für ein optimales Signal verabreichen Sie BODIPY einmal täglich für zwei aufeinanderfolgende Tage vor der Bildgebung. Lassen Sie mindestens 3–4 Stunden nach der zweiten Injektion ein, um die systemische Beseitigung des Hintergrunds und die Stabilisierung des Gewebesignals sicherzustellen.
  5. Um Kernkontrast zu erzeugen, injizieren Sie Hoechst 33342 (2 μg/g Körpergewicht), verdünnt in 1x Heparinlösung (hergestellt durch Mische von 120 μL Heparin mit 180 μL Kochsalzlösung, um 400 U/ml zu erhalten), über den Sinus retro-orbitalen Sinus mit einer 31-G-Insulinspritze.
    HINWEIS: Hoechst wird separat verabreicht, um Niederschlag zu vermeiden, wenn es mit anderen Farbstoffen gemischt wird.
  6. Um die Gefäße zu visualisieren, injizieren Sie 18 μg/g Körpergewicht fluoreszierenden Dextran (70 kDa), verdünnt in derselben 1x-Heparinlösung wie in Schritt 4.5 beschrieben, über den kontralateralen retro-orbitalen Sinus mit einer 31-G-Insulinspritze (Tabelle 2).
    HINWEIS: Heparin wird verwendet, um die Gerinnselbildung zu reduzieren und den gleichmäßigen Blutfluss während der Bildgebenden zu fördern.
  7. Warte 10-15 Minuten nach Hoechst- und Dextran-Injektionen, bevor du mit der Operation und der Bildgebung beginnt.
Fluoreszierender ReporterZweckDosis pro Gewicht (oder Konzentration)
Hoechst 33342Färbungskerne2 μg/g: Injektorvolumen auf 50 μl mit Heparinlösung ergänzen
Bodiby 665/676Färbungs-Lipidtröpfchen0,8 μg/g: Injektivvolumen auf 200 μl in Kochsalzlösung ergänzen
2M Tetramethyl-Rhodamin-Dextran (Dextran)Gefärbungsgefäße18 μg/g: Injektivvolumen auf 50 μl mit Heparinlösung ergänzen

Tabelle 2: Optionen für fluoreszierende Reporter. Diese Tabelle bietet eine detaillierte Beschreibung der Methoden, die zur Markierung von Mausgeweben in vivo Imaging verwendet werden. Die Heparinlösung wird zuerst hergestellt und anschließend verwendet, um die DAPI-Heparin- und Dextran-Heparin-Lösungen7 herzustellen. Hoechst 33342 wird retro-orbital in ein Auge injiziert, während BODIPY direkt 2-3 Tage zuvor in die Schwanzvene injiziert wird, mit einer höheren Konzentration bei fettleibigen Mäusen. Dextran wird retro-orbital in das andere Auge injiziert. Es ist wichtig, Retro-Orbitalinjektionen separat in jedem Auge durchzuführen. Abkürzung: DAPI = 4', 6-Diamidino-2-Phenylindol.

5. Mauschirurgischer Eingriff

  1. Rasieren Sie das Bauchfell mit einem Haarschneider und/oder einer Haarentfernungscreme. Entferne Haarrückstände und verwende 70 % Ethanol, um die freiliegende Haut zu reinigen.
    HINWEIS: Je nach institutionellen IACUC-Anforderungen kann ein abwechselndes Schrubben aus Betadin und Ethanol verwendet werden, um eine angemessene Vorbereitung der Operationsstelle sicherzustellen.
  2. Bewerten Sie vor der Operation die Tiefe der Anästhesie erneut.
  3. Die Leber wird freigelegt, indem man mit einer chirurgischen Schere aus dem Xiphoid einen horizontalen, halbmondförmigen 2–3 cm großen Schnitt unter dem Brustkorb macht, der an der linken Seitenseite des oberen Bauches endet.
  4. Nach dem ersten Schnitt sollte vorsichtig ein kleinerer sekundärer Schnitt in der Muskelschicht gemacht werden, um den linken Leberlappen freizulegen, und bei Bedarf (optional) kauterisieren, um Blutungen zu vermeiden (Abbildung 2E).
    1. Vermeiden Sie Hitzeschäden an der Leber während der Verwendung des Kauterisators, indem Sie eine mit Kochsalzlösung getränkte Gaze zwischen Leber und Muskelschicht legen, um die austretende Wärme der Muskelschicht aufzunehmen.
    2. Vermeiden Sie übermäßige Blutungen, chirurgische oder mechanische Verletzungen oder äußere Kompression.
  5. Sobald die Leber freigelegt ist, überführen Sie die Maus in die Mikroskopphase.

6. Mausplatzierung auf der Mikroskopstufe

  1. Positioniere den Bauch der betäubten Maus nach unten auf der RHIT-Plattform des Mikroskops.
    1. Stellen Sie den Nasenkegel so ein, dass die Maus unter Narkose bleibt.
    2. Verwenden Sie einen mit Kochsalzlösung befeuchteten Applikator mit Baumwollspitzen, um den linken lateralen Lappen der Leber vorsichtig gegen den Deckdeckel zu bewegen und dabei sanften externen Druck auf die Brusthöhle auszuüben.
      HINWEIS: Nutzen Sie die Schwerkraft, um die Leber vorsichtig nach außen und auf das Deckglas zu manövrieren.
    3. Verwenden Sie einen Mullstreifen, um die Leber vorsichtig vom Körper der Maus zu trennen (Abbildung 2E-H).
  2. Überprüfen Sie erneut den Nasenkegel, um sicherzustellen, dass die Maus während der Bildgebenden Narkose bleibt.
  3. Verhindern Sie Gewebedehydrierung, indem Sie ein wasserbasiertes Gel an den Rändern der freiliegenden Höhle auftragen und direkten Kontakt mit dem Heizkissen vermeiden.
    HINWEIS: Die Aufrechterhaltung von Temperatur und Luftfeuchtigkeit kann auch durch ein Mikroskop mit einer geschlossenen Luftfeuchtigkeitskammer 5,6,7 unterstützt werden.
  4. Tragen Sie eine Augensalbe auf die Augen auf, um das Austrocknen der Hornhaut zu verhindern.
  5. Setze eine Zeitraffer-IVM ein, um mitder Bildgebung 7,52 zu beginnen.
    1. Öffnen Sie Laserverschlüsse, bewerten Sie die fluoreszierende Markierung und identifizieren Sie einen stabilen Bereich von Interesse mit bemerkenswertem Blutfluss. Wählen Sie geeignete Bildaufnahmeparameter aus, einschließlich Bildformat, Aufnahmegeschwindigkeit, Bildintervalle, Gesamtaufnahmezeit und Zeilen-/Bildmittelwert (512 × 512 Pixel; 1–5 Bilder s⁻¹ pro Region; Bildintervalle von 5–30 Sekunden; Gesamtaufnahmezeit von 5–20 Minuten; Zeilen-/Frame-Durchschnitt von 2–8, abhängig von experimentellen Anforderungen). Optimieren Sie die Fluoreszenzblitzbelichtung, um die verwendeten Fluorophore zu berücksichtigen.
    2. Definieren Sie obere und untere Grenzen für Z-Stacks, indem Sie im Erfassungspanel Z-Stack auswählen, die oberen und unteren Brennebenen mit den Z-Positionssteuerungen anpassen und den Bereich mit Set First/Set Last bestätigen; starten Sie dann die Zeitrafferaufnahme durch Klicken auf Start Experiment (oder Start Acquisition). Nach Abschluss der Bildgebung wird das Tier gemäß den vom Komitee genehmigten Protokollen der institutionellen Tierpflege und Nutzung eingeschläfert.

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Abbildung 3: Messung der verbesserten hepatischen IVM-Stabilität von RHIT mit SSIM. Leber-IVM des unteren linken Leberlappens unter drei Stabilisierungsbedingungen: (A) kein Einsatz (KEINE), (B) Pappeinsatz und (C) RHIT. Gewebe sind mit BODIPY (Magenta, Lipide), Hoechst 33342 (grün, Kerne) und Dextran (cyan, Gefäße) gekennzeichnet; Die Panels A und B zeigen sichtbare Verzerrungen und Bewegungsartefakte, während C mit RHIT eine verbesserte Klarheit zeigt. (D) Der strukturelle Ähnlichkeitsindex (SSIM) wurde berechnet, um die Bildstabilität zu quantifizieren. Balken zeigen den Mittelwert ± SEM, und jeder farbige Punkt repräsentiert eine individuelle biologische Replikation: RHIT (n = 14), Karton (n = 10), Kein Einsatz (n = 8). Diese Gruppen sind Untergruppen, die aus der gesamten experimentellen Kohorte von etwa 50–70 Mäusen stammen. Nur Sitzungen, die spezifische Bildanforderungen erfüllten (z. B. konsistente Bildausrichtung und Bildqualität), wurden mittels SSIM analysiert. RHIT erzeugte durchweg höhere SSIM-Werte (Mittelwert 0,511 ± SEM), was auf eine verbesserte Stabilität und Auflösung unter Bildgebungsbedingungen hinweist. Skalenbalken = 15 μm. Repräsentative Bilder werden gezeigt; SSIM spiegelt serielle IVM-Sitzungen ohne sichtbare Gewebeschäden oder -störungen wider. Abkürzungen: RHIT = Reusable Hepatic Imaging Tool; IVM = intravitale Mikroskopie; SSIM = struktureller Ähnlichkeitsindex; KARTE = Pappeinsatz. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Ergebnisse

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RHIT wurde mit einer CAD-Anwendung entwickelt (Abbildung 1). Die RHIT-Maße sind skaliert, um kleine, mittelgroße und schwere Mäuse aufzunehmen (Tabelle 1). Das RHIT-Design besteht aus einem 107,50 mm langen ABS-Flachmaterial mit einer Öffnung, die so positioniert ist, dass Leberbildgebung aufgenommen werden kann. IVM wurde unter optimalen (RHIT) und suboptimalen (ohne Einsatz oder Pappe) Bedingungen durchgeführt (siehe A...

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Diskussion

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Die Leber-Intravitalmikroskopie wurde umfassend untersucht, jedoch erfordern frühere Methoden oft hochinvasive und nicht standardisierte chirurgische Eingriffe für stabilisierte terminale Bildgebung 5,6,7,9,31,32. Bewegung ist wohl die größte Barriere, die reproduzierbare Bildgebung bei der ...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde vom Intramural Research Program an den US National Institutes of Health, dem National Cancer Institute und der NIH-Bibliothek unterstützt. H. Sanchez Cornejo dankt der peruanischen Agentur CONCYTEC für die finanzielle Unterstützung durch Zuschuss Nr. PE501087367-2024-PROCIENCIA. Wir möchten den Mitgliedern des Porat-Shliom-Labors und den Mitarbeitern der University of Cambridge Quantum Physics Group für kritisches Lesen, dem NIH-Bibliothekspersonal und Geneti Gaga für die technische Unterstützung danken. Das 3D-gerenderte Bild in Abbildung 2A wurde mit Biorender erstellt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
½-Zoll Maskierband3M Allzweck-Klebeband:b40069428
40-mm-ÜberdeckungenBioptech40-1313-03191
70 % (v/v) EthanolThermo Fisher ScientificBP2818-470 % Ethanol nach Volumen und 30 % Wasser nach Volumen
Anästhesiemaschine: AMD-3 PlusSomniAMD-17106
Aquasonic 100 Ultraschall-TransmissionsgelParker Laboratories  01 08
BODIPY 665/67Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)B3932Siehe Tabelle 2
CAD-Software (Autodesk Inventor oder ein Äquivalent) Autodesk (repräsentative CAD-Software)n/aSoftware
KauteriesystemZwillingeGEM 5917
Clidox-DesinfektionsmittelPharmakale Forschungslabore GmbH.VWR, MSPP-96118F
Konfokales Mikroskop (Leica SP8 oder äquivalent)LeicaSP8
Applikatoren mit BaumwollspitzenPuritanische Medizinprodukte25-806 1WC
Maßgefertigtes Aluminium-Bühneneinsatz (3 mm dick, 35 mm Senkung)N/AN/A
FORANE (Isofluran, USP) Flüssigkeit zum Inhalieren, 250 mlBaxter10019-360-60
Haarschneider (optional)Onyx Fine InstrumentsASWRHC
Wärmekisse mit rektaler SondeALA Wissenschaftliche InstrumenteHEIZMATTE-1/2
Heparinnatrium, 1000 USP U/mLHikma0641-0391-12
Hoechst 33342Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)62249Siehe Tabelle 2
Maus-HeizmatteALA Wissenschaftliche InstrumenteHEIZMATTE-1/2
Mus musculusDas Jackson-LaborC57BL/6Labormaus
Kochsalzlösung (0,9 % Natriumchlorid)Thermo Fisher Scientific7210-16
RHIT (Reuseable Hepatic Imaging Tool) anwendbare GrößeBereitgestelltN/ASiehe Tabelle 1
Chirurgische Pinzette, gebogene SpitzeFeine wissenschaftliche Werkzeuge11251-23
Chirurgisches GazeMckesson6939
Chirurgische SchereFeine wissenschaftliche Werkzeuge14001-14
Tetramethylrhodamin DextranThermo Fisher Scientific (Invitrogen)D7139Siehe Tabelle 2
Ultrafeine U-100 Insulinspritzen, 31 gBetty MillsBD326730

Referenzen

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3D gedrucktes WerkzeugLeberbildgebungwiederverwendbare BildgebungsvorrichtungGewebestabilisierungkonfokale MikroskopieLipidtr pfchen BildgebungMauschirurgieBildreproduzierbarkeitStructural Similarity Index

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