Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

Krebsassoziierte Fibroblasten aus Mammatumoren der Maus als Werkzeuge für molekulare und computergestützte Studien

1.5K Aufrufe

⸱

DOI:

10.3791/68364

⸱

3. Juli 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Biotechnology and Health Science, University of Torino, 2Human Technopole, 3Department of Science and Technological Innovation, University of Piemonte Orientale

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Kultivierung, Manipulation und Analyse von murinen CAFs, einschließlich funktioneller In-vitro-/In-vivo-Assays , Transkriptomik und computergestützter Analyse. Darüber hinaus wird eine webbasierte Plattform beschrieben, die entwickelt wurde, um die öffentlich zugänglichen Transkriptome von mikropräparierten stromalen und epithelialen Komponenten aus einer Sammlung von menschlichen Brustkrebstumoren zu analysieren.

Zusammenfassung

Eine überzeugende Forschungsarbeit hat die entscheidende Rolle der Tumormikroumgebung (TME) für das Wachstum und die Aggressivität von Brustkrebs (BC) bestätigt. Krebsassoziierte Fibroblasten (CAF), die vorherrschende Zellkomponente der TME, beeinflussen ihr Verhalten signifikant durch komplexe Wechselwirkungen mit Krebs- und anderen Stromazellen als Reaktion auf tumorbasierte Aktivierungssignale. Mausmodelle werden ausgiebig verwendet, um die Mechanismen zu untersuchen, die der Rolle von CAF bei der BC-Progression zugrunde liegen, da sie die Bewertung der endogenen TME und die Beurteilung der Beteiligung des Immunsystems anhand syngener Xenotransplantatstudien ermöglichen. Hier stellen wir eine Reihe von Methoden zur Kultivierung von BC-abgeleiteten CAFs, zur Manipulation der Genexpression und zur Bewertung ihrer protumorigenen Funktionen sowohl mit in vitro - als auch mit in vivo-Ansätzen vor. Wir beschreiben auch Protokolle für die Erstellung von CAF-Genexpressionsprofilen und die transkriptomische Analyse sowie ein computergestütztes Verfahren zur Ableitung von transkriptionellen Signaturen in Primärtumoren unter Verwendung öffentlich zugänglicher RNA-seq-Massendaten. Darüber hinaus stellen wir ein benutzerfreundliches, webbasiertes Tool zur Analyse der Transkriptome von stromalen und epithelialen Komponenten aus mikrodissezierten BC-Tumoren mit Lasererfassung vor. Letztendlich können diese Methoden wertvolle Einblicke in die molekularen Mechanismen liefern, die CAF-Tumor-Interaktionen antreiben, und bergen das Potenzial für die Identifizierung neuer therapeutischer Ziele.

Einleitung

Brustkrebs (BC) ist die häufigste bösartige Erkrankung bei Frauen und zeichnet sich durch eine signifikante molekulare Heterogenität aus, wobei unterschiedliche molekulare Profile die Diagnose, Behandlungsentscheidungen und Prognose leiten. Die Tumormikroumgebung (TME) ist ebenfalls sehr heterogen und spielt eine entscheidende Rolle für die Tumorprogression, die Immunität und die Behandlungsergebnisse.

Krebsassoziierte Fibroblasten (CAFs) sind der am häufigsten vorkommende Zelltyp in der TME und wichtige Regulatoren der Tumorentwicklung. Sie tragen zur Ablagerung und zum Umbau der extrazellulären Matrix, zur Angiogenese, zur Immunevasion und zur Arzneimittelresistenz bei 1,2,3,4,5,6. CAFs beeinflussen Tumorzellen durch direkten Zell-Zell-Kontakt, die Freisetzung extrazellulärer Vesikel7 und die Sekretion verschiedener löslicher Faktoren 2,5, um das Tumorwachstum, die Invasion und die Therapieresistenz zu fördern 8,9,10. In der Tat haben stromabezogene Gensignaturen einen prädiktiven Wert für das Fortschreiten der BC und das Ansprechen auf die Therapie und sind mit einer Resistenz gegen Chemotherapie assoziiert 11,12,13,14. Trotz umfangreicher Hinweise, die darauf hindeuten, dass CAFs ein attraktives therapeutisches Ziel darstellen, sind klinische Studien, die auf diese Zellen abzielen, weitgehend gescheitert15. Eine große Herausforderung ist das begrenzte Verständnis der molekularen Mechanismen, durch die CAFs das Tumorverhalten modulieren. Jüngste Fortschritte in der Einzelzell- und räumlichen Transkriptomanalyse haben tiefere Einblicke in die Komplexität von CAFs in BC 16,17,18,19,20,21 ermöglicht, was die Identifizierung unterschiedlicher CAF-Subtypen mit spezifischen funktionellen Programmen ermöglicht 16,22 und deren Komplexität und Plastizität weiter hervorhebt23.

Gentechnisch veränderte Mausmodelle (GEMMs), in denen Onkogene oder Tumorsuppressorgene überexprimiert oder inaktiviert werden, sind etablierte Modelle für die Untersuchung von Krebs beim Menschen 24,25,26,27. Im Vergleich zu syngenen Modellen, bei denen Tumorzellen in Wildtyp-Mäusen transplantiert werden 23,28, ahmen GEMMs das mehrstufige Fortschreiten des BC und die Wechselwirkungen zwischen Krebszellen und der TME genauer nach. Die Manipulation der Aktivitäten von CAFs in GEMMs war jedoch aufgrund ihrer Heterogenität eine Herausforderung, was es schwierig macht, alle CAF-Subtypen ohne Off-Target-Effekte auf andere stromale oder epitheliale Komponenten zu bekämpfen5. Die Kombination von GEMMs mit komplementären Ansätzen, wie z. B. der In-vitro-CAF-Manipulation, kann dazu beitragen, zelluläre Modelle für Funktionsverlustexperimente sowohl in vitro als auch in vivo zu generieren. Die Entwicklung stabiler zellulärer Modelle zur Erforschung der funktionellen Rollen bestimmter Gene bleibt jedoch aufgrund des schnellen Einsetzens der Seneszenz eine Herausforderung.

Hier beschreiben wir eine robuste Plattform für stabile Loss-of-Function-Experimente in CAFs, gefolgt von funktioneller in vitro und in vivo Analyse und transkriptionellem Profiling der gentechnisch veränderten Zellen; Dieser Ansatz bietet eine umfassende Strategie zur Analyse der funktionellen Relevanz von CAF-exprimierten Genen bei Brustkrebs mit Vorteilen in Bezug auf Spezifität, Reproduzierbarkeit und Anpassungsfähigkeit gegenüber bestehenden Methoden. Dieser Ansatz wird auch durch ein neuartiges webbasiertes Tool zur Erforschung von Transkriptomen von mikrodissektionierten Stroma- und Epithelkompartimenten aus menschlichen Brusttumoren ergänzt, das Speziesvergleiche ermöglicht und die Hypothesengenerierung aus menschlichen Daten erleichtert.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

Diese Studie entspricht allen institutionellen Richtlinien bezüglich des Umgangs mit Mäusen und der Gewebeprobenahme. Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit nationalen und internationalen Gesetzen und Richtlinien durchgeführt. Die Mäuse wurden in einer spezifisch pathogenfreien transgenen Einheit unter einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus bei 22 °C und 50% Luftfeuchtigkeit untergebracht und ad libitum mit Futter und Wasser versorgt. Chirurgische Eingriffe müssen den Anweisungen des institutionellen Tierarztes folgen, um eine angemessene Anästhesie und Analgesie sowohl während des Eingriffs als auch in der postoperativen Phase zu gewährleisten. Die Materialtabelle enthält Details zu Materialien, Reagenzien und Instrumenten, die in diesem Protokoll verwendet werden.

1. Zellkultur

  1. Kultivieren Sie Zellen bei 37 °C in einer 5 % CO2 -Atmosphäre mit 95 % relativer Luftfeuchtigkeit in DMEM (HEK293T, CAFs und immortalisierte CAFs (iCAFs)) oder RPMI-Medium (4T1), ergänzt mit 100 μg/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin (1 % Pen/Strepto).
    HINWEIS: Zusammensetzung des vollständigen Mediums (cDMEM, cRPMI): 10 % hitzeinaktiviertes FBS, Zusammensetzung des Hungermediums (sDMEM, sRPMI): kein FBS. Durchschnittliche Verdopplungszeiten für Zellen: HEK293T und iCAFs betragen 24 Stunden; 4T1-Zellen sind 12 Stunden lang.
  2. Passagezellen bei Erreichen einer Konfluenz von 80 %, in einem Verhältnis von nicht mehr als 1:5, nie mehr als 10 Mal nach dem Auftauen, um phänotypisches Driften zu vermeiden, wie unten beschrieben.
    1. Aspirieren Sie das Medium und geben Sie vorsichtig 7 ml PBS an die Seite einer 100-mm-Schale. Aspirieren Sie das PBS und fügen Sie 1 ml Trypsin-EDTA hinzu. 2-3 min bei 37 °C inkubieren.
      ACHTUNG: EDTA ist als gefährliche Verbindung der Kategorie 2 für Augenreizungen aufgeführt. Stecken Sie den Griff in eine biologische/Abzugshaube und tragen Sie geeignete PSA.
    2. Inaktivieren Sie Trypsin-EDTA mit 5 mL cDMEM, lösen Sie die Zellen durch Auf- und Abpipettieren und sammeln Sie sie in einem konischen 15-ml-Röhrchen. Zentrifugieren Sie bei 290 x g für 5 min.
    3. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 5 mL cDMEM. Für eine 1:5-Teilung säen Sie 1 ml resuspendierte Zellen in eine 100-mm-Schale, die 9 ml cDMEM enthält.
  3. Zellzählung: Laden Sie 10 μl der Zellsuspension aus Schritt 1.2.3 auf die Seite einer Neubauer-Zählkammer, zählen Sie die Zellen in den großen Quadraten und multiplizieren Sie die erhaltene Zahl mit 1 x 104 , um die Anzahl der Zellen zu berechnen, die in 1 ml Zellsuspension enthalten sind.
  4. Kryokonservierung: Frieren Sie 50 % einer 100-mm-Schale (ca. 3 x 106 Zellen) in 0,5 mL eiskaltem Gefriermedium (10 % DMSO in hitzeinaktiviertem FBS) ein, wie unten beschrieben.
    1. Aus einer 100-mm-Schale werden die Zellen wie in den Schritten 1.2.1 und 1.2.2 beschrieben trypsinisiert, mit der Ausnahme, dass die Zellen in 1 ml eiskaltem Gefriermedium resuspendiert werden.
    2. Geben Sie 0,5 mL in jedes Kryofläschchen und stellen Sie es bei -80 °C in ein Gefäß, das eine Abkühlrate von etwa 1 °C/min gewährleistet. Jedes Aliquot kann in einer 100 mm Schale aufgetaut werden.
  5. Mykoplasmen-Kontaminationstest: Sammeln Sie 1 ml Wachstumsmedium von konfluenten Zellen, die mindestens 3 Tage lang kultiviert wurden. Bei 95 °C 20 Min. kochen lassen. Bei 16200 x g für 5 min bei Raumtemperatur (RT) schleudern. 5 μl Überstand zu 45 μl PCR-Reaktionsgemisch hinzufügen (0,15 mM dNTPs, 1,5 mM MgCl2, 1x Reaktionspuffer, 1 U Taq-Polymerase, 0,5 μM Primer A und B, siehe Tabelle 1). Führen Sie PCR durch, einschließlich Positiv- und Negativkontrollen, und trennen Sie PCR-Produkte auf einem 1%igen Agarose-Gel zusammen mit einer DNA-Leiter. Mykoplasmen-kontaminierte Proben zeigen eine 600 bp-Bande.

2. Die Isolierung von CAFs aus Brusttumoren

HINWEIS: Dieser Schritt ist für fortgeschrittene Tumoren mit einem Durchmesser von 5-10 mm optimiert (siehe Referenz29 ).

  1. Opfern Sie die Maus durch Zervixluxation. Isolierung von Brusttumoren mit einer Größe von mindestens 125 mm3. Entfernen Sie den Tumor vorsichtig und entfernen Sie die umgebende Haut, das Brustgewebe und die sichtbaren nekrotischen Bereiche. Mit einer Pinzette in einem 1,5-ml-Mikroröhrchen auf Eis sammeln.
  2. Wiegen Sie den Tumor mit einer Präzisionswaage, schneiden Sie ein kubisches Stück von 0,1-0,3 g mit einem Skalpell heraus, geben Sie es in ein neues 1,5-ml-Mikroröhrchen, das mit eiskaltem PBS gefüllt ist, und halten Sie es auf Eis. Stellen Sie sicher, dass das Gewebe untergetaucht ist, um eine Austrocknung zu vermeiden.
  3. In eine Schüssel mit einem Durchmesser von 60 mm auf Eis geben. 1 ml PBS mit einem Skalpell fein hacken, bis ca. 1-2 mm große Stücke entstehen.
  4. Transfer in ein konisches 15-ml-Röhrchen mit 5 mL pro 0,1 g Tumor in cDMEM plus 10 μg/mL Kollagenase. Spülen Sie die Schale mit 1 ml desselben Mediums aus und verwenden Sie eine P1000-Pipette mit abgeschnittener Spitze, um Zellschäden zu vermeiden. Sichern Sie die Kappe mit einer Dichtungsfolie, um ein Auslaufen zu vermeiden.
  5. 1 h lang horizontal bei 37 °C auf einem Orbitalschüttler inkubieren. Legen Sie ein 70-μm-Zellsieb auf ein konisches 50-ml-Röhrchen und übertragen Sie das Homogenat mit einer serologischen 10-ml-Pipette. Verwenden Sie die Rückseite eines 5-ml-Spritzenkolbens, um die Probe zu zerkleinern und durch den Filter zu drücken.
  6. Verwenden Sie cDMEM (nicht mehr als 30 mL Endvolumen), um alles aus dem Sieb zurückzugewinnen. Die Zellen bei 129 x g bei 4 °C 10 min lang schleudern und den Überstand verwerfen.
  7. Fügen Sie 3 ml Ammoniumchlorid-Kalium (ACK) -Lysepuffer hinzu, um rote Blutkörperchen (RBC) zu entfernen. Die Röhrchen fest verschließen und durch Inversion mischen. 5 min bei RT auf einem Orbitalschüttler inkubieren.
  8. Stoppen Sie die Erythrozytenlyse, indem Sie PBS zu einem Endvolumen von 30 ml hinzufügen. Die Zellen bei 129 x g bei 4 °C 10 min lang schleudern und den Überstand verwerfen.
  9. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 mL cDMEM und zählen Sie lebensfähige Zellen wie in Schritt 1.3 mit 10 μl Methylenblau: Lebende Zellen reduzieren den Farbstoff zu einem farblosen Produkt und werden ungefärbt, während tote Zellen blau gefärbt werden.
  10. 5 x 105 Zellen/60 mm Schale in 5 mL cDMEM säen, 20 min bei 37 °C in einer 5 % CO2 -Atmosphäre inkubieren, nicht anhaftende Zellen sammeln und über Nacht wieder ausschichten.
  11. Nach 48 h oder 72 h ist eine differentielle Trypsinisierung durchzuführen. Da sich Fibroblasten schneller ablösen als Epithel- und Myoepithelzellen30, ist wie in Schritt 1.2 beschrieben vorzugehen. Beobachten Sie jedoch die Zellablösung unter dem Mikroskop genau. Fibroblastenförmige Zellen werden rund und lösen sich ab, während die Epithelzellen anhaften.
  12. Fügen Sie cDMEM hinzu, um Trypsin zu inaktivieren und abgelöste CAFs zu sammeln, und übertragen Sie sie in eine neue 60-mm-Schale in 5 ml cDMEM. Primäre CAFs 1:3 für drei Passagen in der Passage (siehe Schritt 1.2) für drei Passagen vorbereiten, dann gefrorene Aliquots für die frühe Passage wie in Schritt 1.4 beschrieben.

3. Immortalisierung durch virale Transduktion

HINWEIS: Einige der folgenden Schritte müssen in einer Umgebung durchgeführt werden, die für den Umgang mit retroviralen Vektoren (z. B. BSL2+) geeignet ist; Überprüfen Sie Ihre institutionellen Regeln.

  1. Vorbereitung des rekombinanten Virus
    1. HEK293T Zellen kultivieren und auf Mykoplasmenkontamination prüfen (siehe Schritt 1).
    2. Eine Schale mit einem Durchmesser von 100 mm beschichten, indem 6 ml einer 0,1 mg/ml-Lösung von Poly-L-Lysin 5 min lang bei RT in ddH2O pipetiert werden, aspirieren und unter der Haube trocknen lassen (ca. 10 min).
    3. Seed 3 x 106 HEK293T Zellen (niedrige Passage, Mykoplasmen negativ) in 10 mL cDMEM in der mit Poly-L-Lysin beschichteten Schale aus Schritt 3.1.2 (siehe Schritt 1.3).
    4. Bereiten Sie am nächsten Tag zwei Röhrchen mit 0,75 ml antibiotikafreiem, transfektionsoptimiertem Medium vor. Zu einem von ihnen fügen Sie 30 μl Kationenlipid-vermitteltes Transfektionsreagenz (T1) hinzu. Fügen Sie dem zweiten 2 μg pCL-Ampho (retroviraler Verpackungsvektor) und 2 μg retroviraler pBABE-neo largeT cDNA-Vektor (T2) hinzu. T2 bis T1 hinzufügen, vorsichtig mischen und 10 Minuten inkubieren.
    5. Verteilen Sie das Medium gleichmäßig über die Zellen, nachdem Sie es durch antibiotikafreies, transfektionsoptimiertes Medium + 10 % hitzeinaktiviertes FBS ersetzt haben. Bringen Sie die Platte in eine Gewebekulturanlage der Biosicherheitsstufe 2+ (BSL-2+). Ersetzen Sie das Medium nach 6-12 h durch cDMEM und inkubieren Sie die Zellen für 24-48 h.
    6. Das Medium, das die pseudoviralen Partikel enthält, wird durch einen 0,45-μm-Spritzenvorsatzfilter gefiltert und einige Tage bei 4 °C oder für die Langzeitlagerung bei -80 °C gelagert.
  2. Die virale Transduktion von CAF
    1. 7,5 x 105 CAFs in je zwei 60-mm-Schalen in 4 mL cDMEM aussäen (siehe Schritt 1.3) und wie in Schritt 1.1 kultivieren.
    2. Am nächsten Tag wird das Medium einer Schale durch 2 ml des pseudovirushaltigen Mediums aus Schritt 3.1.6 (transduzierte CAFs) ersetzt, 2 ml cDMEM hinzugefügt und 24 Stunden lang inkubiert. Lassen Sie das andere Gericht unberührt (nicht transduzierte CAFs).
    3. Wiederholen Sie am nächsten Tag Schritt 3.2.2 auf den transduzierten CAFs. Ersetzen Sie nach 24 Stunden das Medium beider Schalen durch 4 mL cDMEM.
    4. Nach weiteren 24 Stunden beginnen Sie mit der Auswahl, indem Sie das Medium beider Schalen durch cDMEM ersetzen, das mit 400 μg/mL G418 ergänzt wird. Ersetzen Sie das G418-haltige Medium alle 2-3 Tage, bis keine lebenden Zellen mehr in der Kontrollschale von nicht transduzierten CAFs verbleiben.
      HINWEIS: Nicht transduzierte Zellen reagieren empfindlich auf G418 und sterben innerhalb von 7-10 Tagen ab, was darauf hindeutet, dass nur G418-resistente transduzierte Zellen im transduzierten CAF-Zustand überlebt haben. Die optimale Antibiotikakonzentration muss für jeden Zelltyp bestimmt werden, wobei Abtötungskurven durchgeführt werden müssen (testen Sie einen Bereich von 50 bis 1000 μg/ml G418-Konzentration für 7-10 Tage und wählen Sie die Dosis, die alle Zellen innerhalb von 10 Tagen abtötet).
    5. Die ausgewählten transduzierten Zellen werden 2x im Verhältnis 1:3 durchlaufen (siehe Schritt 1.2), bevor die BSL-Anlage verlassen wird. Bereiten Sie kryokonservierte Aliquots von frühen Passagen wie in Schritt 1.4 vor.
    6. Stellen Sie sicher, dass sich die Zellen weiter vermehren, ohne einen seneszenten Phänotyp für mehrere Passagen zu zeigen, und fahren Sie mit der phänotypischen und funktionellen Charakterisierung fort (siehe Schritte 4 und 6-9).

4. Phänotypische Charakterisierung

HINWEIS: CAFs-Marker wie Alpha-Aktin der glatten Muskulatur (α-SMA), Caveolin, Fibroblasten-aktivierendes Protein (FAP), N-Cadherin, Thrombozyten-abgeleiteter Wachstumsfaktor Beta (PDGFR-β), S100A4 und Vimentin29 können durch RT-qPCR und Western Blot bestimmt werden.

  1. RT-qPCR: Extraktion der Gesamt-RNA mit einer monophasischen Lösung von Phenol und Guanidinisothiocyanat, wie in der Referenz15 beschrieben. 2 μg Gesamt-RNA in einem Volumen von 20 μl werden gemäß den Anweisungen des Herstellers für die Reaktionsbedingungen rückwärts transkribiert. Verdünnen Sie cDNA 1:20 und verwenden Sie 3 μl, um die RT-qPCR-Reaktionen gemäß den Anweisungen des Herstellers durchzuführen (siehe Tabelle 1 für Primer).
    HINWEIS: Wir empfehlen, die RNA aus einer 12-Well-Schale zuzubereiten.
  2. Western-Blot
    1. Waschen Sie 2x mit PBS wie in Schritt 1.2.1 beschrieben, fügen Sie 0,2 mL eiskalten Lysepuffer hinzu, lösen Sie die Zellen mit einem Schaber und sammeln Sie sie in einem 1,5 mL Mikroröhrchen wie in29 beschrieben. 20 min auf Eis gehen lassen.
    2. Die Proben bei 16.000 x g für 10 min bei 4 °C schleudern und den Überstand auffangen. Quantifizieren Sie Proteine durch kolorimetrische Assays gemäß den Anweisungen des Herstellers. Verwenden Sie mindestens 20 μg Protein für den Western Blot (siehe Tabelle 2 für Antikörper).
      HINWEIS: Wir empfehlen, Proteine aus nicht weniger als 6 Vertiefungen in einer Schüssel zuzubereiten.
  3. Analyse von sezernierten Proteinen
    1. 2 x 106 iCAFs (siehe Schritt 1.3) in einer Schale mit 100 mm Durchmesser in 10 mL cDMEM aussäen und wie in Schritt 1.1 beschrieben kultivieren.
    2. Nach 24 h das Medium entfernen, 2x mit 10 mL PBS waschen und 48 h mit 10 mL sDMEM inkubieren (siehe Schritt 1.1), um konditioniertes Medium (CM) zu erzeugen.
    3. Nach weiteren 48 h filtrieren Sie das CM durch einen 0,2 μm Spritzenvorsatzfilter in ein konisches 15-mL-Röhrchen. Halten Sie sowohl die Spritze als auch den Schlauch fest und bereiten Sie sich auf einen gewissen Widerstand vor. CM kann bis zu 6 Monate bei -80 °C gelagert werden.
    4. Konzentrieren Sie CM ca. 10x mit Proteinkonzentratoren gemäß den Anweisungen des Herstellers, um konzentriertes CM (conCM) zu erzeugen. Quantifizieren Sie das conCM, kochen Sie und führen Sie einen Western Blot durch (siehe Tabelle 2 für Antikörper).

5. Gen-Knockdown-Analyse

HINWEIS: Um die Genexpression stabil zu beeinflussen, transduzieren wir iCAFs mit lentiviralen Partikeln, die speziell entwickelte shRNAs exprimieren. Diese können durch Klonierung der Targeting-Sequenzen in einem geeigneten lentiviralen Vektor wie pLKO.1-Puro unter Befolgung der bei https://www.addgene.org/protocols/plko/#C verfügbaren Protokolle erhalten werden. Die spezifischen Targeting-Sequenzen können mit öffentlich zugänglichen shRNA-Design-Tools (z. B. GPP-Genetic Perturbation Portal des Broad Institute, https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/) ausgewählt werden. Alternativ sind Sätze von vorgefertigten Targeting-Vektoren im Handel erhältlich (https://en.vectorbuilder.com/products-services/service/shrna-knockdown-solutions.html, https://www.sigmaaldrich.com/IT/it/technical-documents/technical-article/genomics/gene-expression-and-silencing/mission-shrna-getting-started https://www.origene.com/products/rnai/shrna-lentiviral-particles). Wir empfehlen, 4-5 verschiedene shRNAs für jedes Gen zu entwerfen und die besten 2 für Experimente auszuwählen. Generieren Sie auch Nicht-Targeting-Vektoren als Negativkontrollen. Einige der folgenden Schritte müssen in einer Umgebung durchgeführt werden, die für den Umgang mit HIV-abgeleiteten Viren (z. B. BSL2+) geeignet ist. Überprüfen Sie Ihre institutionellen Regeln.

  1. Erzeugung von lentiviralen Partikeln
    1. Seed 3 x 106 HEK293T Zellen wie in den Schritten 3.1.1 bis 3.1.3 setzen. Am folgenden Tag werden die Kationenlipid-vermittelten Transfektionsreagenz-DNA-Komplexe wie in Schritt 3.1.4 unter Verwendung von 9 μg bzw. 3 μg der Verpackungsvektoren pCMV-R8.74 und pCMV-VSVG und 7 μg des shRNA-haltigen pLKO.1-Konstrukts in 0,75 ml antibiotikafreiem transfektionsoptimiertem Medium hergestellt und wie in den Schritten 3.1.5 und 3.1.6 beschrieben vorgegangen.
  2. CAFs-Transduktion
    1. Infizieren Sie Zellen, wie in den Schritten 3.2.1, 3.2.2 und 3.2.4 beschrieben. Entfernen Sie nach 24 h das Infektionsmedium und beginnen Sie die Selektion mit 2 μg/ml Puromycin in cDMEM. Siehe Hinweis in Schritt 3.2.5 zur Bestimmung der optimalen Konzentration.
    2. Puromycin/cDMEM nach 48 h ersetzen. Die Auswahl ist in der Regel in 3 Tagen abgeschlossen. Expandieren und fixieren Sie Zellen wie in Schritt 3.2.6. Beurteilen Sie die Knockdown-Effizienz sowohl durch RT-PCR als auch durch Western Blot, wie in Schritt 4.1 beschrieben. und 4.2.

6. Superaktivierung von iCAFs mit CM aus Tumorzellen

HINWEIS: Die folgenden Schritte veranschaulichen Methoden zur In-vitro-Charakterisierung der protumoralen Aktivitäten von iCAFs. Die pro-tumoralen Aktivitäten von CAFs können durch Inkubation mit CM aus BC-Tumorzellen der Maus (Superaktivierung, s.a.) verstärkt werden, wie unten beschrieben.

  1. Zählen Sie 4T1 murine BC-Zellen wie in Schritt 1.3 beschrieben und säen Sie 2 x 106 Zellen in einer Schale mit einem Durchmesser von 100 mm in 10 ml cRPMI (siehe Schritt 1.1).
  2. Nach 24 h das Medium entfernen, 2x mit 10 mL PBS waschen und 48 h mit 10 mL sRPMI inkubieren (siehe Schritt 1.1), um CM zu erzeugen.
  3. Am nächsten Tag werden 2 x 106 iCAFs auf einer Schale mit einem Durchmesser von 100 mm in 10 ml cDMEM (siehe Schritt 1.3) gesät und wie in Schritt 1.1 beschrieben kultiviert. Das CM wird durch einen 0,2 μm Spritzenvorsatzfilter in ein konisches 15-ml-Röhrchen filtriert, wie in Schritt 4.3.3 beschrieben.
  4. Superaktivierung (s.a.): Nehmen Sie das Medium aus der iCAF-Schale, waschen Sie es 2x mit 10 mL PBS und fügen Sie das gefilterte 4T1 CM (8-10 mL) hinzu. 48 Stunden inkubieren, um s.a. iCAFs zu erhalten.

7. Proliferation von Tumorzellen

  1. 4T1-Zellen werden 48 h lang mit iCAFs CM vorbehandelt, die wie in den Schritten 4.3.1, 4.3.2, 4.3.3 vorbereitet wurden.
  2. Trypsinisieren und zählen Sie sie, säen Sie dann 4 x 103 Zellen/Vertiefung einer 96-Well-Platte in 100 μl cRPMI, wie in Schritt 1.3 beschrieben, und kultivieren Sie sie wie in Schritt 1.1. Platte technisch dreifach.
    1. Bereiten Sie pro Tag des Zeitkurses eine 96-Well-Platte vor. Die hier vorgeschlagene Anzahl von Zellen ist für ein 4-Tage-Protokoll optimiert; Skalieren Sie es für längere Zeiträume herunter.
  3. Nach 4 Stunden oder sobald die Zellen anhaften, das Medium entfernen, mit PBS waschen, indem Sie vorsichtig 100 μl hinzufügen, dabei darauf achten, dass sich die Zellen nicht ablösen, indem Sie die Spitze mit einer Mehrkanalpipette gegen den Rand der Vertiefung legen und ein steriles Reservoir verwenden. Entfernen Sie PBS und fügen Sie dann ebenfalls 100 μl sDMEM (Kontrolle) oder iCAF CM hinzu, beide ergänzt mit 2 % hitzeinaktiviertem FBS (siehe Schritte 4.3.1, 4.3.2, 4.3.3).
  4. Nach 4 h ist die Tag-0-Platte wie in Nummer 7.5 beschrieben zu stoppen. Ersetzen Sie das Medium für die anderen Zeitpunkte alle zwei Tage bis zum Ende des Experiments.
  5. Um die Zelldichte zu bestimmen, nehmen Sie die 96-Well-Platte aus dem Inkubator und waschen Sie die Wells 2x mit 100 μl PBS, wie in Schritt 7.3 beschrieben.
  6. Geben Sie unter einem Abzug 100 μl 4 % Paraformaldehyd (PFA) in jede Vertiefung und fixieren Sie die Zellen 10 Minuten lang bei RT.
    VORSICHT: PFA kann schwere Augenschäden und Hautreizungen verursachen; Es ist schädlich, wenn es verschluckt und eingeatmet wird und steht im Verdacht, genetische Defekte und Krebs zu verursachen. Schieben Sie den Handgriff in einen Abzug und tragen Sie die richtige persönliche Schutzausrüstung (PSA).
  7. 3x mit 100 μL PBS wie in Schritt 7.3 waschen und unter dem Abzug trocknen lassen (ca. 10 min).
  8. Inkubieren Sie mit 50 μl 0,1 % Kristallviolett in 20 % Methanol für 10 min bei RT.
    VORSICHT: Kristallviolett kann schwere Augenschäden verursachen und wird als Gefahr der Kategorie 4 für akute orale Toxizität und als Gefahr der Kategorie 2 als Karzinogen gemeldet. Transportieren Sie es in einem Abzug und tragen Sie geeignete PSA.
  9. 3x mit 100 μL ddH2O waschen, die Vertiefungen leeren und die Platte auf ein saugfähiges Pad oder Papiertuch klopfen, um die Flüssigkeit vollständig zu entfernen.
  10. Lösen Sie Kristallviolett 15 Minuten lang in 100 μl 10 % Essigsäure bei RT auf und messen Sie die optische Dichte (OD) bei 600 nm Wellenlänge in einem Mikroplatten-Reader, wobei 100 μl 10 % Essigsäure als Blindwert verwendet werden. Normalisieren Sie den OD für diesen Tag auf 0 pro Bedingung.

8. Migration und Invasion

  1. Pipettieren Sie 700 μl DMEM, ergänzt mit 1 % hitzeinaktiviertem FBS, 1 % Pen/Strepto, in die Vertiefungen einer 24-Well-Platte. Platzieren Sie in jeder Vertiefung einen Transwell-Einsatz mit 8 μm Poren, beschichtet (Invasion) oder nicht (Migration) mit biologisch aktiver Matrix. Lassen Sie die Platte im Inkubator bei 37 °C äquilibrieren, während Sie 4T1-Zellen wie in Schritt 1.3 sammeln und zählen.
  2. 4T1-Zellen, die 48 h lang mit iCAFs CM vorbehandelt wurden, werden wie in den Schritten 4.3.1, 4.3.2 und 4.3.3 aus einer Schale mit einem Durchmesser von 100 mm entnommen, wobei 1 ml 5 mM EDTA anstelle von Trypsin-EDTA verwendet wird.
  3. Fügen Sie 5 mL cDMEM hinzu, ernten Sie die Zellen in einem konischen 15-ml-Röhrchen und pelletieren Sie es durch Zentrifugieren wie in Schritt 1.2. Die Zellen werden in sDMEM resuspendiert, wie in Schritt 1.3 gezählt und auf 1 x 105 Zellen/100 μl verdünnt.
  4. Geben Sie 100 μl der Zellsuspension in die obere Kammer des Transwells. Als Plattierungskontrolle säen Sie 100 μl Zellen in einer 24-Well-Platte in 500 μl cDMEM. Inkubieren Sie für 16 Stunden (Migration) oder 24 Stunden (Invasion) und beenden Sie das Experiment wie unten beschrieben.
    HINWEIS: Die Inkubationszeiten müssen empirisch bestimmt werden, wenn verschiedene Zellen verwendet werden.
  5. Beschriften Sie die Einsätze auf der Oberseite mit einem dünnen Marker und tauchen Sie sie in ein konisches 50-ml-Röhrchen, das mit PBS gefüllt ist, um sie mit einer Pinzette zu waschen. Reinigen Sie den inneren Teil des Transwells vorsichtig mit einem Wattestäbchen.
  6. Unter einem Abzug werden die Proben in 700 μl 4 % PFA 10 Minuten lang bei RT inkubiert (siehe Schritt 7.6).
  7. 3x mit 700 μL PBS waschen und unter der Haube trocknen lassen (ca. 10 min). Inkubieren Sie die Einsätze mit 700 μl 0,1 % Kristallviolett in 20 % Methanol für 10 min bei RT (siehe Schritt 6.10).
  8. Waschen Sie die Einsätze 3x und tauchen Sie sie mit einer Pinzette in ein konisches 50-ml-Röhrchen, das mit ddH2O gefüllt ist. Reinigen Sie den inneren Teil des Transwells vorsichtig mit einem Wattestäbchen. Lagern Sie Proben bei RT und machen Sie Fotos bis zu 3 Tage später.
  9. Nehmen Sie mit einem Phasenkontrastmikroskop ein Bild mit einem 10-fach-Objektiv auf, das den größten Teil der Vertiefungsoberfläche abbildet, und nehmen Sie dann mit einem 20-fach-Objektiv Bilder aus 5 unabhängigen Bereichen auf.
  10. Kristallviolett in 10%iger Essigsäure wie folgt auflösen: Für Vertiefungen 100 μl Essigsäure hinzufügen und auf einem Orbitalschüttler 10 Minuten lang bei RT mischen; für Transwells legen Sie diese mit der unteren Oberfläche nach oben auf eine Bank, geben Sie 50 μl Essigsäure auf die Oberfläche und mischen Sie durch Pipettieren, bis sich das Kristallviolett vollständig aufgelöst hat.
  11. Lesen Sie die Extinktion bei 600 nm in einer 96-Well-Platte mit 50 μl des gelösten Materials aus dem obigen Schritt ab. Verwenden Sie 10% Essigsäure als Rohling.
  12. Normalisieren Sie die optische Dichte (O.D.) der Plattierungskontrolle aus Schritt 8.5 und drücken Sie Migration oder Invasion relativ zur Kontrollbedingung aus.

9. Primärtumorwachstum und Bildung von Lungenmetastasen

HINWEIS: Der folgende Schritt veranschaulicht Methoden zur In-vivo-Charakterisierung der protumoralen Aktivitäten von CAFs. Dieser Schritt ist optimiert für die Bewertung der pro-tumorigenen Eigenschaften von CAFs in vivo durch Co-Injektion in syngenen Mausmodellen. Da sowohl die CAFs als auch die 4T1-Zellen aus dem Hintergrund der BALB/c-Maus stammen, werden BALB/c-Mäuse verwendet.

  1. 2 Tage vor der Injektion nummerieren Sie 6 Wochen alte weibliche BALB/c-Mäuse mit Metall-ID-Ohrmarken und rasieren Sie die 4. Brustdrüsenregion mit einem Rasierer.
  2. Entnahme und Zählung von 4T1-Zellen und s.a. iCAFs, die wie in Schritt 6 beschrieben hergestellt wurden. Mischen Sie in einem konischen 15-ml-Röhrchen 1 x 105 4T1-Zellen und 3 x 105 s.a. iCAFs/Maus, wobei Sie eine Überschreitung von mindestens 20 % berücksichtigen. Verwenden Sie 4T1 nur als Steuerelement.
  3. 5 min lang bei 290 x g zentrifugieren, in einem PBS-Volumen resuspendieren, das berechnet wurde, um die oben genannte Anzahl von Zellen/Mäusen in 50 μl zu erhalten, in ein 1,5 ml-Mikroröhrchen umfüllen und auf Eis stellen.
    HINWEIS: Um beispielsweise 10 Mäuse zu injizieren, mischen Sie 1,2 x 106 4T1-Zellen mit 3,6 x 106 s.a. iCAFs, Pelletzellen und resuspendieren Sie in 600 μl PBS. Injizieren Sie 50 μl Zellsuspension pro Maus.
  4. Bereiten Sie den Arbeitsbereich vor, indem Sie die Oberfläche einer Laminar-Flow-Haube reinigen und desinfizieren. Decken Sie eine Schaumstoff-OP-Platte mit einer Bankschutzfolie ab.
  5. Betäuben Sie die Mäuse nacheinander gemäß den institutionellen Verfahren (wir verwenden eine intraperitoneale Injektion von Tiletaminbase/Zolazepam-Base + Xylazin 70 mg/kg + 5 mg/kg). Tragen Sie tierärztliche Salbe auf die Augen auf, um Trockenheit zu vermeiden. Desinfizieren Sie die Haut mit einem Wattestäbchen mit einer Povidon-Jod-Lösung.
  6. Verwenden Sie den Zehenkneiftest, um sicherzustellen, dass die Mäuse unter der richtigen Narkose stehen. Injizieren Sie mit einer Injektionsnadel 50 μl der Zellsuspension in das 4. Brustfettpolster. Verwenden Sie den Nippel als Referenz und injizieren Sie ca. 3 mm in Richtung des ipsilateralen Beins.
  7. Untersuchen Sie die Mäuse einige Stunden nach der Injektion und in den folgenden Tagen. Die Tumore werden nach 4 Tagen tastbar.
  8. Messen Sie die Tumorgröße alle 48 Stunden mit einem Messschieber und bestimmen Sie den maximalen und minimalen Durchmesser. Berechnen Sie das Tumorvolumen mit der Formel: (Länge x Breite2)/2.
  9. Entfernen Sie nach 10 Tagen nach der Injektion die Primärtumoren wie unten beschrieben.
    1. Bereiten Sie das Operationsgebiet wie in Schritt 9.5 vor. Sterilisieren Sie Werkzeuge durch Autoklavieren und legen Sie sie während der Arbeit auf eine sterile Oberfläche. Sterilisieren Sie Werkzeuge zwischen Tieren mit einem Heißperlensterilisator.
    2. Betäuben Sie die Mäuse wie in den Schritten 9.6 und 9.7. Machen Sie mit einer Skalpellklinge einen 5-8 mm großen Schnitt in der Nähe des Tumors und ziehen Sie die Haut vorsichtig ab, so dass eine kleine Tasche für den Zugang zum Tumor entsteht. Verätzen Sie sichtbare Blutgefäße mit einem Niedertemperatur-Kauterisationsstift, um Blutungen beim Präparieren zu vermeiden.
    3. Verwenden Sie das Skalpell, um den Tumor zu entfernen, und versuchen Sie, keine Haut zu entfernen. Setzen Sie die Hautlappen wieder in ihre ursprüngliche Position ein, nähen Sie sie mit einem 5-0 chirurgischen Faden mit einer 17 mm 1/2c Nadel zusammen und fügen Sie chirurgischen Kleber hinzu, um die Wunde vollständig zu verschließen.
    4. Lassen Sie die Mäuse nicht unbeaufsichtigt, bis sie wieder genügend Bewusstsein erlangt haben, um die Brustbeinlage aufrechtzuerhalten. Tiere, die operiert wurden, werden erst dann wieder in die Gesellschaft anderer Tiere zurückgebracht, wenn sie vollständig genesen sind.
  10. Überwachen Sie die Tiere nach der Operation genau und verabreichen Sie in den folgenden Tagen bei Bedarf eine schmerzstillende Behandlung gemäß den institutionellen Protokollen. Wir verwenden subkutane Injektionen von Carprofen (3-5 mg/kg).
  11. Wiegen Sie den Tumor mit einer Präzisionswaage wie in Schritt 2.2. Schneiden Sie den Tumor mit dem Skalpell in zwei Hälften. Legen Sie eine Hälfte in ein 1,5-ml-Mikroröhrchen, frieren Sie es in flüssigem Stickstoff ein und lagern Sie es bei -80 °C für molekulare Analysen. Die andere Hälfte wird für die histologische Analyse 24 h lang in 5 ml 4 % PFA in einem konischen 15-ml-Röhrchen bei 4 °C fixiert.
  12. Am Tag 21 nach der Injektion töten Sie die Mäuse durch CO2 -Exposition und sammeln Sie die Lunge nach intratrachealer Infusion mit 4 % PFA, wie unten beschrieben. Arbeiten Sie unter einem Abzug.
    1. Öffnen Sie die Brusthöhle mit einer chirurgischen Schere. Entfernen Sie die Haut aus dem submandibulären Bereich und den Speicheldrüsen, um die Luftröhre deutlich freizulegen.
    2. Bereiten Sie eine 22G-Nadelspritze mit 4%iger PFA-Lösung vor. Führen Sie die Nadel in die Luftröhre der Maus ein und richten Sie sie auf die Lunge, während Sie die Luftröhre in Richtung Kopf klemmen. Injizieren Sie die Lösung, bis die Lunge anschwillt (ca. 2 ml).
    3. Präparieren Sie die Lunge und geben Sie sie in ein 15-ml-Röhrchen, das eine 4%ige PFA-Lösung enthält. Drehen Sie das Rohr einige Male vorsichtig um und lassen Sie es 24 Stunden lang bei 4 °C fixieren.
  13. Es werden semi-serielle Schnitte der Lunge durchgeführt und mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) alle 50/100 μm eine Scheibe gefärbt, bis die Probe erschöpft ist, wie in Referenz31 beschrieben.
  14. Bewerten Sie Metastasen durch softwaregestützte Analyse von Mikrofotografien der H&E-gefärbten Schnitte.

10. Signaturen der Genexpression

  1. Definieren Sie eine Gensignatur wie unten beschrieben.
    1. Abhängig von der Versuchsumgebung und der spezifischen biologischen Fragestellung, die untersucht wird, erhalten Sie auf verschiedene Weise eine Gensignatur. Am häufigsten wird die differentielle Expression zwischen zwei Erkrankungen (z. B. CAFs vs. normale Gegenstücke, oder auf verschiedene Weise behandelt (z. B. superaktiviert oder stummgeschaltet) vs. unbehandelt bewertet.
    2. Alternativ können Sie die variabelsten oder informativsten Gene in den analysierten Proben identifizieren (z. B. Gene mit hoher Varianz oder mit hohen Ladungen in den ersten Komponenten einer Hauptkomponentenanalyse). Hier verwenden wir eine STAT3-regulierte Signatur als Beispiel. Diese Signatur wurde definiert als die Gene, die beim STAT3-Silencing in BC CAFs29 herunterreguliert wurden, wie unten beschrieben. Für eine ausführliche Beschreibung der RNA-Sequenzierung siehe Referenzen32,33.
  2. Extrahieren Sie die Gesamt-RNA in technischer Ausfertigung aus jeder Probe wie in Schritt 4.1.1 und beurteilen Sie die RNA-Qualität, um die RNA-Integrität zu überprüfen (RIN ≥ 9).
  3. Bereiten Sie Bibliotheken aus 2 μg poly(A)-selektierter RNA vor und sequenzieren Sie diese. Wir haben die NextSeq 500 Plattform verwendet.
  4. Map-Lesevorgänge zur Mus musculus mm9-Referenzbaugruppe mit TopHat v2.0. 1034.
  5. Berechnen Sie die Genzahl mit dem Werkzeug htseq-count aus dem HTSeq-Paket (http://www.huber.embl.de/HTSeq/doc/overview.html).
  6. Führen Sie eine differenzielle Expressionsanalyse mit R und dem DESeq2-Paket (http://www.bioconductor.org/packages/devel/bioc/html/DESeq2.html) durch. Filtern Sie herunterregulierte Gene mit FDR < 0,05, um die STAT3-Signatur zu definieren.

11. Abschätzung der Expression der Signatur in Primärtumoren

HINWEIS: Die folgenden Schritte beschreiben ein Verfahren zur rechnerischen Schätzung der Expression der STAT3-regulierten Signatur29 über öffentlich zugängliche transkriptomische Daten von BC-Primärtumoren, wobei ihre Beziehung mit dem geschätzten Stromaanteil in demselben Satz von Proben getestet wird.

  1. Installieren Sie R (https://cran.r-project.org/) und RStudio (https://posit.co/products/open-source/rstudio/). Starten Sie es und installieren Sie die erforderlichen Bibliotheken: GSVA35, TCGAbiolinks36.
  2. Laden Sie primäre Tumor-Genexpressionsdaten, wie z. B. TCGA-Daten aus https://portal.gdc.cancer.gov/, METABRIC-Daten aus http://synapse.org/ (syn1757063) oder andere transkriptomische Daten aus dem Gene Expression Omnibus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) als pränormalisierte Expressionsmatrizen herunter. Die Daten müssen als numerische Matrix mit Zeilen als Gene und Spalten als Stichproben formatiert und je nach Plattform normalisiert und mit einem Offset von 1 logarithmisch skaliert werden.
    1. Laden Sie die Liste der Maus-Mensch-Gen-Orthologe von Biomart bei https://www.ensembl.org/biomart/martview/ herunter, wählen Sie die Datenbank aus: ensembl genes, wählen Sie den Datensatz menschliche Gene und klicken Sie auf die Attributauswahl auf der linken Registerkarte.
    2. Öffnen Sie aus den vorausgewählten Merkmalen die Registerkarte EXTERN und markieren Sie das HGNC-Symbol, wählen Sie Homologe im Feld oben auf der Seite aus und markieren Sie Mausorthologe / Mausgenname.
    3. Klicken Sie auf die Schaltfläche Ergebnisse in der oberen linken Ecke, wählen Sie das CSV-Format aus und klicken Sie auf die Schaltfläche GO , um die Datei herunterzuladen.
  3. Laden Sie die Genexpressionssignatur (einen Satz von Genen) in R. In diesem Fall verwenden wir die Liste der Gene, die durch das STAT3-Silencing in murinen CAFs herunterreguliert wurden.
  4. Laden Sie die Liste der Maus-Mensch-Gen-Orthologe in R und ordnen Sie die STAT3-Signatur über die Biomart-Tabelle den entsprechenden menschlichen Orthologen zu.
  5. Laden Sie die Genexpressionsdaten des Primärtumors in R, und rufen Sie die GSVA-Funktion mit Parametern als ssgseaParam-Objekt auf, einschließlich Primärtumordaten und einer Liste, die die STAT3-Signatur enthält.

12. Testen Sie die Beziehung zwischen der Expression der Gensignatur und den klinischen Merkmalen

  1. Identifizieren Sie die interessierenden Variablen. Der Stromaprozentsatz stellt den Anteil der Zellen in der sequenzierten Tumorprobe dar, die zum Tumorstroma gehören. Verwenden Sie die folgenden klinischen Merkmale, die häufig mit omischen Daten in Verbindung gebracht werden: Tumorgröße, Stadium, Alter des Patienten bei Diagnose, Lymphknotenstatus, Metastasenstatus usw. Für TCGA sind vorab berechnete Schätzungen des Stromaprozentsatzes verfügbar.
    HINWEIS: Konkret sind folgende Stroma-Schätzungen verfügbar: EDec Immun/Stromal = Epigenomische Entfaltung des Stroma-/Immunprozentsatzes37; Immun-Score = ssGSEA basierend auf Genexpressionsprofilen von 141 Immungenen38; LUMP = Leukozyten-Unmethylierung für Reinheit, die durchschnittlich 44 nicht-methylierte immunspezifische CpG-Stellen umfasst39; Stroma-Score = ssGSEA basierend auf Genexpressionsprofilen von 141 stromalen Genen38; IHC = geschätzt durch Bildanalyse von Hämatoxylin- und Eosin-gefärbten Objektträgern, die mit der Nationwide Children's Hospital Biospecimen Core Resource40 erstellt wurden; ABSOLUT = basierend auf somatischen Kopienzahldaten41.
  2. Laden Sie EDEc-Daten aus http://genboree.org/theCommons/documents/569, Stroma- und Immun-Scores aus https://bioinformatics.mdanderson.org/estimate/disease.html (RNASeqV2) und Tumorreinheitsdaten (LUMP, IHC, ABSOLUTE) von TCGAbiolinks herunter. Für andere Datensätze berechnen Sie den Prozentsatz des Stromas, das das GSVA-Paket verwendet, und berechnen Sie das ssGSEA für Stroma und Immunsignaturen, die von Yoshihara et al. erhalten wurden.38.
  3. Berechnen Sie die Korrelation zwischen dem numerischen Vektor des geschätzten Stromaanteils und dem numerischen Vektor der STAT3-Signaturexpression in Primärtumorproben. Dies kann mit der cor.test-Funktion in R erreicht werden.
  4. Laden Sie klinische Daten herunter, die mit dem transkriptomischen Datensatz der Primärtumoren verknüpft sind, als Tabelle mit Proben in Zeilen und klinischen Merkmalen in Spalten.
  5. Laden Sie die klinischen Daten in R, und überprüfen Sie, ob sich die Proben in der Transkriptommatrix und in der Metadatentabelle in der gleichen Reihenfolge wie die Abgleichsfunktion befinden.
  6. Für numerische Variablen (z. B. Tumorgröße) berechnen Sie die Korrelation zwischen dem numerischen Vektor der STAT3-Signaturexpression in Primärtumorproben und dem Vektor der Werte klinischer Merkmale mit der cor.test-Funktion.
  7. Für kategoriale Variablen (z. B. Metastasenstatus) testen Sie den Unterschied in der STAT3-Signaturexpression zwischen zwei Gruppen von Proben (z. B. metastasierte vs. nicht-metastasierende Tumoren) mit dem nicht-parametrischen Wilcoxon-Rangsummentest (unter der Annahme, dass die beiden Gruppen von Proben unabhängig sind). Dies kann mit der Funktion wilcox.test in R erreicht werden.

13. Testen der Regulation der Signatur im Tumorstroma

HINWEIS: Die Expression einer stromalen Signatur in Primärtumoren, die durch Massen-RNA-Sequenzierung analysiert werden, hat den Vorteil, dass sie sich auf große Patientenkohorten mit detaillierten klinischen Annotationen stützt. Auf der anderen Seite ermöglicht die bloße Trennung von Stroma und Epithel die Definition von Genexpressionsänderungen in einem der beiden zellulären Kompartimente im Tumor im Vergleich zu normalem Gewebe42. MetaLCM ist eine ShinyApp, die die Analyse von transkriptomischen Datensätzen von mikrodissektionierten Brusttumoren mit Lasererfassung ermöglicht. Mit diesem Tool kann der Benutzer in transkriptomischen Datensätzen von mikrodissezierten Brusttumoren mit Lasererfassung nach robusten differentiell exprimierten Genen zwischen zwei Zuständen suchen und die Regulation zuvor definierter Gensignaturen im Tumorstroma testen. Die folgenden Schritte beschreiben die Verwendung von MetaLCM.

  1. Rufen Sie die App unter dem Link https://aurorasavino.shinyapps.io/metalcm/ auf. Um die Analyse zu starten, wählen Sie die Merkmale der verglichenen Bedingungen aus.
  2. Wählen Sie die Richtung für den Vergleich aus. Durch die Auswahl hochregulierter Gene werden die Gene mit höherer Expression in Bedingung 1 dargestellt.
  3. Wählen Sie den p-Wert-Schwellenwert für die differenzielle Expression aus, und drücken Sie Ausführen , um die Analyse auszuführen und jedes Mal die Einstellungen zu ändern.
  4. Um die Analyse auf eine vordefinierte Genliste zu beschränken, geben Sie entweder Gensymbole durch Kommas getrennt ein oder importieren Sie eine CSV-Datei mit Gensymbolen in einer einzigen Spalte.
  5. Drücken Sie auf Genliste senden , um Gensymbole zu importieren. Drücken Sie Zurücksetzen, um die Analyse mit allen Genen wiederherzustellen. Speichern Sie die Liste der differentiell exprimierten Gene: Wenn eine Genliste bereitgestellt wird, wird die Korrektur mehrerer Tests nur für diese Gene durchgeführt. Die Tabelle enthält den durchschnittlichen logFC, den reduzierten p-Wert sowie die einzelnen logFC- und p-Werte für die differenzielle Expression in jedem verfügbaren Datensatz.
  6. Erstellen Sie eine Heatmap mit den Faltungsänderungen differentiell exprimierter Gene. Die Heatmap zeigt nur die differentiell exprimierten Gene mit dem vollständig kohärenten Vorzeichen der differentiellen Expression über die Datensätze hinweg.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

In-vitro-Bewertung der Aktivitäten von CAFs
Der Beitrag von krebsassoziierten Fibroblasten (CAFs) aus Mammatumoren zu den aggressiven Merkmalen von Brustkrebs (BC) wurde mit immortalisierten CAFs (iCAFs) untersucht, die gemäß Schritt 3 erzeugt wurden. iCAFs wurden wie in Schritt 6 beschrieben superaktiviert und dann in sDMEM ausgehungert, um ihr CM zu sammeln, das zur Behandlung von 4T1-Zellen für 48 Stunden verwendet wurde (siehe Schritt 7.1). Im Anschluss an diese Behandlun...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

In dieser Studie stellen wir optimierte Protokolle für die Immortalisierung von murinen CAFs und die Charakterisierung ihrer pro-tumorigenen Aktivitäten sowohl in vitro als auch in vivo vor. Anstatt spezifische CAF-Subtypen selektiv auf der Grundlage der Markerexpression zu isolieren, entschieden wir uns, die gesamte Zellpopulation beizubehalten, um die Heterogenität zu erhalten. Die Zellen wurden als Ganzes funktionell charakterisiert und ihre Genexpressionsprofile ana...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden Interessen bestehen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt von der Italienischen Vereinigung für Krebsforschung (AIRC, IG16930 und IG24851 to V.P.); das italienische Ministerium für Universität und Forschung (MIUR PRIN 2017 und 2022 an V.P.); die Truus und Gerrit van Riemsdijk Stiftung, Liechtenstein, Schenkung an V.P.; Region Piemont (Ablenkung). A.S. wurde durch ein Postdoktorandenstipendium der Italian Cancer Research Foundation (FIRC) unterstützt, und L.A. wurde von der Fondazione Umberto Veronesi unterstützt.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1Kb plus DNA-LeiterThermoFisher Scientific10787018
24-Well-PlatteSarstedt833922
96-Well-PlatteSarstedt833924
EssigsäureSigma Aldirch695092
AlterI-HFNeuengland BiolaboreNr. R3552Bei -20 Grad lagern; C
BetadinMeda Pharma23907076
Bü rker Zählkammer VWR40443703
Kauter Low Temp FineTip DispKeelerAX10339KL
ZentrifugeEppendorf5810R
Konisches Röhrchen 15 mLSarstedt62554502
Konisches Röhrchen 50 mLSarstedt62547254
Cryopure 2 mL MikroröhrchenSarstedt72380992
KristallviolettSigma AldirchNr. C0775Bei RT lagern, in einem Abzug verwenden 
Kulturplatte mit 100 mm DurchmesserSarstedt833902
Kulturplatte mit 60 mm DurchmesserSarstedt833920
ddH20SelbstgemachtBei RT lagern, in einer biologischen Haube verwenden
Digitaler MessschieberPreciva02-301-2
Digitales MikroskopLeicaDM6B
DimethylsulfoxidSigma AldirchNr. D8418Verwendung in einer biologischen Haube
Dulbecco' s Modifizierter Adler" s Medium (DMEM)Gibco11965092Bei 4 Grad lagern; C, Verwendung in einer biologischen Haube
EcoRI-HFNeuengland BiolaboreNr. R3101Bei -20 Grad lagern; C
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)Sigma AldirchNr. E6758Bei RT lagern, in einer biologischen Haube verwenden
Fötales Rinderserum (FBS)Gibco16000044Bei 4 Grad lagern; C, Verwendung in einer biologischen Haube
Gefilterte Spitzen 10 & Mikro; LSarstedt703010255
Gefilterte Spitzen 100 & Mikro; LSarstedt703030255
Gefilterte Spitzen 1000 & Mikro; LSarstedt703060255
Gefilterte Spitzen 20 & Mikro; LSarstedt703030265
Gefilterte Spitzen 200 & Mikro; LSarstedt703031255
Filtropur S Plus 0,20 µ M Sarstedt831826102
Filtropur S Plus 0,45 µ M Sarstedt831826
Feine Schere2Biol1406009
Pinzette2Biol1102412
GeneticinGibco10131035Bei 4 Grad lagern; C, Verwendung in einer biologischen Haube
Lipofectamine 2000 TransfektionsreagenzThermoFisher Scientific11668019Bei 4 Grad lagern; C, Verwendung in einer biologischen Haube
Matrigel-Invasionskammern mit 8 μ m PET-Membran Corning354480
Mikroplatten-Reader (600 nm Absorption)PromegaGM3500
Mikroröhrchen 1,5 mL Sarstedt7269001
OptimemGibco31985047Bei 4 Grad lagern; C, Verwendung in einer biologischen Haube
Paraformaldehyd (PFA)Sigma Aldirch158127Bei RT lagern, in einem Abzug verwenden
pBABE-neo largeTcDNA Addgene1780Bei -20 Grad lagern; C, Verwendung in einer biologischen Haube
pCL-AmphoNovus Biological 18746853Bei -20 Grad lagern; C, Verwendung in einer biologischen Haube
pCMV-R8.74Addgene22036Bei -20 Grad lagern; C, Verwendung in einer biologischen Haube
pCMV-VSVG Addgene8454Bei -20 Grad lagern; C, Verwendung in einer biologischen Haube
Penicillin-Streptomycin (Pen Strepto, 10.000 μ g/mL) Gibco15140122Bei 4 Grad lagern; C, Verwendung in einer biologischen Haube
Phasenkontrast-Mikroskop Olympus BX42
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)SelbstgemachtBei RT lagern, in einer biologischen Haube verwenden
pLKO.1-Puro Addgene10878Bei -20 Grad lagern; C, Verwendung in einer biologischen Haube
Poly-L-Lysin-LösungSigma AldirchNr. P8920Bei 4 Grad lagern; C, Verwendung in einer biologischen Haube
Puromycin-Dihydrochlorid aus  Streptomyces albonigerSigma AldirchNr. P8833
rCutSmart Puffer Neuengland BiolaboreNr. B6004Bei -20 Grad lagern; C
Nagetier-RasiererÄskulapGT416
Roswell Park Memorial Institut (RPMI)Gibco61870010Bei 4 Grad lagern; C, Verwendung in einer biologischen Haube
Dursttupfer mit runder SpitzeSigma AldirchZ744127
SkalpellGima27041
Secura Semi Micro WaageSchneidermuskelSECURA125-1S
Serologische Pipette 10 mL Sarstedt861254001
Serologische Pipette 2 mL Sarstedt861252001
Serologische Pipette 25 mL Sarstedt861256001
Serologische Pipette 5 mL Sarstedt861253001
Maschen 5-0EthikonNr. 1866G
Spritze 10 mLPentaferte00202250E14
Spritze 5 mLPentaferte00202250E12
Spritze Omnican Insulin 1 mLBraun9151125S
Gewebe adesiv3M Vetbond1469SB
Transwell-Einsätze 8 & Mikro; m pore Falke353097
Transwell Matrigel Einsätze 8 & micro; m pore Corning354480
Trypsin-EDTA (0,5%), kein PhenolrotGibco15400054
Vivaspin 20 Zentrifugalkonzentrator MWCO 10.000 Da Sigma AldirchZ614602

Referenzen

  1. Bhattacharya, S., et al. Group behavior and emergence of cancer drug resistance. Trends Cancer. 7 (4), 323-334 (2021).
  2. Kalluri, R. The biology and function of fibroblasts in cancer. Nat Rev Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).
  3. Marusyk, A., et al. Spatial proximity to fibroblasts impacts molecular features and therapeutic sensitivity of breast cancer cells influencing clinical outcomes. Cancer Res. 76 (22), 6495-6506 (2016).
  4. Su, S., et al. Cd10(+)gpr77(+) cancer-associated fibroblasts promote cancer formation and chemoresistance by sustaining cancer stemness. Cell. 172 (4), 841-856.e16 (2018).
  5. Sahai, E., et al. A framework for advancing our understanding of cancer-associated fibroblasts. Nat Rev Cancer. 20 (3), 174-186 (2020).
  6. Watson, S. S., et al. Microenvironment-mediated mechanisms of resistance to HER2 inhibitors differ between HER2+ breast cancer subtypes. Cell Syst. 6 (3), 329-342.e6 (2018).
  7. Xie, J., et al. Cancer-associated fibroblast-derived extracellular vesicles: Regulators and therapeutic targets in the tumor microenvironment. Cancer Drug Resist. 8, 2(2025).
  8. Du, R., et al. PDPN-positive CAFs contribute to HER2-positive breast cancer resistance to trastuzumab by inhibiting antibody-dependent NK cell-mediated cytotoxicity. Drug Resist Updat. 68, 100947(2023).
  9. Zhang, H., et al. Define cancer-associated fibroblasts (CAFs) in the tumor microenvironment: New opportunities in cancer immunotherapy and advances in clinical trials. Mol Cancer. 22 (1), 159(2023).
  10. Zheng, S., et al. Dissecting the role of cancer-associated fibroblast-derived biglycan as a potential therapeutic target in immunotherapy resistance: A tumor bulk and single-cell transcriptomic study. Clin Transl Med. 13 (2), e1189(2023).
  11. Bainer, R., et al. Gene expression in local stroma reflects breast tumor states and predicts patient outcome. Sci Rep. 6, 39240(2016).
  12. Farmer, P., et al. A stroma-related gene signature predicts resistance to neoadjuvant chemotherapy in breast cancer. Nat Med. 15 (1), 68-74 (2009).
  13. Winslow, S., Leandersson, K., Edsjo, A., Larsson, C. Prognostic stromal gene signatures in breast cancer. Breast Cancer Res. 17 (1), 23(2015).
  14. Xie, J., et al. Turning up a new pattern: Identification of cancer-associated fibroblast-related clusters in TNBC. Front Immunol. 13, 1022147(2022).
  15. Chen, Y., Mcandrews, K. M., Kalluri, R. Clinical and therapeutic relevance of cancer-associated fibroblasts. Nat Rev Clin Oncol. 18 (12), 792-804 (2021).
  16. Bartoschek, M., et al. Spatially and functionally distinct subclasses of breast cancer-associated fibroblasts revealed by single-cell RNA sequencing. Nat Commun. 9 (1), 5150(2018).
  17. Liu, S. Q., et al. Single-cell and spatially resolved analysis uncovers cell heterogeneity of breast cancer. J Hematol Oncol. 15 (1), 19(2022).
  18. Massa, D., Tosi, A., Rosato, A., Guarneri, V., Dieci, M. V. Multiplexed in situ spatial protein profiling in the pursuit of precision immuno-oncology for patients with breast cancer. Cancers. 14 (19), 4885(2022).
  19. Tietscher, S., et al. A comprehensive single-cell map of T cell exhaustion-associated immune environments in human breast cancer. Nat Commun. 14 (1), 98(2023).
  20. Tzoras, E., et al. Dissecting tumor-immune microenvironment in breast cancer at a spatial and multiplex resolution. Cancers. 14 (8), 1999(2022).
  21. Wu, S. Z., et al. A single-cell and spatially resolved atlas of human breast cancers. Nat Genet. 53 (9), 1334-1347 (2021).
  22. Ning, L., et al. Scrna-seq characterizing the heterogeneity of fibroblasts in breast cancer reveals a novel subtype sfrp4(+) caf that inhibits migration and predicts prognosis. Front Oncol. 14, 1348299(2024).
  23. Salemme, V., et al. The role of tumor microenvironment in drug resistance: Emerging technologies to unravel breast cancer heterogeneity. Front Oncol. 13, 1170264(2023).
  24. Attalla, S., Taifour, T., Bui, T., Muller, W. Insights from transgenic mouse models of pymt-induced breast cancer: Recapitulating human breast cancer progression in vivo. Oncogene. 40 (3), 475-491 (2021).
  25. Ferreira, T., Azevedo, T., Silva, J., Faustino-Rocha, A. I., Oliveira, P. A. Current views on in vivo models for breast cancer research and related drug development. Expert Opin Drug Discov. 19 (2), 189-207 (2024).
  26. Holen, I., Speirs, V., Morrissey, B., Blyth, K. In vivo models in breast cancer research: Progress, challenges and future directions. Dis Model Mech. 10 (4), 359-371 (2017).
  27. Pedroza, D. A., Gao, Y., Zhang, X. H., Rosen, J. M. Leveraging preclinical models of metastatic breast cancer. Biochim Biophys Acta Rev Cancer. 1879 (5), 189163(2024).
  28. Nuckhir, M., Withey, D., Cabral, S., Harrison, H., Clarke, R. B. State of the art modelling of the breast cancer metastatic microenvironment: Where are we. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 29 (1), 14(2024).
  29. Avalle, L., et al. Stat3 induces breast cancer growth via angptl4, mmp13 and stc1 secretion by cancer associated fibroblasts. Oncogene. 41 (10), 1456-1467 (2022).
  30. Halaban, R., Alfano, F. D. Selective elimination of fibroblasts from cultures of normal human melanocytes. In Vitro. 20 (5), 447-450 (1984).
  31. Avalle, L., et al. Micrornas-143 and -145 induce epithelial to mesenchymal transition and modulate the expression of junction proteins. Cell Death Differ. 24 (10), 1750-1760 (2017).
  32. Costa, V., Angelini, C., De Feis, I., Ciccodicola, A. Uncovering the complexity of transcriptomes with rna-seq. J Biomed Biotechnol. 2010, 853916(2010).
  33. Ura, H., Togi, S., Niida, Y. A comparison of mrna sequencing (rna-seq) library preparation methods for transcriptome analysis. BMC Genomics. 23 (1), 303(2022).
  34. Kim, D., et al. Tophat2: Accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biol. 14 (4), R36(2013).
  35. Hanzelmann, S., Castelo, R., Guinney, J. Gsva: Gene set variation analysis for microarray and rna-seq data. BMC Bioinformatics. 14, 7(2013).
  36. Mounir, M., et al. New functionalities in the tcgabiolinks package for the study and integration of cancer data from gdc and gtex. PLoS Comput Biol. 15 (3), e1006701(2019).
  37. Onuchic, V., et al. Epigenomic deconvolution of breast tumors reveals metabolic coupling between constituent cell types. Cell Rep. 17 (8), 2075-2086 (2016).
  38. Yoshihara, K., et al. Inferring tumour purity and stromal and immune cell admixture from expression data. Nat Commun. 4, 2612(2013).
  39. Aran, D., Sirota, M., Butte, A. J. Systematic pan-cancer analysis of tumour purity. Nat Commun. 6, 8971(2015).
  40. Liu, J., et al. An integrated tcga pan-cancer clinical data resource to drive high-quality survival outcome analytics. Cell. 173 (2), 400-416.e11 (2018).
  41. Carter, S. L., et al. Absolute quantification of somatic DNA alterations in human cancer. Nat Biotechnol. 30 (5), 413-421 (2012).
  42. Savino, A., De Marzo, N., Provero, P., Poli, V. Meta-analysis of microdissected breast tumors reveals genes regulated in the stroma but hidden in bulk analysis. Cancers. 13 (13), 3371(2021).
  43. Wiederschain, D., et al. Single-vector inducible lentiviral rnai system for oncology target validation. Cell Cycle. 8 (3), 498-504 (2009).
  44. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of crispr-cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
  45. Pfefferle, A. D., et al. Transcriptomic classification of genetically engineered mouse models of breast cancer identifies human subtype counterparts. Genome Biol. 14 (11), R125(2013).
  46. Hahn, W. C., et al. Enumeration of the Simian virus 40 early region elements necessary for human cell transformation. Mol Cell Biol. 22 (7), 2111-2123 (2002).
  47. Counter, C. M., et al. Dissociation among in vitro telomerase activity, telomere maintenance, and cellular immortalization. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (25), 14723-14728 (1998).
  48. Ferrari, N., et al. Dickkopf-3 links hsf1 and Yap/Taz signalling to control aggressive behaviours in cancer-associated fibroblasts. Nat Commun. 10 (1), 130(2019).
  49. Herrera, M., et al. Cancer-associated fibroblast-derived gene signatures determine prognosis in colon cancer patients. Mol Cancer. 20 (1), 73(2021).
  50. Cancer Genome Atlas Network. Comprehensive molecular portraits of human breast tumours. Nature. 490 (7418), 61-70 (2012).
  51. Cobos, F. A., et al. Effective methods for bulk RNA-seq deconvolution using scRNA-seq transcriptomes. Genome Biol. 24 (1), 177(2023).
  52. Cheng, P. S. W., Zaccaria, M., Biffi, G. Functional heterogeneity of fibroblasts in primary tumors and metastases. Trends Cancer. 11 (2), 135-153 (2025).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Weitere Artikel entdecken

TumormikroumgebungBrustkrebsGenexpressionsprofilierungtranskriptomische AnalyseInvasionsassayMigrationsassaySTAT3-ZielgeneLasermikrodissektion
Krebsassoziierte Fibroblasten aus Mammatumoren der Maus als Werkzeuge für molekulare und computergestützte Studien
Kontaktieren Sie uns
Der Bibliothek empfehlen

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Urheberrecht © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.