Methodenartikel

Optimiertes Mausmodell zur Induktion von Colitis-assoziiertem Dickdarmkrebs unter Verwendung von Azoxymethan und Dextransulfat-Natrium für Tumorimmunologie- und Therapiestudien

DOI:

10.3791/68351

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25. Juli 2025

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1Department of Pharmacology and Therapeutics, University of Florida College of Medicine, 2Department of Anatomy and Cell Biology, University of Florida College of Medicine, 3Department of Immunology, H. Lee Moffitt Cancer Center and Research Institute, 4University of Florida Health Cancer Center

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Azoxymethan (AOM)/Dextransulfat-Natrium (DSS)-induzierter Kolitis-assoziierter Dickdarmkrebs ist ein etablierter und kostengünstiger Ansatz zur Modellierung autochthoner Tumoren des Dickdarms bei Mäusen. Wir stellen ein aktualisiertes Protokoll vor und diskutieren kritische Überlegungen zur geschlechtsspezifischen DSS-Dosisoptimierung und den Beitrag des Mikrobioms zu Strenge, Robustheit und Reproduzierbarkeit.

Zusammenfassung

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Azoxymethan (AOM, ein DNA-schädigendes Mittel) und Dextransulfat-Natrium (DSS, ein Colitis-förderndes Mittel) können Tumore im Dickdarm von Mäusen mit hoher Penetranz induzieren. Das durch AOM/DSS induzierte murine Colitis-assoziierte Dickdarmkrebs (CAC)-Modell gilt als Goldstandard bei der Untersuchung von entzündungsbedingtem Dickdarmkrebs, da es die klinischen Merkmale des menschlichen CAC genau rekapituliert. Zu den Vorteilen des Modells gehören die Herkunft und Entwicklung aus endogenem Gewebe, die Immunkompetenz unter Beibehaltung eines vollständigen Repertoires an Tumor-Immun-Interaktionen, die Anpassungsfähigkeit an zahlreiche Mausstämme, die Bequemlichkeit einer 3-monatigen Latenzzeit und relativ niedrige Kosten. Trotz dieser Vorteile schränken mehrere Herausforderungen die Wirksamkeit des Protokolls ein. Die Variabilität der DSS-Dosierung und der Tumorpenetranz zwischen den Studien führt zu widersprüchlichen Beobachtungen. Darüber hinaus tragen Variationen der Darmmikrobiota zu einer erhöhten experimentellen Variabilität bei, was sich negativ auf die statistische Aussagekraft auswirkt. Geschlechtsunterschiede in der Reaktion auf AOM/DSS erschweren die Interpretation der Ergebnisse zusätzlich. Darüber hinaus behindert die DSS-Variabilität von Charge zu Charge die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse. Die Bewältigung dieser Herausforderungen ist entscheidend, um die Zuverlässigkeit und Anwendbarkeit dieses Modells in der präklinischen Forschung zu verbessern. Um dieses Problem zu lösen, haben wir am Modell von C57BL/6J-Mäusen das etablierte Protokoll mit Strategien zur effektiven Optimierung verfeinert, um die Reproduzierbarkeit und Harmonisierung zwischen den Studien zu verbessern. Dazu gehören Empfehlungen für die DSS-Dosistitration sowohl bei männlichen als auch bei weiblichen Mäusen und die Implementierung einer Mikrobiota-Homogenisierung vor jedem DSS-Zyklus, um die Heterogenität der Darmflora von Käfig zu Käfig zu verringern. Diese Schritte reduzierten die Variabilität erheblich und verbesserten die Reproduzierbarkeit, was zu einer robusten Induktion von CAC führte. Unter Berücksichtigung der zentralen Rolle von Entzündungen und zellulären Immunmechanismen bei der Entwicklung von CAC beschreibt das Protokoll auch Gewebeverarbeitungsverfahren, die für die Isolierung von RNA oder Proteinen und für die Profilierung von entzündlichen Zytokinen aus Dickdarmtumoren und umgebendem Dickdarmgewebe geeignet sind. Letztendlich sorgt der Einsatz dieser Methode für eine strengere, robustere und reproduzierbare CAC-Produktion.

Einleitung

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Darmkrebs (CRC) ist die dritthäufigste Krebserkrankung weltweit und eine der häufigsten krebsbedingten Todesursachen 1,2. Der Colitis-assoziierte Darmkrebs (CAC) entsteht im Vergleich zum sporadischen Darmkrebs als Folge einer anhaltenden, wiederholten Darmschädigung bei Patienten mit chronisch entzündlicher Darmerkrankung (CED)3,4, ist durch einen höheren malignen Grad und eine Tendenz zur multifokalen Präsentation in jüngerem Alter gekennzeichnet. Aufgrund dieser Faktoren erfordert CAC in der Regel eine aggressivere Behandlung mit ungünstigeren klinischen Ergebnissen5. Obwohl CAC zumindest teilweise aufgrund des einzigartigen Zeitpunkts des Erwerbs von Mutationen und einer übergroßen Rolle der inflammatorischen Immunmechanismen und des Mikrobioms als eigenständige Einheit angesehen wird, weisen CAC und sporadischer Darmkrebs viele Ähnlichkeiten in Bezug auf die gesamte genomische Landschaft und pathogenetische Merkmale auf. Um unser Verständnis von Darmkrebs im Allgemeinen und CAC im Besonderen zu verbessern und therapeutische Strategien zu verbessern, sind robuste präklinische Modelle unerlässlich.

Unter den verschiedenen Modellen, die zur Untersuchung von Darmkrebs verwendet werden, ist das AOM/DSS-induzierte CAC-Modell das am weitesten verbreitete und gilt als aktueller Goldstandard 6,7. Dieses Modell, das mit einem starken mutagenen Insult durch AOM eingeleitet wurde, stützt sich auf wiederholte DSS-induzierte Kolitisschübe, die der menschlichen IBD sehr ähnlich sind, wie z. B. Morbus Crohn und Colitis ulcerosa, die gut etablierte Risikofaktoren für CAC8 sind. Das AOM/DSS-Modell bietet mehrere entscheidende Vorteile gegenüber anderen In-vivo-Ansätzen. Im Gegensatz zu Methoden, die auf der Injektion von exogenem krebsauslösendem Material beruhen, um Flanken- oder sogar orthotope Tumoren zu etablieren, ist AOM/DSS-induziertes CAC autochthone, was bedeutet, dass die Tumorinitiation endogen erfolgt und sich die Krebsprogression in der nativen Gewebemikroumgebung entfaltet, was die Biologie und den natürlichen Verlauf des Tumors besser widerspiegelt. Im Gegensatz zu Xenotransplantaten aus menschlichen Zelllinien oder aus patientengewonnenem Material, das nur in immungeschwächten Mäusen gezüchtet werden kann, ist es immunkompetent und ermöglicht die Untersuchung von Krebs-Immun-Wechselwirkungen. Im Gegensatz zu gentechnisch veränderten Modellen, die Tumore mit spezifischen genetischen Treibern produzieren, ist es agnostisch gegenüber vordefinierten Mutationen, was eine breitere Modellierung der Krebssignalwege und Immunaufklärungsmechanismen ermöglicht. Schließlich kann das AOM/DSS-Modell leicht an viele verschiedene Mäusestämme angepasst werden, wodurch langwierige Zuchtprogramme überflüssig werden, was es sowohl zeit- als auch kosteneffizient macht. Faktoren wie das Geschlecht der Tiere, die DSS-Dosierung und Unterschiede in der Darmmikrobiota können jedoch zu Variabilität führen, die die Reproduzierbarkeit beeinträchtigt und die Anwendung in der translationalen Forschung erschwert.

Unser Ziel war es, dieses Protokoll zu verfeinern, um die Auswirkungen dieser Faktoren zu mildern, die die Inkonsistenzen im Ausmaß der Dickdarmentzündung und der CAC-Tumorgenese untermauern. Es gibt eine signifikante Variabilität in den Konzentrationen von DSS, die verwendet werden, um entweder akute Entzündungen, Kolitis oder chronische Entzündungen zu induzieren, und CAC 9,10. DSS ist ein Polymer, und das durchschnittliche Molekulargewicht kann je nach Charge und Hersteller variieren, was zu einer Variabilität der Versuchsergebnisse führt. Daher ist es wichtig, jede Charge von DSS zu testen, um die Konsistenz zwischen den Studien zu gewährleisten. Darüber hinaus wird das Ausmaß der DSS-induzierten Entzündung stark vom Darmmikrobiom beeinflusst, das sich zwischen Mauseinrichtungen auf der ganzen Welt und sogar zwischen verschiedenen Haltungsstandorten und -kolonien innerhalb derselben Einrichtung erheblich unterscheiden kann11,12. Diese Variabilität in der mikrobiellen Zusammensetzung kann die Ergebnisse des Modells beeinflussen und zu inkonsistenten Ergebnissen beitragen13. Die gemeinsame Unterbringung von Tieren aus den verschiedenen Versuchsgruppen ist, wann immer möglich, entscheidend, um die Variabilität zu verringern, reicht jedoch möglicherweise nicht aus, um diesen Störfaktor zu beheben, da die mikrobiellen Gemeinschaften im Laufe der Zeit einer stochastischen Drift unterliegen und in chronischen Entzündungsmodellen zu Käfigeffekten führen14. Da das AOM/DSS-Protokoll eine Langzeitbehandlung zur Aufrechterhaltung chronischer Entzündungen beinhaltet, führten wir eine Mikrobiota-Homogenisierung durch, indem wir die Einstreu aus allen Käfigen, in denen AOM/DSS-behandelte Tiere untergebracht waren, regelmäßig mischten. Diese Praxis trägt zur Homogenisierung der Mikrobiota-Umgebung bei, was zu einer geringeren experimentellen Variabilität führt. Darüber hinaus deuten Beobachtungen darauf hin, dass die Auswirkungen von DSS je nach Geschlecht der Tiere variieren können15,16, was möglicherweise zu unterschiedlichen Reaktionen bei Entzündungen und Krebsentwicklung führt. Wir verfeinerten das bestehende Protokoll, indem wir DSS bei weiblichen und männlichen Mäusen separat titrierten, um eine geeignete DSS-Dosierung für beide Geschlechter zu wählen, um einheitlichere Ergebnisse zu gewährleisten und wichtige Eingaben für statistische Power-Berechnungen zu liefern, um die optimalen Stichprobengrößen sowohl bei männlichen als auch bei weiblichen Mäusen zu bestimmen.

Um die Reproduzierbarkeit des AOM/DSS-Modells zu verbessern, skizzieren wir insgesamt einen standardisierten Satz von Protokollrichtlinien, die diese Störfaktoren berücksichtigen und abschwächen. Wir verwenden Mikrobiom-Homogenisierungstechniken und beschreiben eine präzise DSS-Dosisanpassung, um konsistentere und reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen und dadurch den Nutzen des AOM/DSS-Modells und die Harmonisierung über verschiedene Studien hinweg zu verbessern. Unser Protokoll zeichnet sich dadurch aus, dass es eine reduzierte Variabilität von Mikrobiota-homogenisierten Käfigen demonstriert und klare Schritt-für-Schritt-Anweisungen für die Umsetzung dieser Reproduzierbarkeitspraktiken bietet. Infolgedessen führt die geringere Variabilität innerhalb der Gruppe, die durch diese Protokollverfeinerungen bewirkt wird, zu einer Verringerung der Stichprobengrößen, die erforderlich sind, um die gewünschte statistische Aussagekraft bei der Erkennung von Unterschieden zwischen Versuchsgruppen zu erreichen. Dieses optimierte Protokoll ist auf Forscher zugeschnitten, die das AOM/DSS-Modell an ihre eigenen Mausmodelle und experimentellen Designs anpassen möchten, unabhängig von Stamm oder Geschlechtshintergrund, um Tumorentstehungsmechanismen, therapeutische Ziele oder die Dynamik von Immunzellen zu untersuchen.

Protokoll

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Alle Eingriffe an Tieren müssen nach einem institutionell anerkannten Protokoll durchgeführt werden, um einen humanen Umgang und die Einhaltung ethischer Standards zu gewährleisten. Die hier beschriebenen Studien wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Florida genehmigt.

1. Optimierung der DSS-Dosierung

  1. Es werden Mäuse des Alters, des Stammes und der Herkunft erhalten, die im Hauptversuch verwendet werden sollen, mit einer gleichmäßigen Verteilung von Männchen und Weibchen. Beschriften Sie jede Maus mit Ohrlocher, Schwanzmarkierung oder einer anderen zugelassenen Methode für die individuelle Nachverfolgung. Messen und notieren Sie das anfängliche Körpergewicht jedes Tieres.
    HINWEIS: Männliche Mäuse sollten vor dem Absetzen in Co-Stallungen gehalten und nicht zwischen den Käfigen umverteilt werden, um Kämpfe zu minimieren.
  2. Wenn Sie eine Woche vor Beginn eines Versuchs eine Woche vor Beginn eines Versuchs eine automatische Bewässerung verwenden, stellen Sie die Tiere auf Wasserflaschen um und blockieren Sie gleichzeitig die Käfigdüsen (Metall-Sipper-Röhrchen im Käfig) mit sterilen Stopfen.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass alle Änderungen an der Wasserzufuhr, wie z. B. verstopfte automatische Trinkwasserdüsen, von der IACUC oder der zuständigen Aufsichtsbehörde, die den humanen Umgang mit Tieren überwacht, genehmigt wurden. In Tierkäfigen müssen möglicherweise tägliche Kontrollen durchgeführt werden, um einen ununterbrochenen Zugang zu Trinkwasser zu gewährleisten.
  3. Bereiten Sie die DSS-Lösung vor, indem Sie DSS in autoklaviertem sterilem Trinkwasser in unterschiedlichen Konzentrationen von 1,5 % bis 5 % (w/v) mit einem magnetischen Rührstab und einer Rührplatte auflösen. Warten Sie 30 Minuten bei Raumtemperatur, bis sich das DSS-Pulver vollständig in Wasser aufgelöst hat. Bereiten Sie das DSS-Wasser jede Woche frisch zu und lagern Sie es bis zu einer Woche bei 4 °C.
  4. Füllen Sie zwei konische 50-ml-Röhrchen mit DSS-Wasser in jeder Konzentration (eines für Männer, eines für Frauen) und befestigen Sie eine autoklavierte sterile Trinkdüse sicher, um ein Auslaufen zu verhindern.
  5. Verabreichen Sie DSS-Wasser in jeder Konzentration an weibliche und männliche Mäuse, wobei 3 Mäuse in jedem Käfig die gleiche Konzentration erhalten. Verwenden Sie steriles Trinkwasser ohne DSS als Negativkontrolle. Ersetzen Sie das DSS-Wasser alle zwei Tage.
  6. Verabreichen Sie DSS-Wasser für 7 Tage. Erfassen Sie täglich das Körpergewicht jeder Maus.
  7. Stellen Sie an Tag 8 alle Tiere wieder auf normales Trinkwasser um.
  8. Beurteilen Sie an Tag 8 den Schweregrad des Durchfalls anhand der Stuhlkonsistenz unter Verwendung eines standardisierten Bewertungssystems, wie beschrieben17 , und Rekordergebnisse. Bewerten Sie "1" als weiches, aber noch gebildetes Stuhlkügelchen, "2" als sehr weiches Stuhlkügelchen und "3" als Durchfall.
  9. Entnehmen Sie am 8. Tag 2-3 frische Stuhlpellets und untersuchen Sie das Vorhandensein von okkultem Blut (siehe Materialtabelle). Notieren Sie das Vorhandensein oder Fehlen von Blut in der Probe.
  10. Bewerten Sie die Darmblutungen auf der Grundlage einer Kombination von zwei Bewertungskriterien, Stuhlkonsistenz (0-3) und Vorhandensein von Blut im Stuhl (0-3), für eine Gesamtpunktzahl von 0 bis 6.
  11. Erfassen Sie von Tag 9 bis Tag 12 täglich das Körpergewicht jeder Maus und überwachen Sie DSS-behandelte Tiere genau auf signifikanten Körpergewichtsverlust und schweren Durchfall. Tiere, die humane Endpunkte erreichen oder überschreiten, unverzüglich durch Kohlendioxid (CO 2), Erstickung oder eine andere geeignete Methode gemäß dem genehmigten Tierverwendungsprotokoll und den festgelegten ethischen Richtlinien einzuschläfern.
  12. Setzen Sie die Überwachung der Tiere von Tag 13 bis Tag 18 fort und zeichnen Sie das Körpergewicht jeder Maus täglich auf, bis sie sich vollständig auf das Niveau vor dem Versuch erholt hat.
  13. Bestimmen Sie die optimale DSS-Konzentration, die zu einem Körpergewichtsverlust von ca. 20 % führt, begleitet von weichem, aber noch gebildetem Stuhl. Die optimale DSS-Dosis kann je nach Männchen und Weibchen, Mausstämmen, Alter, DSS-Chargen und Tiereinrichtungen variieren.

2. CAC-Induktion

  1. Tag 0-6: AOM-Behandlung Tag 7-28: 1 . Zyklus der DSS-Behandlung
    1. AOM-Stoffaufbereitung: AOM-Pulver in steriler Kochsalzlösung auflösen, um eine Stammkonzentration von 10 mg/ml zu erreichen. Die Lösung wird durch einen 0,45-μm-Filter filtriert, 1 ml-Aliquote in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen verteilt und bis zu einem Jahr bei -80 °C gelagert.
      HINWEIS: AOM ist ein flüchtiges Karzinogen und muss unter einer Biosicherheitshaube mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (PSA) gemäß den Sicherheitsempfehlungen des Herstellers mit Vorsicht gehandhabt werden. AOM und alle AOM-kontaminierten Materialien sollten in Übereinstimmung mit den Entsorgungsprotokollen der Institution für gefährliche chemische Abfälle entsorgt werden. Es liegt in der Verantwortung des Prüfers, die erforderlichen Umwelt-, Gesundheits- und Sicherheitsgenehmigungen im Voraus einzuholen.
    2. Wenn Sie eine automatische Käfigbewässerung verwenden, ist 1 Woche vor Beginn des Versuchs die automatische Trinkwasserdüse zu verstopfen und die Tiere zur Akklimatisierung auf Wasserflaschen umzustellen, wie in Schritt 1.2 beschrieben.
    3. Wiegen und notieren Sie am Tag 0 das Körpergewicht jeder Maus, um die insgesamt erforderliche Menge an AOM zu berechnen. Berechnen Sie dann das Gesamtvolumen der AOM (1 mg/ml endgültige Arbeitskonzentration) basierend auf dem Gewicht jedes Tieres, um eine Dosis von 10 mg/kg zu erreichen, z. B. 200 μl für eine 20-g-Maus.
    4. Tauen Sie die erforderliche Anzahl neuer Aliquots von 10 mg/ml AOM vor jedem Gebrauch auf Eis auf. Verdünnen Sie jeweils 1 ml aliquotes AOM mit 9 ml steriler Kochsalzlösung, um eine Arbeitskonzentration von 1 mg/ml zu erreichen.
    5. Verabreichen Sie Mäusen AOM durch intraperitoneale Injektion. Führen Sie diesen Vorgang in einer Biosicherheitswerkbank durch, während Sie geeignete PSA wie Doppelhandschuhe und eine N95-Maske für optimalen Schutz tragen.
      ACHTUNG: Entsorgen Sie alle übrig gebliebenen AOM-Lösungen gemäß den Anforderungen an die Entsorgung gefährlicher chemischer Abfälle.
    6. Bringen Sie an Tag 3 mit AOM behandelte Tiere in saubere Käfige. Tragen Sie geeignete PSA, wenn Sie mit AOM-kontaminierten Käfigen und anderen Materialien zum Schutz umgehen.
      VORSICHT: Entsorgen Sie verschmutzte Käfigeinstreu und Lebensmittelreste gemäß den von der Einrichtung zugelassenen Entsorgungsverfahren für gefährliche chemische Abfälle.
      HINWEIS: AOM und seine Metaboliten werden 72 Stunden nach Verabreichung18 vollständig ausgeschieden, woraufhin verschmutzte Käfigeinstreu entsorgt werden kann.
    7. Führen Sie an Tag 7 eine Homogenisierung der Darmmikrobiota durch, um die Variabilität von Käfig zu Käfig zu minimieren. Nehmen Sie dazu eine Probe von 25 % der Einstreu aus jedem Käfig, mischen Sie sie gründlich und verteilen Sie sie wieder in jeden Käfig.
      HINWEIS: Verzichten Sie während der Woche der DSS-Behandlung und für fünf Tage danach auf einen Käfigwechsel. Stimmen Sie sich bei Bedarf mit dem Käfigwechseldienst der Einrichtung ab.
    8. Initiieren Sie die Kolitis-Induktion, indem Sie DSS im Trinkwasser mit konischen 50-ml-Röhrchen verabreichen, die mit geeigneten Düsen ausgestattet sind. Kontrollieren Sie die Mäuse täglich, um sicherzustellen, dass die Tiere uneingeschränkten Zugang zu DSS-Wasser haben. Ersetzen Sie das DSS-Wasser alle zwei Tage. Erfassen Sie täglich das Körpergewicht jeder Maus.
    9. Ersetzen Sie am 14. Tag DSS-Wasser durch normale Trinkwasserflaschen. Überwachen Sie die Tiere weiterhin engmaschig auf Schmerzen und Ängste.
    10. Wiegen Sie an den Tagen 14 bis 19 jede Maus täglich. Euthanasieren Sie Tiere, die mehr als 25 % ihres Körpergewichts verlieren oder wenn ein Tier einen der humanen Endpunkte erreicht, die im genehmigten Tierpflege- und -verwendungsprotokoll festgelegt sind. Überwachen und zeichnen Sie außerdem alle Fälle von rektalen Blutungen auf.
  2. Tag 7-28: 1. Zyklus der DSS-Behandlung
    1. Führen Sie an Tag 7 eine Homogenisierung der Darmmikrobiota durch, um die Variabilität von Käfig zu Käfig zu minimieren. Nehmen Sie dazu eine Probe von 25 % der Einstreu aus jedem Käfig, mischen Sie sie gründlich und verteilen Sie sie wieder in jeden Käfig.
      HINWEIS: Verzichten Sie während der Woche der DSS-Behandlung und für fünf Tage danach auf einen Käfigwechsel. Stimmen Sie sich bei Bedarf mit dem Käfigwechseldienst der Einrichtung ab.
    2. Initiieren Sie die Kolitis-Induktion, indem Sie DSS im Trinkwasser mit konischen 50-ml-Röhrchen verabreichen, die mit geeigneten Düsen ausgestattet sind. Kontrollieren Sie die Mäuse täglich, um sicherzustellen, dass die Tiere uneingeschränkten Zugang zu DSS-Wasser haben. Ersetzen Sie das DSS-Wasser alle zwei Tage. Erfassen Sie täglich das Körpergewicht jeder Maus.
    3. Ersetzen Sie am 14. Tag DSS-Wasser durch normale Trinkwasserflaschen. Überwachen Sie die Tiere weiterhin engmaschig auf Schmerzen und Ängste.
    4. Wiegen Sie an den Tagen 14 bis 19 jede Maus täglich. Euthanasieren Sie Tiere, die mehr als 25 % ihres Körpergewichts verlieren oder wenn ein Tier einen der humanen Endpunkte erreicht, die im genehmigten Tierpflege- und -verwendungsprotokoll festgelegt sind. Überwachen und zeichnen Sie außerdem alle Fälle von rektalen Blutungen auf.
  3. Tag 29-49: 2 . Zyklus der DSS-Behandlung
    1. Wiederholen Sie die Homogenisierung der Mikrobiota zusammen mit der DSS-Verabreichung nach den gleichen Verfahren wie in den Schritten 2.2.1-2.2.4. Optional: Nach dem zweiten und/oder dritten DSS-Zyklus eine Koloskopie wie zuvor beschriebendurchführen 19.
  4. Tag 50-70: 3. Zyklus der DSS-Behandlung
    1. Wiederholen Sie die Homogenisierung der Mikrobiota zusammen mit der DSS-Verabreichung nach den gleichen Verfahren wie in den Schritten 2.2.1-2.2.4. Da Mäuse dazu neigen, drei Tage nach dem dritten DSS-Zyklus das meiste Gewicht zu verlieren, sollten Sie alle Tiere während dieser Zeit engmaschig auf übermäßigen Körpergewichtsverlust oder auf Anzeichen von rektalen Blutungen überwachen und bei Bedarf feuchtes Futter zur unterstützenden Pflege bereitstellen.

3. Beurteilung des Schweregrads der Kolitis und der CAC-Pathologie

  1. Entnehmen Sie an Tag 70 2-3 frische Kotpellets von jeder Maus, um das Vorhandensein von okkultem Blut und/oder Entzündungsmarkern wie Lipocalin-220 zu testen, um den Schweregrad der Kolitis zu beurteilen. Verwenden Sie geeignete Reagenzien/Kits (siehe Liste der Materialien und Geräte) und befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers, um die Tests durchzuführen, die unten kurz beschrieben sind.
  2. Zur Vorbereitung von Stuhlproben für die Beurteilung des Lipocalin-2-Spiegels des Entzündungsmarkers geben Sie frische Stuhlpellets in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Pellets in 1 ml steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit einem Vortex-Mischer auflösen, bis eine gleichmäßige Lösung erreicht ist. Die Lösung bei 10.000 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugieren. Der Überstand kann sofort für den Lipocalin-2-ELISA verwendet oder für die spätere Verwendung bei -80 °C gelagert werden.
  3. Führen Sie den Maus-Lipocalin-2-ELISA gemäß den Anweisungen des Kit-Herstellers durch. Führen Sie Pilotexperimente zur seriellen Verdünnung durch, um die optimale Verdünnung von Stuhlproben im Vergleich zu den Standards zu bestimmen.
    HINWEIS: Es wird erwartet, dass die Lipocalin-2-Spiegel bei DSS-behandelten Mäusen im Vergleich zu wasserbehandelten Kontrolltieren mindestens um das 1000-fache ansteigen20.
  4. Beurteilen Sie den Schweregrad der Kolitis anhand eines Durchfallbewertungssystems17 , wie in den Schritten 1.8 bis 1.10 beschrieben.
  5. An Tag 70 werden die Tiere durch CO2 -Erstickung oder mit einer anderen zugelassenen humanen Methode eingeschläfert.
  6. Besprühen Sie den Bauchbereich jedes Tieres mit 70 % Ethanol, um die Kontamination in den nachfolgenden Schritten zu minimieren.
  7. Verwenden Sie eine feine chirurgische Zange, um die Haut und die Bauchfellschicht anzuheben. Machen Sie einen horizontalen Schnitt mit einer Schere, um die Bauchhöhle freizulegen.
  8. Ziehe den Dünndarm nach außen und identifiziere den Blinddarm. Hebe den Blinddarm und den Dickdarm vorsichtig mit einer Pinzette an. Präparieren Sie den Dickdarm vorsichtig, indem Sie das Mesenterium und das zugehörige Gefäßsystem mit einer Schere durchtrennen und dabei eine Punktion oder einen Schnitt durch den Dickdarm vermeiden.
  9. Schneiden Sie den Beckenknochen und die Haut, die den rektal-analen Bereich umgibt, um den gesamten distalen Dickdarm freizulegen. Es ist wichtig, den gesamten Dickdarm mit intaktem distalen Teil zu präparieren, da die meisten Tumoren typischerweise in dieser Region auftreten.
  10. Legen Sie den präparierten Doppelpunkt auf einen sauberen Streifen Filterpapier und glätten Sie ihn vorsichtig.
  11. Messen Sie die Doppelpunktlänge mit einem Lineal und dokumentieren Sie diese mit einem Foto. Fügen Sie das Lineal für den Maßstab in das Foto ein.
  12. Reinigen Sie die Peyer-Flecken an der Außenseite des Dickdarms und achten Sie darauf, das Gewebe nicht zu durchstechen.
  13. Spülen Sie den Dickdarm in kaltem, sterilem PBS.
  14. Befestigen Sie eine 200-μl-Mikropipettenspitze (ohne Filter) mit Paraffinfilm auf einer 3-ml-Spritze. Verwenden Sie dieses Setup, um die Spritze mit sterilem PBS zu füllen, führen Sie die Pipettenspitze in das Dickdarmlumen ein und spülen Sie den Inhalt des Dickdarms vorsichtig 2-3 Mal aus, um sicherzustellen, dass die Stuhlpellets vollständig entfernt werden.
  15. Strecken Sie den Doppelpunkt vorsichtig auf einem sauberen, vorbenetzten Streifen Filterpapier aus. Schneiden Sie den Doppelpunkt längs auf und legen Sie ihn flach auf das Filterpapier.
  16. Identifizieren Sie größere Tumoren, die sich typischerweise als markante Bläschen präsentieren, die aus der Dickdarmwand herausragen und ein entzündetes, rotes Aussehen haben.
  17. Bei kleineren Tumoren ist bei der Identifizierung zusätzliche Vorsicht geboten. Verwenden Sie eine sterile Bakteriensäschlaufe, um die Oberfläche des Dickdarms vorsichtig auf Unregelmäßigkeiten oder Beulen zu untersuchen. Vergewissern Sie sich, dass es sich bei den erkannten Beulen nicht um Überreste von Lymphknoten oder Blutgefäßen handelt, die sich an der Außenseite der Dickdarmwand befinden.
  18. Verwenden Sie digitale Messschieber, um die Breite und Länge jedes Tumors zu messen.
  19. Notieren Sie die Tumorzahl sowie die Größe und Lage jedes Tumors auf einer vorgedruckten Dickdarmkarte.

4. Histologische Beurteilung

  1. Verwenden Sie zwei Paare einer Pinzette mit feiner Spitze, um beide lateralen Enden des distalen Dickdarms zu greifen. Rollen Sie den Dickdarm vom distalen Ende zum proximalen Ende in eine Swiss-Roll-Form, wie an anderer Stellebeschrieben 21. Stellen Sie sicher, dass sich das distale Ende in der Mitte der Rolle befindet und das proximale Ende die äußerste Schicht bildet.
  2. Befestigen Sie jeden Swiss-rolled Dickdarm mit einer 271/2-G-Nadel.
  3. Legen Sie jeden gesicherten Swiss-rolled Colon in eine entsprechend beschriftete Gewebekassette.
  4. Tauchen Sie die Gewebekassetten mit dem Swiss-Roll-Dickdarm in 4 % Paraformaldehyd (PFA) in sterilem PBS. Lassen Sie das Gewebe 24 Stunden im Fixiermittel verbleiben.
  5. Nach 24 h das Gewebe in 70%iges Ethanol umfüllen. Die Gewebe können in 70%igem Ethanol bei 4 °C bis zu drei Monate aufbewahrt werden.
  6. Die Swiss-Rolle kann für mehrere histopathologische Untersuchungen verwendet werden, einschließlich konventioneller Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&E), Immunhistochemie und Immunfluoreszenz.

5. Gewebeentnahme für die Protein- und RNA-Isolierung aus Tumoren und dem umgebenden Dickdarm

  1. Arbeiten Sie auf Eis und verwenden Sie vorgekühlte Röhrchen und Reagenzien, um die Integrität des biologischen Materials zu erhalten.
  2. Nach der Tumorbeurteilung werden die Tumore präpariert und in vorgekühlten, vormarkierten Röhrchen mit geeignetem Puffer (siehe unten) auf Eis gesammelt. Je nach Versuchsdesign werden alle Tumoren desselben Tieres gepoolt oder einzeln bearbeitet. Falls gewünscht, sammeln Sie auf ähnliche Weise ~1 cm große Stücke des umgebenden Dickdarmgewebes, das nicht zum Tumor gehört.
  3. Isolierung von Proteinen
    1. Geben Sie 0,5 ml 800 μm Mahlglasperlen und 400 μl Lysepuffer (1 % NP-40 in 150 mM NaCl mit 20 mM Tris-HCl (pH 7,5) und 1 % Protease- und Phosphatasehemmer-Cocktail in jedes Gewebehomogenisierungsröhrchen und übertragen Sie das Dickdarm-/Tumorgewebe in jedes Röhrchen.
    2. Homogenisieren Sie Dickdarm-/Tumorgewebe mit einem Gewebehomogenisator auf Bead-Basis bei 6 M/S für 30 s, wiederholen Sie dies zweimal für eine vollständige Homogenisierung.
      HINWEIS: Legen Sie die Röhrchen zwischen den Zyklen auf Eis, um eine Überhitzung der Probe durch mechanische Homogenisierung zu vermeiden.
    3. Nach der Homogenisierung werden 150 μl des Lysats (Überstand) aspiriert und in ein sauberes 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführt.
    4. Schleudern Sie das Lysat bei 10.000 g bei 4 °C ab, um unlösliches Material zu pelletieren. Übertragen Sie den Überstand auf Wunsch in ein sauberes Röhrchen.
    5. Quantifizieren Sie die Gesamtproteinkonzentration durch einen Bicinchoninsäure-Assay (BCA) oder eine andere geeignete Methode.
    6. Falls gewünscht, passen Sie die Gesamtproteinkonzentration für jede Probe mit demselben Lysepuffer auf 4 mg/ml an.
    7. Verwenden Sie Proteinlysate sofort für nachgelagerte Assays wie Immunblotting oder Zytokinanalyse oder lagern Sie sie für die spätere Verwendung bei -80 °C.
  4. RNA-Aufreinigung:
    1. Nach der Dissektion wird der Dickdarm/der Tumor in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen gegeben und in 200 μl des entsprechenden RNA-Konservierungsreagenzes getaucht.
      HINWEIS: Pausenpunkt: Frisches Dickdarm-/Tumorgewebe kann in flüssigem Stickstoff schockgefroren und für die spätere Verarbeitung bei -80 °C gelagert werden
    2. Tauen Sie Dickdarm-/Tumorgewebe auf Eis auf.
    3. Übertragen Sie den Dickdarm/Tumor in ein Gewebehomogenisierungsröhrchen mit 500 μl geeignetem Lysepuffer, der für die RNA-Isolierung geeignet ist, und 200 μl Mahlglasperlen.
    4. Homogenisieren Sie mit einem Bead-basierten Gewebehomogenisator bei 6 M/s dreimal für 30 s, mit einer zweiminütigen Pause zwischen jedem Zyklus.
      HINWEIS: Übertragen Sie das Röhrchen zwischen den Zyklen auf Eis, um eine Überhitzung der RNA während der mechanischen Homogenisierung zu verhindern.
    5. Übertragen Sie 300 μl Lysat in ein neues 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
    6. Isolieren Sie die Gesamt-RNA bei Bedarf mit dem geeigneten RNA-Aufreinigungsverfahren. Messen Sie die RNA-Konzentration, Reinheit und Qualität/Integrität entsprechend für die nachgelagerte Verwendung.

Ergebnisse

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Wir führten eine DSS-Dosisoptimierung für unsere experimentellen Bedingungen durch. Die DSS-Dosierung muss für jede Tiereinrichtung, jeden Mausstamm, jedes Studiendesign und jede DSS-Charge neu kalibriert werden. Für diese Studie wurden C57BL/6J-Mäuse in einem spezifischen pathogenfreien Vivarium in beatmeten Käfigen mit ad libitum standardbestrahltem 18%-Protein-Nagetierfutter untergebracht. Sowohl männliche als auch weibliche Mäuse beginnen ab Tag 5 nach dem Einsetzen in DSS-Wasser abzunehmen, und erreichen drei Tage nach dem DSS-Entzug ihr niedrigstes Gewicht (Abbildung 1A, C). Am Tag des größten Gewichtsverlusts zeigten männliche Mäuse einen Gewichtsverlust von etwa 15 %, während weibliche Mäuse einen Gewichtsverlust von etwa 20 % aufwiesen (Abbildung 1B, D). Basierend auf diesen Ergebnissen stellten wir fest, dass die optimale Dosis für unsere spezifischen Versuchsbedingungen 3,0 % für Frauen und 3,25 % für Männer betrug. Der Behandlungsplan für AOM/DSS ist in Abbildung 2A dargestellt, wobei die Mikrobiomhomogenisierung zu Beginn jedes DSS-Behandlungszyklus bis zum Abschluss des Experiments erfolgt, um die Auswirkungen und die Variabilität der Käfighaltung zu mildern. Die typische Dynamik des Gewichtsverlusts und der Erholung von Tieren während der gesamten Dauer des Versuchs ist in Abbildung 2B dargestellt. Die Tiere erholen sich innerhalb von zwei Wochen nach Absetzen der DSS-Verabreichung vollständig auf ihr ursprüngliches Körpergewicht. Ein gut kalibriertes DSS-Colitis-Modell führt zu weichen, aber immer noch gebildeten Stuhlkügelchen anstelle von Durchfall (Stuhlkonsistenz-Score 1-2), mit gelegentlichem Nachweis von okkultem Blut im Stuhl, der auf subklinische Blutungen hinweist, und wenigen Fällen von sichtbarem Blut im Stuhl (Blutanwesenheits-Score 1-2)17. Um den Schweregrad der Kolitis weiter zu beurteilen, wurden Stuhlproben entnommen, um den Entzündungsmarker Lipocalin-2-Spiegel zu analysieren. Das Vorhandensein von okkultem Blut wurde bei Mäusen, die während des gesamten Experiments regelmäßig Trinkwasser erhielten, im Gegensatz zu DSS-behandelten Tieren nicht nachgewiesen (Abbildung 2C). Konsistent waren die Lipocalin-2-Spiegel bei AOM/DSS-behandelten Mäusen im Vergleich zu AOM/Nur-Wasser-Kontrollen etwa 1.000-fach erhöht (Abbildung 2D).

Am Endpunkt präparierten wir den Dickdarm und zählten die Tumore mit Hilfe einer Tumoraktenkarte (Abbildung 3A). Die DSS-Colitis führt zu einer signifikant kürzeren Dickdarmlänge, im Gegensatz zu AOM/Nur-Wasser-Kontrollen (Abbildung 3B). Darüber hinaus entwickeln AOM/DSS-behandelte Tiere sichtbare Dickdarmtumoren, von denen sich die meisten am distalen Ende bilden (Abbildung 3C). Die histologische Untersuchung der H&E-gefärbten Dickdarmschnitte ergab bei AOM/DSS-Mäusen eine signifikante Erosion der Epithelzellen, Immuninfiltration und Ulzerationen (Abbildung 4A). Der Schweregrad der Dickdarmhistopathologie kann mit etablierten Scoring-Systemen für DSS-induzierte murine CAC quantifiziert werden, basierend auf vier Parametern (Abbildung 4B): Immuninfiltration und Ödem (0-3), Ulzeration (0-3), Morphologie des Dickdarmepithels (0-4) und Neoplasien (0-4)22,23,24. Die Ergebnisse solcher Auswertungen, wie sie auf Histologiebeispiele in Abbildung 4A angewendet werden, sind in Abbildung 4C dargestellt. Die Proliferation des Dickdarmepithels wurde mittels immunhistochemischer Analyse mit Hilfe der Ki67-Färbung untersucht, was zeigt, dass die DSS-Behandlung die Proliferation von Dickdarmepithelzellen fördert. Darüber hinaus können die Dickdarmschnitte für die Immunfluoreszenzfärbung verschiedener Marker, wie z.B. des Angiogenesemarkers CD31, verwendet werden (Abbildung 4D,E).

Darüber hinaus untersuchten wir die Auswirkungen der Mikrobiota-Homogenisierung auf experimentelle Endpunkte wie das Ausmaß der Dickdarmentzündung, den Gewichtsverlust des Körpers und die kumulative Tumorlast bei jedem Tier. Eine Gruppe von Mäusen wurde in Käfigen untergebracht, die an Tag 0 dem Mischen und Umverteilen der verschmutzten Einstreu unterzogen wurden, um eine Homogenisierung der Mikrobiota zu erreichen, zusammen mit Kontrolltieren in Käfigen, in denen diese Manipulation unterlassen wurde. Die Tiere beider Gruppen erhielten 7 Tage lang 2,5 % DSS-Wasser. Während sich die durchschnittlichen Spiegel des Entzündungsmarkers Lipocalin-2 im Kot pro Käfig an Tag 8 nicht signifikant zwischen den Gruppen unterschieden (Welchs t-Test), beobachteten wir in Käfigen, die einer Mikrobiota-Homogenisierung unterzogen wurden, eine signifikant geringere Variabilität zwischen den Datenpunkten (Abbildung 5A, Welchs F-Test zum Vergleich von Varianzen, S<0,0001). Konsistent zeigten alle Tiere an Tag 8 einen ähnlichen Körpergewichtsverlust im Vergleich zum Ausgangswert an Tag 0. Mäuse in der Mikrobiota-Homogenisierungsgruppe zeigten jedoch im Vergleich zur Kontrollgruppe eine geringere Variabilität im Körpergewichtsverlust (Abbildung 5B). Darüber hinaus war in einem 10-wöchigen CAC-Induktionsprotokoll (Abbildung 2A) mit (Mikrobiota-Homogenisierung) und ohne (Kontroll-)Käfigeinstreumischung vor jedem DSS-Zyklus die kumulative Tumorlast pro Maus in der Mikrobiota-homogenisierten Gruppe konsistenter als bei Kontrollen, die signifikant variabler waren (Abbildung 5C). Insgesamt liefern diese Daten einen starken Beweis dafür, dass die Homogenisierung der Mikrobiota die Robustheit und Reproduzierbarkeit des AOM/DSS-Modells stark verbessert.

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Abbildung 1. DSS-Dosistitration bei männlichen und weiblichen Mäusen. (A-D) Prozentuale Veränderung des Körpergewichts im Vergleich zu Tag 0 bei 14 Wochen alten männlichen (A, B) und weiblichen (C, D) C57BL/6J-Wildtyp-Mäusen, die mit Wasser mit angegebenen DSS-Konzentrationen gehalten wurden (1 %, 1,5 %, 2 %, 2,5 %, 3 % für männliche Mäuse und 2 %, 3 %, 4 % für weibliche Mäuse). (A, C) Den Tieren wurde 7 Tage lang DSS verabreicht und bis zu 12 Tage lang auf Körpergewichtsverlust überwacht. B und D zeigen einen Körpergewichtsverlust von männlichen Mäusen an Tag 8 (B) und weiblichen Mäusen an Tag 9 (D) ab Beginn der DSS-Behandlung. Die Daten werden als Durchschnittswerte ± SEM dargestellt; n=3 in A & B, n=4 in C & D. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2. AOM/DSS-induzierte CAC-Zeitleiste und Überwachung. (A) AOM/DSS-induzierter CAC-Experimentalzeitplan. (B) Körpergewicht im Verhältnis zu Tag 0 bei experimentellen AOM/DSS-behandelten (rot) oder Kontroll- (nur AOM, kein DSS, schwarz) weiblichen C57BL/6J-Wildtyp-Mäusen. Alle Tiere erhielten eine Dosis AOM (10 mg/kg) und wurden entweder über einen Zeitraum von insgesamt 70 Tagen in drei Zyklen mit 3 % DSS (rot) oder normalem Trinkwasser (Kontrolle, schwarz) randomisiert. Die Daten werden als Durchschnittswerte ± SEM, n=2 und 11 dargestellt. (C) Fäkaler hämoccultischer Test von Kontroll- (nur AOM) oder DSS-behandelten (AOM und 1,5 % DSS) weiblichen Mäusen. (D) Fäkale Lipocalin-2-Spiegel von 6 kontrollierten (nur AOM, schwarz) oder 35 behandelten (AOM und 1,5 % DSS, rot) weiblichen Mäusen an Tag 70. Die Daten werden als Durchschnittswerte ± REM dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3. Makroskopische Beurteilung des Dickdarms. (A) Beispiel für eine Tumoraktenkarte. (B) Repräsentative Dickdarmbilder von Kontroll- (nur AOM) oder DSS-behandelten (AOM und 1,5 % DSS) weiblichen Mäusen an Tag 70. Eine Verkürzung der Dickdarmlänge deutet auf eine stärkere Entzündung bei DSS-behandelten Tieren hin. Stange - 5 mm; , p=0,002, Mann-Whitney-Rangsummentest; n=12 & 30. (C) Repräsentative grobpathologische Bilder von Dickdarm mit Tumoren am Tag 70 von weiblichen Mäusen, die mit AOM und 3% DSS behandelt wurden (Tumore sind eingekreist und mit schwarzen Dreiecken markiert). Stange - 5 mm. Callout - vergrößerte Ansicht der distalen Dickdarmregionen mit Tumoren; Stange - 1 mm). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4. CAC-histologische Beurteilung. (A) Repräsentative H&E-gefärbte Schnitte von Swiss-rolled Dickdarm von AOM/DSS-behandelten und Kontrollmäusen (nur AOM) an Tag 70 mit vergrößerten distalen Regionen von 3 Tieren, dargestellt auf der rechten Seite. Kontroll-Doppelpunkte zeigen eine intakte Organisation der Kolonkrypta. Dickdarm von AOM/DSS-behandelten Mäusen ist gekennzeichnet durch submuköse Verdickung (Pfeilspitzen), Immuninfiltration (Pfeile), Störung oder Verlust der Kryptenarchitektur (Stern), Erosion der Epithelschicht, epitheliale Hyperplasie oder dysplastische Epithelien (Kreise) mit Adenom- und Adenokarzinombildung (umrandet durch gestrichelte Linie). Balken - 500 μm. (B) Histopathologisches Bewertungssystem zur Beurteilung des Schweregrads des CAC-Phänotyps. (C) Beispiel für Dickdarm-Histologie-Scores von Mäusen, die nur mit AOM oder AOM/DSS behandelt wurden, gezeigt in A. (D) Repräsentative immunhistochemische Färbung des Ki67-Proliferationsmarkers in Swiss-rolled Colon von AOM-behandelten Tieren nach 1 oder 3 DSS-Zyklen. Proliferierende Ki67-positive Zellen (braun) lokalisieren sich am Boden der Dickdarmkrypten, breiten sich aber nach oben aus und dringen mit CAC-Initiation und fortgeschrittenerer Pathologie in die Krypten ein. Stab - 100 μm. (E). Repräsentative Immunfluoreszenzfärbung zur Beurteilung der Vaskularisation auf der Grundlage eines CD31-Endothelmarkers (rot) und gegengefärbt mit DAPI zur Visualisierung von Zellkernen (blau) in Dickdarmschnitten von AOM/DSS-behandelten Mäusen. Stab - 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 5. Die Homogenisierung der Mikrobiota reduziert die Variabilität der Dickdarmentzündung und der CAC-Tumorlast. (A) Durchschnittliche fäkale Lipocalin-2-Spiegel bei Mäusen, die an Tag 8 mit 2,5 % DSS behandelt wurden. Die statistische Analyse wurde mit dem Welch-t-Test durchgeführt, um die durchschnittlichen Lipocalin-2-Spiegel im Stuhl zwischen den beiden Gruppen (p = 0,137, n = 6 und 12 Käfige) zu vergleichen. Zusätzlich wurde ein F-Test der Varianzen durchgeführt, der einen p-Wert von 0,0001 ergab, was auf signifikante Unterschiede in der Varianz zwischen den beiden Gruppen hinweist. (B) Durchschnittlicher Körpergewichtsverlust bei AOM/DSS-behandelten Tieren, die an Tag 8 DSS-Wasser erhielten. Während sich der durchschnittliche Körpergewichtsverlust zwischen den beiden Gruppen nicht signifikant unterscheidet (Welchs t-Test, p=0,194, n=6 & 12), ist die Varianz innerhalb der Gruppen signifikant unterschiedlich (F-Test, p=0,027). (C) Tumorlast pro Maus nach 10-wöchiger AOM/DSS-Behandlung. Die statistische Analyse wurde mit dem Welch-t-Test durchgeführt, um die Unterschiede in der durchschnittlichen Tumorlast zwischen den Gruppen (p=0,211, n=8 & 18) zu bewerten, und einem F-Test, um die Differenz zwischen den Varianzen (p=0,013) zu bewerten. (A-C) Blaue Violindiagramme zeigen die Gruppe, die einer Mikrobiota-Homogenisierung unterzogen wurde, während grüne Violindiagramme die Kontrollgruppe (ohne Mikrobiota-Homogenisierung) darstellen, ns - nicht signifikant. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

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Das AOM/DSS-Protokoll wurde erstmals 1996 von Okayasu et al.25 eingeführt und gilt seitdem als hervorragendes Modell für die getreue Nachahmung der Entstehung und des Fortschreitens von Dickdarmkrebs von normalem Gewebe zu adenomatösen Veränderungen und schließlich zum Karzinom, wie Suzuki et al. im Jahr 200626 zeigten, insbesondere im Zusammenhang mit Dickdarmentzündungen. Nachfolgende Studien untersuchten die Auswirkungen von AOM und AOM/DSS auf verschiedene Mausstämme sowie den Einfluss unterschiedlicher Behandlungsdauern auf den Tumorphänotyp und die Penetranz 26,27,28. Im Jahr 2018 veröffentlichten Christopher Williams und seine Gruppe ein aktualisiertes Protokoll29, das eine entscheidende Grundlage für die Entwicklung dieser Methodik legte. Jüngste Fortschritte haben die Nützlichkeit des AOM/DSS-Modells für die Untersuchung der Schleimhautimmunität durch die Integration von Methoden zur Isolierung von intestinalen Immuninfiltraten und Immunphänotypisierung mittels Durchflusszytometrie30 weiter demonstriert.

Eine der größten Stärken des AOM/DSS-Protokolls liegt in der einfachen Anpassungsfähigkeit an praktisch jeden Mäusestamm, was die Untersuchung der Auswirkungen verschiedener genetischer Hintergründe erforderlich macht. So verglichen Suzuki et al. die Anfälligkeit für AOM/DSS-induzierte Dickdarmkarzinogenese in vier verschiedenen Mausstämmen unter Verwendung der Dickdarmadenom-Penetranz als Messwert, mit folgenden Ergebnissen: BALB/c > C57BL/6N > DBA/2N = C3H/HeN26. Weitere Studien zeigten, dass FVB/N-Mäuse nach wiederholter AOM-Behandlung im Vergleich zu den Stämmen C57BL/6J und 129/SvJ leichter Dickdarmtumoren entwickeln27. Bemerkenswert ist, dass die Entwicklung eines gut differenzierten Dickdarm-Adenokarzinoms mit nahezu 100%iger Penetranz bei FVB/N-Mäusen in einem 10-wöchigen AOM/DSS-CAC-Induktionsprotokoll berichtetwurde 31. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass verschiedene Mausstämme möglicherweise nicht gleich anfällig für eine AOM/DSS-Behandlung sind, was zu Variationen in der Tumorgenese beiträgt und die Notwendigkeit eines konsistenten Richtliniensatzes für die Harmonisierung und Reproduzierbarkeit des AOM/DSS-Protokolls über Mausstämme, Haltungseinrichtungen und andere Variablen hinweg unterstreicht. Unter diesen behindert die signifikante Variabilität des Darmmikrobioms die Reproduzierbarkeit von Studien, die sich auf Entzündungen und Tumorpenetranz konzentrieren 9,10. Insbesondere die Zusammensetzung des Darmmikrobioms, einschließlich der Arten Duncaniella muricolitica und Alistipes okayasuensis, kann einen übergroßen Einfluss auf den Schweregrad der DSS-Kolitishaben 13. Eine andere Studie unterstrich die Bedeutung der Mikrobiota-Zusammensetzung bei der CAC-Induktion, indem sie zeigte, dass NLRP3-defiziente Mäuse einen verschlimmerten Colitis-Phänotyp aufwiesen, der durch ein erhöhtes Vorhandensein der bakteriellen Stämme Bacteroidetes (insbesondere Prevotellaceae) und TM710 gekennzeichnet war.

Trotz der Popularität der Methode haben die bestehenden AOM/DSS-Protokolle das signifikante Problem der hohen Variabilität, die bei Tieren innerhalb von Versuchsgruppen beobachtet wurde, nicht gelöst32. Um diese Herausforderung anzugehen, haben wir eine Reihe von Empfehlungen zur Protokolloptimierung und -harmonisierung durch die Implementierung der DSS-Titration (unter Berücksichtigung des Tiergeschlechts) und der Homogenisierung der Mikrobiota vorgelegt. Unser Ansatz zielt darauf ab, die Variabilität zu reduzieren und die Reproduzierbarkeit des AOM/DSS-Modells über Tierstämme, Versuchsdesigns und Endpunkte hinweg zu verbessern. Obwohl wir keine spezifischen Empfehlungen bezüglich der Stichprobengrößen geben können, wird die Anzahl der experimentellen Replikate durch das spezifische Studiendesign und die erwarteten Effektgrößen für jedes Experiment bestimmt. Die geringere Variabilität innerhalb der Gruppe, die durch diese Verfeinerungen erreicht wird, erfordert weniger Tiere in jeder Bedingung, um die gleiche statistische Aussagekraft bei der Erkennung dieser Unterschiede zu erreichen. Wir gehen davon aus, dass diese Verbesserungen den ethischen Umgang mit Tieren, den verantwortungsvollen Umgang mit Forschungsgeldern und die Reduzierung von Arbeitsaufwand weiter fördern werden, was zu einer Effizienzsteigerung führt.

Das AOM/DSS-Modell hat einen signifikanten translationalen Wert bei der Untersuchung von Colitis-assoziiertem Darmkrebs beim Menschen. Angesichts der Herausforderungen bei der Modellierung von humanem Darmkrebs aufgrund seiner komplexen Ätiologie ist es wichtig zu betonen, dass das AOM/DSS-Modell zwar einige Einblicke in die Pathogenese von sporadischem Darmkrebs geben könnte, aber am besten für Studien zu entzündungsassoziierten Malignomen geeignet ist. Darüber hinaus weist der AOM/DSS-induzierte Krebs eine geringe Inzidenz von Metastasenauf 33,34 und ist daher für die Untersuchung der Metastasierung ungeeignet. Ungeachtet dieser Einschränkungen ist das AOM/DSS-Modell sehr penetrant, zuverlässig, weist eine für den Menschen relevante Histopathologie auf und ahmt das Fortschreiten der Erkrankung von der Entzündung über die Dysplasie bis zum Adenokarzinom genau nach, während es gleichzeitig kostengünstig bleibt. In diesem Protokoll geben wir Empfehlungen zur Generierung reproduzierbarer Ergebnisse und zur Minimierung von Störfaktoren auf der Grundlage bestehender Arbeitsabläufe 8,35.

Die Identifizierung der optimalen DSS-Dosierung durch Dosis-Wirkungs-Pilotexperimente, bei denen das Geschlecht der Tiere als biologische Variable berücksichtigtwird 16,36,37, ist der erste entscheidende Schritt zur Etablierung eines robusten AOM/DSS-Protokolls (Abbildung 1). Wir fanden heraus, dass die Behandlung mit 3% DSS für 7 Tage zu einer signifikanteren Abnahme des Körpergewichts bei Frauen (~20%) im Vergleich zu Männern (~15%) führte (Abbildung 1B,D). Männliche Mäuse können jedoch im Vergleich zu Weibchen mehr, weniger oder gleich empfindlich auf DSS reagieren. Dies kann auf unterschiedliche Mausstämme und Unterschiede in der Zusammensetzung des Darmmikrobioms in den Tierhaltungen zurückzuführen sein, was eine Neuanpassung der DSS-Konzentration erforderlich macht, die auf jede spezifische Versuchsreihe zugeschnitten ist. Die optimale DSS-Konzentration ist ein Kompromiss zwischen der Maximierung der Dickdarmentzündung und der Tumorinduktion, ohne die tolerierbare Toxizität zu überschreiten. Unserer Erfahrung nach wird dieses Gleichgewicht höchstwahrscheinlich bei DSS-Dosen erreicht, was zu einem Körpergewichtsverlust von etwa 20% nach dem ersten Zyklus führt. Die Tiere neigen dazu, im zweiten Behandlungszyklus weniger Gewicht zu verlieren, aber im dritten Zyklus der DSS wird im Allgemeinen eine stärkere Verringerung des Körpergewichts beobachtet, möglicherweise aufgrund der Tumorbildung im Dickdarm. Daher kann ein Körpergewichtsverlust von 25 % als humaner Endpunkt für institutionelle Tierverwendungsprotokolle übernommen werden. Darüber hinaus führt eine gut kalibrierte DSS-Kolitis zu weichen, aber immer noch gebildeten Stuhlpellets anstelle von Durchfall und gelegentlichen positiven hämoccultischen Tests, aber zu wenigen Fällen von sichtbaren Blutspuren im Stuhl, wobei davon ausgegangen wird, dass sich die Tiere innerhalb von zwei Wochen nach Beendigung der DSS-Verabreichung vollständig erholen.

DSS ist ein Polymer mit einem Molekulargewicht von 36.000 bis 50.000 Da. Aufgrund der Variabilität von Charge zu Charge bei der DSS-Herstellung ist es wichtig, für jede neue Charge des Produkts DSS-Dosis-Rekalibrierungsexperimente durchzuführen. Um die Konsistenz zu wahren, ist es praktisch, die Gesamtmenge an DSS zu schätzen, die für die gesamte Studie benötigt wird, die von derselben Charge erworben werden soll. Darüber hinaus beschreibt dieses Protokoll auch Schritte zur Standardisierung der Mikrobiota-Zusammensetzung über die gesamte experimentelle Kohorte von Mäusen während der CAC-Induktion, um so potenzielle Käfigeffekte zu mildern und die Variabilität zu reduzieren. Als zusätzliche Vorsichtsmaßnahme zur Minimierung von Auswirkungen auf die Käfighaltung wird empfohlen, Tiere aus verschiedenen Versuchsgruppen nach Möglichkeit in gemeinsamer Haltung zu halten. Abhängig von den spezifischen Versuchszielen und der ethischen Tierverwendungspolitik sollten diese Überlegungen in Pilotversuchen widergespiegelt werden. Die Abdrift der Mikrobiota kann auch durch Einstreuwechsel in einem nassen Käfig mit undichten Trinkflaschen ausgelöst werden. Es ist am besten, während der DSS-Lieferung und für fünf Tage danach auf Käfigwechsel zu verzichten. Die Verwendung von 50-ml-Röhrchen für die DSS-Wasserverabreichung reduziert das Risiko von Leckagen und minimiert den DSS-Abfall. Diese logistischen Überlegungen können eine enge Zusammenarbeit zwischen Forschungspersonal und Tierpflegern erfordern, die Käfigwechsel und Haltungsdienste durchführen.

In diesem Protokoll bieten wir auch einen grundlegenden Arbeitsablauf für die Gewebe- und Zellentnahme sowie die Datenerfassung an. Dazu gehören die Untersuchung auf okkultes Blut (Abbildung 2C) und die Kartierung von Tumoren (Abbildung 3A). Das AOM/DSS-Modell eignet sich für immunkompetente Mäuse und ist daher aufgrund des vollständig intakten Immunsystems ein ideales System für die Erforschung der Immunmikroumgebung des Tumors38,39, im Gegensatz zu Xenotransplantat-Ansätzen. Insbesondere ist es anfällig für experimentelle Störungen des Immunsystems oder der stromalen Komponenten, sei es durch ein genetisches Cre-Lox-System für zelltypspezifische Gen-Knock-in/-outs oder Reporterkassetten oder durch Transplantation oder Depletion spezifischer Zellpopulationen. So haben wir beispielsweise durch die Kombination des AOM/DSS-Modells mit einer Knochenmarktransplantation untersucht, wie Mutationen im hämatopoetischen System den Schweregrad und die Belastung der CAC modulieren40. Um solche Studien zu unterstützen, gibt es hervorragende veröffentlichte Methoden zur Isolierung lebensfähiger tumorinfiltrierender Leukozyten, die sich für weitere Analysen eignen, wie z. B. Immunphänotypisierung, funktionelle Assays und Einzelzell-Multi-Omics41. Aufgrund der hohen Penetranz und der konsistenten Latenz eignet sich das AOM/DSS-Modell für präklinische therapeutische Studien, bei denen die Gesamttumorlast als primärer Messwert verwendet wird.

Offenlegungen

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Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde teilweise durch die NIH-Preise R01 DK121831 (OAG) und R01 AI067846 (DA) finanziert. OAG wurde auch von der Edward P Evans Foundation und der Oxnard Family Foundation unterstützt. DA wird durch den Merit Society Award unterstützt. Das UFHCC ist ein NCI-designiertes Krebszentrum (P30 CA247796).

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Azoxymethan-PulverSigma-AldrichCAS 25843-45-2, Cat# A4586Karzinogen zur Induktion von Dickdarmtumoren
Tisch-MikrozentrifugeNA NAFür die Probenvorbereitung 
C57BL/6J MäuseJackson Laboratory000664Dehnung und Alter je nach spezifischer Studie
Konische Röhrchen, 50 mLFisher 14955239Zur Verabreichung von DSS-Wasser
Dextransulfat-Natriumsalz, MW ca. 40.000Cayman Chemical 23250Zur Induktion einer Dickdarmentzündung 
Ethanol, 70%Fisher 43655223Zur Desinfektion von Arbeitsflächen und Sezierwerkzeugen
Schleifen von Glasperlen, 800 & micro; M VWR12621-148Zur Erleichterung der Homogenisierung von Dickdarm-/Tumorgewebe
HemoCue America  Beckman Coulter Hemoccult ICT Immunchemisches Testkit für okkultes Blut im StuhlHemoCue America 395065AKatalog-Nr.23280010Zum Nachweis von okkultem Blut im Kot
Insulinspritze 27GX5/8 1CC BD 3294-12Für AOM-Injektionen
Lixit BlockerNANAZum Blockieren der automatischen Wasserabgabe in Mäusekäfige, falls vorhanden (von der Tiereinrichtung zur Verfügung gestellt, steril) 
Magnetrührstab und Rührplatte NANADSS auflösen 
Mikroröhrchen-Bead-Homogenisator, BeadBlaster 24 BenchmarkD2400Zur Homogenisierung von Dickdarm-/Tumor-Maus
Lipocalin-2/NGAL DuoSet ELISAR& D SystemsKatalog Nr. DY1857Zum Nachweis von Lipocalin-2 aus Stuhlproben
NP-40 Lösung, 10Thermo Fisher Scientific85124Für die Lyse von Tumor-/Dickdarmgewebe
Pierce BCA Protein Assay KitThermo Fisher ScientificA65453Zur Quantifizierung der Proteinkonzentration in Gesamtgewebelysaten oder eine andere geeignete Methode
Protease- und Phosphatinhibitor-Cocktail FisherPI78440Zur Vorbereitung von Proben für die Zytokin-/Proteinanalyse 
RLTplus-PufferQiagen1053393Zur Isolierung von RNA oder einer anderen geeigneten RNA-Isolierungsmethode
RNAlaterThermo Fisher ScientificAM7021Zur Konservierung von Gewebeproben vor der RNA-Isolierung
RNeasy Microprep Kit QIAGEN74004Zur Isolierung von RNA oder einer anderen RNA-Isolations- und Aufreinigungsmethode je nach Bedarf
Düse für Nagetier-Wasserflaschen (30 mm)VisionTyp EZur Verabreichung von Wasser oder DSS-Lösung
Sterile Scheren und PinzettenNANA FürGewebedissektion
Spritzennadeln, 27 G x 1/2 Zoll Länge (kurz)BD 305109Für die Fixierung von Dickdarm-Swiss-Roll-Gewebe 
Spritzen, Luer-Lock, 3 mLBD 309657Zur Spülung des Dickdarms vor der Dissektion und dem Staging
TapeStationAgilentFür die Bewertung der RNA-Konzentration und der Qualität/Integrität
Teklad 2918Evigo BioproductsT.2918M.15Standard-Nagetierfutter, 18 % Protein, bestrahlt
GewebekassetteVWR#87002-472Zur Konservierung der Probe zum Einbetten
Toploading-Laborwaage, 0-220 gNANAZum Wiegen von Tieren
Whatman Löschpapier VWRInternationalKat# 28298-020Zum Staging von präparierten Dickdarms für die grobe Pathologie und Tumorzählung
% die

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Azoxymethane DSS ModelMouse Colon CancerInflammation Related CancerMicrobiota HomogenizationDSS Dose TitrationC57BL 6J MiceCytokine ProfilingTissue Processing
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