Fluoreszenzgesteuerte matrixgestützte Laserdesorption/Ionisation mit laserinduzierter Postionisations-Massenspektrometrie einzelner Nervenzellen von Ratten

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von microMS für die fluoreszenzgesteuerte Einzelzell-MALDI-2-Massenspektrometrie, die ein verbessertes molekulares Profiling von primären neuronalen Zellen der Ratte ermöglicht.

Zusammenfassung

Einzelzellmessungen sind entscheidend für das Verständnis der reichhaltigen raumchemischen Heterogenität des Gehirns. Die Matrix-gestützte Laser-/Desorptionsionisations-Massenspektrometrie (MALDI) ist in der Lage, endogene Moleküle in einzelnen Zellen markierungsfrei und mit hohem Durchsatz zu charakterisieren. Die jüngsten Fortschritte bei der Entwicklung von MALDI-Massenspektrometern mit laserinduzierter Postionisation (MALDI-2) bieten eine stark verbesserte Empfindlichkeit der Detektion für eine Vielzahl von Lipiden und anderen kleinen Molekülen. Die MS-Bildgebung großer Proben mit MALDI-2 in zellulärer Auflösung ist jedoch für die meisten Anwendungen unerschwinglich langsam. Bei diesem Protokoll werden Primärzellen isoliert und auf leitfähigen Objektträgern dispergiert. Die relativen Zellpositionen werden durch Fluoreszenzmikroskopie des gesamten Objektträgers bestimmt, gefolgt von einer genauen Coregistrierung der Mikroskopiekoordinaten mit den Tischkoordinaten des MALDI-2-Massenspektrometers. Die gezielte MS-Analyse nur von Zellstandorten ermöglicht Einzelzellmessungen mit hohem Durchsatz und hoher Analytabdeckung und reduzierter Datengröße im Vergleich zur MS-Bildgebung der gesamten Probe. Wir beschreiben die kritischen Schritte, die für die Einzelzellpräparation, die Fluoreszenzbildgebung des gesamten Objektträgers, die Matrixapplikation und die MALDI-2-Massenspektrometrie erforderlich sind.

Einleitung

Lipide und Metaboliten sind grundlegend für die zelluläre Funktion und dienen als wesentliche Bestandteile von Membranen, Energiequellen und Signalmolekülen ^1,2. Ihre Zusammensetzung und Häufigkeit kann jedoch zwischen den einzelnen Zellen erheblich variieren, was die Unterschiede in den Zelltypen und Entwicklungs- und Funktionszuständen widerspiegelt ^3,4,5. Die Analyse dieser Unterschiede ist entscheidend für das Verständnis der biologischen Variabilität und die Identifizierung unterschiedlicher Zellsubpopulationen. Einzelzell-Messtechniken, wie z. B. die RNA-Sequenzierung, liefern nützliche zellspezifische Transkriptprofile⁶. Diese Messungen auf Transkriptebene spiegeln jedoch nicht direkt die tatsächlichen zellulären Mengen an Lipiden und Metaboliten wider, da die Genexpression nicht immer mit der tatsächlichen Häufigkeit dieser Analyten korreliert. Für eine umfassende Analyse der chemischen Zusammensetzung einzelner Zellen und ihrer Populationen sind daher spezialisierte Methoden zur direkten Messung von Lipiden und Metaboliten erforderlich.

Die matrixgestützte Laserdesorption/Ionisation (MALDI) Massenspektrometrie-Bildgebung (MSI) ist ein Werkzeug der Wahl für die markierungsfreie räumliche Kartierung endogener Biomoleküle in situ ^7,8. Typischerweise wird bei MALDI ein UV-Laser verwendet, um Material aus einer dünnen Probenschicht abzutragen, die mit einer organischen Matrix cokristallisiert ist und eine Wolke aus Ionen und neutralen Molekülen bildet. Die gebildeten Ionen werden dann mit einem MS-Analysator getrennt und in einem Massenspektrometer detektiert. Aufgrund der genauen Positionierung moderner Massenspektrometertische kann der Laser so positioniert werden, dass er auf bestimmte Probenregionen abzielt, oder über Regionen hinweg gerastert werden, um molekulare Bilder durch MSI zu erzeugen. MSI mit zellulärer oder subzellulärer Ortsauflösung (< 10 μm), die mit einem fokussierten Laserstrahl und einer genauen Tischbewegung erreicht wird, kann verwendet werden, um chemische Informationen über einzelne Zellen^{zu erhalten 9,10}. MSI-Messungen in dieser Größenordnung sind jedoch ineffizient, insbesondere bei Proben mit geringer Zielzelldichte, da viel Zeit für die Bildgebung leerer Bereiche zwischen den Zellen aufgewendet wird. Darüber hinaus ist die Nachweisbarkeit vieler Analyten aufgrund des geringen Probenvolumens eingeschränkt. Um diese Herausforderungen zu meistern, haben wir einen bildgesteuerten MALDI-MS-Ansatz für die Hochdurchsatz-Einzelzellanalyse entwickelt^11,12. Bei diesem Ansatz werden die Positionen dispergierter Zellen programmatisch aus Ganzdia-Fluoreszenzbildern bestimmt und dazu verwendet, den Massenspektrometertisch an Positionen zu führen, an denen sich einzelne Zellen mit bestimmten Parametern (z. B. Größe und Form) befinden und dann durch Bestrahlung mit dem MALDI-Laser analysiert werden. Frühere Arbeiten mit diesem gezielten Ansatz wurden zur Charakterisierung von Lipiden, Peptiden und anderen Biomolekülen in heterogenen Zellpopulationen verwendet ^5,13.

Angesichts der begrenzten Masse einzelner Zellen ist die Anzahl der in solchen Proben nachgewiesenen Analyten im Allgemeinen geringer als die Anzahl der direkt aus Gewebe beobachteten. Um die Analytabdeckung in der Einzelzell-MS-Analyse zu erhöhen, ist es daher entscheidend, die Empfindlichkeit der Analytdetektion zu erhöhen. Ein kürzlich entwickelter Ansatz, der bei der Überwindung dieser Detektionsherausforderung hilft, ist MALDI mit Laser-Nachionisation (MALDI-2), der nachweislich die Empfindlichkeit für ein breites Spektrum von Analyten^erhöht 9,14,15,16. Infolgedessen generiert MALDI-2 umfassendere Einzelzelldatensätze und bietet eine tiefere molekulare Abdeckung in massenbegrenzten Proben, wie z. B. isolierten Zellen.

Ziel dieser Methode ist es, Lipidmessungen von Tausenden von einzelnen Zellen zu erhalten. Zu diesem Zweck beschreiben wir einen Arbeitsablauf, der eine Hochdurchsatz-Einzelzell-MALDI-2-Massenspektrometrie ermöglicht und im Allgemeinen auf jeden sondenbasierten Massenspektrometrie-Ansatz mit präziser Tischkontrolle erweitert werden^{kann 17}. In diesem Arbeitsablauf wird Gewebe aus der/den interessierenden Hirnregion(en) präpariert, und einzelne Zellen werden nach einem Papain-Dissoziationsverfahren aus dem Gewebe gewonnen. Die Zellen werden dann mit einem Kernfleck markiert und auf leitfähige Objektträger dispergiert, die mit Passermarken geätzt sind, wo sie haften bleiben. Als nächstes werden ganze Objektträgerbilder mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie aufgenommen. Die Matrix wird durch Sublimation abgeschieden, wodurch eine wiederholbare homogene Kristallschicht und ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis für die Einzelzell-MS-Analyse erzeugt werden. Mit der Open-Source-Software microMS¹¹ werden die relativen Koordinaten der Zellstandorte aus dem Mikroskopiebild kartiert und mit den Koordinaten des Massenspektrometertisches abgeglichen, indem eine Punktsatzregistrierung verwendet wird, bei der Passermarkenmarker verwendet werden, die auf die Objektträger geätzt werden, in denen die Zellen abgelegt wurden. Schließlich werden unter Verwendung dieser Informationen präzise, zielgerichtete MS-Spektren von jeder einzelnen Zelle erfasst, so dass Tausende von Zellen in einem einzigen Lauf (<1 h) profiliert werden ^können12,13.

Protokoll

Alle Tierversuche in dieser Studie wurden in Übereinstimmung mit dem Tierverwendungsprotokoll durchgeführt, das vom Illinois Institutional Animal Care and Use Committee (23228) genehmigt wurde, unter strikter Einhaltung sowohl der nationalen als auch der ARRIVE-Standards für die ethische Behandlung und Pflege von Tieren.

1. Vorbereitung von Materialien und Lösungen

1. Bereiten Sie modifizierte Gey's balanced salt solution (mGBSS) mit 1,5 mM CaCl₂, 4,9 mM KCl, 0,2 mM KH₂PO₄, 11 mM MgCl₂, 0,3 mM MgSO₄, 138 mM NaCl, 27,7 mM NaHCO₃, 0,8 mM Na₂HPO₄ und 25 mM HEPES vor. Stellen Sie den pH-Wert mit 3 M NaOH auf 7,2 ein. Es wird empfohlen, 1 l mGBSS vorzubereiten und bis zur Verwendung bei 4 °C zu lagern.
2. Bereiten Sie 50-ml-Spritzen vor, indem Sie sie mit der vorbereiteten mGBSS-Lösung füllen und für die transkardiale Perfusion auf Eis legen. Bereiten Sie 1 Spritze für jede sezierte Ratte vor.
3. Bereiten Sie Aliquots der Papain-Lösung nach dem Protokoll des Worthington Papain-Dissoziationssystems vor. Dieses System enthält vier Fläschchen, wie unten beschrieben, wobei Fläschchen 4 für dieses Protokoll nicht verwendet wird:
   Fläschchen 1: sterile Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) mit Bikarbonat und Phenolrot
   Fläschchen 2: Papain mit L-Cystein und EDTA
   Fläschchen 3: Desoxyribonuklease I (DNase)
   Fläschchen 4: Ovomucoid-Proteasehemmer mit Rinderserumalbumin
   1. Geben Sie 5 mL EBSS (Fläschchen 1) in das Papain-Fläschchen (Fläschchen 2) und legen Sie es für 10 Minuten in ein 37 °C heißes Wasserbad, um das Papain aufzulösen.
   2. 500 μl EBSS (Fläschchen 1) in das DNase-Fläschchen (Fläschchen 3) geben und vorsichtig mischen. 250 μl der verdünnten DNase-Durchstechflasche (Durchstechflasche 3) in die Durchstechflasche Papain (Durchstechflasche 2) geben. Dieses Präparat enthält eine Endkonzentration von 20 Einheiten/ml Papain, 0,005 % DNase, 0,5 mM EDTA und 1 mM L-Cystein.
   3. Frieren Sie 250 μl Aliquote dieser vorbereiteten Papainlösung für nachfolgende Dissoziationen ein (ergibt ~20 Aliquote). Ergänzen Sie diese Lösung mit den folgenden Antibiotika: 100 Einheiten/ml Penicillin G, 100 μg/ml Streptomycin und 100 μg/ml Gentamicin. Dies kann für die Anwendung des Benutzers geändert werden.
4. Bereiten Sie eine 150 mM Ammoniumacetatlösung vor und lagern Sie sie bei 4 °C. Bereiten Sie eine 33%ige Glycerinlösung vor, indem Sie Glycerin in die vorbereitete mGBSS-Lösung verdünnen.
5. Ätzen Sie Passermarken auf mit Indiumzinnoxid (ITO) beschichtete Objektträger, indem Sie entweder einen Gravierstift mit einer Wolframkarbid- oder Diamantspitze oder einen CO₂ -Lasergravierer verwenden. Ätzen Sie auf der leitfähigen Seite des ITO-Objektträgers 20-40 X-förmige Passermarkenmarker entlang der Peripherie des Objektträgers, um eine plattformübergreifende (z. B. Mikroskop und Massenspektrometer) räumliche Registrierung zu ermöglichen.
   HINWEIS: Achten Sie darauf, dass Sie nicht in eine verbundene Leitung ätzen, die die Probe oder ihre Bereiche umgibt, da dies die Oberflächenleitfähigkeit zwischen dem Bereich und einem Glasschiebeadapter stört.

2. Präparation der primären Nervenzellen

HINWEIS: Das Hippocampusgewebe der Ratte wird präpariert, mit Papain in einzelne Zellen dissoziiert und bei geringer Dichte auf leitfähigen Glasobjektträgern abgelagert. Die Isolierung von Zellen auf diese Weise ermöglicht die Hochdurchsatz-Einzelzell-Massenspektrometrie von endogenen Lipiden.

1. Vor der Sektion von Tieren wird ein Aliquot der vorbereiteten Papainlösung aufgetaut und in einen Behälter mit einem Ein- und Auslassrohr gegeben, so dass CO₂ die Luft im Behälter verdrängen kann. Stellen Sie dieses System in ein auf 37 °C eingestelltes Wasserbad und setzen Sie den CO₂ -Fluss fort, bis die Lösung den richtigen pH-Wert hat, wie durch die Farbe angezeigt, unter Verwendung der pH-Farbkarte, die in der Verpackung des Worthington Papain Dissoziationssystems enthalten ist. Der angestrebte pH-Wert liegt zwischen 7,2 und 7,4.
   HINWEIS: Blasen Sie CO_{2 nicht} in die enzymatische Lösung, da dies zu einer Denaturierung der DNase und zum Verlust der biologischen Aktivität führt. Verwenden Sie ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen mit zwei Röhrchen, die in den Deckel eingeklebt sind, so dass CO₂ das Röhrchen von unten füllen und aus dem oberen Auslassröhrchen entweichen kann.
2. Euthanasieren Sie Ratten(n) in Übereinstimmung mit den IACUC-Protokollen gemäß den institutionellen, lokalen und bundesstaatlichen Richtlinien. Hier werden 2 bis 3 Monate alte männliche Sprague-Dawley-Ratten verwendet und durch CO₂ -Erstickung getötet.
3. Die Ratte wird transkardial mit eiskalter (4 °C) mGBSS-Lösung perfundiert, um Blut aus dem Gefäßsystem zu entfernen und den Körper des Tieres schnell zu kühlen. Ein Beispiel für dieses Vorgehen findet sich im Protokoll von We et ^al.18.
4. Isolieren Sie das Gehirn chirurgisch von der Ratte und achten Sie darauf, die interessierende Gehirnregion nicht zu beschädigen. Eine zuvor veröffentlichte Übersicht über diese Isolation enthält weitere Details zu einigen der einzelnen Schritte¹⁹.
5. Verwenden Sie einen Gewebehacker oder einen Gewebewürfel, um einen Querschnitt (~2 mm dick) des Gehirns zu schneiden, um die Region (Hippocampus, Kortex oder Striatum) für die Probe freizulegen.
6. Verwenden Sie einen 2-mm-Biopsiestempel, um die gewünschte Gehirnregion zu entnehmen, und geben Sie das Gewebestück in das Fläschchen mit Papainlösung.
7. Inkubieren Sie dieses Gewebe und die Papainlösung bei 37 °C unter ständigem Rühren (z. B. durch eine elektrische Wippe) für 30-90 Minuten.
   HINWEIS: Die enzymatische Behandlungsdauer sollte auf der Grundlage der Gehirnregion, des Tierstamms, des Alters und der gewünschten Zellleistung optimiert werden (z. B. Neuronen und Astrozyten mit Terminals im Vergleich zur maximalen Ausbeute von Zellen ohne Terminals). Für Hippocampusgewebe der Ratte sind 60-90 min typisch. Kürzere Behandlungen können einige Endterminals erhalten, aber viele Zellen in undissoziierten Clustern belassen, während längere Behandlungen die Ausbeute verbessern, aber die Zellschädigung erhöhen können, was eine Bewertung mit Lebend-/Tot-Assays erfordert (z. B. LIVE/DEAD-Viabilitäts-/Zytotoxizitätskit). Für vergleichende Studien müssen die Behandlungen über alle Stichprobentypen hinweg konsistent sein.
8. Legen Sie ein Fläschchen mit Taschentuch und Papain auf Eis, um die enzymatische Aktivität zu kühlen und zu unterdrücken. Zerreiben Sie das Gewebe mit einer abgeschnittenen Pipettenspitze, die an einer P100-Pipette mit einstellbarem Volumen befestigt ist, bis der größte Teil des Gewebes visuell aufgebrochen ist. Bilden Sie während der Dissoziation keine Luftblasen, um übermäßige Zellschäden zu vermeiden.
   HINWEIS: Eine kräftige Verreibung führt zu einer hohen Ausbeute an Zellen; Die meisten ihrer Prozesse behalten sie jedoch nicht bei. Die sanfte Verreibung sorgt für mehr Prozesse an den Zellen, führt aber zu mehr undissoziierten Zellen. Auch Pipettenspitzen unterschiedlicher Größe und andere Methoden können verwendet und für ein optimales Dissoziationsergebnis optimiert werden²⁰.
9. Zentrifugieren Sie die dissoziierten Zellen bei 300 x g für 5 min bei Raumtemperatur, um die Zellen zu pelletieren. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 1 mL mGBSS. Hoechst 33342 Kernfärbung bis zu einer Endkonzentration von 1 μg/ml zugeben.
10. Pipettieren Sie 100-500 μl der Zellsuspension auf geätzte ITO-Objektträger und lassen Sie sie etwa 5 Minuten oder länger ruhen, damit die Zellen sedimentieren und am Objektträger haften können.
    1. Die Verdünnung der Zellsuspension muss empirisch bestimmt werden. Geben Sie mit einem optischen Mikroskop ein Tröpfchen der Zellen auf den Objektträger, um die grobe Dichte zu bestimmen, und verdünnen Sie von dort aus, um sicherzustellen, dass genügend Abstand zwischen den Zellen vorhanden ist (d. h. ausreichend größer als die MALDI-Strahlgröße). Diese Verdünnung kann am ersten Objektträger durchgeführt werden, und dann kann die Verdünnung bei Bedarf für nachfolgende Objektträger angepasst werden.
11. Saugen Sie die Zellsuspension vorsichtig mit einem Vakuumsystem vom Objektträger ab, das Folgendes enthält (in der Reihenfolge von der Vakuumleitung aus): 1) Schlauch mit einem Inline-Gas-HEPA-Filter, 2) Schlauch auf einem 50-ml-Filterkolben, 3) Schlauch, der mit einem zweiten Filterkolbeneinlass mit einer angebrachten Pipettenspitze (z. B. 100 μl) verbunden ist. Wenn Sie die plattierten Zellen für die zukünftige Verwendung aufbewahren, ersetzen Sie die aspirierte Suspension 1-2 Minuten lang durch 33%ige Glycerinlösung und entfernen Sie sie.
    HINWEIS: Dieser Schritt stellt die Zellstabilität sicher. Die Abgabe von Glycerinlösung von der einen Seite bei sanftem Aspirieren von der anderen Seite ist optimal für die Aufrechterhaltung der Zellstruktur. Überwachen Sie alle hier beschriebenen Schritte während der Vorbereitung der ersten Probe immer visuell mit einem inversen Mikroskop.
12. Tragen Sie 100-500 μl Ammoniumacetat auf die abgelagerten Bereiche auf, lassen Sie es etwa 1 Minute einwirken und saugen Sie dann ab, um die Objektträger zu reinigen. Wiederholen Sie den Vorgang bei Bedarf, um sicherzustellen, dass die Objektträger frei von Salz oder Glycerin sind.

3. Mikroskopie

HINWEIS: Um die Position der abgelagerten Zellen zu bestimmen, wird jeder Objektträger durch Hellfeld-/Fluoreszenzmikroskopie abgebildet. Der Fluoreszenzkanal ermöglicht die genaue Lokalisierung von Hoechst-gefärbten Zellen, während die Hellfeld-Bildgebung morphologische Informationen liefert. Jedes Mikroskop, das in der Lage ist, gekachelte Bilder zu erfassen, ist für diesen Prozess geeignet.

1. Falls noch nicht geschehen, spülen Sie die Objektträger mit 2-3 ml 150 mM Ammoniumacetat aus. Dieser Schritt ist entscheidend, um Glycerin- und Salzkristalle zu entfernen, die die Mikroskopie und die Anwendung der MALDI-Matrix beeinträchtigen können. Trocknen Sie die Folie unter einem sanften Strahl N₂ oder lassen Sie sie an der Luft trocknen.
2. Laden Sie den Objektträger in den Mikroskoptisch. Fokussieren Sie das Mikroskop mit mindestens 10 Stützpunkten, die gleichmäßig über den Objektträger verteilt sind.
3. Unter Verwendung von Filtern, die für DAPI (Anregung: 335-383 nm, Emission: 420-470 nm) und Hellfeld-Bildgebung geeignet sind, erhalten Sie ein gekacheltes Fluoreszenzbild mit 5-facher bis 10-facher Vergrößerung über den gesamten Objektträger, wodurch sichergestellt wird, dass die (in Schritt 1.5 erstellten Passermarken) erfasst werden.
   HINWEIS: Eine 5-fache Vergrößerung ist in der Regel ausreichend, insbesondere wenn viele Dias abgebildet werden müssen. Um eine feinere zelluläre Morphologie aufzuklären, können 10x- oder 20x-Objektive verwendet werden, was zu einer quadratisch längeren Bildgebungszeit und einer Zunahme der Dateigrößen führt.
4. Fügen Sie das gekachelte Bild mit einer Mikroskopiesoftware wie ZEN (Zeiss) zusammen. Ein genaues Stitching ist von entscheidender Bedeutung, da alle Fehler in diesem Schritt auf den letzten Registrierungsschritt übertragen werden, was zu einem ungenauen Targeting führt. Stellen Sie zur Überprüfung sicher, dass vertikal benachbarte Kacheln nicht versetzt sind. Darüber hinaus sollten Sie gekachelte Bilder mit einer großen Kachelüberlappung (20 % bis 30 %) erwerben.
5. Verarbeiten und exportieren Sie jedes Bild als bigTIFF-Datei in der Mikroskopie-Software. Wenn der abgebildete Bereich relativ klein ist und zu einer endgültigen Bildgröße von weniger als 2 GB führt, verwenden Sie stattdessen ein Standard-TIFF-Dateiformat.

4. Matrix-Anwendung

HINWEIS: Eine konsistente und korrekte Anwendung der MALDI-Matrix ist entscheidend für die Erzielung qualitativ hochwertiger Einzelzelldaten. Während hier die Sublimation unter Verwendung einer kommerziellen Vorrichtung verwendet wird, kann das Auftragen der Matrix auch unter Verwendung eines Robotersprühgeräts¹², einer Airbrush²¹ oder einer selbstgebauten Sublimationsvorrichtung²² durchgeführt werden. Wir haben festgestellt, dass Einzelzellpräparate weniger Matrix benötigen als dünne Gewebeschnitte, die typischerweise für die massenspektrometrische Bildgebung verwendet werden. Um Batch-Effekte zu reduzieren, wird empfohlen, die Matrix während einer Sitzung auf alle zu untersuchenden Objektträger anzuwenden und Zellen aus verschiedenen Gruppen (z. B. Hirnregion oder Behandlung vs. Kontrolle) nach Möglichkeit auf demselben Objektträger zu deponieren. Die Auswahl der Matrix ist sowohl für traditionelle MALDI- als auch für MALDI-2-Einzelzell-Workflows von entscheidender Bedeutung. Für einzelliges MALDI wurden DHB²³, 9-AA²⁴ und CHCA²⁵ erfolgreich eingesetzt. In MALDI-2 haben wir und andere eine signifikante Signalverstärkung mit DHAP⁹ beobachtet, während Matrizen wie NEFZ¹⁶ und CHCA²⁶ ebenfalls effektiv angewendet wurden.

1. Löse 20 mg 2,5-Dihydroxyacetophenon (DHAP) in 1,5 ml Aceton auf. Legen Sie die Objektträger in die Halterung der Sublimationskammer und legen Sie sie in die Sublimationsapparatur.
2. Pipettieren Sie die gelöste Matrixlösung auf den Keramikwafer und lassen Sie das Aceton verdampfen. Schließen Sie die Sublimationskammer, um sie zu verschließen.
3. Füllen Sie die Kühlmittelkammer mit einem Eiswasser-Slush und legen Sie ihn auf die Kammer.
4. Schalten Sie das Vakuum ein und lassen Sie das System 5 Minuten lang äquilibrieren. Der Druck im System sollte weniger als 40 mbar betragen.
5. Beginnen Sie die Sublimation, indem Sie die Kammer 5 Minuten lang auf 200 °C erhitzen.
6. Entfernen Sie das Eiswasserbad, drehen Sie die Temperatur auf 25 °C und stellen Sie einen Kühlkörper auf die Kammer. Lassen Sie das System 5 Minuten lang auf Raumtemperatur erwärmen, um Kondensation zu vermeiden.
   HINWEIS: Der Behälter mit dem Eiswasserbad kann geleert und mit heißem Wasser gefüllt werden, um als Kühlkörper zu dienen.
7. Entlüften Sie das System langsam, öffnen Sie die Kammer und entfernen Sie die Objektträger.

5. Einzelzellige MALDI MS

HINWEIS: Einzelzell-MS-Daten werden mit einem MALDI-2 timsTOF-Gerät (timsTOF flex) unter Verwendung des Open-Source-microMS-Pakets zur Erkennung von Zellen und zur Führung des Massenspektrometers gewonnen. Dies erfordert, dass die optischen Bildpixelpositionen der Zielzellen in die physikalischen Koordinaten des Massenspektrometertisches übersetzt werden.

1. Öffnen Sie microMS und dezimieren Sie die bigTIFF-Mikroskopiebilder mit der Option Bildgruppe, da es sowohl Hellfeld- als auch Fluoreszenzkanäle gibt.
2. Identifizieren Sie mit dem Tool Blob-Optionen die optimalen Parameter, die für die Zielzellen ausgewählt werden sollen. Passen Sie die folgenden Parameter an: die maximale und minimale Blob-Größe, um auszuwählen, wie klein oder groß die Blobs gefunden werden sollen. die Schwellenwerteinstellung, die bestimmt, wie der Schwellenwert des Fluoreszenzkanals für die Blob-Erkennung festgelegt wird; und die Zirkularität, die bestimmt, wie kreisförmig die identifizierten Zellen sein müssen, um in Betracht gezogen zu werden. Für die hier vorgestellten Daten haben wir die folgenden Parameterwerte verwendet: maximale Zirkularität: keine; Min. Zirkularität: 0,6; Schwelle: 75; Mindestgröße: 20; Maximale Größe: Keine.
3. Verwenden Sie die Option Blob suchen, um Blobs zu suchen, und das Popup-Fenster, um die Blobliste unter einem gewünschten Namen zu speichern.
4. Verwenden Sie das Werkzeug Entfernungsfilter, um einen bestimmten Abstand auszuwählen, der für jede Zelle voneinander entfernt sein muss (für diese Daten haben wir mit Hilfe der 5-fachen Fluoreszenzmikroskopie einen Entfernungsfilter von 35 Pixeln verwendet). Dadurch soll sichergestellt werden, dass die Zellen weit genug voneinander entfernt sind, um eine Einzelzellanalyse durchzuführen. Diese Zahl wird in Pixeleinheiten angegeben, also kennen Sie die Umrechnung von Pixel in μm für das Mikroskop, um die ideale Zahl zu bestimmen. Verwenden Sie die Größe des Lasersondendurchmessers plus ca. 20-30 μm, um Fehler bei der Registrierung zu berücksichtigen.
5. Legen Sie die Objektträger mit dem MTP Slide Adapter II in das Gerät ein. Kehren Sie mit microMS zum Computer zurück und greifen Sie mit einer Remote-Desktop-Anwendung auf den Massenspektrometer-Computer zu.
6. Wenn das Instrument zum ersten Mal verwendet wird, überprüfen Sie die X-Y-Position des Instruments. Gehen Sie dazu zu Tools und Instrumenteneinstellungen. Das Popup-Fenster zeigt einen Satz von Koordinaten mit ihren X- und Y-Positionen an. Wählen Sie jeden dieser spezifischen Punkte auf der Schiebeadapter-II-Geometrie am Gerät aus und aktualisieren Sie die X- und Y-Positionen im microMS-Fenster.
7. Navigieren Sie mit der Kamera und den Tischsteuerungen des Massenspektrometers zu einer leicht erkennbaren Stelle auf dem Objektträger und kopieren Sie die Koordinaten des Geräts. Suchen Sie in microMS die entsprechende Position im Mikroskopbild, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf diese Position und geben Sie die Koordinaten in die Textposition des Popup-Fensters ein. Runden Sie alle Koordinaten auf die nächste ganze Zahl, und trennen Sie die X- und Y-Koordinaten durch Leerzeichen (z. B. 39595 -23232).
8. Wiederholen Sie Schritt 5.7. um mindestens 12 Passermarken auf der gesamten Folie zu registrieren. Nachdem drei Registrierungspunkte hinzugefügt wurden, färbt sich einer der Kreise rot, was darauf hinweist, dass er die am weitesten von der Registrierung abweichende Position ist. Löschen Sie in diesem Fall den aktuellen Registrierungspunkt mit Umschalt + Rechtsklick, und versuchen Sie es erneut.
9. Wechseln Sie unter Datei zu Speichern und dann zu Registrierung, um die Registrierungsdatei (MSREG) zu speichern.
10. Wenn die Blobs auf der Folie angezeigt werden, speichern Sie die Datei mit der Instrumentenposition (.xeo), indem Sie zu Datei, dann zu Speichern und dann zu Instrumentenpositionen wechseln. Übertragen Sie diese .xeo-Datei mit Hilfe der Remote-Desktop-Software auf den Gerätecomputer.
11. Kopieren Sie den Text aus der benutzerdefinierten .xeo-Datei, die in die .xeo-Datei des MTP Slide Adapter II auf dem Instrument generiert wurde, und speichern Sie sie. Dadurch wird diese Geometriedatei mit den Positionen der Zellen aktualisiert.
12. Klicken Sie auf die Registerkarte Automatisierung und wählen Sie Neu..., um eine automatische Ausführung zu starten. Ziehen Sie über den angezeigten Probenbereich, um die Zellen auszuwählen, und klicken Sie mit der rechten Maustaste, um sie der Analyseliste hinzuzufügen. Speichern Sie den Automatisierungslauf und klicken Sie auf Automatischen Lauf starten , um die Erfassung zu starten. Die Länge des Laufs hängt von einer Vielzahl von Faktoren ab, darunter die Anzahl der Zellen, die Laserschüsse und die Laserfrequenz, aber im Allgemeinen können im MALDI-Modus (10 kHz Laserwiederholrate) etwa 5-10 Zellen analysiert werden, und 1-5 Zellen können im MALDI-2-Modus (1 kHz Laserwiederholrate) pro Sekunde analysiert werden.

6. Datenverarbeitung

HINWEIS: Bestehende kommerzielle Softwarepakete eignen sich nicht gut für die Analyse von Einzelzell-Massenspektrometriedaten mit hohem Durchsatz. Während einzelne Spektren visualisiert werden können, erfordert die Extraktion aussagekräftiger biologischer Erkenntnisse spezielle Werkzeuge. Um dieses Problem zu lösen, stellen wir frei verfügbare Software zur Verfügung, die die Analyse von Einzelzell-MALDI-2-MS-Daten ermöglicht. Unser aktualisierter Workflow erleichtert die direkte Konvertierung von Einzelzelldaten in das Open-Source-imzML-Format²⁷ und ermöglicht so die Kompatibilität mit SCiLS MVS und anderer Anbietersoftware. Für eine erweiterte Datenanalyse enthält das vollständige Skript auch Funktionen für Lipidannotation, Clustering und andere Visualisierungswerkzeuge, die von Matplotlib (Version 3.7.3) aktiviert werden. Das Parsen und Lesen der Rohdaten wird durch die pyTDFSDK-Bibliothek erleichtert, eine Reihe von Funktionen, die im TIMSCONVERT-Workflow²⁸ enthalten sind.

1. Initialisieren Sie die benutzerdefinierte Python-Bibliothek SC_MALDI2_Analysis, indem Sie die in der Zusatzdatei 1 bereitgestellte Datei in denselben Arbeitspfad wie Jupyter Notebook kopieren und dann UMSCHALT+EINGABETASTE auf der Tastatur in der ersten Codezelle drücken. Dies ermöglicht es uns, diese Funktionen später aufzurufen und zur Verarbeitung der Daten zu verwenden.
2. Kopieren Sie den Pfad zu den gesammelten Daten (Bruker .d-Dateien). Es wird empfohlen, die Ordner und Namen der einzelnen Dateien beschreibend zu benennen, damit wir diese Dateipfade später analysieren können, um Metadaten für jedes Beispiel zu erstellen. Führen Sie das Importieren der Bruker-.d-Dateien aus, und speichern Sie es in einer Listencodezelle. Dadurch wird die Gesamtzahl der geladenen .d-Dateien ausgegeben.
3. Führen Sie die Codezelle mit dem Titel Verarbeiten der Rohdaten und Speichern in imzML aus. Dadurch wird jede bereitgestellte Bruker-.d-Datei gelesen, ein Peak-Picking für die Daten durchgeführt und dann 20 ppm Daten um jeden Peak herum in einer .imzML-Datei gespeichert, die in die .d-Datei geschrieben wird.
   1. Um die gespeicherten Daten zu finden, öffnen Sie den Speicherort der ersten .d-Datei und die imzML und andere Metadaten werden in diesem Pfad gespeichert. Zu diesem Zeitpunkt kann die gespeicherte imzML-Datei in Herstellersoftware, wie z. B. SCiLS Lab MVS, importiert werden. Für eine erweiterte Datenanalyse fahren Sie mit dem Skript fort.
4. Laden Sie die gespeicherten imzML-Daten, indem Sie den Befehl Laden in der zuvor gespeicherten imzML-Dateicodezelle ausführen. Dadurch werden die gespeicherten Daten in die variablen Daten geladen.
5. Führen Sie die Zelle Binning der Daten und Speichern der Data Matrix aus, um alle Daten entlang einer gemeinsamen m/z-Achse zu sortieren, Features zu entfernen, die in geringer Häufigkeit (<0,1 %) vorhanden sind, und Werte zu entfernen, die kleiner als Rauschen sind (100 relative Intensität). Diese Funktion ordnet die Daten dann neu, indem sie jeden m/z-Spitzenwert innerhalb jedes Abschnitts mittelt. Die resultierende Datenmatrix wird als datacube_array gespeichert, die der Matrix zugeordneten m/z-Klassen werden als valid_mz_bins gespeichert, und die Zählung jeder Klasse wird als Anzahl gespeichert.
6. Um die Daten mit Anmerkungen zu versehen, führen Sie die Annotationszelle Peaks für LIPID MAPS exportieren aus. Dadurch werden alle m/z-Peaks innerhalb Ihrer Datenmatrix in Ihre Zwischenablage kopiert. Fügen Sie diese in eine leere Textdatei ein und speichern Sie sie, um sie auf LIPID MAPS hochzuladen.
7. Öffnen Sie lipidmaps.org, und wählen Sie dann MS Data Bulk Search und Search LMSD aus, um nach biologisch relevanten Lipidspezies zu suchen. Laden Sie die Peakliste hoch, indem Sie die Textdatei auswählen und die entsprechenden Addukte auswählen (z. B. [M+H]+, [M+Na]⁺ und [M+K]⁺). Wählen Sie die für Ihr Massenspektrometer geeignete Massentoleranz aus (wir haben +/- 0,01 m/z gewählt), wählen Sie alle gewünschten Lipidklassen aus und klicken Sie auf Suchen. Laden Sie die TSV-Datei herunter.
8. Laden Sie die Spektrenmetadaten, indem Sie das Laden in den einzelnen Zellpfaden für Metadatenzellen ausführen. Ändern Sie hier den geteilten Code basierend auf den Dateipfadstrukturen.
9. Verarbeiten Sie die Daten vor, indem Sie die Zelle Datenvorverarbeitung und Lipidannotation ausführen. Dabei wird die lipidMAPS-TSV-Datei verwendet, um den Datensatz mit einem Fehler von 10 ppm zu annotieren, ungerade Lipide aus den lipidMAPS-Ergebnissen zu entfernen, die verbleibenden Daten zu normalisieren und Merkmale oder Zellen zu entfernen, die einen bestimmten Schwellenwert nicht überschreiten. Dadurch wird der neu verarbeitete Datensatz als Daten2 und die aktualisierten Spektrenmetadaten als updated_cell_types gespeichert.
10. Die Analyse der Daten erfolgt durch scanpy. Führen Sie die Zelle UMAP- und Clustering-Analyse für einzelne Zellen aus, um relevante Daten auszuwählen (hier haben wir nur MALDI-2-, M2-Daten ausgewählt), skalieren Sie das Dataset und laden Sie es in ein scanpy AnnData-Objekt, um die Analyse zu vereinfachen.
    HINWEIS: Hier wurde Leiden Clustering and Dimensionality Reduction (UMAP) für den Datensatz durchgeführt, sowohl die ursprünglichen Datenklassen als auch die Cluster auf dem UMAP wurden visualisiert, und einige der statistisch signifikantesten Merkmale unter den Clustern wurden mit der Funktion rank_genes_groups_dotplot von scanpy zusammengefasst.

Ergebnisse

Abbildung 1 gibt einen Überblick über den Arbeitsablauf für die fluoreszenzgesteuerte einzellige MALDI-2-MS. Zunächst wird das Gewebe, das aus den Zielregionen des Gehirns präpariert wird (Abbildung 1A), in einzelne Zellen dissoziiert und auf leitfähigen, ITO-beschichteten Mikroskopieobjektträgern abgelagert (Abbildung 1B). Die Positionen der Zellen werden durch Fluoreszenzbildgebung des gesamten Objektträgers (...

Diskussion

Die bildgesteuerte Einzelzell-MALDI-MS mit hohem Durchsatz ist ein wertvolles Werkzeug für das Verständnis der chemischen Heterogenität auf Einzelzellebene. Die Zugabe von laserinduzierter Nachionisation (MALDI-2) ermöglicht eine tiefere Analytabdeckung, was für massen- und volumenbegrenzte Proben, wie z. B. isolierte Säugetierzellen, von entscheidender Bedeutung ist.

Während die überwiegende Mehrheit der veröffentlichten einzelligen Lipid- und Metaboliten-MS-...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
2',5'-Dihydroxyacetophenon	Sigma Aldrich	D107603	einer Reinheit von 97 %
	Sigma Aldrich	238074	ACS-Reagenz, ≥ 97%
Axio M2 Imager	Zeiss	N/A	N/A
Biopsiestanze, 2 mm	Fisher Scientific	12-460-399	integra miltex Standard Biopsiestanze, 2mm
Calciumchlorid	Sigma Aldrich	C4901	wasserfrei, Pulver > 97%
Eppendorf Zentrifuge	Sigma Aldrich	EP5405000441	Zentrifuge 5425 mit Rotor FA-24x2
Gentamicin	Sigma Aldrich	G1272	Flüssigkeit, BioReagent
Glasätzstift	Sigma Aldrich	Z225568	Karbidzeit, Packung mit 1
Glycerin	Sigma Aldrich	G7893	ACS Reagenz, ≥ 99,5%
HEPES Puffer	Sigma Aldrich	H3375	&ge≥ 99,5 % (Titration)
Hoechst 33258 Lösung	Sigma Aldrich	94403	1 mg/mL in H2O, ≥ 98,0% (HPLC)
Inline-HEPA-Filter	Sigma Aldrich	WHA67225001	VACU-GUARD 60 mm Scheibe, 0,45 PFTE Gehäuse
ITO-beschichtete Objektträger für die Mikroskopie	Delta Technologies	CG-90IN-S115	70-100Ω Beständigkeit
Magnesiumchlorid	Sigma Aldrich	M8266	wasserfrei, ≥ 98%
Magnesiumsulfat	Sigma Aldrich	208094	wasserfrei, ≥ 97%
Mikrozentrifugenröhrchen	Sigma Aldrich	HS4323K	Röhrchenkapazität 1,5 ml, Packung mit 500
Papain Dissoziationssystem	Worthington Biochemical	LK003150	einer Packung, 5 Einwegfläschchen
Penicillin-Streptomycin	Sigma Aldrich	P4458	flüssig, BioReagenz
Kaliumchlorid	Sigma Aldrich	529552	Molekularbiologisches
Kaliumphosphat monobasisch	Sigma Aldrich	P5379	Reagenz Plus
Natriumbiocarbonat	Sigma Aldrich	S6014	ACS-Reagenz, ≥ 99,7%
Natriumchlorid	Sigma Aldrich	S9888	ACS Reagenz, ≥ 99%
Natriumhydroxid	Sigma Aldrich	221465	ACS-Reagenz, ≥ 97%, Pellets
Natriumphosphat zweibasig	Sigma Aldrich	S9763	ACS Reagenz, ≥ 99%
Sublimat	HTX	N/A	N/A
timsTOF FleX MALDI-2	Bruker	N/A	microGRID fähiger
Vakuumschlauch	Thermo Scientific	8701-0080	Nalgene PVC-Schläuche ohne Phthalate