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Amplikon-Sequenzierung mit den Long-Read-Sequenzierungstechnologien

DOI:

10.3791/68370

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August 29th, 2025

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1Department of Science and Innovation - National Research Foundation Centre of Excellence for Biomedical Tuberculosis Research, South African Medical Research Council Centre for Tuberculosis Research, Division of Molecular Biology and Human Genetics, Faculty of Medicine and Health Sciences, Stellenbosch University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll wurde für die gezielte Tiefensequenzierung von 18 Arzneimittelresistenzregionen bei Mycobacterium tuberculosis unter Verwendung einer Long-Read-Sequenzierungsplattform optimiert, gefolgt von der Analyse mit einer Tuberkulose-spezifischen Bioinformatik-Pipeline, die für Long-Read-Daten ausgelegt ist.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Weltgesundheitsorganisation (WHO) betont weiterhin den dringenden Bedarf an einer schnellen, kostengünstigen und benutzerfreundlichen Diagnosemethode für Tuberkulose (TB) und arzneimittelresistente TB (DR-TB). Die von der WHO befürworteten Next-Generation-Sequencing-Technologien (NGS) haben die Erkennung von DR-TB erheblich verbessert. Unter diesen ermöglicht das zielgerichtete NGS (tNGS) den gezielten Nachweis genetischer Mutationen, die mit Arzneimittelresistenzen verbunden sind, wodurch die Notwendigkeit traditioneller kulturbasierter Diagnostika entfällt. Ein weit verbreiteter tNGS-Assay bietet schnelle und umfassende Empfindlichkeitstests für Medikamente, wurde aber in erster Linie für Sequenzierungsplattformen mit hoher Genauigkeit optimiert. Die hohen Kosten dieser Sequenzierungssysteme haben jedoch den Zugang in Ländern mit niedrigem und mittlerem Einkommen, insbesondere in Afrika, eingeschränkt. Portable Sequencing-Technologien stellen eine vielversprechende Alternative dar, da sie Flexibilität und reduzierte Infrastrukturanforderungen bieten. In dieser Studie wurde DNA aus Rifampicin-resistenten TB (RR-TB)-Isolaten extrahiert, mit einem tNGS-Assay amplifiziert und auf einer tragbaren Sequenzierungsplattform sequenziert. Die gleichen Amplifikationsprodukte wurden auch auf einer hochpräzisen Short-Read-Sequenzierungsplattform sequenziert, um als Referenz zu dienen. Die Daten des tragbaren Sequenzierers wurden mit einer Bioinformatik-Pipeline verarbeitet, die für die Long-Read-Sequenzierung ausgelegt ist, während die Short-Read-Sequenzierungsdaten mit einer etablierten webbasierten Anwendung analysiert wurden. Die Analyse zeigte, dass der Long-Read-Sequencing-Ansatz erfolgreich hochfrequente widerstandsassoziierte Varianten identifizierte, die durch Short-Read-Sequenzierung detektiert wurden, aber Einschränkungen bei der Detektion niederfrequenter Varianten aufwies.

Introduction

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Tuberkulose (TB) ist nach wie vor eine der Haupttodesursachen weltweit und stellt eine anhaltende Herausforderung für die öffentliche Gesundheit dar, insbesondere in Ländern mit niedrigem und mittlerem Einkommen 1,2. Trotz Initiativen zur Verbesserung der TB-Kontrollmaßnahmen wurden nur langsam Fortschritte erzielt, was zum Teil auf die Schwierigkeiten zurückzuführen ist, schnelle, genaue, kostengünstige und umfassende Diagnosetechniken zu entwickeln 3,4,5. Während molekulardiagnostische Methoden wie Line Probe Assays (LPAs) und automatisierte Nukleinsäureamplifikationstests (NAATs) die Identifizierung von TB und arzneimittelresistenter TB (DR-TB) beschleunigt haben, schränkt ihr begrenzter Mutationsnachweis gründliche Empfindlichkeitstests (DST) ein. Diese Einschränkung ist besonders signifikant in Ländern mit hoher TB-Belastung 6,7,8,9.

Um diese Einschränkungen zu beheben, hat die Weltgesundheitsorganisation (WHO) den Einsatz von Next-Generation-Sequencing-Technologien (NGS) empfohlen, die sich als leistungsstarke Instrumente für die TB-Überwachung und den Nachweis von Resistenzen erwiesen haben10,11. Sowohl die Ganzgenomsequenzierung (WGS) als auch die gezielte NGS-Methode (tNGS) bieten eine breitere Mutationsabdeckung und ermöglichen die Identifizierung von resistenzassoziierten Varianten über mehrere Arzneimittelhinweg 8,12,13,14,15. Die Ganzgenomsequenzierung (WGS) liefert zwar einen umfassenden DST-Bericht, ist aber aufgrund ihrer Abhängigkeit von der Kultur für eine schnelle Diagnostik ungeeignet, da die Kultur bis zu sechs Wochen dauern kann 15,16,17. Gezieltes NGS bietet eine bessere Alternative, da es nicht von der Kultur abhängt. Die Sequenzierung kann direkt aus klinischen Proben durchgeführt werden18. Aus diesem Grund hat die WHO die Verwendung von drei tNGS-Assays für die DST empfohlen: Deeplex Myc-TB-Assay: Dieser Assay weist eine Resistenz gegen Rifampicin, Isoniazid, Fluorchinolone, Aminoglykoside (Amikacin, Kanamycin, Capreomycin), Ethambutol, Pyrazinamid und Ethionamidnach 19,20,21. Sentinel-TB-Assay: Dieser zielt auf die Resistenz gegen Rifampicin, Isoniazid, Fluorchinolone und injizierbare Zweitlinienmedikamenteab 18,20. AQ-TB-Assay: Dies identifiziert eine Resistenz gegen Rifampicin, Isoniazid, Fluorchinolone und injizierbare Zweitlinienmedikamente. Diese Assays wurden aufgrund ihrer hohen Genauigkeit für den Einsatz auf der Short-Read-Plattform optimiert20. ONT MinION Long-Read-Plattformen hingegen bieten Echtzeitdaten, Portabilität und das Potenzial für eine kosteneffiziente Implementierung22,23. Die weit verbreitete Nutzung von NGS ist jedoch durch die Anforderungen an die Infrastruktur und die Kosten begrenzt, insbesondere bei Systemen mit kurzenLesevorgängen 10.

Der Deeplex-Assay ist der umfassendste der drei empfohlenen Assays. Der Assay wurde ursprünglich für die Durchführung einer Multiplex-PCR an 18 Regionen entwickelt, die mit einer Resistenz gegen 13 Anti-TB-Medikamente assoziiert sind. Die WHO empfahl es jedoch für 10 Anti-TB-Medikamente, was auf eine ausreichende Sensitivität und Spezifität hinweist. In dieser Studie wurde es für die Verwendung mit dem ONT MK1B MinION, einer Long-Read-Sequenzierungsplattform, optimiert. Das tragbare und wiederverwendbare Flusszellensystem dieser Plattform reduziert sowohl die Infrastruktur- als auch die potenziellen Sequenzierungskosten pro Probe 4,22,23. Es wurden zwar auch andere Long-Read-kompatible Assays entwickelt, aber sie haben tendenziell einen begrenzten DST-Umfang und zielen in der Regel nur auf einen engen Bereich von Resistenzgenen ab. Im Gegensatz dazu bietet der Assay eine breite Zielabdeckung und ist damit ein umfassenderes Diagnosewerkzeug für dezentrale DST24,25. Eine detaillierte Liste der genomischen Ziele, die durch den Assay amplifiziert werden, und ihrer entsprechenden Wirkstoffassoziationen ist in Tabelle 1 enthalten, die die diagnostischen Fähigkeiten des Assays hervorhebt25.

Vor der DNA-Extraktion müssen die Proben unter den Bedingungen der Biosicherheitsstufe 3 (BSL-3) unter Einhaltung der erforderlichen Sicherheitsvorkehrungen dekontaminiert und inaktiviert werden 25,26,27. Interne Amplifikation und externe Kontrollen sollten in jeden Lauf einbezogen werden, wobei die Kontamination durch Negativkontrollen und routinemäßige Laborbewertungen verfolgt werdensollte 25. Wichtige Qualitätsmetriken, einschließlich Lesetiefe, Abdeckungsbreite und Amplifikationserfolg, sollten nach der Sequenzierung bewertet werden. Für die gezielte Sequenzierung empfiehlt die WHO eine Mindestablesetiefe von 100x für jedes Amplikon und eine angemessene Abdeckung aller Zielregionen mit Arzneimittelresistenz, um den Nachweis kleinerer Varianten zu ermöglichen, die bei ≥5 % vorhanden sind28. Die Weltgesundheitsorganisation befürwortet diese gezielten Sequenzierungsmethoden zur Identifizierung von Resistenzen gegen Medikamente der ersten und zweiten Wahl unter der Annahme, dass Qualitätssicherungssysteme eingerichtet sind und alle Zielregionen ausreichend abgedeckt sind28.

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Protocol

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Diese Forschung wurde im Rahmen des TS ELiOT-Projekts durchgeführt, das am 20. Oktober 2021 von der Ethikkommission für die Humanforschung (HREC) an der Universität Stellenbosch (N21/09/093) ethisch genehmigt wurde. Darüber hinaus erhielt es von Western Cape Health Research die Genehmigung für die Nutzung von staatlichen Einrichtungen. Die Proben wurden in Zusammenarbeit mit dem NHLS Green Point und der Stellenbosch University unter der SU HREC-Zulassungsnummer N09/11/296 entnommen. Die verwendeten Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbereitung der Probe

  1. Inaktivierung der Hitze
    1. Inkubieren Sie die MGIT-Kulturen 1 h lang bei 80 °C, um eine vollständige Hitzeinaktivierung unter BSL-3-Bedingungen zu erreichen.
    2. Fahren Sie mit der DNA-Extraktion mit der InstaGene-Methodefort 29.
  2. DNA-Extraktion
    1. Geben Sie 5 mL hitzeinaktivierte MGIT-Kultur in ein 15-ml-Röhrchen.
    2. Zentrifugieren Sie bei 4000 x g für 30 min bei Raumtemperatur (RT).
    3. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig durch Pipettieren, wobei Sie das Sediment belassen.
    4. Geben Sie 200 μl eines auf Chelats basierenden DNA-Extraktionsreagenzes in das Sediment und inkubieren Sie es 15 Minuten lang bei 56 °C.
    5. Füllen Sie die Lösung in ein 2-ml-Schraubröhrchen und fügen Sie jeweils drei Glasperlen mit einem Durchmesser von 2 mm hinzu.
    6. 10 s vortexen, um die Zellen zu verteilen, und die Röhrchen für 8 min bei 100 °C in einen Trockenbad-Inkubator legen.
    7. Homogenisieren Sie die Proben mit dem Bead-Beating-Homogenisator mit den folgenden Einstellungen: 3 Zyklen à 20 s bei 4,0 m/s.
    8. Zentrifugieren Sie bei 12.000 x g für 15 min bei RT und überführen Sie vorsichtig 130 μl des Überstands (DNA-haltige Flüssigkeit) in ein 1,5-ml-Röhrchen, wobei Sedimente und Ablagerungen vermieden werden.
    9. Resuspendieren Sie die Kügelchen durch Schnippen oder Vortexen und geben Sie 156 μl der Kügelchen in das 1,5-ml-Röhrchen mit der extrahierten DNA.
    10. 10 Mal langsam auf und ab pipettieren, um zu mischen und 5 Minuten bei RT zu inkubieren.
    11. Legen Sie die Röhrchen für 5 Minuten auf ein Magnetgestell, um die DNA-gebundenen Kügelchen zu trennen.
      HINWEIS: Über einem kompakten Pellet aus dunklen magnetischen Kügelchen an der dem Magneten zugewandten Seite des Rohrs sollte ein klarer Überstand erscheinen, der die Bereitschaft zur Entfernung des Überstands anzeigt.
    12. Pipettieren Sie den Überstand ab, ohne die Kügelchen zu stören.
    13. Geben Sie 100 μl frisch zubereitetes 80%iges Ethanol in das Bead-Pellet, während es auf dem Gestell steht, und lassen Sie es 30 s einwirken, dann entfernen Sie das Ethanol. Wiederholen Sie den Waschschritt.
    14. Trocknen Sie das Bead-Pellet 5 min lang bei RT an der Luft. Stellen Sie sicher, dass das Bead-Pellet matt erscheint und keine sichtbare Flüssigkeit zurückbleibt, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.
    15. Nehmen Sie das Rohr aus dem Magnetgestell.
    16. Geben Sie 25 μl nukleasefreies Wasser (NFW) direkt zu den getrockneten Kügelchen und resuspendieren Sie sie, indem Sie 10 Mal vorsichtig auf und ab pipettieren.
    17. 5 Minuten bei RT inkubieren.
    18. Legen Sie die Röhre für weitere 5 Minuten wieder in das Magnetregal.
    19. Übertragen Sie die eluierte DNA (Überstand) vorsichtig in ein neues 1,5-ml-Röhrchen.
    20. Messen Sie die DNA-Konzentration mit dem hochempfindlichen fluoreszenzbasierten dsDNA-Quantifizierungsreagenz.
      HINWEIS: Die DNA kann in einem -20 °C-Gefrierschrank gelagert oder mit PCR fortgesetzt werden.
  3. Amplifikation (PCR)
    1. Multiplex-PCR und Post-PCR-Reinigung gemäß den Anweisungen des Herstellers25.
    2. Messen Sie die DNA-Konzentration mit dem hochempfindlichen fluoreszenzbasierten dsDNA-Quantifizierungsreagenz.
  4. Gel-Elektrophorese
    1. Bereiten Sie ein 2%iges Agarose-Gel vor, indem Sie Agarosepulver in 1x TAE-Puffer durch Mikrowellenerwärmung auflösen, bis es vollständig geschmolzen ist.
    2. Geben Sie 5 μl ungiftiges fluoreszierendes DNA-Gel-Fleck zu der geschmolzenen Agarose und mischen Sie es gründlich.
    3. Gießen Sie die Gelmischung in eine Gelgießschale, die mit einem Kamm versehen ist, um Vertiefungen zu bilden.
    4. Lassen Sie das Gel bei RT festigen.
    5. Sobald er fest ist, entfernen Sie den Kamm und stellen Sie die Gelschale in den Elektrophoresetank, der mit 1x TAE-Puffer gefüllt ist.
    6. Laden Sie 5 μl einer kb-DNA-Leiter gemischt mit 5 μl Ladepuffer in die erste Vertiefung.
    7. Mischen Sie für jedes PCR-Produkt 5 μl des Produkts mit 5 μl Ladepuffer und laden Sie es in einzelne Wells.
    8. Lassen Sie das Gel 1 h lang bei 100 V laufen.
    9. Visualisieren Sie die DNA-Banden mit dem Gel-Dokumentationssystem mit Durchleuchtung.

2. Vorbereitung der ONT-Bibliothek

  1. End-Vorbereitung
    1. Berechnen Sie 100 ng jeder Amplikonprobe basierend auf der Konzentration und übertragen Sie das erforderliche Volumen in ein sauberes PCR-Röhrchen.
    2. Um die Gesamtmasse (in ng) der Amplikons in einer bestimmten Probe zu berechnen, multiplizieren Sie die Konzentration der Probe (ng/μL) mit ihrem verbleibenden Volumen (μL) nach der Qualitätskontrolle (QC).
      HINWEIS: Wenn eine Probe beispielsweise eine Konzentration von 2 ng/μl und ein Restvolumen von 1 μl nach der QC aufweist, beträgt die Gesamtmasse des Amplikons:
      Gesamtmasse = 2 ng/μL × 1 μL = 45 ng
      Um 10 ng Amplikons für die Sequenzierung vorzubereiten, verwenden Sie die Verdünnungsformel:
      C1V1 = C2V2
      Dabei gilt: C1 = 45 ng, V1 = unbekannt, C2 = 10 ng, V2 = 1 μL, V1 = (C2 × V2) / C1 = (10 ng × 1 μL) / 45 ng = μL
      Daher sollten μl der anfänglichen Amplikonprobe verwendet werden, um 10 ng DNA für die Sequenzierung zu erhalten.
    3. Passen Sie das Gesamtvolumen jeder Probe mit NFW auf 12,5 μl an.
    4. Mischen Sie die Proben vorsichtig, indem Sie 10 Mal auf und ab pipettieren und kurz schleudern.
    5. Jede Probe wird mit 1,75 μl Endreparatur- und A-Tailing-Reaktionspuffer und 0,75 μl Endreparatur- und A-Tailing-Enzymmischung versorgt.
    6. Gründlich mischen, indem Sie 10 Mal auf und ab pipettieren und kurz herunterdrehen.
    7. Inkubieren Sie die Röhrchen in einem Thermocycler bei 25 °C für 30 Minuten, gefolgt von 65 °C für 30 Minuten.
      HINWEIS: Sollte sich der Benutzer zu diesem Zeitpunkt entscheiden, den Prozess abzubrechen, ist es ratsam, Kügelchen für die Reinigung der endvorbereiteten DNA zu verwenden. Die aufgereinigte DNA kann dann bei 4 °C für eine maximale Dauer von sieben Tagen gelagert werden.
  2. Native Barcode-Ligation
    1. Tauen Sie die magnetischen Kügelchen auf und bereiten Sie sie für die DNA-Aufreinigung und Größenauswahl, paramagnetische DNA-Reinigungskügelchen, EDTA und native Barcodes (NB01-96) gemäß den Anweisungen des Herstellers vor und legen Sie sie dann auf Eis.
    2. In neue PCR-Röhrchen fügen Sie nacheinander Folgendes hinzu: 2,75 μl nukleasefreies Wasser, 1 μl endpräparierte DNA, 1,25 μl native Barcodes (NB01-96) und 5 μl DNA-Ligationsenzymmix.
    3. Mischen Sie jede Reaktion, indem Sie 10 Mal vorsichtig pipettieren, mit einer Mikrozentrifuge kurz drehen und 20 Minuten lang bei RT inkubieren.
    4. Geben Sie 1 μl EDTA in jede Vertiefung, mischen Sie gründlich durch Pipettieren und drehen Sie es kurz.
    5. Proben mit einem Pool-Barcode in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen füllen.
    6. Resuspendieren Sie die DNA-Aufreinigungskügelchen durch Vortexen und fügen Sie das 0,7-fache des gesamten gepoolten Probenvolumens hinzu (z. B. für 23 Proben mit einem Gesamtvolumen von 253 μl fügen Sie 177,1 μl Kügelchen hinzu).
    7. Mischen Sie die Lösung durch Pipettieren und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang auf einem HulaMixer bei RT.
    8. Bereiten Sie 2 ml 80%iges Ethanol vor, indem Sie 1600 μl reines Ethanol mit 400 μl NFW mischen.
    9. Stellen Sie das Röhrchen für 5 Minuten auf ein Magnetgestell, bis das Eluat klar und farblos ist.
    10. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören.
    11. Waschen Sie die Kügelchen mit 700 μl frisch zubereitetem 80%igem Ethanol, ohne das Pellet zu stören, entfernen Sie dann das Ethanol und entsorgen Sie es.
    12. Wiederholen Sie den Schritt zum Waschen von Ethanol.
    13. Zentrifugieren Sie das Röhrchen kurz, kehren Sie zum Magnetgestell zurück und entfernen Sie das restliche Ethanol.
    14. Die Kügelchen 30 s an der Luft trocknen lassen.
    15. Nehmen Sie das Röhrchen aus dem Magnetgestell, resuspendieren Sie die Kügelchen in 35 μl nukleasefreiem Wasser durch leichtes Schnippen und inkubieren Sie bei 37 °C für 10 min.
    16. Legen Sie das Röhrchen wieder in das Magnetgestell, bis das Eluat klar und farblos ist.
    17. Übertragen Sie 35 μl des Eluats in ein sauberes 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen für die nachfolgenden Schritte.
      HINWEIS: Die Bibliothek kann zu diesem Zeitpunkt über Nacht bei 4 °C gelagert werden.
  3. Adapterligation und -reinigung
    1. Bereiten Sie das DNA-Ligations-Reagenzkit für die schnelle Ligation gemäß den Anweisungen des Herstellers vor und legen Sie es auf Eis.
    2. Mischen Sie den Native Adapter (NA) und die Quick Ligase durch Pipettieren und legen Sie sie dann auf Eis.
    3. Tauen Sie den Elutionspuffer (EB) bei RT auf, wirbeln, zentrifugieren Sie ihn und legen Sie ihn auf Eis.
    4. Short Fragment Buffer (SFB) bei RT auftauen, vortexen, zentrifugieren und auf Eis legen.
    5. Mischen Sie in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit niedriger Bindung Folgendes: 30 μl gepoolte barcodierte Probe, 5 μl nativer Adapter (NA), 10 μl Puffer für schnelle Ligationsreaktionen und 5 μl schnell wirkende T4-DNA-Ligase.
    6. Zum Mischen vorsichtig pipettieren, kurz zentrifugieren und 20 Minuten bei RT inkubieren.
    7. Resuspendieren Sie die DNA-Aufreinigungskügelchen durch Vortexen und fügen Sie der Reaktion 20 μl (0,4x) Kügelchen hinzu.
    8. Mischen Sie vorsichtig durch Pipettieren und inkubieren Sie auf einem HulaMixer für 10 Minuten bei RT.
    9. Pelletieren Sie die Kügelchen auf einem Magnetgestell und saugen Sie den Überstand an, ohne das Pellet zu stören.
    10. Waschen Sie die Kügelchen durch Zugabe von 125 μl Short Fragment Buffer (SFB), resuspendieren Sie sie durch Schnippen, zentrifugieren Sie kurz und kehren Sie zum Magnetgestell zurück.
    11. Pelletieren Sie die Kügelchen und saugen Sie den Überstand an; Wiederholen Sie den Waschschritt einmal.
    12. Kurz zentrifugieren, das Röhrchen wieder in das Magnetgestell einführen und den restlichen Überstand absaugen.
    13. Nehmen Sie das Röhrchen aus dem Magnetgestell und resuspendieren Sie die Kügelchen in 15 μl Elutionspuffer (EB).
    14. Kurz zentrifugieren und 10 min bei 37 °C inkubieren, um die DNA zu eluieren.
    15. Stellen Sie das Röhrchen auf das Magnetgestell, pelletieren Sie die Kügelchen, bis das Eluat klar und farblos ist, und aspirieren Sie 15 μl des Eluats in ein sauberes 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
    16. Quantifizieren Sie 1 μl des Eluats.
    17. Verdünnen Sie die Bibliothek auf 20 fmol (berechnen Sie mit dem NEB-Rechner) und verwenden Sie 12 μl der vorbereiteten 20-fmol-Bibliothek für die Sequenzierung auf der R10.4.1-Durchflusszelle.
      HINWEIS: Die Bibliothek kann jetzt bei -20 °C gelagert werden, so dass sie wiederholt verwendet werden kann.
  4. Ansaugen und Beladen der Nanoporen-Sequenzierungs-Durchflusszelle
    1. Tauen Sie den Sequencing Buffer (SB), die Library Beads (LIB), den Flow Cell Tether (FCT) und den Flow Cell Flush (FCF) bei RT auf, mischen Sie sie durch Vortexen und schleudern Sie sie herunter.
    2. Bereiten Sie die Durchflusszellen-Priming-Mischung vor, indem Sie 5 μl Rinderserumalbumin (BSA, 50 mg/ml), 30 μl Flow Cell Tether (FCT) und 1170 μl Flow Cell Flush (FCF) kombinieren und die Lösung durch Inversion und Pipettieren mischen.
    3. Öffnen Sie die Ansaugöffnung der Durchflusszelle, saugen Sie ~20 μl Puffer an, um Luftblasen zu entfernen, laden Sie 800 μl der Ansaugmischung in die Ansaugöffnung, ohne Luftblasen einzuführen, und warten Sie 5 Minuten.
    4. Bereiten Sie die Bibliothek vor, indem Sie 37,5 μl Sequencing Buffer (SB), 25,5 μl Library Beads (LIB) oder Library Solution (LIS) und 12 μl der 20 fmol DNA-Bibliothek in einem 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen mischen und durch Pipettieren gründlich mischen.
    5. Entlüften Sie die Durchflusszelle erneut, indem Sie die Kappe des Probenanschlusses der Durchflusszelle vorsichtig anheben, 200 μl der Ansaugmischung in die Ansaugöffnung laden, ohne Luftblasen einzuführen, und die Bibliothek für das Laden vorbereiten.
    6. Mischen Sie die vorbereitete Bibliothek vorsichtig durch Pipettieren und laden Sie 75 μl der Bibliothek tropfenweise in den Probenanschluss der Sequenzierungsdurchflusszelle, wobei Sie sicherstellen, dass jeder Tropfen in den Anschluss fließt, bevor der nächste hinzugefügt wird.
    7. Schließen Sie die Kappe des Durchflusszellen-Probenanschlusses, stellen Sie sicher, dass der Stopfen in den Durchflusszellen-Probenanschluss eintritt, und schließen Sie dann den Ansauganschluss.
    8. Schließen Sie das tragbare Sequenziergerät an einen Computer (mit unterbrechungsfreier Stromversorgung) an und starten Sie die Sequenzierung mit einer Steuerungs- und Analysesoftware für ein Sequenziergerät.
  5. Software-Parameter
    HINWEIS: Diese von ONT entwickelte Softwareanwendung wird für die umfassende Verwaltung von Sequenzierungsläufen und die Erstellung detaillierter Berichte verwendet.
    1. Um den Sequenzierungsprozess zu starten, wählen Sie bitte die Option Start und anschließend Sequenzierung starten.
      HINWEIS: Sie werden dann aufgefordert, einen Ordner für die Dateispeicherung festzulegen und einen Namen für Ihre Sequenzierung anzugeben, z. B. "sequencing_run_1". Klicken Sie anschließend auf Weiter zu den Einstellungen , um den entsprechenden Kit-Namen auszuwählen, z. B. library-sequencing-amplicons-native-barcoding-v14-sqk-nbd114-96, und passen Sie die gewünschte Laufzeit an, z. B. 20 h (die maximale Laufzeit beträgt 72 h).
    2. Wählen Sie als Nächstes den Ausgabedateityp aus, und wählen Sie aus Optionen wie POD5 für Rohausgabe-Lesevorgänge und FASTQ für Basecalling-Ausgaben aus. Wählen Sie anschließend das Modell FAST-Basecalling aus.
    3. Bitte beachten Sie, dass einige der Standardeinstellungen häufige Porenscans alle 1,5 Stunden, eine Mindestleselänge von 200 bp und eine Mindestqualitätsbewertung von 8 umfassen. Überprüfen Sie abschließend die Einstellungen und starten Sie den Lesevorgang.

3. Analyse nach der Sequenzierung

  1. Systemanforderungen
    HINWEIS: Leitfaden für die Einrichtung der Umgebung und die Analyse von Mycobacterium tuberculosis-Amplikon-Sequenzierungsdaten unter Verwendung der ONT-TB-NF-Pipeline. Die Anweisungen richten sich sowohl an Windows- (über WSL) als auch an macOS-Benutzer.
    1. Verwenden Sie Folgendes: - Betriebssystem: Windows 10/11 (mit WSL2) oder macOS; Arbeitsspeicher: Mindestens 8 GB RAM (16 GB empfohlen); Speicher: Mindestens 50 GB freier Speicherplatz; Internet: Erforderlich für das Herunterladen von Paketen und Daten; Berechtigungen: Möglichkeit, Software zu installieren und Umgebungen zu verwalten.
  2. Stellen Sie sicher, dass die folgende Umgebung eingerichtet ist: Windows-Benutzer (mit WSL2). Aktivieren Sie WSL2.
    1. Öffnen Sie PowerShell als Administrator, und führen Sie Folgendes aus: wsl - install.
    2. Starten Sie den Computer neu, wenn Sie dazu aufgefordert werden.
  3. Ubuntu installieren
    1. Starten Sie nach dem Neustart den Microsoft Store, suchen Sie nach Ubuntu und installieren Sie die bevorzugte Version (z. B. Ubuntu 22.04 LTS).
    2. Starten Sie Ubuntu über das Startmenü .
    3. Erstellen Sie einen neuen UNIX-Benutzernamen und ein neues Kennwort, wenn Sie dazu aufgefordert werden.
    4. Update-Paketlisten: sudo apt update && sudo apt upgrade -y.
  4. macOS-Benutzer
    1. Installieren Sie Homebrew (falls noch nicht installiert): /bin/bash -c "$(curl -fsSL https://raw.githubusercontent.com/Homebrew/install/HEAD/install.sh)".
    2. Installieren Sie die erforderlichen Pakete: brew install git wget
  5. Installieren von Conda oder Mamba
    1. Besuchen Sie die Miniconda-Download-Seite , um das richtige Installationsprogramm für das Betriebssystem herunterzuladen.
    2. Um Miniconda zu installieren, führen Sie das Installationsprogramm aus und folgen Sie den Anweisungen auf dem Bildschirm. Nachdem die Installation abgeschlossen ist, starten Sie bitte das Terminal neu.
    3. Conda-Kanäle konfigurieren:
      conda config --add channels Standardeinstellungen
      conda config --Kanäle hinzufügen bioconda
      conda config --Kanäle hinzufügen conda-forge
    4. Installation von Mambaforge (Mamba)
      Für Linux:
      wget
      https://github.com/conda-forge/miniforge/releases/latest/download/Mambaforge-Linux-x86_64.sh
      Für macOS:
      wget https://github.com/conda-forge/miniforge/releases/latest/download/Mambaforge-MacOSX-arm64.sh
    5. Mambaforge installieren: bash Mambaforge-*.sh
    6. Befolgen Sie die Anweisungen, um die Installation abzuschließen, und starten Sie Ihr Terminal neu, um Mamba zu aktivieren.
  6. Einrichten der ONT-TB-NF-Pipeline
    1. Erstellen Sie eine neue Conda-Umgebung: conda create -n ont_tb_env samtools=1.15.1 minimap2=2.24 nanoplot=1.40.2 mosdepth=0.3.3 flye=2.9.1 nanofilt fastqc bedtools -c bioconda
    2. Alternativ können Sie Mamba verwenden: mamba create -n ont_tb_env samtools=1.15.1 minimap2=2.24 nanoplot=1.40.2 mosdepth=0.3.3 flye=2.9.1 nanofilt fastqc bedtools -c bioconda
    3. Aktivieren Sie die Umgebung: conda activate ont_tb_env
    4. Nextflow installieren: curl -s https://get.nextflow.io | bash, sudo mv nextflow /usr/local/bin/
    5. Klonen Sie das ONT-TB-NF-Repository: git clone https://github.com/HKU-BAL/ONT-TB-NF.git
      cd ONT-TB-NF
    6. Pullen erforderlicher Docker-Images (bei Verwendung von Docker)
      docker pull hkubal/clair3:v0.1-r12
      docker pull quay.io/biocontainers/tb-profiler:4.3.0--pypyh5e36f6f_0
  7. Ausführen der Pipeline
    1. Verketten Sie die Basecalled FASTQ-Dateien der einzelnen Samples unabhängig voneinander mit dem folgenden Befehl.
      Katze *.fastq.gz > concatenated.fastq.gz
      nextflow run run_tb_amplicon.nf \
      read_fq /Pfad/zum/concatenated.fastq.gz \
      sample_name SAMPLE_ID \
      amplicon_bed /Pfad/zum/amplicon_regions.Bett \
      Gewinde 16 \
      output_dir /absolut/Pfad/zum/output_directory
  8. Ausgabedateien und Interpretation
    1. Stellen Sie nach erfolgreicher Ausführung sicher, dass die Pipeline die folgenden Ausgaben im angegebenen Ausgabeverzeichnis generiert:
      1. Ausgerichtete Lesevorgänge: *.bam-Dateien.
      2. Variantenaufrufe: *.vcf Dateien, die SNPs und Indels enthalten.
      3. Zusammenfassende Berichte: *.csv- oder *.tsv-Dateien, die Arzneimittelresistenzmutationen und andere relevante Metriken zusammenfassen.
      4. Qualitätskontrollberichte: *.htmL-Dateien, die von Tools wie MultiQC generiert werden.
      5. Protokolle: Detaillierte Protokolle der Pipelineausführung.
      6. Zwischendateien: Werden im Verzeichnis work/ abgelegt (können nach erfolgreichem Lauf gelöscht werden).
        HINWEIS: Im Falle von Berechtigungsfehlern ist es wichtig zu überprüfen, ob man über die erforderlichen Berechtigungen zum Lesen und Schreiben von Dateien sowie zum Ausführen von Skripten verfügt. In Bezug auf Umweltfragen stellen Sie bitte sicher, dass die entsprechende Conda-Umgebung aktiviert ist, bevor Sie die Pipeline ausführen. Für diejenigen, die Docker-Profile verwenden, ist es unbedingt erforderlich, zu bestätigen, dass Docker sowohl installiert als auch betriebsbereit ist. Darüber hinaus müssen die Systemressourcen sorgfältig überwacht werden, um Speicher- oder Speicherbeschränkungen während der Ausführung zu vermeiden. Einen Überblick über diese Methoden gibt Abbildung 1.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die gewählte DNA-Extraktionsmethode wurde aufgrund ihrer Effizienz und überlegenen Ausbeute im Vergleich zu anderen Schnelltechniken ausgewählt. Es produzierte durchweg hochwertige genomische DNA (gDNA), und die Integration eines beadbasierten Aufreinigungsschritts trug dazu bei, die Verarbeitungszeit zu minimieren und gleichzeitig die Kosten pro Probe zu senken. Dies wurde erreicht, indem keine zusätzlichen Qualitätskontrollen wie spektrophotometrische Messungen erforderlich waren, wobe...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Long-Read-Sequenzierungsplattform zeigte in dieser Studie bemerkenswerte Vorteile, insbesondere ihre Fähigkeit, eine schnelle Sequenzierung mit gleichbleibend hoher Abdeckungsbreite zu erreichen. Über alle erfolgreich sequenzierten Isolate hinweg wurde eine Abdeckungsbreite von 99,9% erreicht, was auf eine nahezu vollständige Darstellung der resistenzassoziierten genomischen Regionen hinweist. Die durchschnittliche Abdeckungstiefe über alle Zielgene hinweg betrug 4462X, wobei das

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Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir möchten dem SAMRC-Zentrum für Tuberkulose an der Universität Stellenbosch unseren aufrichtigen Dank für die Bereitstellung der notwendigen Ressourcen und Einrichtungen aussprechen. Wir sind auch der TS ELiOT-Studie zutiefst dankbar für die Bereitstellung der Proben, die für diese Studie unerlässlich waren.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
15 mL & 1,5 mL oder 2 mL Lo-BindungsröhrenEppendorfEP0030108051-250EA
1kb-LeiterThermo Fisher ScientificSM0311
2-mL SchraubkappenröhrenScientific Specialties IncP2TUB056C-0001,5ST
2 mm sterile GlasperlenSigma-AldrichZ273627-1EA
AMPure XP BeadBeckman ColterA63881
Deeplex Myc-TB GenoScreen20090205
ElektrophoresekammerThermo Fisher ScientificA25977
Ethylalkohol, PureSigma-AldrichE7023-500ML
FastPrep-HomogenisiererMP Biomedizin116005500
Filterpipettenspitzen (10 & micro; L) Bio-Smart ScientificFT-10-R
Filterpipettenspitzen (1000 & micro; L) Bio-Smart ScientificFT-1000-R
Filterpipettenspitzen (20 & micro; L) Bio-Smart ScientificFT-20-R
Filterpipettenspitzen (200 & micro; L) Bio-Smart ScientificFT-200-R
Flow-cell Oxford Nanopore TechnologienFLO-MIN114
HeizblockEppendorf5382000031
InstaGen-MatrixBio-RadBBRD7326030
Magnetisches Rack Thermo Fisher Scientific 12321D
MikrozentrifugeEppendorf 5406000046
GünstlingOxford Nanopore TechnologienMK1B
Native-Barcoding-Kit V14 Oxford Nanopore TechnologienSQK-NBD114.24
NEB Blunt/TA Ligase Master MixSCHNABELM0367
NEBNext SchnellligationsmodulSCHNABELE6056
NEBNext Ultra II End-Reparatur-/dA-Tailing-ModulSCHNABELE7546
Nukleasefreies Wasser (NFW)Thermo Fisher ScientificAM9937
Pipetten (P10, P20, P200 und P1000)EppendorfEP3123000918-1EA
Qubit-Assay-RöhrenThermo Fisher ScientificQ32856
Qubit dsDNA HS Assay KitThermo Fisher ScientificQ33231
Qubit-FluorometerThermo Fisher ScientificQ33226
SYBR Safe DNA-Gel-StammThermo Fisher ScientificS33102
UltraPure AgaroseThermo Fisher Scientific17852
Universal Hood III transilluminator (Molecular Imager Gel Doc XR System)Bio-Rad170-8170
Vortex-MixerLasecWMBB0L0E0216

References

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