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Methodenartikel

Umweltproben von photosynthetischen Mikroben und ihren Viren: Vom Feld ins Labor

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DOI:

10.3791/68379

⸱

3. Juli 2025

 , 
1Department of Molecular and Cell Biology, University of California, Merced, 2Quantitative Systems Biology Program, University of California, Merced

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir Methoden der Probenahme aus den euphotischen Zonen von Meeres- und Süßwasserökosystemen zur Isolierung von Cyanophagen (und ihren Wirten) und Post-Sampling-Prozesse, die einzelne Genotypen anreichern und die Dynamik der Virus-Wirt-Interaktion charakterisieren.

Zusammenfassung

Die Probenahme von photosynthetischen Mikroorganismen und ihren Viren in der Umwelt spielt eine entscheidende Rolle für das Verständnis der heutigen Biodiversität und Ökosystemdynamik im Meer und Süßwasser sowie für die Auswirkungen klimawandelbedingter Faktoren (z. B. steigende Temperaturen und Versauerung) auf die evolutionäre Entwicklung von Arten und die Zusammensetzung von Gemeinschaften. Leider unterstützt die Vielfalt der Virosphäre keinen einzigen universellen Probenahme- und experimentellen Arbeitsablauf. In der Tat hat jedes Virussystem einzigartige Eigenschaften, die Änderungen an den Standardprotokollen in der Virologie erfordern, um die Forschungsziele zu erreichen. Obwohl die Entdeckung und Charakterisierung von Viren Ansätze erfordert, die spezifisch für das Zielsystem sind, sind die Forschungsziele für alle Viren ähnlich: Isolierung des Virus; Bestimmen Sie den Hostbereich; produktive Infektion bestätigen; und charakterisieren Sie das Virus, den Wirt und die Virus-Wirt-Dynamik. Robuste Beschreibungen von Virus-Wirt-Systemen bestehen nur aus der Aufklärung von Morphologie, Physiologie, Biochemie und Omics-Profilen. Weitere Informationen können durch Manipulation des Systems durch Ändern von Faktoren wie Multiplizität der Infektionen, Temperatur, pH-Wert, Wirt-Schalter, gerichtete Evolution oder durch Anwendung von Medikamenten zur Beobachtung der Virus-Wirt-Systemreaktion erhalten werden. Unser Labor untersucht Viren in verschiedenen Lebensbereichen (Archaeen, Bakterien und Eukarya). In diesem Bericht beschreiben wir Methoden zur Probenahme photosynthetischer Mikroben aus der euphotischen Zone von Süßwasser- und Meeresumgebungen mit Schwerpunkt auf der Isolierung von Bakteriophagen (d.h. Cyanophagen) von Cyanobakterien. Cyanobakterien sind Schlüsselarten, die für die Primärproduktion und den Nährstoffkreislauf in diesen aquatischen Ökosystemen von entscheidender Bedeutung sind. Der beschriebene Arbeitsablauf reicht von der Probenahme von Gewässern in verschiedenen Tiefen bis hin zur Charakterisierung von Virus-Wirt-Systemmerkmalen unter Verwendung von Flüssig- und Feststoffkulturen, fortschrittlichen molekularen/genetischen Methoden und analytischen Ansätzen. Die beschriebenen Methoden sind anpassbar an die Entdeckung von Bakteriophagen und Viren in Virus-Wirt-Systemen in verschiedenen Lebensbereichen.

Einleitung

Die Charakterisierung der Infektionsdynamik und der evolutionären Beziehungen von Cyanophagen und ihren Wirten ist der Schlüssel zum Verständnis des aktuellen und zukünftigen Zustands von Meeres- und Süßwasserökosystemen. Fortschrittliche Hochdurchsatz-Sequenzierungstechniken und moderne Analysemethoden ermöglichen eine schnelle Sequenzierung von Cyanophagengenomen (und Wirtsgenomen), um die Virus-Wirt-Beziehungen zu untersuchen 1,2. Die Arbeitsabläufe beginnen jedoch mit der Probenahme in der Umgebung, um Viren und ihre Wirte zu isolieren und zu identifizieren 3,4,5. Aufgrund der Vielfalt der Virosphäre gibt es kein einheitliches Protokoll für die Probenahme und Charakterisierung aller Viren und Bakteriophagen. In der Tat hat jedes Virus-Wirt-System seine einzigartigen Eigenschaften. Nichtsdestotrotz sind die grundlegenden Ziele unabhängig vom untersuchten Virussystem ähnlich: Isolierung des Virus; Bestimmen Sie den Hostbereich; eine produktive Infektion in einem oder mehreren Wirten nachweisen; Charakterisierung der Virus-, Wirt- und Virus-Wirt-Infektionsdynamik mit qualitativen und quantitativen Ansätzen. Ein fortgeschrittenes Verständnis des Virensystems kann durch Störung des Systems überprüft werden. Die Änderung von Parametern wie der Multiplizität der Infektion (MOI)6, der Temperatur, dem pH-Wert, dem Wirtsstamm oder durch die Anwendung von Medikamenten, um zu bestimmen, wie das System reagiert, liefert zusätzliche Einblicke in die Art der Virus-Wirt-Dynamik. Fortgeschrittenere Manipulationen, wie z. B. die gerichtete Evolution, können zusätzliche Informationen über den möglichen evolutionären Verlauf des Systems liefern und darüber, wie sich koevolutionäre Endpunkte auf die größere mikrobielle Gemeinschaft und das Ökosystem auswirken können.

In dieser Studie stellen wir ein (aber leicht anpassbares) Modellprotokoll für die Umweltprobenahme von photosynthetischen Mikroben wie Cyanobakterien und Mikroalgen vor, die eine entscheidende Rolle im Nährstoffkreislauf und in der Primärproduktion in Meeres-, Süßwasser- und anderen aquatischen Ökosystemen spielen 7,8,9,10,11 . Der Arbeitsablauf konzentriert sich auf die Isolierung von Wirten aus den euphotischen Zonen von Meeres- und Süßwasserumgebungen und deren Viren und Bakteriophagen, die in diesen Ökosystemen eine wichtige Rolle spielen12. Sowohl Viren als auch Bakteriophagen beeinflussen sowohl eukaryotische als auch prokaryotische Populationsstrukturen und beeinflussen die Diversität und Produktivität von Ökosystemen stark13. Daher besteht das Ziel darin, ein Sampling-Protokoll und einen Post-Sampling-Workflow bereitzustellen, der die Anreicherung von Hosts und Viren für die Untersuchung folgender Faktoren erleichtert: Einzelvirus/Einzelhost, Multivirus/Einzelhost, Einzelvirus/Multihost und Multivirus/Multihost-Dynamik; -omics-Substrate, die der Dynamik von Virus-Wirt-Infektionen zugrunde liegen; und potenzielle koevolutionäre Verläufe und evolutionäre Endpunkte, die sich auf das untersuchte Virus-Wirt-System und das größere Ökosystem auswirken, aus dem die Viren und der Wirt extrahiert wurden.

Konkret beschreiben wir einen Arbeitsablauf für die Probenahme in der Umgebung, die Vorverarbeitung von Proben vor Ort (d.h. bevor sie das Labor erreichen), die Nachbearbeitung für die Isolierung von Bakteriophagen (und Viren), die Anreicherung von Mischkulturen von Mikroorganismen zur Identifizierung freizügiger Wirte, die Entwicklung von Einzelkolonie-Isolaten mutmaßlicher Wirte und die Bestätigung einer Bona-fide Virus-Wirt-Beziehung (d. h. produktive Infektion) und Charakterisierung grundlegender Infektionseigenschaften (z. B. Virulenz). Infektionsassays ermöglichen nicht nur die Berechnung der relativen Virulenz (VR)14 und der Wirtsresilienz (RR)15, sondern umfassen auch Schritte zur Extraktion von Kulturproben zu wichtigen Zeitpunkten für die Untersuchung von -omics-Substraten, die der beobachteten Physiologie (d. h. der Virus-Wirt-Interaktionsdynamik) zugrunde liegen. Schließlich diskutieren wir potenzielle Fallstricke, Fehlerbehebung und Lösungen sowie Möglichkeiten, ausgewählte Schritte zu ändern, um bestimmte Taxa ins Visier zu nehmen. Der Arbeitsablauf ist auf Cyanophagen-Cyanobakterien, Phycodnavirus-Mikroalgen und thermophile Fusellovirus-Archaeen-Systemeanwendbar 16,17 und demonstriert seinen Nutzen bei der Charakterisierung von Viren in allen drei Lebensbereichen: Bakterien, Eukarya und Archaeen.

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Protokoll

1. Umweltprobenahme

HINWEIS: Dieses Protokoll beschreibt die Offshore-Probenahme auf photosynthetische Mikroben aus der euphotischen Zone innerhalb von 5 Meilen vor der Küste vor der Küste Südkaliforniens. Das Protokoll wurde jedoch an Proben aus Seen, zugefrorenen Seen oder geothermischen heißen Quellen angepasst (Abbildung 1).

  1. Umweltprobenahme vor der Küste Südkaliforniens
    HINWEIS: Ein 6 m langes Schiff mit tiefer V-Mittelkonsole (d. h. Boot) mit zwei 150-PS-Außenbordmotoren wurde mit Forschungsausrüstung beladen (Materialtabelle). Für die Probenahme in der euphotischen Zone wurden drei Standorte ausgewählt: (a) Standort 1: N 30° 15,436, W 117° 31,551; b) Standort 2: N 33° 12.521, W 117° 25.275; und c) Standort 3: N 32° 59.914, W 117° 17.058. An jedem Standort wurden mittags 20 l Wasserproben aus drei verschiedenen Tiefen entnommen: < 3 m (Oberflächenprobe), 6 m und 14 m.
    1. Montage der Transferpumpe: Bei Erreichen jedes Probenstandorts den Bootsanker ausfahren und die GPS-Koordinaten des Navigationssystems aufzeichnen. Montieren Sie das Probenahmesystem.
      1. Kurz gesagt, montieren Sie ein Ende eines blauen Flex-Plus-PVC-Schlauchs mit einem Innendurchmesser von 2,54 cm (50 Fuß) an ein 2,54 cm Saugsieb, um zu verhindern, dass große Ablagerungen in das Pumpensystem gelangen. Sichern Sie die Verbindung zwischen Sieb und Rohr mit Klebeband. Montieren Sie das gegenüberliegende Ende des Rohrs am Ansaugkrümmer der 1-PS-Transferpumpe aus Edelstahl.
      2. Befestigen Sie einen 10-Fuß-Abschnitt mit einem Durchmesser von 2,54 cm aus zusammenklappbarem Gummiflexschlauch am Auslass der Pumpe. Stecken Sie das Netzkabel der Transferpumpe in den gasbetriebenen 3800-W-Inverter-Generator. Nach dem Zusammenbau die Förderpumpe ansaugen und testen, ob das Pumpensystem betriebsbereit ist (Abbildung 1, obere Reihe).
    2. Beschweren des Transferrohrs: Befestigen Sie ein Ende eines 25 m langen Nylon-Marineseils mit einem Durchmesser von 1,25 cm an der Öse eines 14 kg schweren Pilzankers. Befestigen Sie das Seil alle 3 m mit Klebeband an dem blauen PVC-Schlauch, wobei das Saugsieb ca. 1 m über dem Anker angebracht ist, um zu verhindern, dass das Sieb im Sand stecken bleibt oder auf Felsen unter Wasser trifft. Verwenden Sie den Anker, um das Transferrohr (blaues PVC-Rohr) einzutauchen und zu vermeiden, dass starke Unterströmungen einen großen Winkel zwischen dem Boot und dem Rohr erzeugen, der zu ungenauen Probentiefen führen würde. Senken Sie die Anker-/Seil- und Rohrbaugruppe auf die Tiefe ab.
    3. Entnahme von Meerwasserproben: Sobald sich die Rohrspitze mit dem Sieb in der gewünschten Tiefe befindet, schalten Sie den Generator und die Pumpe ein. Entlüften Sie die Pumpe neu oder schütteln Sie den Transferschlauch, damit das Wasser aus der Tiefe zu pumpen beginnt. Sobald ein stetiger Wasserfluss aus der Tiefe übertragen wurde, lassen Sie 1-2 Rohrvolumen zurück in den Ozean, um sicherzustellen, dass Wasser aus der gewünschten Tiefe durch die Pumpe fließt. Sammeln Sie Wasserproben in 20-Liter-Wasserkrügen (Abbildung 1, obere Reihe, ganz rechts).
    4. Probentransport zur Feldstation: Füllen Sie 20-l-Wasserkrüge auf ca. 18 l, um den Gasaustausch (z. B. O2/CO2) zwischen den Wasserproben und dem Kopfraum während des Transports zu ermöglichen. Notieren Sie vor dem Verschließen von Wasserkrügen Temperatur, pH-Wert und Salzgehalt von Rohwasserproben. Verschließen Sie dann die Wasserkrüge, stellen Sie sie auf ein Eisbett im Unterdecklager und decken Sie sie mit einem leichten Tuch ab, um eine übermäßige Sonneneinstrahlung und hohe Temperaturen zu vermeiden.
  2. Vorverarbeitung von Wasserproben vor Ort
    HINWEIS: Bei der Ankunft in einer Einrichtung an Land (z. B. Hotelzimmer/Konferenzraum/Feldstation) wurde eine Reihe von Vorverarbeitungsschritten durchgeführt, um den mikrobiellen Gehalt in den Wasserproben zu schützen und verschiedene Fraktionen der Meerwasserproben basierend auf der Partikelgröße zu trennen.
    1. Montage des Filtersystems: Befestigen Sie ein Ende eines 1 m langen Stücks durchsichtigen Vinylschlauchs mit einem Innendurchmesser von 9,525 mm am Schlauchtülleneinlass am Vakuumanschluss einer tragbaren Luftmembran-Vakuumpumpe. Befestigen Sie das gegenüberliegende Ende desselben Schlauchs an einer 1,0-l-Filtersaugerbaugruppe mit 0,45 μm. Verwenden Sie sowohl 0,45 μm als auch 0,22 μm Filterbecher nacheinander, um verschiedene Fraktionen der Meerwasserprobe zu trennen, wie unten beschrieben.
    2. Um das System auf Undichtigkeiten oder defekte/zerrissene Filter zu testen, filtern Sie 0,25 l Meerwasser durch den 0,45 μm Polyethersulfon (PES)-Membranfilterbecher. Ein undichtes System zeigt einen Sog zwischen dem Filter und dem Gitter an, sobald die Meerwasserprobe vollständig durchgefiltert ist.
    3. Filtration durch 0,45 μm PES-Membranfilterbecher: Um photosynthetische Mikroorganismen (z. B. Mikroalgen und Cyanobakterien) zu isolieren, besteht das Ziel darin, 2 l Meerwasserprobe durch den 0,45 μm PES-Membranfilterbecher mit zwei 1 l Filterbechern (oder vier 500 mL Filterbechern) zu filtrieren. Alle Filtratflaschen sind mit der Filtergröße, der Tiefe, aus der die Probe entnommen wurde, dem Datum und der Bezeichnung der Probenahmestelle entsprechend zu beschriften. Zum Schluss schrauben Sie den Deckel auf und decken Sie Flaschen mit 0,45 μm Filtrat mit einem halbtransparenten Tuch oder einer Hülle ab, um übermäßige Sonneneinstrahlung zu vermeiden.
      HINWEIS: Lassen Sie den Filter im Filterbecher nicht trocken laufen. Halten Sie immer eine dünne Schicht Flüssigkeit auf dem Filter. Der Filter sammelt biologische Ablagerungen (z. B. Zellen) an. Wenn der Filter durch Schmutz verstopft ist, schrauben Sie die Becherbaugruppe vorsichtig ab und legen Sie den gebrauchten Filterbecher beiseite, aber entsorgen Sie den verstopften Becher nicht. Setzen Sie einen neuen 0,45-μm-Filter ein und fahren Sie fort.
    4. Filtration durch 0,22 μm PES-Membranfilterbecher: Um große eukaryotische Viren zu isolieren, verwenden Sie 1 l des 0,45 μm Filtrats aus dem vorherigen Schritt (Schritt 1.2.3) und filtrieren Sie durch einen 0,22 μm Filterbecher. Beschriften Sie die Ultrafiltratflasche entsprechend mit der Filtergröße, der Tiefe, aus der die Probe entnommen wurde, dem Datum und der Bezeichnung der Probenahmestelle. Zum Schluss schrauben Sie den Deckel auf und decken die Flasche mit 0,22 μm Ultrafiltrat (aus der Filtration des 0,45 μm Filtrats) ab.
      HINWEIS: Lassen Sie den Filter im Filterbecher nicht trocken laufen. Halten Sie immer eine dünne Schicht Flüssigkeit auf dem Filter. Der Filter sammelt biologische Ablagerungen an, die biologische Proben enthalten. Wenn der Filter verstopft ist, schrauben Sie die Becherbaugruppe ab und legen Sie den gebrauchten Filterbecher beiseite. Entsorgen Sie den verstopften Becher nicht. Setzen Sie einen neuen 0,22-μm-Filter ein und fahren Sie fort.
    5. Konzentrat Biomasse aus 0,45 μm Filter: Gießen Sie 48 mL Filtrat (aus 0,22 μm Filtration) in jeweils zwei sterile 50 mL konische Zentrifugenröhrchen aus Polypropylen. Schneiden Sie mit einem sterilen Skalpell gleichmäßig entlang der äußersten Kante des verbrauchten 0,45-μm-Filters innerhalb der Becherbaugruppe. Verwenden Sie eine sterile Pinzette, um den mit Biomasse beladenen und feuchten Filter zu entfernen. Schneiden Sie es in zwei Hälften. Rollen Sie die Hälfte des Filterpapiers zu einem konischen 50-ml-Röhrchen auf. Wiederholen Sie den Vorgang mit der zweiten Hälfte der Filtermembran und dem zweiten Schlauch. Röhrchenkappen aufschrauben und mit Klarsichtfolie sichern. Beschriften Sie die Tube.
    6. Konzentrieren Sie große Virusbiomasse aus einem 0,22-μm-Filter: Gießen Sie je 14 ml Ultrafiltrat in zwei sterile konische 15-ml-Zentrifugenröhrchen aus Polypropylen. Schneiden Sie mit einem sterilen Skalpell entlang des äußeren Randes des verwendeten 0,22-μm-Filters innerhalb der Becherbaugruppe. Verwenden Sie eine sterile Pinzette, um den mit Biomasse beladenen und feuchten Filter zu entfernen. Schneiden Sie es in zwei Hälften. Rollen Sie es auf und führen Sie eine Hälfte des Filterpapiers in eines der konischen 15-ml-Röhrchen ein. Wiederholen Sie dies für die zweite Hälfte der Filtermembran und das zweite konische 15-ml-Röhrchen. Tubenkappen aufschrauben und mit Klarsichtfolie (z.B. Parafilm) fixieren. Beschriften Sie jedes Röhrchen mit der Filtergröße (z. B. 0,22 μm), der Stelle, der Tiefe und dem Datum.
    7. Bewahren Sie das verbleibende 0,45-μm-Filtrat sowie das verbleibende 0,22-μm-Filtrat für den Rückversand an das Labor auf. Wiederholen Sie den gesamten Filtrationsprozess (Schritte 1.2.2 bis 1.2.6) für jede Tiefe und jeden Probenahmeort.
      HINWEIS: Ultrafiltrat wird im Labor als Medienbasis (mit nativen Mineralien und anderen Nährstoffen) verwendet.
      Rohprobenmikroskopie (optional): Nehmen Sie ein konisches 50-ml-Röhrchen mit einem 0,45-μm-Filter darin und schütteln Sie es vorsichtig. Verwenden Sie eine Plastikpipette (oder Pipette), um 30-50 ml Meerwasser aus dem konischen 50-ml-Röhrchen zu entnehmen, und bereiten Sie einen Glasobjektträger mit der Probe und einem Deckglas vor. Betrachten Sie mit einem Feldmikroskop und einem Computer den Inhalt des Objektträgers, um die Eigenschaften der beobachteten Mikroorganismen zu erkennen und aufzuzeichnen (Abbildung 2D).

2. Probenverarbeitung zur Konzentration von Viren/Bakteriophagen und zur Anreicherung von Wirten

HINWEIS: Dieses Protokoll beschreibt die ersten Verarbeitungsschritte, die erforderlich sind, sobald die Proben vom Feldstandort aus das Labor erreichen. Der Transport mit dem Flugzeug und das Straßenfahrzeug können unterschiedliche Überlegungen erfordern. Die Lebensfähigkeit der Proben in der Umgebung nimmt bei abrupten Änderungen der Temperatur, des pH-Werts, des Salzgehalts, der Lichteinwirkung oder -mangel, der Konzentration gelöster Gase (z. B. CO2 und O2) und der Zeit zwischen der Extraktion in der Umgebung und der Laborverarbeitung ab.

  1. Spin-Konzentration und Lagerung von Viren und Bakteriophagen
    HINWEIS: Sobald die Proben im Labor eintreffen, kann die Verarbeitung innerhalb von 8 Stunden nach der Ankunft den Verlust lebensfähiger Mikroben aufgrund der Zeitspanne zwischen der Entnahme an der Probenstelle und der Ankunft im Labor minimieren. Die nachstehenden Schritte liefern Aliquots von konzentrierter Bakteriophagen- (oder Virus-)Suspension (d. h. Arbeitsbestände) für die Langzeitlagerung und -verwendung.
    1. Konzentrierendes Ultrafiltrat: Für jede Probenahmetiefe und -stelle wird das verbleibende ~800 mL Ultrafiltrat an das Labor gesendet. Verwenden Sie einen 3K NMWL 15 mL Zentrifugal-Spin-Filter und zentrifugieren Sie 10-20 Minuten lang bei 6000 x g , um 50-100 mL Ultrafiltrat auf 1,0-1,5 mL zu konzentrieren. Bereiten Sie Gitter für die TEM-Bildgebung vor, wie zuvorbeschrieben 16 , um zu beurteilen, ob das resultierende konzentrierte Ultrafiltrat virusähnliche Partikel (VLPs) enthält. Wenn VLPs nachgewiesen werden, teilen Sie das Konzentrat in 100 mL Aliquots auf. Bei 4 °C (bzw. -20 °C für längerfristige Lagerung) lagern.
    2. Konzentrieren von Partikeln aus dem 0,22-μm-Filter: Verwenden Sie ein steriles Skalpell, um Schmutz von den 0,22-μm-Filtern vorsichtig in das Ultrafiltrat in den 50-ml-Röhrchen zu kratzen, in denen die Filter transportiert wurden. Verwenden Sie eine 10K NMWL-Spin-Konzentrator-Becher-Baugruppe, um 50-200 mL Suspension auf ein Volumen von ~3 mL Probenretentat zu konzentrieren. Bereiten Sie Gitter für die TEM-Bildgebung vor, wie zuvorbeschrieben 16 , um zu bestimmen, ob VLPs aus dem 0,45-μm-Filtrat vorhanden sind, die möglicherweise auf der Oberfläche des 0,22-μm-Filters eingefangen wurden. Wenn VLPs nachgewiesen werden, teilen Sie das Konzentrat in 100 mL Aliquots und lagern Sie es bei 4 °C (oder -20 °C für eine längerfristige Lagerung).
  2. Spin-konzentrierendes und anreicherndes Retentat aus 0,45-μm-Filtern.
    HINWEIS: Mischkulturen von Mikroorganismen können Wirte für die oben isolierten Viren und Bakteriophagen enthalten (Schritte 2.1.1 und 2.1.2). Die Spinkonzentration und die Anreicherung von Mischkulturen liefern Arbeitsbestände, aus denen Reinkulturen mutmaßlicher Wirte entwickelt werden können (siehe Schritt 3).
    1. Konzentrationsgemischte Suspensionen: Für jede Probenahmetiefe und -stelle werden ~100 ml Ultrafiltrat mit einem mit Zelltrümmern beladenen 0,45-μm-Filter an das Labor zurückgeschickt. Verwenden Sie ein steriles Skalpell, um Ablagerungen aus dem 0,45-μm-Filter in das Ultrafiltrat in den 50-ml-Röhrchen zu kratzen, in denen sie transportiert wurden. Zentrifugieren Sie die Probe bei 2000 x g für 10 min, 4 °C, um die Biomasse zu pelletieren. Das Pellet wird in 5 mL 1:8 verdünntes BG-11-Medium18 durch sanftes Verreiben mit einer Pipette resuspendiert.
    2. Anreicherung des Retentats aus einem 0,45-μm-Filter: Bereiten Sie sechs parallele Kulturen in 250-ml-Erlenmeyerkolben mit Blende her, die Folgendes enthalten: 50 mL BG-11-Medium (3 Kolben) und eine Mischung aus Ultrafiltrat von der Probenstelle (40 mL) plus BG-11 (10 mL). Jeder Kolben wird mit 0,5 ml Zellkonzentrat beimpft (aus Schritt 2.2.1). Inkubieren Sie unter leichtem Schütteln in einem Photobioreaktor für mindestens 7-10 Tage bei 25 °C mit einer Lichtintensität von 20-40 mmol Photonen/m2/s.19 Sobald das Wachstum robust ist (z. B. OD730 nm = 0,8), zentrifugieren Sie bei 2000 x g, 10 min, 4 °C zum Pelletieren. Resuspendieren Sie das Pellet in 10 mL 1:8 verdünntem BG-11-Medium durch sanftes Verreiben mit einer Pipette. Bereiten Sie 10-20 Aliquots mit 0,5 ml Zellsuspension in Kryoröhrchen mit Schraubverschluss für die Lagerung bei -80 °C vor.

3. Entwicklung von Reinkulturen mikrobieller Wirte mit einem Genotyp

HINWEIS: Dieses Protokoll beschreibt Verfahren zur Isolierung und Reinigung mutmaßlicher mikrobieller Wirte für Viren und Bakteriophagen aus Mischkulturen, die aus gesammelten Umweltproben verarbeitet wurden. Mehrere Wirtsphänotypen können isoliert und gereinigt werden, wodurch die Wahrscheinlichkeit erhöht wird, dass permissive Wirte für die in gelagerten Wasserproben vorhandenen Viren und Bakteriophagen nachgewiesen werden (Schritte 2.1.1-2.1.2).

  1. Streifen von Platten und Auswahl von Einzelkolonie-Isolaten
    HINWEIS: Aus Mischkulturen werden mehrere Reinkulturen mit einem Genotyp entwickelt, um die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, einen anfälligen und freizügigen Wirt von Viren oder Bakteriophagen zu isolieren, die während der Umweltprobenahme gefangen wurden, und um das Wirtsspektrum von Viren und Bakteriophagen zu untersuchen.
    1. Entwickeln Sie Einzelkolonieisolate (SCI) wie unten beschrieben.
      1. BG-11 Agarplattenvorbereiten 20. Ein Aliquot der gemischten Suspension, die bei -80 °C gelagert wurde (aus Schritt 2.2.2), wird auf Eis aufgetaut. Es wird eine sterile Schlaufe verwendet, um Zellkonzentrate unter Verwendung von Standardtechniken20 auf die BG-11-Agarplatten zu streifen. Inkubieren Sie gestreifte Platten in einem Photobioreaktor für ~10 Tage bei 25 °C mit einer Lichtintensität von 20-40 mmol Photon/m2/s oder bis Kolonien auf den Platten erscheinen.
      2. Bereiten Sie ~10 Samenkulturen in 20-ml-Kulturröhrchen mit 5 mL BG-11-Medium und/oder 5 mL einer Mischung aus Ultrafiltrat von der Probenstelle und BG-11 vor. Nehmen Sie mit einem sterilen Zahnstocher einen Querschnittlähmer von der Platte und impfen Sie jedes Röhrchen einzeln, indem Sie einen Zahnstocher in jedes Röhrchen fallen lassen. Inkubieren Sie unter leichtem Schütteln in einem Photobioreaktor für mindestens 10-15 Tage bei 25 °C mit einer Lichtintensität von 20-40 mmol Photon/m2/s oder bis ein Wachstum festgestellt wird (z. B. OD730 nm = 0,4-0,8).
        HINWEIS: Wenn auf der ersten Streifenplatte mehrere Kolonie-Phänotypen (z. B. Morphologie, Transparenz, Farbe) vorhanden sind, wählen Sie einzelne Kolonien für die Inokulation aus einer Reihe von Kolonie-Phänotypen aus.
    2. Entwicklung von Reinkulturen von Arbeitstieren: Sobald ein positives Wachstum der Samenkultur festgestellt wird, wiederholen Sie die Streifenverfahren, bis nur noch ein einziger Kolonie-Phänotyp auf den Platten erscheint (Abbildung 3B und Abbildung 4B). Skalieren Sie die Saatgutkulturen auf 50-ml-Kulturen in 250-ml-Kolben mit Blende (Abbildungen 3C und Abbildung 4C), wie oben beschrieben (Schritt 2.2.2). Bereiten Sie ~20 Aliquots mit 0,5 ml SCI-Zellsuspension vor und pipettieren Sie sie in 1,0 ml-Kryoröhrchen mit Schraubverschluss für die Lagerung bei -80 °C.
      HINWEIS: Für die Entwicklung von Reinkulturen von Cyanobakterien können Antibiotika oder Antimykotika erforderlich sein (z. B. Imipenem, Cycloheximid), um die Kontamination der Kultur zu verringern21. Das Beschichtungsverfahren ist ein Dreh- und Angelpunkt, an dem die Isolierung von Cyanobakterien oder Mikroalgen angestrebt werden kann. Die Lichtparameter während der Inkubation können in Bezug auf die Lichtintensität oder die Ein-Aus-Zyklen variieren.
  2. Charakterisierung des Einzelgenotyps und Lagerung von Arbeitsbeständen
    HINWEIS: Um die Isolierung und Anreicherung einzelner mutmaßlicher Wirtsgenotypen zu bestätigen, werden Reinkulturen morphologisch und genetisch charakterisiert.
    1. Morphologische Charakterisierung: Sobald die Zyklen der Flüssigkultur und der Feststoffplatte zu einem einzigen Zellphänotyp führen, charakterisieren Sie die mikrobiellen Morphotypen sowohl durch Lichtmikroskopie (Abbildung 2A-C) als, falls verfügbar, durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) und/oder Rasterelektronenmikroskopie (REM; Abbildung 3A und Abbildung 4A). Unter Lichtmikroskopie (z. B. 60-100-fache Vergrößerung) kann eine grüne, hellbraune oder transparente einzellige, koloniale, filamentöse, spiralförmige, verzweigte oder trichomzelluläre Organisation beobachtet werden. Dies deutet auf eine mögliche taxonomische Zuordnung hin.
    2. Genetische Charakterisierung: Validieren Sie die Isolierung eines einzelnen mikroorganismischen Genotyps durch DNA-Extraktion aus den mutmaßlichen Reinkulturen, gefolgt von einer partiellen Genomsequenzierung. Bei Cyanobakterien ist das 16S rRNA-Gen häufig ein Ziel (Abbildung 5A)22. Eine phylogenetische 16S-Analyse kann die taxonomische Gruppierung22 identifizieren. In Mikroalgen wird häufig 18S rRNA angegriffen23. Für Isolate von Interesse oder neuartige Isolate kann die Sequenzierung des gesamten Genoms durchgeführt werden.

4. Entwicklung von Virus-/Bakteriophagen-Suspensionen mit einem Genotyp

HINWEIS: Dieses Protokoll beschreibt Verfahren zur Isolierung und Reinigung mehrerer Virus- und Bakteriophagensuspensionen mit einem Genotyp aus Umweltproben.

  1. Verdünnung und TEM von VLP-Konzentraten
    ANMERKUNG: Unter Verwendung von TEM und plattenbasierten Plaque-Assays24 wird die Bestätigung erreicht, dass VLPs echte Bakteriophagen (oder Viren) sind, die Wirtszellen infizieren.
    1. Transmissionselektronenmikroskopie von Filtraten (0,45 μm und 0,22 μm): Verwenden Sie Konzentrate aus 0,45 μm und 0,22 μm Filtration von Rohwasserproben (siehe Schritt 2.1), um TEM-Gitter16 und Bilder herzustellen, um die Heterogenität der Viruspartikel (d. h. die Vielfalt der Morphotypen) zu untersuchen. Verdünnen Sie Proben, die zu Gittern mit hoher Konfluenz (z. B. 90 %) führen, bevor Sie die nachfolgenden Schritte ausführen, um eine Konfluenz von 30 % bis 50 % zu erreichen. Eine manuelle Partikelzählung oder die Verwendung von Bildgebungssoftware kann verwendet werden, um die Zellkonfluenz auf Gittern abzuschätzen.
      HINWEIS: Eine hohe Konfluenz auf den Gittern kann dazu führen, dass Wirtsrasen auf festen Medienplatten gerodet wird, anstatt dass einzelne Platten entstehen, die ausgewählt werden können. Daher kann die Verdünnung von Proben vor Plaque-Assays Zeit sparen. Alternativ können mehrere Wirtsrasenplatten unter Verwendung von seriellen Verdünnungen von VLP-Konzentraten auf Wirt-Virus-Wechselwirkungen getestet werden.
    2. Nachweis der Aktivität von Bakteriophagen (oder Viren) auf Wirtsrasen: Züchten Sie auf BG-11-Agarplatten mutmaßliche Wirtsrasen von Cyanobakterien (oder Mikroalgen) aus Arbeitsbeständen (Schritt 3.1.2). Pipettieren Sie 0,5 ml VLP-Suspension in 4,5 ml Medium auf den Rasen (Abbildung 6A, links) und schwenken Sie es vorsichtig, bis die gesamte Oberfläche des Rasens mit Suspension bedeckt ist. Inkubieren Sie in einem Photobioreaktor für 3-10 Tage bei 25 °C mit einer Lichtintensität von 20-40 mmol Photonen/m2/s oder bis Plaques auf den Platten sichtbar sind (Abbildung 6A, rechts).
  2. Abkratzen von Plaques und Entwicklung von Virus- oder Bakteriophagensuspensionen mit einem Genotyp
    HINWEIS: Durch das Schaben einzelner Plaque-Phänotypen und die Vermehrung von Bakteriophagen in Flüssigkulturen des Wirts werden echte Wirt-Bakteriophagen-Wechselwirkungen (oder Wirt-Virus-Interaktionen) bestätigt, so dass Bakteriophagen- (oder Virus-) Arbeitsstämme für Infektionstests entwickelt werden können. Arbeitsbestände von Bakteriophagen (oder Viren) müssen mit einer von mehreren Methoden (z. B. qPCR, Plaque-Assays) titerisiert werden, um mit Infektionsassays bei einer definierten Infektionsmultiplizität (MOI) fortzufahren.
    1. Isolierung und Vermehrung eines Bakteriophagen- (oder Virus-)Genotyps: Sobald einzelne Plaques auf den Platten zu sehen sind (aufgrund einer ausreichenden Verdünnung des VLP-Konzentrats), verwenden Sie eine sterile Schlaufe, um eine einzelne Plaque abzukratzen. Schwenken Sie die Schleife in einer 10-ml-Seed-Kultur des Wirts (Abbildung 6B, links). Inkubieren Sie unter leichtem Schütteln (z. B. 70-120 U/min) in einem Photobioreaktor für 3-10 Tage bei 25 °C mit einer Lichtintensität von 20-40 mmol Photon/m2/s oder bis OD730 nm Tropfen oder Zelltrümmer im Boden des Röhrchens nachgewiesen werden, was auf Zelltod/Lyse hinweist (Abbildung 6B, rechts)25.
      HINWEIS: Wenn sich Plaques auf dem Rasen des Wirts bilden, aber in der Flüssigkultur keine Anzeichen einer Infektion zu sehen sind, können Plaques von einem Bakteriocin26 und nicht von einem Bakteriophagen (oder Virus) gebildet worden sein. TEM kann Plattenassays unterstützen, indem es den Zelltod durch Bakteriophagen- (oder Virus-)Infektion anzeigt.
    2. Quantifizierung des Titers für Arbeitsstämme von Bakteriophagen (oder Viren): Die Isolierung von Bakteriophagen (oder Viren) wird mit den oben beschriebenen Filtrations- und Spin-Konzentrationsmethoden erreicht. Quantifizierung der Titer für Bakteriophagen- (oder Virus-) Suspensionen durch serielle Verdünnungs-Plaque-Assays27. Alternativ können Sie eine DNA-Extraktion und eine Sequenzierung des gesamten Virusgenoms sowie eine Phylogenetik durchführen (Abbildung 5B), um Primer für die Durchführung einer qPCR-basierten Titerisierung von Bakteriophagen zu entwickeln, um Arbeitsstämme für nachfolgende Infektionsassays zu erstellen.
      HINWEIS: Die Vermehrung einzelner Bakteriophagen- (oder Virus-) Genotypen kann auf 50 ml- oder 100-ml-Kulturen hochskaliert werden, wenn die Titer- oder Arbeitsbestandsvolumina für experimentelle Anforderungen zu gering sind. Berücksichtigen Sie die Art des Virus-Wirt-Systems (z. B. hohe oder niedrige Virulenz), die Multiplizität der Infektionen (MOI), die für Infektionstests geplant ist, und die Anzahl der Infektionsassays, die für ein Projekt durchgeführt werden, wenn Sie Arbeitsbestände an Bakteriophagen (oder Viren) entwickeln. Es ist nicht ratsam, Virusbestände aufzutauen und wieder einzufrieren. Tauen Sie auf und verwenden Sie für jedes Experiment einen vollen Virusbestand aus Replikaten desselben Präparats mit demselben Titer im gleichen Titer. Andere Titertechniken können die beschriebenen Verfahren ergänzen, einschließlich der Elektrospray-Ionisation/Massenspektrometrie (ESI/MS)28.

5. Infektionstests

HINWEIS: Dieses Protokoll beschreibt Wirt-Phagen- (oder Wirt-Virus-) Infektionsassays, die verwendet werden, um: Virulenz, Wirtsspektrum und Infektionsphänotyp (ein Indikator für die Replikationsstrategie) auf festen Medien qualitativ zu charakterisieren; und quantitative Bewertung der Wachstumskinetik, der Virulenzdes Virus 14 und der Wirtsresilienz15 in Flüssigkulturen.

  1. Bestimmung der relativen Virulenz von Bakteriophagen (oder Viren) und des Wirtsspektrums auf festen Medien
    HINWEIS: Alle Feststoff-Assays, einschließlich Spot-on-Lawn-Assays, Einzelplatten-Plaque-Assays mit serieller Verdünnung und Wirtsresistenzplatten-Assays, liefern qualitative Daten zu Bakteriophagen-Wirt-Infektionsparametern wie Virusvirulenz, Wirtsspektrum und Replikationsstrategie. Flüssigkultur-Wachstumsassays ermöglichen quantitativere Messungen und Modellierungen der Virus-Wirt-Dynamik.
    1. Spot-on-Lawn-Assays: Um das Wirtsspektrum zu bestimmen, bereiten Sie Rasenflächen mehrerer mutmaßlicher Wirte vor, die aus Umweltproben oder von Stämmen isoliert wurden, die aus anderen Labors oder Kultursammlungen erworben wurden. Auf Rasenflächen 2 μl Bakteriophagen- (oder Virus-) Suspension mit einer Pipette auf den Rasen aufsetzen. Spotten Sie in einem separaten Bereich derselben Platte das gleiche Volumen von Triton X-100 und nanoreinem (18 MW) Wasser als Positiv- bzw. Negativkontrolle16. Es werden mehrere Spot-on-Lawn-Assays mit einem bestimmten Bakteriophagen (oder Virus) an mehreren Wirten durchgeführt, um das Wirtsspektrum des Bakteriophagenzu beurteilen 16. Plaque-Phänotypen bieten Einblicke in die Replikationsstrategie von Bakteriophagen (oder Viren). Plaques, die scharfe Ränder aufweisen und bis zum Agar durchsichtig sind, deuten auf lytische Replikation hin, während Plaques mit diffusen Rändern oder einem Halo auf eine nicht-lytische Replikation hinweisen können16,17.
      HINWEIS: Alternativ zeigen Einzelplatten-Plaque-Assays mit serieller Verdünnung an, ob es eine lineare Beziehung zwischen der Plaquegröße und dem Bakteriophagentiter gibt. Verwende einen Markierer auf der Rückseite der Platte, um die Platte in ein Raster oder Tortenabschnitte zu unterteilen. Führen Sie dann unter Verwendung des gleichen Volumens (d. h. 2 ml), aber mit Verdünnungen der Bakteriophagensuspension (z. B. 1:1, 1:4, 1:16, 1:64) den Spot-on-Lawn-Assay auf einer einzigen Wirtsplatte durch.
    2. Wirtsresistenz-Assays: Um festzustellen, ob eine Reihe von Bakteriophagen auf einem bestimmten Wirt eine Infektion hervorrufen kann, bereiten Sie einen Wirtsrasen auf einer Platte vor, wie oben beschrieben. Unterteile die Platte mit einem Markierer auf der Rückseite der Platte in ein Raster oder Tortenabschnitte. Platzieren Sie dann 2 ml jeder Bakteriophagen- (oder Virus-) Suspension in einem Abschnitt des Gitters (oder Kuchens), wobei Triton X-100 und Nanoreines Wasser als Kontrollen verwendet werden. Wenn alle Bakteriophagen- (oder Virus-)Suspensionen mit gleichen Titern zugegeben werden, dann beurteilen Sie die relative Virulenz zwischen Bakteriophagenstämmen (oder Viren) auf dem Wirt qualitativ (d. h. größere Plaque = virulenteres Virus).
  2. Quantifizierung von Virulenz, Resilienz und Wachstum in Flüssigkultur-Infektionsassays
    HINWEIS: Erste qualitative Ergebnisse bilden eine Grundlage für die gezielte Identifizierung spezifischer Bakteriophagen-Wirt-Paare und die Durchführung quantitativer Analysen der Dynamik von Virus-Wirt-Interaktionen. In der Flüssigkultur wird eine Wachstumskurve für infizierte Wirte erstellt und mit dem Wachstum des nicht infizierten (Kontroll-)Wirts verglichen.
    1. Führen Sie einen Flüssigkultur-Einzelvirus-/Einzelwirt-Infektionsassay wie unten beschrieben durch.
      1. Etablierung paralleler Flüssigkulturen (~6-12) eines Mikroorganismus (z. B. eines Cyanobakteriums), der sich durch Feststoffplatten-Assays (Schritt 5.1) als anfällig und permissiv erwiesen hat, in entweder: 1,0 l (320 mL Kultur), 500 mL (160 mL Kultur) oder 250 mL (80 mL Kultur) - gefüllte Kulturflaschen, wie zuvor beschrieben17. Zu einem vordefinierten Zeitpunkt (typischerweise 0,5 oder 1 Wirtsverdopplungszeit) inokulieren Sie eine Teilmenge paralleler Kulturen mit äquivalenter Zelldichte (z. B. OD730 nm = 0,08) in dreifacher Ausfertigung mit Bakteriophagensuspension unter Verwendung des geeigneten Volumens, das erforderlich ist, um eine vorausgewählte Multiplizität der Infektion (MOI) mit verfügbarem Arbeitsstammtiter zu erhalten.
      2. Lassen Sie andere Parallelkulturen (auch in dreifacher Ausfertigung) ungeimpft (d. h. nicht infiziert) als Kontrollen. Optional inokulieren Sie einen dritten Satz paralleler Kulturen mit einem anderen Bakteriophagen- (oder Virus-) Stamm, um Vergleiche zwischen ausgewählten Bakteriophagen-Wirt-Paarungen durchzuführen. Lassen Sie die Kulturen 3-10 Tage lang bei 25 °C und einer Lichtintensität von 20-40 mmol Photonen/m2/s in einem Photobioreaktor wachsen.
      3. Generieren Sie Wirtswachstumskurven, indem Sie OD730nm-Messungen in regelmäßigen Zeitabständen (z. B. 8 Stunden) von Bakteriophagen-infizierten und nicht infizierten (Kontroll-)Kulturen vornehmen (Abbildung 7A). Verwenden Sie die TEM-Verifizierung von nicht infizierten Kontrollkulturen (Abbildung 7C) und die produktive Infektion in Wirtszellkulturen (Abbildung 7D). Zytopathische Effekte29,30 sind bei den meisten infizierten Zellen leicht zu beobachten, während nicht infizierte Zellen keine Anzeichen von morphologischer Transformation oder Stress zeigen.
    2. Baseline-Analytik für Flüssigkultur-Infektionsassays: Aus Einzelvirus/Single-Host-Infektionsassays (SVSH) können mehrere Baseline-Metriken abgeleitet werden, wie z. B. die maximale spezifische Wachstumsrate (μmax)31, die relative Virulenz von Bakteriophagen (oder Viren)14 und die relative Wirtsresilienz15 - für eine quantitativere Beschreibung der Bakteriophagen-Wirt- oder Virus-Wirt-Dynamik (Abbildung 7B). Zu den standardmäßigen meldepflichtigen Metriken gehören die Wachstumsrate (oft als maximale spezifische Wachstumsrate oder μangegeben) und die relative Virulenz (VR)14 im Vergleich zu einer nicht infizierten Wirtskontrolle und/oder einem separaten Bakteriophagen auf demselben Wirt. Andere Metriken wie die Tragfähigkeit des Systems (N-Asymptote) und die relative Resilienz des Wirts (R,R)15 können ebenfalls berichtet werden.

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Ergebnisse

Die Verwendung eines tragbaren benzinbetriebenen Stromgenerators, einer Wasserförderpumpe und zusammenbruchsicherer Schläuche dient als effektive Methode zur Entnahme von Wasserproben aus dem Meer, Seen, gefrorenen Seen und anderen aquatischen Umgebungen (z. B. Lagunen) in ausgewählten Tiefen (Abbildung 1, obere drei Reihen). Für das hochtemperaturige saure Wasser von geothermischen heißen Quellen, Pools und Schlammtöpfen, die einen pH-Wert von < 4 und Tempe...

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Diskussion

Die Virosphäre ist riesig und vielfältig und erfordert daher unterschiedliche experimentelle Ansätze zur Untersuchung verschiedener Virussysteme. Dazu gehören unterschiedliche Strategien zur Isolierung von Viren und ihren Wirten aus unterschiedlichen Umgebungen und unterschiedlichen Verarbeitungsmethoden, um sicherzustellen, dass Reinkulturen von Wirten und ihren Viren aus Rohproben hergestellt werden können. Diese Reinkulturen können in SVSH-Infektionsassays sowohl auf festen Medien als...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Danksagungen

Diese Studie wurde teilweise von der U.S. National Science Foundation (NSF) OISE Grant Nr. 1856091 (PI-Ceballos) und NSF DBI Grant Nr. 2119968 (PI-Ceballos) finanziert. Die Autoren würdigen die Beiträge von Dr. Chinnapong Wangnai und Dr. Chakrit Tachaapaikoon von der King Mongkut's University of Technology Thonburi (Thailand), die die Videografie bzw. die Feldunterstützung für Umweltproben zur Verfügung stellten. Die Autoren danken auch Dr. Jorge Armando Leiva Sanabria von der Universität von Costa Rica - Guanacaste für seine Unterstützung bei der Erlangung von Probenahmegenehmigungen von Nationalparks in Costa Rica und bei der Unterstützung bei der Probenentnahme aus den geothermischen Pools. Die Autoren danken auch Herrn Enrique Marroquin, Jr. (University of California Merced) und Frau Alexia Maceda (University of Maine, Orono, ME, USA), die bei der Probenahme vor der Küste Südkaliforniens bzw. den Seen im Norden von Minnesota geholfen haben. Die Autoren danken und danken Frau Socheata Hour für ihre technische Unterstützung, die die Infektionsparameter für den φSBL14-SWII-Datensatz berechnet hat.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1 PS Edelstahl-Transferpumpe Utilitech, Charlotte, NC, USAN/A
1,5 ml Röhrchenwww.eppendorf.com30123611
10K NMWL Centricon Plus 70 Spin-Konzentrator www.sigmaaldrich.comUFC701008
250 mL Erlenmeyerkolben mit Prallwand www.sigmaaldrich.comCLS4450250
3800-Watt-Inverter-GeneratorWEN Products, West Dundee, IL, USAWEN 56380i
3K NMWL Amicon 15 mL www.sigmaaldrich.comUFC800308
500 mL Erlenmeyerkolben mit Schwall www.sigmaaldrich.comCLS4450500
5-Gallonen-Wasserkrüge www.homedepot.comN/A
80 Fuß lang, 0,5" Durchmesser, Nylon https://facomex.mx/producto/combo/N/A
Eine 26 Fuß tiefe V-Mittelkonsole Sailfish 2660 mit zwei Yamaha 150 PS Außenbordmotoren https://yamahaoutboards.com/N/A
Ammoniumacetat (CH3CO2NH4)www.sigmaaldrich.com631618
Borsäure (H3BO3)www.sigmaaldrich.com10043353
Calciumchlorid-Dihydrat (CaCl2. 2H2O)www.sigmaaldrich.com10035048
Zentrifuge 5920  Rwww.eppendorf.com5948000107
Zitronensäure (C6H8O7)www.sigmaaldrich.com77929
Kobalt(II)-nitrathexahydrat [Co(NO3)2,6H2O]www.sigmaaldrich.com10026229
Zusammenklappbarer Gummi-Flexschlauch swanhose.comCELTF58050
Kupfer(II)-sulfat-Pentahydrat (CuSO4.5H2O)www.sigmaaldrich.com7758998
Corning 50 mL Zentrifugenröhrchen www.sigmaaldrich.comCLS430291
Dikaliumphosphat (K2HPO4)www.sigmaaldrich.com7758114
Dinatriumethylendiamintetraessigsäure (Na2EDTA)www.sigmaaldrich.com6381926
DS-11 FX+_Microvolume und Spektralphotometer und Florometerwww.denovix.comN/A
Klebeband www.homedepot.comN/A
Eppendorf Röhrenwww.sigmaaldrich.comEP022364120
Ethanolwww.sigmaaldrich.com64175
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)www.sigmaaldrich.com60004
Eisenammoniumcitrat (C6H8O7· xFe3+· yNH3)www.sigmaaldrich.com1185575
Flex-plus blauer PVC-Schlauchwww.carlonsales.com12008-750
Innova S44i - Stapelbarer Inkubator-Schüttlerwww.eppendorf.com2231001081
LVEM5 Tischgerät Elektronen- Microscope_Transmission Elektronenmikroskopie (TEM)delongamerica.comN/A
Magnesiumsulfat-Heptahydrat (MgSO4,7 H2O)www.sigmaaldrich.com10034998
Mangan(II)-chlorid-Tetrahydrat (MnCl2.4H2O)www.sigmaaldrich.com13446349
Pilzanker schwarz Vinyl beschichtet/30 lbswww.homedepot.comN/A
Petrischale, Polystyrolwww.sigmaaldrich.comNr. P5481
Membran-Filterbecher aus Polyethersulfon (PES) mit 0,22 mmwww.sigmaaldrich.comZ358193-1CS
Membran-Filterbecher aus Polyethersulfon (PES) mit 0,45 mmwww.sigmaaldrich.comZ370622-1CS
Kaliumethylxanthogenat (C2H5OCSSK)www.sigmaaldrich.com140896
Natriumcarbonat (Na2CO3)www.sigmaaldrich.com497198
Natriumdodecylsulfat [CH3(CH2)11OSO3Na]www.sigmaaldrich.com151213
Natriummolybdat-Dihydrat (Na2MoO4.2H2O)www.sigmaaldrich.com10102406
Natriumnitrat (NaNO3)www.sigmaaldrich.com7631994
Tris(hydroxymethyl)methyl]-2-aminoethansulfonsäure aci (TES) (C6H15NO6S)www.sigmaaldrich.com7365448
Triton X-100 www.sigmaaldrich.comNr. T8787
Trizma-Hydrochlorid (Tris-HCl)www.sigmaaldrich.com1185531
Vakuum-/Druckpumpe Cole-Parmer; Vernon Hills, IL, Vereinigte Staaten von AmerikaNr. EW-79204-00
Vinyl-Schläuchewww.homedepot.comN/A
Zinksulfat-Heptahydrat (ZnSO4.7H2O)www.sigmaaldrich.com7446200

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