Methodenartikel

Simultane 3D-Analyse von Herzschädigung und Immunantwort bei reperfundiertem akutem Myokardinfarkt mittels Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie

DOI:

10.3791/68347

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26. September 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology and Vascular Medicine, West German Heart and Vascular Center, University Hospital Essen, 2Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG, 3Institute for Experimental Immunology and Imaging, University Hospital, University Duisburg-Essen

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Die dreidimensionale (3D) Rekonstruktion von Herzschäden bei reperfundiertem akutem Myokardinfarkt (repAMI) ermöglicht eine getreue Quantifizierung und Co-Lokalisierung von assoziierten krankheitsbeeinflussenden Mustern. Hier wird ein automatisierbarer, lichtblattgeführter Bildgebungsansatz für die gleichzeitige Messung von Herzschäden, Risikobereichen und Immunzellantworten bereitgestellt.

Zusammenfassung

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Komplexe zelluläre Wechselwirkungen bestimmen den funktionellen und strukturellen Gewebeumbau während des reperfundierten akuten Myokardinfarkts (repAMI). Diese Prozesse zeigen eine ausgeprägte räumliche Verteilung, da der verletzte Herzmuskel in verschiedene Bereiche (Schadensbereich, Risikobereich (AAR)) und abgelegener Bereich) unterteilt wird. Die dreidimensionale (3D) Visualisierung dieser Bereiche ist essentiell für die Analyse verschiedener Wechselwirkungen zwischen residenten Herzzellen und infiltrierenden Immunzellen, um mögliche Behandlungsziele zu identifizieren. Hier wird ein Protokoll zur gleichzeitigen und automatisierbaren 3D-Visualisierung und Quantifizierung der kardialen Schädigungsfläche, der AAR, und der infiltrierenden Immunzellen (z.B. Neutrophile) nach repAMI beschrieben. Dazu gehören die intravitale Antikörper-vermittelte Färbung des kardialen Schädigungsbereichs (CD31neg) und die Neutrophileninfiltration (Ly6G+) nach ex vivo Visualisierung der AAR durch retrograde Antikörperperfusion sowie weitere nicht-toxische Gewebereinigung für die Bildgebung der Lichtblattfluoreszenzmikroskopie (LSFM). Diese Technik ermöglicht die räumliche Analyse von Zielzellen, z.B. infiltrierenden Immunzellen und geschädigten Bereichen in einem intakten Mausherz nach repAMI. Die traditionelle Histologie und Immunhistochemie kann nach der Reinigung des ungiftigen Gewebes und der Bildaufnahme mit computergestützter Nachbearbeitung durchgeführt werden. Dies ermöglicht das Multiplexing des Informationsgewinns innerhalb desselben Mausherzens, stärkt die Datenrobustheit und ist besonders wichtig bei einer hochkomplexen Verletzung wie repAMI.

Einleitung

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Die Gewebeverletzung beim reperfundierten akuten Myokardinfarkt (repAMI) ist der Haupttreiber für den kardialen Umbau und die Entwicklung einer Herzinsuffizienz1. Mehrere lokale Mediatoren und residente Herzzellen, aber auch infiltrierende Immunzellen beeinflussen seine Expansion in einem komplexen Zusammenspiel 2,3. Das Verständnis der räumlichen Organisation dieser Prozesse ist unerlässlich, um fundierte Erkenntnisse für die Identifizierung neuer Therapieziele zu gewinnen, um Gewebeverletzungen nach repAMI zu begrenzen und die Herzfunktion zu verbessern.

Da der Herzmuskel selbst aus verschiedenen Zelltypen besteht, ist eine detaillierte Analyse der Herzschädigung eine Herausforderung, da jeder Zelltyp seine eigene spezifische Widerstandsfähigkeit bei Ischämien und Reperfusionsschäden aufweist 4,5. Ein wichtiges Kennzeichen im Zusammenhang mit repAMI ist ein großer Verlust des Gefäßsystems, der mit einer Verschlechterung der Endothelzellfunktion einhergeht6. Der etablierteste Marker, der für die Darstellung der Gefäßstruktur und die Analyse der endothelialen Dysfunktion bei Mäusen und Menschen verwendet wird, ist CD31 (auch bekannt als PECAM-1), ein Adhäsionsmolekül, das auf der Endothelzelloberfläche exprimiertwird 7. In verschiedenen Ischämie-/Reperfusionsmodellen erwies sich der Verlust von CD31 als guter Surrogatmarker für die Unterscheidung von Endothelgewebsschäden 8,9,10. Darüber hinaus werden während der repAMI drei Hauptverletzungskompartimente im gesamten Herzen unterschieden. Herzgewebe, das nicht von Ischämie/Reperfusion (I/R) betroffen ist, stellt den abgelegenen Bereich dar. Das Myokard stromabwärts eines Gefäßverschlusses wird als Risikobereich (AAR) definiert11,12. Nach Beginn der Reperfusion kann innerhalb der AAR ein bestimmter Bereich des Herzgewebes differenziert werden, der durch die vorangegangene Ischämie geschädigt wurde (Schadensbereich)13. Bei der konventionellen Beurteilung der kardialen I/R-Schädigung bei Mäusen wird Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) in seriellen Dickschnitten verwendet, die eine verminderte metabolische Aktivität geschädigter Herzzellen zeigen13,14. Gleichzeitig kann ex vivo die Bläuefärbung von evan für die Bestimmung von AAR15 hinzugefügt werden. Diese etablierten Methoden weisen jedoch mehrere Einschränkungen auf, darunter die eingeschränkte Möglichkeit der Co-Bewertung der Immunzellinfiltration, die Unterscheidung zelltypspezifischer Verletzungen und die genaue 3D-Geweberekonstruktion.

Die Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie (LSFM) ermöglicht es, intakte, geklärte ganze Mausorgane mit einer Fluoreszenzsignalauflösung bis auf die zelluläre Ebene sichtbar zu machen. Vor kurzem wurde eine verbesserte nicht-toxische Gewebereinigungsmethode mit Ethylzimat (ECi) für die 3D-Visualisierung von intakten Mausherzen eingeführt8. Um die Einschränkungen der TTC/Evan-Blaufärbung zu beheben, wurde eine intravitale Antikörper-basierte CD31-Fluoreszenzfärbung verwendet, die kardiale Endothelverletzungen als Bereiche ohne CD31-Färbung (CD31neg) während repAMI8 aufdeckte. Die zusätzliche Verabreichung einer ex vivo retrograden Aorteninjektion mit einem Fluorophor-konjugierten Anti-CD31-Antikörper mit einem anderen Fluoreszenzspektrum als bei der intravitalen Färbung erklärt die gleichzeitige 3D-Darstellung der AAR. Darüber hinaus kann diese Methode durch Hinzufügen von Neutrophilenfärbung erweitert werden, was eine Analyse der Zellverteilung nach entferntem Bereich, AAR und kardialem Endothelverletzungsvolumen ermöglicht, um das Verständnis der Neutrophilenfunktion während der repAMI zu verbessern.

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Protokoll

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Alle Versuchstierverfahren wurden von der zuständigen lokalen Regierungsbehörde (AZ 81-02.04.2023.A059 - Landesamt für Natur-, Umwelt- und Verbraucherschutz (LANUV)) genehmigt und entsprachen allen relevanten ethischen Vorschriften für Tierversuche und Forschung. Die Experimente wurden mit männlichen C57BL/6J-Mäusen (im Alter von 9-30 Wochen) durchgeführt. Die Tiere wurden unter spezifischen pathogenfreien (SPF) Bedingungen im örtlichen Tierhaus im 12 h/12 h Tag- und Nachtzyklus untergebracht und eingesetzt.

HINWEIS: Alle chirurgischen Eingriffe wurden unter intraperitonealer Induktion der Anästhesie mit Ketamin (100 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg) unter Verwendung von Isofluran (1,5 Vol%) durchgeführt. Um das Leiden der Tiere zu verringern, erhielten alle Tiere tagsüber subkutane Injektionen von 0,1 mg/kg Buprenorphin vor und nach der Anästhesie in Kombination mit Buprenorphin-haltigem Trinkwasser über Nacht. Das chirurgische Protokoll zur Einleitung von repAMI wurde bereits an anderer Stelle beschrieben16,17. Bevor Sie mit der intravitalen Antikörperinjektion beginnen, bereiten Sie zwei 6 cm große Petrischalen vor, die in den späteren Schritten unten beschrieben für die ex vivo retrograde Antikörperinjektion verwendet werden. Eine flache Petrischale mit PBS auf Eis wird benötigt, um überschüssiges umgebendes Gewebe aus dem Herzen grob zu entfernen (es wird empfohlen, zugeschnittene Gazestücke in der Schale zu verwenden, um die spätere Handhabung zu erleichtern). Eine weitere Schale wird für die Kanülierung der Aorta mit einer 20 G stumpfen Stahlkanülennadel benötigt, die in PBS auf Eis mit einem losen Knoten aus 5-0-Naht über der Kanülenkerbe getaucht ist. Vermeiden oder entfernen Sie Luftblasen in der Kanüle, da sie die Herzkranzgefäße verstopfen und eine vollständige Durchblutung verhindern können.

1. Intravitale Antikörper-Injektion

  1. Betäuben Sie die Maus mit Ketamin (100 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg).
  2. Injizieren Sie jeweils 10 μg direkt markierte Maus-Anti-CD31- (Klon: MEC13.3; Fluorophor: AlexaFluor 790) und Maus-Anti-Ly6G-Antikörper (Klon: 1A8; Fluorophor: AlexaFluor 647) in PBS mit einem Gesamtvolumen von 5 μl pro g Körpergewicht (100 μl für eine 20-g-Maus) durch intravenöse Schwanzveneninjektion.
    HINWEIS: Diese Antikörperinjektion markiert das gesamte Endothel im Herzen und dient zur Quantifizierung der Größe der repAMI-Verletzung.
  3. Lassen Sie die injizierten Antikörper 10 Minuten lang zirkulieren, bevor Sie den Eingriff fortsetzen.

2. Herzentnahme

HINWEIS: Die Abschnitte 2 und 3 sind zeitkritisch und müssen in weniger als 6 Minuten abgeschlossen werden.

  1. Das Tier wird 10 Minuten nach der Antikörperinjektion durch Zervixluxation getötet. Überprüfen Sie den Tod, indem Sie Reflexe beurteilen.
    HINWEIS: Wenn Blutproben benötigt werden, entnehmen Sie diese, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.
  2. Platzieren Sie die Maus unter einem Stereomikroskop.
  3. Öffnen Sie die Brusthöhle und schneiden Sie die freiliegende obere Hohlvene in der Nähe des Gefäßaustritts vom Brustkorb zum Hals an.
    HINWEIS: Lassen Sie die Aorta intakt, da sie für die ex vivo Injektion von retrograden Antikörpern benötigt wird.
  4. Perfundieren Sie die Herzen in situ über die rechte und linke Vorhofohrmuschel mit heparinhaltigem PBS (20 IE/ml) unter Verwendung einer 27 G Nadel mit einer Rollenpumpe (70 μL/s) für insgesamt 3 min. Eine ausreichende kardiale Blutentnahme macht sich durch das Verblassen der oberflächlichen Gefäßzeichnung des Herzens und die Aufhellung von Lunge und Leber bemerkbar.
    HINWEIS: Vermeiden Sie eine Herzperfusion über den rechten oder linken Ventrikel, da dies bei der Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie zu bildgebenden Artefakten führen kann.
  5. Das Herz und mindestens 5 mm der verbleibenden Aorta zusammen mit dem umgebenden Lungengewebe herausschneiden.
    HINWEIS: Halten Sie den Herzmuskel während der Exzision nicht direkt fest, um Gewebeschäden und bildgebende Artefakte während der Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie zu vermeiden.

3. Ex-vivo-Injektion von retrograden Antikörpern

  1. Das Herz in eine 6 cm große Petrischale mit eiskaltem PBS und zuvor vorbereiteter Gaze geben.
  2. Schneiden Sie das restliche umliegende Lungen-, Fett- und Gefäßgewebe ab, bis nur noch das Herz mit ca. 5 mm Aorta übrig bleibt.
  3. Übertragen Sie das Herz in die vorbereitete Schüssel für die Aortenkanülierung.
  4. Ziehen Sie die verbleibende Aorta über die 20 G stumpfe Stahlkanüle und binden Sie sie mit der Naht pre-knot 50 an die Kanülenkerbe.
    HINWEIS: Die Kanülenspitze sollte nahe an die Aortenklappe geschoben werden, um sicherzustellen, dass keine Perfusionsflüssigkeit austritt.
  5. Ligieren Sie die linke vordere absteigende Arterie (LAD) dauerhaft mit einer 6-0-Naht an genau der Stelle, die zuvor für die Induktion von repAMI verwendet wurde.
  6. Injizieren Sie 400 μl PBS mit 20 μg Maus-Anti-CD31-Antikörper (Klon: MEC13.3), markiert mit AlexaFluor 546, retrograd über eine eingeführte Kanüle.
    HINWEIS: Verschließen Sie die Verbindungsstelle zwischen der Injektionsspritze und der eingeführten Kanüle mit einer Dichtungsfolie, um eine vollständige Antikörperperfusion über die Herzkranzgefäße zu gewährleisten. Diese Antikörperinjektion färbt nur das Endothel außerhalb des AAR und kann daher für die AAR-Quantifizierung verwendet werden.
  7. Ziehen Sie die eingeführte Kanüle aus der Aorta heraus.
  8. Das Herz wird in ein 15-ml-Reaktionsröhrchen aus Polypropylen mit 10 ml 4 % Paraformaldehyd (PFA) umgefüllt und ohne Rühren über Nacht bei 4 °C im Dunkeln inkubiert.

4. Probenverarbeitung und -freigabe

  1. Das fixierte Herz in drei Wechseln von je 5 mL PBS für 10 min bei Raumtemperatur (RT) im Dunkeln waschen, immer unter Rühren mit nahezu Überkopfrotation in 5 mL Polypropylen-Reaktionsröhrchen.
  2. Dehydrieren Sie das fixierte Herz in 5 mL aufsteigender Ethanolreihe bei 50 %, 70 % und 100 % in deionisiertem Wasser, jeweils für mindestens 2 h bei RT im Dunkeln, immer unter Rühren mit nahezu Überkopfrotation in 5 mL Polypropylen-Reaktionsgefäßen.
    HINWEIS: Die Inkubation in 50 % und 70 % Ethanol kann bis zum nächsten Tag verlängert werden, während die Inkubation in 100 % Ethanol bis zu 3 Tage verlängert werden kann.
  3. Dehydriertes Herz in 15 mL Polypropylen-Reaktionsröhrchen mit 10 mL 100 % Ethanol mit 5 % DMSO und 5 % H2O2 ohne Rühren für 4 h im Dunkeln bleichen.
    HINWEIS: Während des Bleichvorgangs kann sich Druck im Inneren der Tube aufbauen; Seien Sie vorsichtig, wenn Sie die Tube danach öffnen.
  4. Waschen Sie das gebleichte Herz dreimal für jeweils 12 Stunden bei RT im Dunkeln in 5 ml 100%igem Ethanol und rühren Sie dabei immer mit nahezu Überkopfdrehung in 5 mL Polypropylen-Reaktionsröhrchen.
    HINWEIS: Jeder Inkubationsschritt kann um bis zu 3 Tage verlängert werden.
  5. Das Herz wird zur Gewebereinigung in ein 5-ml-Polypropylen-Reaktionsröhrchen mit 4 ml Ethylcinnesat (ECi) überführt und 3 Tage lang ohne Rühren bei RT im Dunkeln inkubiert.
    HINWEIS: Das gereinigte Herz kann bei korrekter Lagerung im Dunkeln bei RT mindestens 3 Monate lang in ECi verbleiben, ohne dass die Fluoreszenzintensität abnimmt. Lagern Sie ECi oder in ECi gelagerte Proben nicht unter 6 °C, da ECi bei dieser Temperatur gefriert und die Probe dabei schädigt.

5. Zubereitung von Gellan-Kaugummiblöcken

  1. Mischen Sie 1 g Gellan-Pulver in 100 ml erhitztem Leitungswasser (50-60 °C).
  2. Mischen lassen, bis es sich mit einem Magnetrührer vollständig aufgelöst hat.
    HINWEIS: Wenn sich das Pulver nicht richtig auflöst, erhitzen Sie die Lösung, bis sie in der Mikrowelle kocht.
  3. Filtrieren Sie die Gellan-Kaugummilösung durch ein 100 μm Zellsieb.
  4. Die filtrierte Lösung in eine flache 10 cm große Petrischale geben.
  5. Abkühlen lassen, bis das Gel ausgehärtet ist.
  6. Schneiden Sie das Gel in Blöcke von 15 mm 15 mm 5 mm.
  7. Dörrblöcke in 50 mL aufsteigender Ethanolreihe bei 50 % und 70 % in deionisiertem Wasser, jeweils für mindestens 2 h bei RT, immer mit nahezu Überkopfdrehung in einem 50 mL Polypropylen-Reaktionsröhrchen.
    HINWEIS: Füllen Sie das Reaktionsröhrchen mit Ethanol, nachdem Sie Gelblöcke hinzugefügt haben. Füllen Sie das Reaktionsgefäß nur zur Hälfte mit Gelblöcken.
  8. Dehydrierte Blöcke in 50 mL 100 % Ethanol dreimal für jeweils 12 h bei RT inkubieren, wobei Sie immer mit nahezu Überkopfdrehung in einem 50 mL Polypropylen-Reaktionsröhrchen rühren.
    HINWEIS: Füllen Sie das Reaktionsröhrchen mit Ethanol, nachdem Sie Gelblöcke hinzugefügt haben. Füllen Sie das Reaktionsgefäß nur zur Hälfte mit Gelblöcken. Gelblöcke können im letzten Reaktionsröhrchen mit 100 % Ethanol für längere Zeit verbleiben, bis sie in ECi freigegeben sind.
  9. Die Blöcke werden in ein 50-ml-Polypropylen-Reaktionsröhrchen mit 25 ml ECi überführt und 3 Tage lang ohne Rühren bei RT inkubiert.
    HINWEIS: Geben Sie nur wenige Blöcke in ein Reaktionsgefäß mit ECi, um das Entfernen von Artefakten zu vermeiden. Gelöschte Blöcke können mindestens 6 Monate in ECi verbleiben und bei RT gelagert werden.

6. Bildgebung

  1. Schneiden Sie die gereinigten Gellan-Kaugummiblöcke auf die Größe zu, die zur Stabilisierung des gereinigten Herzens im Probenhalter des Mikroskops erforderlich ist.
    HINWEIS: Gellan-Gummiblöcke können mehrfach wiederverwendet werden.
  2. Detektieren Sie interessierende Fluoreszenzsignale (Autofluoreszenz, AAR-Färbung [Anti-CD31-Antikörper, markiert mit AlexaFluor 546], AlexaFluor647-gekoppelter Anti-Ly6G-Antikörper und CD31-Neg-Färbung [Anti-CD31-Antikörper, markiert mit AlexaFluor 790]) mit geeigneten Anregungs- und Emissionsfiltereinstellungen. Verwenden Sie für die Erfassung ein Objektiv mit 0,1 NA und einem Arbeitsabstand von 17,6 mm.
    HINWEIS: Erfassen Sie Signale mit einem Weißlichtlaser (200 mW; 480-2400 nm). Für die Detektion von aus Bindegewebe gewonnener Autofluoreszenz ist ein 470/30 nm Bandpass-Anregungsfilter und ein 525/50 nm Bandpass-Emissionsfilter zu verwenden; CD31-Färbungen mit einem AlexaFluor 546-gekoppelten Antikörper werden mit einem 520/40 nm Bandpass-Anregungsfilter und einem 585/40 nm Bandpass-Emissionsfilter detektiert; Die Ly6G-Färbung mit einem AlexaFluor 647-gekoppelten Antikörper wird mit einem 630/30 nm Bandpass-Anregungsfilter und einem 680/30 nm Bandpass-Emissionsfilter detektiert; CD31-Färbungen mit einem AlexaFluor 790-gekoppelten Antikörper werden mit einem 740/40 nm Bandpass-Anregungsfilter und einem 824/55 nm Bandpass-Emissionsfilter detektiert. Die Beleuchtungszeiten und der Prozentsatz der Laserdämpfung müssen je nach Signalqualität angepasst werden.
  3. Wählen Sie die folgenden Einstellungen für die Lichtblattmikroskopie:
    1. Wählen Sie eine Blech-NA von 0,079, was zu einer geringen Blechdicke von 5 μm führt.
    2. Wählen Sie 10 μm als Abstand zwischen zwei einzelnen Z-Ebenen.
      HINWEIS: Dies führt zu einer Unterabtastung und einem anschließenden Genauigkeitsverlust bei der Verfolgung und Volumenmessungen. Um dies zu vermeiden, sollte der Abstand zwischen zwei einzelnen Z-Ebenen der halben Lichtblechdicke entsprechen, in diesem Fall also 2,5 μm. In dieser Studie wurde eine Unterstichprobe der Daten gewählt, da die Vorteile durch die Reduzierung der Bildgebungszeit und der Größe des Datenstapels den minimalen Verlust der Analysegenauigkeit überwiegen.
    3. Verwenden Sie eine Blechbreite von 100 %, um eine homogene Ausleuchtung der Probe zu erhalten.

7. Nachbearbeitung von Bildern

HINWEIS: Die erfassten digitalen Bilddaten wurden mit einer wissenschaftlichen 3D-Bildverarbeitungs- und Analysesoftware weiterverarbeitet, die in der Materialtabelle aufgeführt ist.

  2. Wählen Sie den Ausgabeordner über Ordner auswählen aus.
  3. Klicken Sie auf Alle starten und warten Sie, bis die Dateien in IMS-Imaris-Dateien konvertiert wurden.
  4. Starten Sie die Software und wählen Sie in der oberen linken Ecke Surpass aus.
  5. Öffnen Sie Image-Stacks, indem Sie Open (Öffnen ) wählen und die entsprechende .ims-Datendatei auswählen.
  6. Um eine automatisch generierte Oberfläche des gesamten Herzens zu erstellen, wählen Sie 3D-Ansicht und Oberflächen.
  7. Wählen SieSegment only a Region of Interest, Total Image final process (Gesamtes Bild endgültig verarbeiten) und Objekt-Objekt-Statistik (Objekt-Objekt-Statistik ), während Sie die Option "Oberflächen klassifizieren " im Abschnitt "Algorithmus-Einstellungen " deaktivieren.
    HINWEIS: Die Aktivierung der Objekt-Objekt-Statistik ermöglicht die Überlagerungsberechnung verschiedener Oberflächen und Punktfunktionen.
  8. Klicken Sie auf die blaue Pfeilschaltfläche in der unteren rechten Ecke des Blattes erstellen , um mit den nächsten Schritten fortzufahren.
  9. Bestimmen Sie den dreidimensionalen Interessenbereich mithilfe der Manipulatoren, die in der Bildansicht angezeigt werden.
  10. Fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort, indem Sie den Quellkanal (Autofluoreszenzkanal) auswählen.
  11. Aktivieren Sie Glätten , und wählen Sie die Standardeinstellung von 11,8 μm.
  12. Fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort und bestimmen Sie den Schwellenwert, der erforderlich ist, um eine optisch zufriedenstellende dreidimensionale Oberfläche zu erzeugen, die in der Bildansicht erscheint.
  13. Passen Sie im letzten Schritt den Oberflächenfilter an, indem Sie Anzahl der Voxel als Filtertyp und 10 als Schwellenwert festlegen.
  14. Erstellen Sie eine Oberfläche, indem Sie auf die grüne Pfeilschaltfläche in der unteren rechten Ecke des Abschnitts Erstellen klicken. Ändern Sie mithilfe des Farbblatts das Material und die Farbe der erstellten Oberfläche nach Bedarf.
  15. Generieren Sie zwei zusätzliche manuell erstellte Oberflächen für AAR (CD31neg-Volumen im AlexaFluor 546-Kanal) und kardiales Endothelverletzungsvolumen (CD31neg-Volumen im AlexaFluor 790-Kanal), indem Sie erneut 3D-Ansicht und Oberflächen auswählen.
  16. Wählen Sie Segmentieren Sie nur einen Interessenbereich, Gesamtes Bild abschließend verarbeiten und Objekt-Objekt-Statistik , während Sie Oberflächen klassifizieren im Abschnitt Algorithmus-Einstellungen deaktivieren, und klicken Sie auf Automatische Erstellung überspringen, manuell bearbeiten.
  17. Wählen Sie im Platinenblatt XY für die Ausrichtung und Keine für die Sichtbarkeit aus, und stellen Sie den Auflösungsregler manuell auf Maximum ein.
  18. Wechseln Sie zum Modellblatt , klicken Sie auf das Symbol Abstand und stellen Sie den Scheitelpunktabstand auf 100 μm ein.
  19. Aktivieren Sie CD31-Neg-Bereiche im AlexaFluor 546-Kanal oder im AlexaFluor 790-Kanal alle 10 Bildsegmente zeichnen und einkreisen.
  20. Nachdem Sie alle entsprechenden Bereiche eingekreist haben, wählen Sie Automatisch anpassen und Automatische Anpassung durchführen.
  21. Klicken Sie auf Fläche erstellen , und passen Sie das Material und die Farbe der generierten Flächen im Farbblatt an.
  22. Um Neutrophile als Ly6G+ -Flecken anzuzeigen, generieren Sie eine Spot-Funktion, indem Sie 3D-Ansicht und Spots auswählen.
  23. Wählen Sie "Nur einen Interessenbereich segmentieren", "Gesamtes Bild abschließend verarbeiten" und "Objekt-Objekt-Statistik " aus, während Sie die Option "Punkte klassifizieren " im Abschnitt "Algorithmuseinstellungen " deaktivieren.
  24. Fahren Sie mit den nächsten Schritten fort, indem Sie den blauen Pfeil in der unteren rechten Ecke des Blattes "Erstellen " verwenden.
  25. Bestimmen Sie den dreidimensionalen Interessenbereich mit den Manipulatoren, die wie oben erwähnt in der Bildansicht angezeigt werden.
  26. Fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort, indem Sie den Quellkanal (AlexaFluor 647-Kanal) verwenden.
  27. Legen Sie den geschätzten XY-Durchmesser auf 10 μm fest, aktivieren Sie die Modell-PSF-Dehnung entlang der Z-Achse, und stellen Sie den geschätzten Z-Durchmesser auf 20 μm ein.
  28. Deaktivieren Sie die Hintergrundsubtraktion.
  29. Fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort, wählen Sie Intensität Min als Filter aus und legen Sie einen geeigneten Schwellenwert fest.
    HINWEIS: Um den Schwellenwert zu schätzen, klicken Sie im oberen Bereich des Programmfensters auf Slice und wählen Sie den Kanal AlexaFluor 647 aus. Bewegen Sie den Cursor über verschiedene Stellen in der Rohbildschicht, die eine positive Ly6G-Färbung darstellen, und lesen Sie den Intensitätswert in der unteren linken Ecke des Programmfensters ab.
  30. Generieren Sie Punkte, indem Sie auf die grüne Pfeilschaltfläche in der unteren rechten Ecke des Create-Blatts klicken.
  31. Legen Sie den Radiusmaßstab im Abschnitt "Punktstil/Qualität" des Create-Blatts auf 3,0 fest.
  32. Zum Farbblatt gelangt, um die Sonderfarbe wie gewünscht anzupassen.

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Ergebnisse

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Der vorgestellte Ansatz mit Hilfe der Lichtblattfluoreszenzmikroskopie (LSFM) ermöglicht die gleichzeitige Analyse von AAR, Endothelverletzung und Neutrophileninfiltration nach repAMI. Abbildung 1A zeigt die intravitale und ex vivo Antikörperfärbung von C57BL/6J-Mäusen 24 h nach Induktion von repAMI. Antikörper zur Färbung von kardialen Endothelschäden (Anti-CD31, markiert mit AlexaFluor 790) und Neutrophileninfiltration (Anti-Ly6G, markiert mit AlexaFluor 647) wurden 10 Minuten vor...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Es gibt mehrere bildgebende Einrichtungen, um Verletzungen des Herzgewebes während der RepAMI bei Mäusen zu erkennen. Diese Techniken bieten unterschiedliche Vorteile, bergen aber auch Grenzen. Die Färbung der verminderten metabolischen Aktivität von Herzzellen mittels TTC ist die am häufigsten verwendete Methode zur Quantifizierung von kardialen I/R-Verletzungen und kann mit der Evan-Blaufärbung zur Unterscheidung von AAR 13,14,15 kombiniert werden.

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Elias Haj-Yehia berichtet über persönliche Honorare und andere von AstraZeneca, die außerhalb der eingereichten Arbeit liegen. Simon F. Merz und Lea Bornemann sind derzeit bei der Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG beschäftigt. Matthias Totzeck und Tienush Rassaf berichten über persönliche Honorare, andere von Edwards und Novartis, Bristol Myers Squibb, Bayer, Daiichi Sankyo und Astra Zeneca, die außerhalb der eingereichten Arbeit liegen. Tienush Rassaf und Ulrike B. Hendgen-Cotta sind Mitbegründer von Bimyo, einem Unternehmen, das sich auf die Entwicklung von kardioprotektiven Peptiden konzentriert. Matthias Gunzer erhielt eine allgemeine Forschungsförderung von der Miltenyi BioTec B.V. & Co. KG. Alle anderen Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren nennen folgende Förderquellen: Deutsche Forschungsgemeinschaft (UMEA Clinician Scientist, FU 356/12-2, Elias Haj-Yehia; HE6317/2-1, Ulrike Hendgen-Cotta, RA969/12-1, Tienush Rassaf) and German Cardiac Society (DGK, Deutsche Gesellschaft für Kardiologie - Herz- und Kreislaufforschung e.V., DGK02/2022, Elias Haj-Yehia). Ein Teil dieser Arbeiten wurde am Imaging Center Essen (IMCES) durchgeführt, einer Service Core Facility der Medizinischen Fakultät der Universität Duisburg-Essen, Deutschland. Wir danken den Mitarbeitern des IMCES für ihre kontinuierliche technische Unterstützung und den Einsatz ihrer Instrumente.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
27 g NadelBecton Dickinson305889BD Finsternis
3D-Bildverarbeitung & Analyse-SoftwareBitplaneVers. 10.1.0Imaris
5-0 NahtSerag-WiessnerIC108000Seide
6-0 NahtEthikonEH7814Prolene
AlexaFluor 546 Antikörper-MarkierungskitInvitrogenNr. A20183
AlexaFluor 790 Antikörper-MarkierungskitInvitrogenNr. A20189
Anti-Maus-Ly6G-Antikörper (AlexaFluor 647)Biolegende127610Klon: 1A8
Zellsieb (100 & Mikro; m)Corning431752
Dimethylsulfoxid (DMSO)Carl Roth7029.1
EthanolCarl Roth0911.4
Ethylcinnesat (ECi)Sigma-Aldrich112372
Software zur DateikonvertierungBitplaneVers. 10.1.0Imaris
GazeFuhrmann10021
Gellan Gummi PulverSigma-AldrichNr. P8169Gattung Phytagel
Heparin (25.000 IE/5 ml)LEO Pharma15261203
Wasserstoffperoxid (H2O2, 30%)Carl Roth8070.2
InjektionsspritzeB Braun9161502SOmnican F
Ketamin (100 mg/ml)Bela-Pharma402581.00.00
Lichtblatt-MikroskopsystemMiltenyi Biotec-UltraMikroskop Blaze
Luer-Lock-SpritzeBecton Dickinson303172BD Plastipak
MagnetrührerVWR444-0572
Neo sCMOS-Kamera (4,2 MP)Andor-TechnologieZL41 Zelle 4.2
ObjektivMiltenyi Biotec130-133-625MI Plan 1.1x NA 0.1, WD 17.6 mm
Paraformaldehyd (PFA, 4%)Sigma-Aldrich1.0049610% Formalin, neutral gepuffert
PetrischaleGreiner Bio-One632181
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)Gibco14190-094Ohne MgCl2/CaCl2
Röhrchen aus Polypropylen (15 mL)Greiner Bio-One188261
Röhrchen aus Polypropylen (5 mL)Carl RothEKY9.1Schwarz
Röhrchen aus Polypropylen (50 mL)Greiner Bio-One227261
Zubereitungsschale für die Kanülierung des MausherzensHugo Sachs Elektronik73-4327Inklusive Kanüle
Gereinigter Anti-Maus-CD31-AntikörperBecton Dickinson53369Klon: MEC13.3
RollenpumpeIsmatecISM597-230
SiegelfolieBemisPM-996Parafilm
StereomikroskopLeicaS6D
Rotator für RohreHeidolphPolymax 1040
WeißlichtlaserNKT PhotonikSuperK extrem200 mW, 480– 2400 nm
WT-Maus-StammJanvier Labs-C57BL/6JRj
Xylazin (2%)Ceva Tiergesundheit6324464.00.00

Referenzen

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