Isolierung, Kultur und Charakterisierung von Prostatakrebs-assoziierten Fibroblasten

Prostatakrebs (PCa) ist in fast zwei Dritteln der Länder weltweit die am häufigsten diagnostizierte Krebserkrankung bei Männern. Im Jahr 2022 wurden etwa 1,5 Millionen neue Fälle gemeldet, die weltweit zu 3.97.000 Todesfällen führten. Damit ist PCa die zweithäufigste Krebserkrankung und die fünfthäufigste krebsbedingte Todesursache bei Männern¹.

PCa ist eine multifokale und biologisch komplexe Erkrankung, die durch eine erhebliche intertumorale Heterogenität ^2,3,4, verschiedene molekulare Subtypen und variable klinische Ergebnisse ^5,6 gekennzeichnet ist, die alle die Prognose und das therapeutische Ansprechen signifikant beeinflussen⁷.

Während die entscheidende Rolle der Tumormikroumgebung (TME) bei der Initiierung und Progression von Prostatatumoren gut etabliert ist ^8,9, sind die molekularen Wechselwirkungen zwischen Tumorzellen und dem umgebenden Stromakompartiment noch nicht vollständig verstanden. Es ist zwar allgemein bekannt, dass die Mikroumgebung des Prostatatumors (TME) eine entscheidende Rolle bei der Tumorentstehung und -progression spielt, aber die molekularen Wechselwirkungen zwischen Tumorzellen und dem umgebenden Stroma sind nach wie vor unzureichend definiert. Die TME umfasst eine Vielzahl von Stromazellen, einschließlich solcher mesenchymalen und immunen Ursprungs, die als Reaktion auf tumorabgeleitete Signale aktiviert werden und anschließend tumorfördernde Funktionen erwerben^10,11. Unter diesen stellen krebsassoziierte Fibroblasten (CAFs) oft die am häufigsten vorkommende Stromapopulation dar. CAFs tragen zum Umbau der extrazellulären Matrix (EZM) bei, fördern das Tumorwachstum und erleichtern die Invasion und Migration von Krebszellen 4,11,12,13. Durch sezernierte Faktoren und direkte Zell-Zell-Interaktionen beeinflussen CAFs auch die Proliferation, Invasion und Therapieresistenz. Bemerkenswert ist, dass CAFs eine heterogene Population sind. Obwohl einige Subtypen im Allgemeinen mit pro-tumorigenen Funktionen assoziiert sind, können sie tumorsuppressive Rollen ausüben^14,15. Wichtig ist, dass das Fehlen einzigartiger Marker für CAFs eine Herausforderung für ihre genaue Identifizierung und die funktionelle Zerlegung ihrer verschiedenen Rollen darstellt^12,16.

Ein robuster Ansatz zur Untersuchung der funktionellen Wechselwirkung zwischen CAFs und Tumorzellen besteht darin, primäre CAFs und übereinstimmende normale Fibroblasten (NFs) zu isolieren und dann ihren jeweiligen Einfluss auf das Verhalten von Tumorzellen wie Proliferation, Migration, Koloniebildung und verankerungsunabhängiges Wachstum zu bewerten 17,18,19. Dieser Artikel beschreibt ein verfeinertes, hochgradig reproduzierbares Protokoll zur Isolierung von CAFs und NFs aus radikalen Prostatektomieproben von Hochrisiko-PCa-Patienten. Eine wichtige Komponente dieses Protokolls ist die genaue Identifizierung und Dissektion von Tumoren und tumorfreien Regionen durch einen erfahrenen Uropathologen, die die Ableitung von CAFs und NFs vom selben Patienten ermöglicht. Dieser Ansatz mit gepaarten Stichproben hilft bei der Kontrolle der intertumoralen Heterogenität und individueller patientenspezifischer Variablen, die die Fibroblasten-Phänotypen beeinflussen können 20,21,22. Um sicherzustellen, dass ausreichend Tumorgewebe zur Verfügung steht, konzentrieren wir uns auf Proben von Patienten mit einem Gleason-Score ≥7.

Eine zuverlässige phänotypische Charakterisierung der isolierten Fibroblasten erfordert die Verwendung mehrerer Marker, um sie von anderen Zelltypen zu unterscheiden, insbesondere von Epithelzellen, die möglicherweise eine überlappende Markerexpression aufweisen¹⁶. Da primäre PCa-Fibroblasten typischerweise nach 10-15 Passagen eine Seneszenz durchlaufen, was Langzeitanalysen erschwert, stellen wir auch ein Protokoll für die Zellimmortalisierung durch stabile Expression der humanen Telomerase-Reverse-Transkriptase (hTERT) ^vor23.

Um die funktionellen Auswirkungen von CAFs und NFs auf Tumorzellen zu untersuchen, haben wir verschiedene experimentelle Strategien getestet und optimiert. Da CAFs ihren Einfluss sowohl über sezernierte Faktoren als auch über direkten Zell-Zell-Kontakt^{ausüben 24}, werden zwei komplementäre Assay-Systeme entwickelt: (1) die Behandlung von Krebszellen mit Fibroblasten-konditioniertem Medium (CM) und (2) die direkte Co-Kultur von Fibroblasten und Tumorzellen. Diese Assays bewerten die wichtigsten Eigenschaften von Krebszellen, einschließlich Proliferation, verankerungsunabhängiges Wachstum und Migration. Um den Einfluss sezernierter Faktoren zu standardisieren, wurden konditionierte Medien aus CAFs und NFs konzentriert und basierend auf dem Gesamtproteingehalt quantifiziert (conCM).

Der Nachweis signifikanter funktioneller Effekte durch diese Assays kann die Identifizierung kritischer Mediatoren der CAF-gesteuerten Tumorgenese unterstützen und potenzielle Ziele für therapeutische Interventionen bieten.

Diese Studie wurde in voller Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien für die Verwendung klinischer Proben durchgeführt, die vom Bioethischen Komitee des Krankenhauses Città della Salute Molinette in Turin, Italien, genehmigt wurden. Alle Proben wurden nach Unterzeichnung der Einverständniserklärung durch die teilnehmenden Patienten entnommen. Der folgende Abschnitt enthält ein detailliertes Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Isolierung von krebsassoziierten Fibroblasten (CAFs) und ihren entsprechenden normalen Fibroblasten (NF)-Gegenstücken. Das Protokoll umfasst die Dissektion des Tumors und angrenzender nicht-tumoröser Bereiche, die Gewebeverarbeitung, die Zellkultur sowie sowohl die phänotypische als auch die funktionelle Charakterisierung der isolierten Zellen. Alle Eingriffe müssen unter sterilen Bedingungen in einer zertifizierten Biosicherheitswerkbank durchgeführt werden. Die Zellen wurden bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO₂ unter Verwendung von Dulbecco's Complete Dulbecco's Modified Eagle Medium (cDMEM) kultiviert, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS), 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin, sofern nicht anders angegeben. Alle Zentrifugationsschritte werden bei betätigter Bremse durchgeführt. In der Materialtabelle finden Sie eine umfassende Liste der Reagenzien, Materialien und Geräte, die im gesamten Protokoll verwendet werden. Diese Methodik wurde für Hochrisiko-Prostatakrebsproben mit einem Gleason-Score von 4+3 oder höher optimiert.

1. Chirurgische Probendissektion

HINWEIS: Dieses Verfahren wurde an chirurgischen Proben durchgeführt, die aus radikalen Prostatektomieverfahren²⁵ entnommen wurden, die an Patienten mit hochgradigem Prostatakrebs (PCa) durchgeführt wurden, und nach standardisierten Protokollen durchgeführt, die auf internen institutionellen Richtlinien und etablierter internationaler Literatur und Best Practices basieren 26,27,28.

1. Legen Sie die Prostata unter einer Biosicherheitshaube auf ein steriles Tuch und richten Sie sie entsprechend den anatomischen Orientierungspunkten aus.
   HINWEIS: Dieses Verfahren muss von einem erfahrenen Uropathologen durchgeführt werden.
2. Mit einer sterilen Klinge werden Gewebeschnitte aus Bereichen herausgeschnitten, die im präoperativen Biopsiebericht als neoplastisch oder frei von Tumorzellen identifiziert wurden.
3. Führen Sie eine kryostatische Schnellanalyse²⁹ an beiden Gewebeproben durch, indem Sie 2,5 μm dicke Gewebeschnitte anfertigen und diese mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) färben, um das Vorhandensein oder Fehlen von Tumorzellen in den ausgewählten Regionen gemäß den diagnostischen Kriterien für das Prostataadenokarzinom der neuesten Ausgabe der WHO-Klassifikation³⁰ zu überprüfen (siehe Abbildung 1A).
   HINWEIS: Wenn Unstimmigkeiten auftreten, wiederholen Sie den Probenahmevorgang, bis die histologische Bestätigung sowohl der neoplastischen als auch der nicht-neoplastischen Bereiche vorliegt.
4. Entnehmen Sie ca. 10 mm² Proben aus dem neoplastischen und nicht-neoplastischen Bereich, geben Sie sie in konische 15-ml-Röhrchen mit 7 ml eiskaltem Gewebelagerpuffer und bewahren Sie sie für nachfolgende Eingriffe auf Eis auf.
   HINWEIS: Proben können in diesem Puffer bis zu 48 Stunden bei 4 °C gelagert werden.

2. Isolierung von Fibroblasten

HINWEIS: Alle folgenden Verarbeitungsvorgänge müssen, sofern nicht anders angegeben, auf Eis bei 4 °C durchgeführt werden. Siehe Abbildung 1 A für ein Schema.

1. Tag 1: Wiegen Sie die Gewebeproben.
   HINWEIS: Im Durchschnitt werden 70-100 mg erhalten.
2. Wechseln Sie zu einer 6 cm großen Schale und führen Sie vier aufeinanderfolgende Waschungen durch, zweimal in 4 mL eiskaltem PBS und zweimal in 4 mL eiskaltem cDMEM, beide ergänzt mit 200 U/mL Penicillin, 200 μg/ml Streptomycin (2x), wobei Sie eine sterile Pinzette verwenden, um das Gewebe von einer Schale in die nächste zu übertragen.
3. Unterbrechen Sie das Gewebe mechanisch, indem Sie es in eine 6 cm dicke Platte auf Eis legen, mit 1 ml DMEM, ergänzt mit 100 μg/ml Penicillin-G und 100 μg/ml Streptomycin, und zerkleinern Sie es dann mit einer Schere oder Klinge in kleine Fragmente (<1 mm²).
4. In ein konisches 15-ml-Röhrchen mit 5 mL eiskaltem cDMEM umfüllen. Zentrifugieren Sie bei 754 x g für 5 min bei 4 °C.
5. Verwenden Sie eine 10-ml-Pipette, um den Überstand vorsichtig zu entfernen, und resuspendieren Sie das Pellet in 5 mL eiskaltem cDMEM. Erneut bei 754 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren.
6. Entfernen Sie den Überstand wie oben beschrieben und resuspendieren Sie das Pellet in Kollagenase II (1 mg/ml in DMEM) mit 1 ml/100 mg Gewebe. Wechseln Sie zu einem 1,5-ml-Mikroröhrchen.
   HINWEIS: Aufgrund der Variabilität der Kollagenase-Chargen sollten Sie verschiedene Chargen testen und sicherstellen, dass sie genügend haben, um alle vorhergesagten Isolierungen durchzuführen.
7. Die Röhrchen mit Paraffinfilm abdecken und die Proben O/N (8-12 h) bei 37 °C unter ständigem Schaukeln aufschließen.
   HINWEIS: Führen Sie die folgenden Schritte an Tag 2 aus.
8. Übertragen Sie die Proben in konische 15-ml-Röhrchen und fügen Sie 5 ml eiskaltes cDMEM zur Zellsuspension hinzu, um die Kollagenase zu inaktivieren, und zentrifugieren Sie dann 5 Minuten lang bei 4 °C bei 754 x g .
   HINWEIS: Kollagenase wird entsorgt, indem sie in einen waschmittelhaltigen Behälter abgesaugt wird.
9. Aspirieren Sie den Überstand mit einer 10-ml-Pipette und resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml 0,05 % Trypsin/EDTA. 5 min bei 37 °C inkubieren, dabei gelegentlich schütteln.
10. Geben Sie 1 mL DNase I zu den Proben und mischen Sie gut. Verwenden Sie eine frisch zubereitete 25 mg/ml-Lösung in PBS.
    HINWEIS: Die Behandlung mit DNase I in diesem Stadium hilft, die Einzelzelllösung zu erhalten.
11. Zentrifugieren Sie bei 754 x g für 5 min bei 4 °C.
12. Verwenden Sie eine 10-ml-Pipette, um den Überstand abzusaugen, und resuspendieren Sie das Pellet in 5 mL kaltem cDMEM. Zentrifugieren bei 754 x g für 5 min 4 °C.
13. Resuspendieren Sie Zellen in 20% FBS cDMEM. Platte und Inkubation bei 37 °C, 5 % CO₂ und 95 % Luftfeuchtigkeit für mindestens 3 Tage. Achten Sie darauf, die Schüssel nicht zu bewegen/zu kippen. Für 70-100 mg Gewebe verteilen Sie die Zellsuspension in 2 x 3,5 cm Schalen in 2 ml Medium. Skalieren Sie bei Bedarf entsprechend herunter.
    HINWEIS: Weniger als 50 mg Gewebe führen zu einer ineffizienten Zellableitung. Das Aufteilungs- und Einfrierungsschema ist in Abbildung 1B dargestellt.
14. Überprüfen Sie die Zellen nach 3 Tagen auf Morphologie/Lebensfähigkeit und ersetzen Sie 2/3 des Mediums, um die zellproduzierten Wachstumsfaktoren zu erhalten. Es dauert etwa 7-10 Tage, bis die Zellen Konfluenz erreichen und das Medium jeden zweiten Tag ausgetauscht wird.
15. Sobald die Zellen zusammenfließen, werden sie in eine 10-cm-Schale mit 20 % FBS cDMEM geleitet.
16. Ersetzen Sie das Medium jeden zweiten Tag, indem Sie zweimal 15 % FBS-Medium verwenden, dann einmal, 12,5 %, dann 10 %. Für FACS-Analysen folgen die RNA- und Proteinextraktions- und Gefrierbestände dem Schema in Abbildung 1B.
17. Spaltung der Zellen, wenn sie zu etwa 100 % zusammenfließen (ca. 10 Tage). 2-3 Mal mit reichlich PBS für jeweils 5 min waschen. Fügen Sie 1% Trypsin/EDTA (2x) hinzu und geben Sie es in den Inkubator, wobei Sie alle paar Minuten auf Zellablösung prüfen.

3. Kultivierungszustand

1. Passieren Sie die Zellen nur, wenn sie zu 100 % zusammenfließen, nicht mehr als 1:3.
2. Aliquoten, die 50 % einer konfluenten 10-cm-Schale entsprechen, werden in 0,5 ml eiskaltem Gefriermedium (10 % DMSO in FBS) eingefroren. Jedes Aliquot in einer 10 cm großen Schale auftauen.
   HINWEIS: Die durchschnittliche Verdopplungszeit beträgt 80-90 h.

4. FACS-Analyse

HINWEIS: Dieses Protokoll gewährleistet eine zuverlässige Charakterisierung der Fibroblastenpopulation und identifiziert eine mögliche Kontamination durch Epithel-, Endothel- oder Immunzellen. Die FACS-Analyse wird in Passage 2 durchgeführt, wie in Abbildung 2A dargestellt.

1. Ernten Sie Zellen und resuspendieren Sie sie in FACS-Puffer (PBS plus 2 % FBS) in einer Konzentration von 10⁶ Zellen/ml.
2. Markieren Sie Durchflusszytometrie-Röhrchen und fügen Sie jeweils 1 x 10⁵ Zellen mit einem Volumen von 100 μl hinzu. Für die Färbung mit 4 Antikörpern werden 11 Röhrchen vorbereitet, um sowohl die Färbung als auch das Gating wie folgt zu berücksichtigen (Tabelle 1)
   HINWEIS: 1 Röhrchen, keine Antikörper (ungefärbte Kontrolle), zur Beurteilung der Zellautofluoreszenz, 1 Röhrchen mit Antikörper-Isotyp-Kontrolle, zur Beurteilung einer aspezifischen Bindung, 4 Röhrchen mit jeweils einem einzelnen Antikörper zur Kompensation; Kompensationskügelchen können Zellen ersetzen, 4 Fluoreszenz-Minus-Röhrchen (FMO) für das Gating, wobei jeweils einer der Antikörper weggelassen wird, 1 Röhrchen mit allen 4 Antikörpern (tatsächliche Probe). Folgende fluoreszenzmarkierte Antikörper werden verwendet (siehe Materialtabelle): (1) Anti-EpCAM-PE (Epithelzellmarker), (2) Anti-CD31-VioBlue (Endothelzellmarker), (3) Anti-CD45-FITC (Immunzellmarker), (4) Anti-CD90-APC (Fibroblastenzellmarker). Antikörper, die an andere Fluorophore konjugiert sind, können entsprechend den verfügbaren Durchflusszytometerfiltern verwendet werden. Führen Sie alle Schritte auf Eis durch, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten.
3. Inkubieren Sie Zellen mit Blockern von kristallisierbaren Fragmentrezeptoren (FcR), wie z. B. gereinigten Anti-CD16/CD32-Antikörpern oder Blockierungspuffer (PBS 1 %-2 % BSA). Verwenden Sie 1-5 μl FcR-Blockierungsreagenz pro 100 μl Zellsuspension und inkubieren Sie 10-15 Minuten lang bei 4 °C.
4. Fahren Sie direkt mit der Färbung fort, ohne sie zu waschen. Den Röhrchen sind geeignete Antikörperverdünnungen oder die entsprechenden Isotypkontrollen zuzuführen, wie in Tabelle 1 angegeben.
5. Leicht mischen und bei 4 °C im Dunkeln 30 min inkubieren.
6. Mit 2 mL FACS-Puffer waschen.
7. 5 min bei 300 x g bei 4 °C zentrifugieren.
8. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml frischem FACS-Puffer.
9. Viabilitätsfarbstoff (Propidiumiodid) gemäß den Anweisungen des Herstellers zugeben (siehe Materialtabelle).
10. Entnehmen Sie die Proben auf einem Durchflusszytometer.
11. Verwenden Sie die Kompensationssteuerung für einfach gefärbte Kompensationen, um die Kompensationsmatrix einzurichten. Wenden Sie für die Datenanalyse die folgende Gating-Strategie auf FACS-Dichtediagramme an:
12. Vorwärts- und Side-Scatter-Gating: Diagramm FSC-A vs. SSC-A und entwerfen Sie eine Region um die Hauptzellpopulation, um zelluläre Trümmer auszuschließen.
13. Für den Dublettenausschluss: Diagramm FSC-A vs. FSC-W (oder FSC-H vs. FSC-A) und entwerfen Sie einen Bereich, um Zellklumpen auszuschließen, die eine größere Breite relativ zur Fläche (oder eine vergrößerte Fläche relativ zur Höhe) aufweisen. Wählen Sie die einzelnen Zellen aus, und führen Sie das gleiche Verfahren aus, indem Sie SSC-A vs. SSC-W (oder SSC-H vs. SSC-A), um die Reinheit der Einzelzellpopulation zu erhöhen.
14. Plotten Sie den Viabilitätsfarbstoff (d. h. Propidiumiodid) vs. SSC-A und wählen Sie negative lebende Zellen aus.
15. An lebenden Zellen ist CD326 (x-Achse) vs. CD31 (y-Achse); Verwenden Sie die entsprechenden FMO-Proben, um die Gates genau einzustellen. FMO ermöglicht es, die Ausbreitung der Fluoreszenz in einen bestimmten Kanal zu erklären, die durch die anderen Fluorophore verursacht wird.
    1. Wenn Sie sich die CD326-FMO-Probe ansehen, zeichnen Sie ein Quadrantengatter, das alle Zellen in den linken Quadranten enthält (d. h. negativ für CD326). Wiederholen Sie den gleichen Vorgang mit der CD31-FMO-Probe, um das Gate so anzupassen, dass alle FMO-Zellen in den unteren Quadranten liegen (d. h. negativ für CD31). Verwenden Sie diesen Quadranten, um die Proben zu analysieren, und wählen Sie Zellen im unteren linken Quadranten (CD31^- CD326^-) aus.
16. Wiederholen Sie den gleichen Vorgang beim Plotten von CD326 (x-Achse) vs. CD45 (y-Achse), wobei der CD326 FMO und der CD45 FMO zum Festlegen des Quadrantengatters verwendet werden. Verwenden Sie diesen Quadranten, um alle Proben zu analysieren und Zellen im unteren linken Quadranten (CD45-CD326^-) auszuwählen.
17. Plot CD90 vs. SSC-A und verwenden Sie den CD90 FMO, um eine Region festzulegen, die negative Zellen ausschließt und nur CD90⁺ umfasst. Verwenden Sie diesen Bereich, um alle Proben zu analysieren und den Prozentsatz der CD90⁺ -Zellen zu messen. Repräsentative Ergebnisse sind in Abbildung 2A dargestellt.

5. Immortalisierung von Fibroblasten

HINWEIS: Die Immortalisierung von CAF- und NF-Populationen wird durch stabile Transduktion mit einem hTERT-exprimierenden retroviralen Vektor erreicht. Im Folgenden finden Sie die Protokolle zur Vorbereitung infektiöser pseudoviraler Partikel und zur Transduktion von Zellen.

1. Produktion retroviraler Partikel
   1. Tag 1, Poly-L-Lysin-Beschichtung und Zellbeschichtung: Eine 10 cm große Schale mit 6 mL Poly-L-Lysin-Lösung (0,1 mg/mL in H₂O) bestreichen, 5 min unter der TC-Haube inkubieren, aspirieren und die geöffnete Schale unter der Haube trocknen lassen, bevor 3 x 10⁶ HEK293T Zellen plattiert werden.
   2. Tag 2: Geben Sie 30 μl Kationenlipid-vermitteltes Transfektionsreagenz in 0,75 ml antibiotikafreies, lipofektionsoptimiertes Medium.
   3. Geben Sie parallel dazu 2 μg pCL-Ampho Retrovirus Packaging Vector und 2 μg pBABE-puro-hTERT-Plasmide zu weiteren 0,75 mL antibiotikafreiem, lipofektionsoptimiertem Medium.
   4. 5 min bei RT inkubieren.
   5. Mischen Sie die beiden Verdünnungen in einem konischen 15-ml-Röhrchen und inkubieren Sie sie 20 Minuten lang bei RT.
   6. Ersetzen Sie in der Zwischenzeit das HEK293T Medium durch 6 ml lipofektionsoptimiertes Medium, das mit 10 % FBS ergänzt wird.
   7. Verteilen Sie die DNA-Komplexe vorsichtig auf der Schalenoberfläche und inkubieren Sie sie für 6 h bis O/N in einem befeuchteten CO₂ -Inkubator.
   8. Tag 3: Ersetzen Sie das Medium durch 7 mL cDMEM und inkubieren Sie es 48 Stunden lang.
      HINWEIS: Beginnend mit diesem Schritt müssen die Arbeiten in einer Gewebekulturanlage der Biosicherheitsstufe 3 (BSL3) gemäß den institutionellen Regeln durchgeführt werden.
   9. An Tag 5 wird das virushaltige Medium aufgefangen und durch einen 0,22-μm-Spritzenvorsatzfilter filtriert.
   10. Aliquotieren und bei -80 °C lagern.
2. Virale Transduktion
   1. Tag 1: Platte von Low-Passage-Fibroblasten bei 60% Konfluenz in 2 Vertiefungen einer 6-Well-Platte.
   2. Tag 2: Ersetzen Sie das Medium durch 1 ml des zuvor hergestellten retroviralen Präparats pBABE-puro-hTERT mit 8 μg/mL Polybren und inkubieren Sie es für 12-16 h.
   3. Tag 3: Ersetzen Sie das virushaltige Medium durch 2 mL cDMEM.
   4. Tag 4: Nach 24 Stunden beginnen Sie zwei 48-Stunden-Runden mit Puromycin-Selektion (2 μg/ml).
      HINWEIS: Die Konzentration sollte für jede Charge des Antibiotikums und des Zelltyps empirisch bestimmt werden, und die niedrigste Konzentration sollte so gewählt werden, dass alle Zellen innerhalb von 4 Tagen nach der Selektion abgetötet werden.
   5. Tag 8: Überprüfen Sie, ob die nicht infizierten Kontrollzellen alle abgestorben sind. Ersetzen Sie das Medium durch cDMEM und lassen Sie infizierte Zellen wachsen, bis sie konfluent sind, bevor Sie sie 1:3 passieren. Lassen Sie die Zellen die Konfluenz erreichen und sich wieder 1:3 teilen. In diesem Stadium können die Zellen die BLS3-Anlage verlassen.
      HINWEIS: Bereiten Sie so schnell wie möglich gefrorene Aliquots zu. Um sicherzustellen, dass die Immortalisierung stattgefunden hat, passieren Sie die Zellen 5-6 Mal und bewerten Sie ihre Morphologie und Duplikationsraten, die sich mit den Passagen nicht ändern sollten. Vergleichen Sie immortalisierte Zellen funktionell mit ihren primären Gegenstücken unter Verwendung der unten beschriebenen Methoden.

6. Charakterisierung der Fibroblasten

1. Phänotypisch werden die isolierten Zellen auf die Expression von CAF/NF-Markern analysiert und funktionell auf ihre potenziellen pro-onkogenen Aktivitäten auf Tumorzellen charakterisiert.
   HINWEIS: Die qPCR-Oligonukleotide und Antikörper, die für die Beurteilung der Markerexpressionsniveaus sowohl auf RNA- als auch auf Proteinebene optimiert sind, sind in Tabelle 2 bzw. Materialtabelle aufgeführt. Beachten Sie, dass Antikörper gegen das Fibroblasten-Aktivierungsprotein (FAP) oft unspezifisch sind. Es ist sicherzustellen, dass geeignete Positiv- und Negativkontrollen enthalten^{sind 31,32}. Es können verschiedene Methoden verwendet werden, um die Wechselwirkung zwischen Fibroblasten und Tumorzellen zu beurteilen. Hier werden zwei alternative Ansätze beschrieben, die entweder aus der Behandlung von Tumorzellen mit konditioniertem Medium (CM) bestehen, das von CAFs oder NFs abgeleitet ist, oder der Co-Kultivierung von Fibroblasten und Tumorzellen. Die Wirksamkeit beider Ansätze zur Verbesserung der Proliferation von Tumorzellen wird beschrieben.

7. Zubereitung und Konzentrierung des konditionierten Mediums

HINWEIS: Das konditionierte Medium wird nach der Entnahme konzentriert und genau dosiert, um den Vergleich zwischen verschiedenen Zellen zu erleichtern.

1. Die Zellen mit 70 % Konfluenz in einer 15 cm großen Schale in cDMEM anrichten.
2. Wechseln Sie am nächsten Tag zu 15 mL Hungermedium (DMEM ohne FBS) und inkubieren Sie 48 Stunden lang, um das CM zu produzieren.
3. Sammeln Sie das CM, zentrifugieren Sie es bei 300 x g für 5 Minuten bei RT und filtrieren Sie durch einen 0,22-μm-Filter, um Zelltrümmer zu entfernen und zu sterilisieren.
4. In Konzentrationsröhrchen (MWCO 10.000 Da) umfüllen und 20 min bei 2000 x g und 4 °C zentrifugieren, oder gemäß den Anweisungen des Herstellers, um etwa 1 mL des konzentrierten CM (conCM) zu erhalten, d. h. 15 x Konzentration.
5. Aliquotieren Sie das conCM und lagern Sie es bei -80 °C.
6. Quantifizieren Sie den Proteingehalt des gesammelten conCM mit einem kolorimetrischen Proteinassay.
   HINWEIS: Die durchschnittliche Konzentration beträgt 0,5 und 2 μg/μl. Niedrigere Konzentrationen können weiterhin verwendet werden.

8. Proliferations-Assay

HINWEIS: Die Zellproliferation (unter Verwendung von DU145- oder LNCaP-humanen PCa-Zelllinien) wurde mit einem Lebendzellanalysegerät unter zwei verschiedenen Bedingungen bewertet, wobei die Tumorzellen entweder mit conCM behandelt oder gemeinsam mit CAFs oder NFs kultiviert wurden. In diesem Fall müssen fluoreszierende Tumorzellen verwendet werden. Repräsentative Ergebnisse sind in Abbildung 3 dargestellt.

1. Proliferationsassay nach Behandlung mit conCM
   HINWEIS: Dieses Protokoll ist für DU145-Zellen optimiert. Unterschiedliche Zellen können Anpassungen erfordern.
   1. Platten Sie Tumorzellen in cDMEM in einer 96-Well-Platte (750 Zellen/Well) unter Berücksichtigung von mindestens 3 Replikaten pro Bedingung und inkubieren Sie O/N.
   2. Ersetzen Sie cDMEM durch Hungermedium, ergänzt oder nicht, mit 50 μg/ml conCM.
   3. Übertragen Sie die Platte in die Instrumentenkammer für die Lebendzellanalyse im Inkubator.
   4. 30 min bei 37 °C erwärmen lassen, dann mit dem ersten Scannen beginnen.
   5. Verwenden Sie den Phasenkontrastkanal und wählen Sie ein geeignetes Objektiv und die gewünschte Anzahl von Feldern/Vertiefung (10x Objektiv und 5 Felder/Vertiefung werden empfohlen) sowie den Standard-Scantyp. Scan alle 6 h für 4-5 Tage (Dauer muss empirisch für Bedingungen und Zelltypen bestimmt werden).
   6. Führen Sie die Analyse gemäß den Anweisungen des Herstellers durch (siehe Materialtabelle).
   7. Berechnen Sie für jede Vertiefung (technische Replikate für jede Bedingung) die Änderung der Faltung relativ zu ihrem Wert zum Zeitpunkt Null. Generieren Sie die entsprechenden Grafiken und bewerten Sie die statistische Signifikanz mit geeigneter Software.
2. Proliferationsassay nach Co-Kultivierung
   1. Co-Plate von 750 RFP-exprimierenden DU145-Zellen und CAFs oder NFs im Verhältnis 1:3 in cDMEM in einer 96-Well-Platte.
   2. Wechseln Sie am nächsten Tag zu 2 % FBS DMEM. Übertragen Sie die Platte in die Instrumentenkammer für die Lebendzellanalyse im Inkubator und starten Sie 4 Tage lang alle 6 Stunden den Standardscan, wobei sowohl der Phasenkontrast als auch der orangefarbene Kanal verwendet werden.
   3. Führen Sie die Proliferationsanalyse gemäß den Anweisungen des Herstellers durch (siehe Materialtabelle).
   4. Berechnen Sie für jede Vertiefung (technische Replikate für jede Bedingung) die Änderung der Faltung relativ zu ihrem Wert zum Zeitpunkt Null. Generieren Sie die entsprechenden Grafiken und bewerten Sie die statistische Signifikanz mit geeigneter Software.

9. Assay zur Wundheilung

HINWEIS: Hier wird eine automatisierte Version des klassischen Scratch-Assays³³ vorgestellt, um die Zellmigration unter Verwendung eines Lebendzellanalysegeräts zu messen.

1. Platte Tumorzellen in einer 96-Well-Platte, die für das Instrument zur Lebendzellanalyse geeignet ist, um eine konfluente Monoschicht zu erhalten.
2. Behandeln Sie die Zellen am nächsten Tag 2 h lang mit 10 μg/ml Mitomycin C.
   HINWEIS: Dieser Schritt ist wichtig, um eine Zellproliferation während des Assays zu vermeiden, die die Ergebnisse verfälschen würde.
3. Bringen Sie den Kratzer gemäß den Anweisungen des Herstellers auf die Vertiefungen an (siehe Materialtabelle).
4. Mit 100 μl PBS waschen, um abgelöste Zellen zu entfernen.
5. Geben Sie Hungermedium mit 50 mg/ml oder ohne (Kontrolle) zu.
6. Stellen Sie die Platte in die Lebendzellanalysekammer im Inkubator.
7. Programmieren Sie nach 30 Minuten das empfohlene Wundheilungs-Scanprotokoll, alle 4 Stunden für 1 Tag oder länger, abhängig von den Zellen und Bedingungen.
8. Analysieren Sie die Ergebnisse gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle).

10. Verankerungsunabhängiges Wachstum durch Weichagar-Assay

1. CAFs oder NFs werden mit 70 % Konfluenz in 12-Well-Platten beschichtet, wobei drei leere Wells als Kontrolle verbleiben.
2. Am nächsten Tag wird eine 4x weiche Agar-Stammlösung (3,6%) hergestellt, indem 0,45 g niedrigschmelzender Agar zu 12,5 mL PBS in einem konischen 50-ml-Röhrchen unter sterilen Bedingungen gegeben werden.
3. In der Mikrowelle auflösen. Achten Sie auf übermäßiges Sieden, das dazu führen würde, dass sich die Lösung konzentriert.
4. Auf 37 °C abkühlen lassen, dann eine 1x Arbeitslösung herstellen, indem man sie 1:4 mit vorgewärmtem cDMEM verdünnt.
5. Aspirieren Sie das Medium aus der 12-Well-Platte und geben Sie 500 μl 1x Agarlösung in jede Vertiefung.
6. Lassen Sie es 20 Minuten lang bei 4 °C erstarren, während Sie den Rest der Agarlösung bei 37 °C lagern.
7. In der Zwischenzeit trypsinisieren Sie die Tumorzellen und bereiten eine Zellsuspension von 2 x 10⁴ Zellen/ml her.
8. Mischen Sie gleiche Volumina der Zellsuspension und der Agar-1x-Lösung, indem Sie mehrmals pipettieren, und geben Sie 500 μl (d. h. 5000 Zellen) auf die erste Agarschicht in jeder Vertiefung. Stellen Sie sicher, dass Sie mindestens 10% Überschuss an Zellsuspension vorbereiten.
9. Lassen Sie den Agar erstarren, indem Sie ihn 20 Minuten lang bei 4 °C inkubieren.
10. Geben Sie 1 ml cDMEM in jede Vertiefung und erneuern Sie es jeden zweiten Tag, indem Sie das Medium vorsichtig vom Rand der Vertiefung ansaugen und das frische Medium in die Mitte geben, fast tropfenweise, um eine Verschiebung der weichen Agarschicht zu vermeiden.
11. Inkubieren, bis gut sichtbare Kolonien erscheinen. DU145-Zellen brauchen in der Regel etwa 12 Tage, mit leichten Schwankungen.
12. Entsorgen Sie das Medium und färben Sie die Kolonien, indem Sie 200 μl Nitroblau-Tetrazoliumchlorid-Lösung (1 mg/ml in PBS) hinzufügen. Über Nacht bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator inkubieren.
13. Sobald die Kolonien gefärbt sind, verwerfen Sie die Farbstofflösung und nehmen Sie Bilder mit einem Stereomikroskop auf. Stellen Sie die Platte auf den Mikroskoptisch und stellen Sie die Vergrößerung auf den niedrigsten Wert (0,8x) ein, um sicherzustellen, dass die gesamte Vertiefung sichtbar ist. Verwenden Sie den Grobfokusknopf, um die Kolonien scharf zu fokussieren, und passen Sie dann die Beleuchtungs- und Moduseinstellungen an, bevor Sie die Bilder aufnehmen.
14. Es ist eine geeignete Software³⁴ zu verwenden, um die Anzahl der Kolonien und die bewohnte Fläche zu quantifizieren, indem die in der Zusatzdatei 1 beschriebenen Schritte befolgt werden.
15. Bewerten Sie die Anzahl und Größenverteilung der Kolonien (siehe Abbildung 4).

CAF- und NF-Paare von 7 hochgradigen PCa-Patienten wurden mit diesem Protokoll erfolgreich isoliert. Das Alter der Patienten bei der Operation und die Gleason-Werte sind in Tabelle 3 zusammengefasst. Um die Reinheit der abgeleiteten Fibroblastenpopulationen zu bewerten, wurden zwei primäre CAFs und NFs abgetrennt und mit den angegebenen fluoreszierenden Antikörpern oder mit Propidiumiodid gefärbt, um die Apoptose zu beurteilen. Repräsentative Ergebnisse der anschließenden FACS-Analyse sind in Abbildung 2A dargestellt, wobei die Gating-Strategie und der Prozentsatz der positiven Zellen für jeden Marker hervorgehoben werden. Die Analyse umfasste Marker für Epithelzellen (EpCAM), Endothelzellen (CD31), Immunzellen (CD45) und aktivierte Fibroblasten (CD90). Die Ergebnisse bestätigen die erfolgreiche Isolierung reiner Fibroblasten, da die Zellen überwiegend negativ für epitheliale, endotheliale oder Immunzellmarker waren und eine variable Positivität für CD90 zeigten, das als Marker für die CAF-Aktivierung gilt35,36. In vielen Fällen, insbesondere in frühen Passagen, zeigten CAFs im Vergleich zu NFs eine spindelartigere Morphologie, wie in Abbildung 2B gezeigt. Diese morphologischen Unterschiede nahmen jedoch mit den folgenden Passagen tendenziell ab.

Um die Auswirkungen von CAFs und NFs auf die DU145-Zellproliferation zu bewerten, wurden Proliferationsassays mit zwei alternativen Ansätzen durchgeführt: entweder die Behandlung von PCa-Zellen mit conCM aus CAF/NF-Paaren (Abbildung 3A,B) oder die Co-Plattierung von PCa-Zellen und Fibroblasten im Verhältnis 1:3 (Abbildung 3C,D). Durch die Verwendung von fluoreszierenden RFP-DU145-Zellen, die durch das Lebendzellanalysegerät oranger Filter spezifisch detektiert werden können, konnte zwischen den beiden Zelltypen unterschieden werden. Die gezeigten Experimente wurden mit CAFs und NFs durchgeführt, die vom selben Patienten stammten. Beide Ansätze konnten eine pro-proliferative Aktivität der Fibroblasten zeigen. Die Unterschiede zwischen CAFs und NFs zeigten sich jedoch vor allem beim conCM-Ansatz, wie in den Grafiken deutlich dargestellt ist (Abbildung 3B,D). Die variablen Effekte von conCM aus verschiedenen CAF/NF-Paaren sind in Abbildung 3E dargestellt.

Das verankerungsunabhängige Wachstum ist ein Merkmal, das oft als Proxy für die Metastasierungsfähigkeit angesehen wird. Unter mehreren Methoden zur Bewertung der Auswirkungen von CAF/NFs auf das verankerungsunabhängige Wachstum von PCa-Zellen wurden die besten Ergebnisse durch die Co-Kultivierung von Fibroblasten und Tumorzellen ohne direkten Kontakt erzielt. Die Fibroblasten wurden in 12-Well-Platten ausgesät und mit einer Schicht aus 0,9 % weichem Agar in cDMEM bedeckt, auf der Tumorzellen in 0,45 % weichem Agar cDMEM geschichtet wurden. Die Koloniebildung wurde über 12 Tage überwacht. Repräsentative Bilder der erhaltenen DU145-Kolonien sind in Abbildung 4A dargestellt, zusammen mit entsprechenden Diagrammen, die die Anzahl der Kolonien unterschiedlicher Größe analysieren. Bemerkenswert ist, dass sowohl CAFs als auch NFs in ähnlicher Weise in der Lage waren, die koloniebildende Fähigkeit von DU145-Zellen zu stimulieren, verglichen mit den Kontrollzellen, die ohne eine Fibroblasten-Feeder-Schicht plattiert wurden. Die Kolonien neigten auch dazu, größer zu werden, was auf eine zunehmende Vermehrung hindeutet. Ein Problem, auf das wir gelegentlich bei diesem Assay gestoßen sind, ist die frühe Ablösung der Fibroblastenschicht, möglicherweise aufgrund einer falschen Weichagar-Dichte oder -Temperatur beim Plattieren. In diesen Fällen wurde der Versuch abgebrochen (Abbildung 4B).

Das CAFs/NFs-induzierte verankerungsunabhängige Wachstum wurde ebenfalls unter Behandlung mit conCM untersucht. Kurz gesagt, DU145-Zellen, die in weichem Agar plattiert waren, wurden mit 1 ml 5 % FBS DMEM plus oder minus 50 μg/ml conCM geschichtet und bis zum Abschluss des Assays alle 4 Tage ersetzt. Unter diesen Bedingungen waren DU145-Zellen jedoch nicht in der Lage, große Kolonien zu bilden, und es wurde keine Verbesserung nach der Behandlung mit conCM beobachtet, wie in Abbildung 4C gezeigt.

Abbildung 1: Fibroblastenisolierung und Kultivierungsschemata. (A) Schrittweise Darstellung des Verfahrens zur Dissektion und Isolierung von Fibroblasten aus PCa-Patientenproben. Die Bilder zeigen die H&E-Kryoschnitte, die den zu präparierenden Tumor und die normalen Geweberegionen identifizieren. (B) Schematische Darstellung des Aufteilungs- und Einfrierschemas. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: FACS-Analyse und repräsentative Bilder von isolierten Fibroblasten. (A) Fibroblasten von Patient 11 wurden gemäß dem in Abbildung 1A beschriebenen Verfahren gewonnen, und die zytofluorimetrische Analyse wurde an Zellen der Passage 2 durchgeführt, wie in Abbildung 1B beschrieben. Repräsentative FACS-Dichtediagramme, die die aufeinanderfolgenden Gating-Strategien (rote Pfeile) zeigen, die zur Bewertung der Expression von CD45, CD31, EpCAM und CD90 in der Zellpopulation verwendet werden, die aus Tumor- oder Nicht-Tumorbereichen (CAFs bzw. NFs) stammt. CD326 = EpCAM, Marker für Epithelzellen; CD31, Marker für Endothelzellen; CD45, Marker für Immunzellen; CD90, ein Marker für die Aktivierung von Fibroblasten. Die Zellen waren für die ersten drei Marker negativ und für CD90 unterschiedlich positiv. (B) Repräsentative Bilder des isolierten Paares 11 NFs und CAFs während der Passage 2. Maßstabsbalken = 2 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Proliferationsassays an DU145 PCa-Zellen. (A,B) Behandlung mit conCM. 750 DU145-Zellen wurden in 96-Well-Platten plattiert und am nächsten Tag auf Hungermedium umgestellt, das 50 μg/ml des Paares 11 CAF/NF conCM enthielt oder nicht, wie im Text beschrieben, und in ein Lebendzellanalysegerät gegeben. (A) zeigt fünf gescannte Felder/Vertiefungen zu den angegebenen Zeiten. Das relevante Proliferationsdiagramm, berechnet als Faltungsänderung der Zelldichte für die drei Bedingungen, jeweils normiert auf ihren Zeitwert 0, ist in (B) dargestellt. (C,D) 750 RFP-exprimierende DU145-Zellen wurden in 96-Well-Platten in cDMEM plattiert, entweder allein oder zusammen mit CAFs oder NFs desselben Patienten im Verhältnis 1:3. Am folgenden Tag wurden die Zellen auf 2% FBS DMEM umgestellt und in ein Lebendzellanalysegerät gegeben. 5 gescannte Felder der fluoreszierenden Zellen/Vertiefung zu den angegebenen Zeitpunkten sind in (C) dargestellt, während (D) das relevante Proliferationsdiagramm zeigt, berechnet als Faltenänderung im orangefarbenen Objektbereich, der die Tumorzellen darstellt, für die drei Bedingungen, jeweils normiert auf ihren Zeitwert 0. Variable Effekte von conCM von 7 verschiedenen Patienten CAF/NF sind in (E) dargestellt. Die Daten werden als Mittelwert+/-SEM von dreifachen Vertiefungen dargestellt. Sternchen zeigen signifikante Unterschiede zwischen den drei Bedingungen an (Zwei-Wege-ANOVA bei wiederholten Messungen mit Tukey-Post-Test). *p < 0,05; p < 0,001; p < 0,0001. Maßstabsbalken = 1μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Soft-Agar-Analysen. (A) Das verankerungsunabhängige Wachstum von DU145-Zellen wurde bewertet, indem Tumorzellen in einer Agar-Matrix auf eine Feeder-Schicht aus CAFs oder NFs desselben Paares gesetzt wurden, die am Vortag plattiert worden waren, oder ohne Feeder-Zellen als Kontrolle (Strg), wobei das Medium jeden zweiten Tag mit 10% FBS DMEM aufgefrischt wurde, wie im Text beschrieben. Die Diagramme stellen den Mittelwert +/- SEM der Anzahl der Kolonien dar, wobei entweder alle Kolonien ≥8 × 103 μm2 oder ≥16 × 103 μm2 groß sind. (B) zeigt einen Versuch wie in (A), der aufgrund der Ablösung der Zuführschicht abgebrochen werden musste. Weitere Informationen finden Sie im Text. (C) DU145-Zellen wurden wie im Text beschrieben in weichem Agar ausgesät und mit conCM behandelt/oder nicht, das von CAFs oder NFs in 5% FBS DMEM abgeleitet wurde. Medium wurde nicht aktualisiert. Unter diesen Bedingungen wuchsen die Kolonien deutlich weniger als bei der Verwendung von CAF/NFs-Feederzellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Vorbereitung der FACS-Proben. Die Tabelle legt fest, wie Durchflusszytometrie-Röhrchen für die Färbung mit vier Antikörpern vorbereitet werden, wie das Gating eingerichtet wird und wie das Protokoll für die FACS-Analyse entworfen wird. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 2: Primer-Sequenzen für die qRT-PCR. Die Tabelle listet die Vorwärts- und Rückwärts-Primersequenzen auf, die zur Beurteilung der Expression bekannter CAF-Markergene verwendet werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 3: Patienteninformationen. Die Tabelle zeigt das Alter bei der radikalen Prostatektomie (RP) und die Gleason-Scores aller Patienten, von denen CAF- und NF-Paare abgeleitet wurden. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Ergänzende Datei 1: Bildkalibrierung für Soft-Agar-Assays. Schritt-für-Schritt-Verfahren zur Bildanalyse zur Bewertung der Kolonien und zur Messung der gesamten belegten Fläche. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden Interessen bestehen.