Methodenartikel

Simultane 3D-Analyse von Herzschädigung und Immunantwort bei reperfundiertem akutem Myokardinfarkt mittels Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie

DOI:

10.3791/68347

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26. September 2025

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1Department of Cardiology and Vascular Medicine, West German Heart and Vascular Center, University Hospital Essen, 2Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG, 3Institute for Experimental Immunology and Imaging, University Hospital, University Duisburg-Essen

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Die dreidimensionale (3D) Rekonstruktion von Herzschäden bei reperfundiertem akutem Myokardinfarkt (repAMI) ermöglicht eine getreue Quantifizierung und Co-Lokalisierung von assoziierten krankheitsbeeinflussenden Mustern. Hier wird ein automatisierbarer, lichtblattgeführter Bildgebungsansatz für die gleichzeitige Messung von Herzschäden, Risikobereichen und Immunzellantworten bereitgestellt.

Zusammenfassung

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Komplexe zelluläre Wechselwirkungen bestimmen den funktionellen und strukturellen Gewebeumbau während des reperfundierten akuten Myokardinfarkts (repAMI). Diese Prozesse zeigen eine ausgeprägte räumliche Verteilung, da der verletzte Herzmuskel in verschiedene Bereiche (Schadensbereich, Risikobereich (AAR)) und abgelegener Bereich) unterteilt wird. Die dreidimensionale (3D) Visualisierung dieser Bereiche ist essentiell für die Analyse verschiedener Wechselwirkungen zwischen residenten Herzzellen und infiltrierenden Immunzellen, um mögliche Behandlungsziele zu identifizieren. Hier wird ein Protokoll zur gleichzeitigen und automatisierbaren 3D-Visualisierung und Quantifizierung der kardialen Schädigungsfläche, der AAR, und der infiltrierenden Immunzellen (z.B. Neutrophile) nach repAMI beschrieben. Dazu gehören die intravitale Antikörper-vermittelte Färbung des kardialen Schädigungsbereichs (CD31neg) und die Neutrophileninfiltration (Ly6G+) nach ex vivo Visualisierung der AAR durch retrograde Antikörperperfusion sowie weitere nicht-toxische Gewebereinigung für die Bildgebung der Lichtblattfluoreszenzmikroskopie (LSFM). Diese Technik ermöglicht die räumliche Analyse von Zielzellen, z.B. infiltrierenden Immunzellen und geschädigten Bereichen in einem intakten Mausherz nach repAMI. Die traditionelle Histologie und Immunhistochemie kann nach der Reinigung des ungiftigen Gewebes und der Bildaufnahme mit computergestützter Nachbearbeitung durchgeführt werden. Dies ermöglicht das Multiplexing des Informationsgewinns innerhalb desselben Mausherzens, stärkt die Datenrobustheit und ist besonders wichtig bei einer hochkomplexen Verletzung wie repAMI.

Einleitung

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Die Gewebeverletzung beim reperfundierten akuten Myokardinfarkt (repAMI) ist der Haupttreiber für den kardialen Umbau und die Entwicklung einer Herzinsuffizienz1. Mehrere lokale Mediatoren und residente Herzzellen, aber auch infiltrierende Immunzellen beeinflussen seine Expansion in einem komplexen Zusammenspiel 2,3. Das Verständnis der räumlichen Organisation dieser Prozesse ist unerlässlich, um fundierte Erkenntnisse für die Identifizierung neuer Therapieziele zu gewinnen, um Gewebeverletzungen nach repAMI zu begrenzen und die Herzfunktion zu verbesse....

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Protokoll

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Alle Versuchstierverfahren wurden von der zuständigen lokalen Regierungsbehörde (AZ 81-02.04.2023.A059 - Landesamt für Natur-, Umwelt- und Verbraucherschutz (LANUV)) genehmigt und entsprachen allen relevanten ethischen Vorschriften für Tierversuche und Forschung. Die Experimente wurden mit männlichen C57BL/6J-Mäusen (im Alter von 9-30 Wochen) durchgeführt. Die Tiere wurden unter spezifischen pathogenfreien (SPF) Bedingungen im örtlichen Tierhaus im 12 h/12 h Tag- und Nachtzyklus untergebracht und eingesetzt.

HINWEIS: Alle chirurgischen Eingriffe wurden unter intraperitonealer Induktion der Anästhesie mit Ke....

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Ergebnisse

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Der vorgestellte Ansatz mit Hilfe der Lichtblattfluoreszenzmikroskopie (LSFM) ermöglicht die gleichzeitige Analyse von AAR, Endothelverletzung und Neutrophileninfiltration nach repAMI. Abbildung 1A zeigt die intravitale und ex vivo Antikörperfärbung von C57BL/6J-Mäusen 24 h nach Induktion von repAMI. Antikörper zur Färbung von kardialen Endothelschäden (Anti-CD31, markiert mit AlexaFluor 790) und Neutrophileninfiltration (Anti-Ly6G, markiert mit AlexaFluor 647) wurden 10 Minuten vor.......

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Diskussion

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Es gibt mehrere bildgebende Einrichtungen, um Verletzungen des Herzgewebes während der RepAMI bei Mäusen zu erkennen. Diese Techniken bieten unterschiedliche Vorteile, bergen aber auch Grenzen. Die Färbung der verminderten metabolischen Aktivität von Herzzellen mittels TTC ist die am häufigsten verwendete Methode zur Quantifizierung von kardialen I/R-Verletzungen und kann mit der Evan-Blaufärbung zur Unterscheidung von AAR 13,14,15 kombiniert werden.

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Offenlegungen

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Elias Haj-Yehia berichtet über persönliche Honorare und andere von AstraZeneca, die außerhalb der eingereichten Arbeit liegen. Simon F. Merz und Lea Bornemann sind derzeit bei der Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG beschäftigt. Matthias Totzeck und Tienush Rassaf berichten über persönliche Honorare, andere von Edwards und Novartis, Bristol Myers Squibb, Bayer, Daiichi Sankyo und Astra Zeneca, die außerhalb der eingereichten Arbeit liegen. Tienush Rassaf und Ulrike B. Hendgen-Cotta sind Mitbegründer von Bimyo, einem Unternehmen, das sich auf die Entwicklung von kardioprotektiven Peptiden konzentriert. Matthias Gunzer erhielt eine allgemeine Forschungsförderung von der Miltenyi BioTec B.V. & Co. KG. Alle anderen Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.

Danksagungen

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Die Autoren nennen folgende Förderquellen: Deutsche Forschungsgemeinschaft (UMEA Clinician Scientist, FU 356/12-2, Elias Haj-Yehia; HE6317/2-1, Ulrike Hendgen-Cotta, RA969/12-1, Tienush Rassaf) and German Cardiac Society (DGK, Deutsche Gesellschaft für Kardiologie - Herz- und Kreislaufforschung e.V., DGK02/2022, Elias Haj-Yehia). Ein Teil dieser Arbeiten wurde am Imaging Center Essen (IMCES) durchgeführt, einer Service Core Facility der Medizinischen Fakultät der Universität Duisburg-Essen, Deutschland. Wir danken den Mitarbeitern des IMCES für ihre kontinuierliche technische Unterstützung und den Einsatz ihrer Instrumente.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
27 g NadelBecton Dickinson305889BD Finsternis
3D-Bildverarbeitung & Analyse-SoftwareBitplaneVers. 10.1.0Imaris
5-0 NahtSerag-WiessnerIC108000Seide
6-0 NahtEthikonEH7814Prolene
AlexaFluor 546 Antikörper-MarkierungskitInvitrogenNr. A20183
AlexaFluor 790 Antikörper-MarkierungskitInvitrogenNr. A20189
Anti-Maus-Ly6G-Antikörper (AlexaFluor 647)Biolegende127610Klon: 1A8
Zellsieb (100 & Mikro; m)Corning431752
Dimethylsulfoxid (DMSO)Carl Roth7029.1
EthanolCarl Roth0911.4
Ethylcinnesat (ECi)Sigma-Aldrich112372
Software zur DateikonvertierungBitplaneVers. 10.1.0Imaris
GazeFuhrmann10021
Gellan Gummi PulverSigma-AldrichNr. P8169Gattung Phytagel
Heparin (25.000 IE/5 ml)LEO Pharma15261203
Wasserstoffperoxid (H2O2, 30%)Carl Roth8070.2
InjektionsspritzeB Braun9161502SOmnican F
Ketamin (100 mg/ml)Bela-Pharma402581.00.00
Lichtblatt-MikroskopsystemMiltenyi Biotec-UltraMikroskop Blaze
Luer-Lock-SpritzeBecton Dickinson303172BD Plastipak
MagnetrührerVWR444-0572
Neo sCMOS-Kamera (4,2 MP)Andor-TechnologieZL41 Zelle 4.2
ObjektivMiltenyi Biotec130-133-625MI Plan 1.1x NA 0.1, WD 17.6 mm
Paraformaldehyd (PFA, 4%)Sigma-Aldrich1.0049610% Formalin, neutral gepuffert
PetrischaleGreiner Bio-One632181
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)Gibco14190-094Ohne MgCl2/CaCl2
Röhrchen aus Polypropylen (15 mL)Greiner Bio-One188261
Röhrchen aus Polypropylen (5 mL)Carl RothEKY9.1Schwarz
Röhrchen aus Polypropylen (50 mL)Greiner Bio-One227261
Zubereitungsschale für die Kanülierung des MausherzensHugo Sachs Elektronik73-4327Inklusive Kanüle
Gereinigter Anti-Maus-CD31-AntikörperBecton Dickinson53369Klon: MEC13.3
RollenpumpeIsmatecISM597-230
SiegelfolieBemisPM-996Parafilm
StereomikroskopLeicaS6D
Rotator für RohreHeidolphPolymax 1040
WeißlichtlaserNKT PhotonikSuperK extrem200 mW, 480– 2400 nm
WT-Maus-StammJanvier Labs-C57BL/6JRj
Xylazin (2%)Ceva Tiergesundheit6324464.00.00

Referenzen

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  1. Whelan, R. S., Kaplinskiy, V., Kitsis, R. N. Cell death in the pathogenesis of heart disease: mechanisms and significance. Annu Rev Physiol. 72, 19-44 (2010).
  2. Frangogiannis, N. G. Inflammation in cardiac injury, repair and regeneration. Curr Opin Cardiol.

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Schlagwörter

LichtschnittmikroskopieAnalyse von Herzsch denImmunantwort des HerzensMyokardinfarkt 3DGewebekl rungNeutrophileninfiltrationRisikogebiet Area At RiskAntik rperf rbungEndothelsch digung3D Herzbildgebung

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