Visualisierung von retinalen Organoiden mit zellulärer Auflösung

Retinale Organoide

Retinale Organoide sind komplexe 3D-Strukturen, die die menschliche Netzhaut nachahmen und eine wertvolle Plattform für die Untersuchung der Netzhautentwicklung, der Krankheitsmechanismen und potenzieller therapeutischer Strategien bieten¹. Sie behalten die natürliche 3D-Architektur der Netzhaut bei, demonstrieren transkriptomische Treue und funktionelle Kompetenz, indem sie Phototransduktion und synaptische Konnektivität reproduzieren². Darüber hinaus ahmen sie die In-vivo-Entwicklung ^{genau nach 3,4}, was eine realistischere Darstellung im Vergleich zu flachen Zellkulturen ermöglicht. In früheren Studien etablierten Isla-Magrané et al. ein zweistufiges Protokoll zur Gewinnung von multiokularen Organoiden, die aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC) gewonnen wurden, um zelluläre Merkmale des menschlichen Auges in der Entwicklung zu modellieren ^5,6. Aufgrund des Mangels an fötalem Gewebe beschränkte sich die Forschung zur Entwicklung des menschlichen Auges auf anatomische Studien.

Die mit diesem Protokoll erhaltenen Netzhaut-Organoide wiesen eine korrekte Schichtung auf und enthielten alle wichtigen Subtypen von Netzhautzellen, wie Photorezeptoren, bipolare Zellen, Ganglienzellen, amakrine und horizontale Zellen und Makroglia, zusammen mit wichtigen morphologischen Merkmalen und korrekter räumlicher Organisation und Verbindungen. Organoide Modelle sind zwar eine mögliche Lösung, weisen aber eine erhebliche Variabilität auf, was es schwierig macht, konsistente Ergebnisse zu erzielen. Daher besteht ein dringender Bedarf, eine Vielzahl fortschrittlicher Technologien in zuverlässigeren menschlichen Modellen einzusetzen. Bisher wurden diese Organoide nur in histologischen Schnitten untersucht, da ihre komplexe zelluläre Zusammensetzung, Dichte und Größe das Eindringen von Licht behindern, was zu einer schlechten optischen Abbildungsleistung in tieferen Schichten führt und somit eine umfassende Analyse einschränkt.

Komplett-Mount-Bildgebung

Traditionelle histologische Techniken, bei denen fixiertes Gewebe geschnitten und gefärbt wird, können zwar detaillierte Informationen über bestimmte Regionen liefern, erfassen jedoch nicht die Gesamtarchitektur und die räumlichen Beziehungen innerhalb des gesamten Organoids. Um diese Einschränkung zu überwinden, erweist sich die Whole-Mount-Bildgebung als wertvolles Werkzeug für die Untersuchung von Netzhaut-Organoiden. Die Whole-Mount-Bildgebung ermöglicht die Visualisierung des gesamten Organoids in seiner intakten 3D-Form, wobei die räumliche Verteilung von Zelltypen und extrazellulären Matrixkomponenten erhalten bleibt. Dieser Ansatz ist besonders vorteilhaft für die Untersuchung der zellulären Zusammensetzung innerhalb und zwischen Organoiden und ermöglicht ein vollständigeres Verständnis ihrer Entwicklungsprozesse und funktionellen Organisation. Aufgrund ihrer zellulären Dichte und Verdichtung sind retinale Organoide jedoch undurchsichtig (Abbildung 1, ungeklärt). Die inhärente Opazität der Proben führt zu Lichtstreuung, die eine detaillierte Visualisierung der inneren Strukturen mit Hilfe der Mikroskopie erschwert. Hier erweisen sich optische Clearing-Techniken als mächtiges Werkzeug.

Optische Clearing-Techniken

Optisches Clearing bezieht sich auf physikalisch-chemische Behandlungen, bei denen dicke biologische Proben transparent gemacht werden, indem die Brechungsindexgradienten (RI) des Gewebes an die des Klärmittels angepasst und lichtabsorbierende Substanzen entfernt^{werden 7}. Diese Methoden reduzieren die Lichtstreuung drastisch und erhöhen die Transparenz. Diese Transformation ermöglicht es uns, durch das gesamte retinale Organoid hindurch zu sehen, was eine umfassende Analyse seiner komplizierten zellulären Organisation und Morphologie durch bildgebende Verfahren ermöglicht. In der Praxis wird dies erreicht, indem die Probe mit einer Substanz mit hohem RI-Gehalt imprägniert und Lipide und Pigmente entfernt werden.

Es stehen verschiedene Clearing-Methoden zur Verfügung, die sich in verschiedenen Aspekten unterscheiden (z. B. Grad der Transparenz, Kompatibilität mit mikroskopischen Techniken, Proben und fluoreszierenden Molekülen, Machbarkeit, Dauer), aber keine sticht als das beste gemeinsame Protokoll hervor⁸. Sie werden in vier Hauptgruppen eingeteilt: (1) einfache Immersion, (2) hydrophob auf Basis organischer Lösungsmittel, (3) auf Basis von Hyperhydratation und (4) auf Basis von Gewebetransformations- oder Hydrogel-Einbettung, wie von Avilov et al.⁷ gut zusammengefasst. Alle Methoden beinhalten einen Schritt für den RI-Abgleich, in der Regel durch Eintauchen der Probe in eine Lösung, die der durchschnittlichen RI des Gewebes entspricht. Bei hydrophoben Verfahren werden Lipide und Wasser entfernt, indem die Probe in eine zunehmende Konzentration an organischen Lösungsmitteln (wie Methanol oder Propanol) getaucht wird.

Das vorgestellte Protokoll ist eine optimierte Methode, die optisches Clearing mit Immunmarkierung integriert, um die 3D-Visualisierung von Netzhautorganoiden mit konfokaler Mikroskopie zu erleichtern und so eine Ganzvolumen-Bildgebung bei gleichzeitiger Wahrung der strukturellen Integrität zu ermöglichen. Dieser Ansatz ermöglicht die Identifizierung wichtiger retinaler Zelltypen innerhalb des Organoids und gibt den Forschern ein leistungsfähiges Werkzeug an die Hand, um die Reifung und räumliche Organisation von retinalen Organoiden in einem physiologisch relevanten Kontext zu untersuchen.

1. Herstellung von maßgeschneiderten fluoreszierenden Sekundärantikörpern

HINWEIS: Dieser Ansatz dient als Alternative zur Verwendung kommerzieller fluoreszierender Antikörper (siehe die Diskussion zu den Vorteilen der Herstellung von fluoreszierenden Sekundärantikörpern). Darüber hinaus kann dieses Protokoll zur Konjugation von Fluorophoren an Primärantikörper verwendet werden, falls eine direkte Immunfluoreszenz durchgeführt werden soll und der fluoreszierende Primärantikörper nicht kommerziell verfügbar ist. Die Kontrolle des Fluorophor-zu-Antikörper-Verhältnisses durch Anpassung der Fluorophormenge in der Markierungsreaktion führt zu helleren konjugierten Antikörpern. Speziell angefertigte Sekundärantikörper sind jedoch weniger stabil, und die Konzentration des resultierenden Konjugats ist 10-mal niedriger als die der kommerziellen fluoreszierenden Antikörper. Dieses Protokoll ist eine Adaption der von Bálint et al.⁹ beschriebenen Arbeit.

1. 1 mg des Fluorophors in wasserfreiem DMSO auflösen und in Röhrchen aliquotieren, um die letzten 0,02 mg Fluorophor pro Röhrchen zu erhalten. Entfernen Sie das gesamte DMSO mit einem Speed-Vakuum-Konzentrator, der 1 h und 30 min läuft. Lagern Sie die Aliquote bei -20 ºC vor Licht geschützt. Für Alexa Fluor 405 ist das hochreine H₂O das geeignete Lösungsmittel für die Herstellung von Aliquoten.
2. Zur Durchführung der Markierungsreaktion lösen Sie ein Aliquot des Fluorophors in 1-10 μl DMSO (oder ultrareines H₂O für Alexa Fluor 405).
   HINWEIS: Die genaue Menge an DMSO wird durch frühere Kontrollkonjugationstests bestimmt. Diese Tests werden durchgeführt, wenn eine neue Charge eines Fluorophors verwendet werden soll (oder wenn eine vorherige Fluorophor-Charge ausgeht) oder wenn ein neues Fluorophor zum ersten Mal in der Konjugation verwendet wird. Der Kontrollkonjugationstest umfasst die Durchführung von Markierungsreaktionen mit unterschiedlichen Mengen an Fluorophor, um das optimale Fluorophor-zu-Antikörper-Verhältnis im Konjugat zu bestimmen. In unserem Fall liegt das optimale Verhältnis typischerweise zwischen 3 μL und 5 μL.
3. Inkubieren Sie 50 μl sekundäres IgG (oder primäres IgG), 6 μl 1 M NaHCO₃ und 1-5 μl Fluorophor für 40 Minuten bei Raumtemperatur (RT) auf einer vor Licht geschützten Wippplattform.
4. Während der Reaktion sind die Säulen für den Ausschluss der Reinigungsgröße vorzubereiten, indem Sie die Deckel entfernen und den Puffer passieren lassen. Äquilibrieren Sie die Säule (eine für jede Markierungsreaktion), indem Sie 3 x 2-3 mL PBS durch die Säule laufen lassen. Falls der letzte Äquilibrierungsschritt vor Ende der Inkubation abgeschlossen ist, setzen Sie die Deckel wieder auf, um ein Austrocknen zu vermeiden, und warten Sie, bis die Markierungsreaktion abgeschlossen ist.
   HINWEIS: Säulen zum Ausschluss der Reinigungsgröße arbeiten durch Schwerkraft. Stellen Sie sicher, dass die Säule zu keinem Zeitpunkt austrocknet, da sonst die Reinigungsreaktion nicht richtig funktioniert.
5. Wenn die Reaktion beendet ist (Schritt 1.3), fügen Sie der Markierungsreaktion 140 μl PBS hinzu, um das Volumen auf etwa 200 μl zu erhöhen, und wirbeln Sie es vortexen. Geben Sie diese Lösung in die Mitte der Säule, lassen Sie die Probe in die Säule eintreten und drücken Sie, nachdem der letzte Tropfen eluiert ist, indem Sie 550 μl PBS hinzufügen. Wenn die Flüssigkeit nicht mehr fällt, eluieren Sie durch Zugabe von 300 μl PBS und sammeln Sie sie in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
6. Berechnen Sie die Antikörperkonzentration und die Markierungsverhältnisse, indem Sie die Extinktion der Probe bei 280 nm und die Absorption der verwendeten Fluorophore messen. Wenden Sie das Beer-Lambert-Gesetz an, um die Konzentration (in Molarität) wie folgt zu bestimmen:
   
   Dabei steht A für die Absorption, ε für den molaren Extinktionskoeffizienten, und CF₂₈₀ ist ein Maß für die Absorption, die das spezifische Fluorophor bei 280 nm hat und als Korrekturfaktor dient. Dann beträgt die Konzentration des Antikörpers:
   
   Und das Beschriftungsverhältnis ist:
   
7. Lagern Sie die markierten Antikörper bis zu 6 Monate lang bei 4 ºC lichtgeschützt.

2. Immunfluoreszenz-Markierung

1. Fixieren Sie die Organoide mit 4% Paraformaldehyd (PFA) bei RT für 45 min.
   HINWEIS: OPTIONAL: Inkubieren Sie die Organoide mit einer Antigen-Retrieval-Lösung (Schritte 2.2 und 2.3), um die Immunreaktivität der Antigene zu erhöhen.
2. Bereiten Sie 40 ml Antigen-Retrieval-Lösung vor, indem Sie 0,117 mg Natriumcitrat tribasisches Dihydrat in ultrareines H₂O mischen und auf pH 9 einstellen.
3. Die Organoide werden mit der Antigen-Retrieval-Lösung unter leichtem Schütteln (30 U/min) bei 60 °C für 1 h inkubiert.
4. Permeabilisieren Sie die Organoide mit PBST (PBS mit 1% Triton X-100) mit leichtem Schütteln bei RT für 4 h.
5. Blockieren Sie die Organoide mit einer Blockierungslösung (2 % Rinderserumalbumin (BSA) mit 0,1 % Triton X-100) bei RT über Nacht (oder über 1 Tag).
   HINWEIS: Die Konzentrationen von Primär- und Sekundärantikörpern hängen vom jeweiligen Antikörper ab. Für die Immunfluoreszenz von Ganzstückproben verwenden wir eine höhere Konzentration im Vergleich zu geschnittenen Proben. Wir inkubieren den primären Antikörper bei 10 μg/ml, was in den meisten Fällen 1:100 aus dem Stamm entspricht (Tabelle 1). Wir inkubieren unsere maßgeschneiderten Sekundärantikörper bei 20-50 μg/ml.
6. Die Organoide werden mit den in Waschlösung (0,1 % BSA und 0,1 % Triton X-100) verdünnten Primärantikörpern 2 Tage lang bei 4 °C unter leichtem Schütteln inkubiert.
7. Waschen Sie die Organoide 3 x 15 min in Waschlösung mit leichtem Schütteln bei RT.
8. Die Organoide werden mit den in Waschlösung verdünnten Sekundärantikörpern in Waschlösung bei 4 °C 2 Tage lang unter leichtem Schütteln inkubiert.
9. Waschen Sie die Organoide 3 x 15 min in Waschlösung mit leichtem Schütteln bei RT.
   HINWEIS: Nach der Immunmarkierung können Fluoreszenzfarbstoffe der Wahl inkubiert werden. Normalerweise verwenden wir fluoreszierende Kernmarker wie DAPI (1:1.000) und DRAQ5 (1:500) oder Phalloidin (1:100), um das Aktinfilament-Netzwerk sichtbar zu machen.
10. Die Organoide werden mit den in Waschlösung verdünnten Fluoreszenzfarbstoffen bei RT 1 h lang unter leichtem Schütteln inkubiert.
11. Waschen Sie die Organoide 3 x 15 min in Waschlösung mit leichtem Schütteln bei RT.

3. Optisches Clearing mit FluoClear BABB

HINWEIS: 1-Propanol kann Kunststoffbehälter beeinträchtigen, insbesondere bei langfristiger Exposition. Um sicher zu gehen, verwenden Sie Glasbehälter.

1. Schritt der Dehydrierung
   1. Bereiten Sie 1-Propanol-Lösungen in hochreinem H₂O in den angegebenen Prozentsätzen (15 %, 30 %, 45 %, 60 %, 75 %, 90 %) vor und stellen Sie sie dann mit Trimethylamin auf pH 9,5 ein.
      ACHTUNG: Triethylamin ist giftig, wenn es eingeatmet wird. Arbeiten Sie unter einem Abzug. Lösungen können bei sachgemäßer Lagerung (gut verschlossener Behälter) wiederverwendet werden. Stellen Sie den pH-Wert vor dem Gebrauch ein.
   2. Die Proben werden mit dem zunehmenden Gradienten von 1-Propanol-Lösungen (15 %, 30 %, 45 %, 60 %, 75 %, 90 %) jeweils 2 h bei 30 °C unter leichtem Schütteln inkubiert.
   3. Die Proben werden über Nacht bei 30 °C unter leichtem Schütteln mit 100 % 1-Propanol inkubiert.
2. Schritt "Clearing"
   ACHTUNG: BABB ist ein starkes Lösungsmittelgemisch, das für seine Fähigkeit bekannt ist, viele Kunststoffe aufzulösen oder erheblich zu beschädigen. Verwenden Sie zur Sicherheit Glasbehälter mit kompatiblen Deckeln und arbeiten Sie in einem Abzug.
   1. Bereiten Sie das BABB vor, indem Sie Benzylalkohol (BA) und Benzylbenzoat (BB) im Verhältnis 1:2 mischen.
   2. Tauchen Sie die Proben über Nacht in BABB bei RT ein.
   3. Aktualisieren Sie vor dem Imaging das BABB.
      HINWEIS: Bei Organoiden mit einem Durchmesser von ~1 mm induziert BABB einen Reinigungseffekt, der innerhalb von Dutzenden von Minuten sichtbar wird. Abhängig von der Größe und Art der Probe kann der Grad der Räumung unterschiedlich sein und/oder eine längere Einwirkzeit in die Räumlösung erfordern. Wir empfehlen, Bilder vor und nach der BABB-Immersion aufzunehmen, um das Clearing-Protokoll zu verbessern.
   4. BABB-freigegebene Proben mit BABB-Lösung langfristig bei 4 °C lagern. Vor Licht schützen, um die Fluoreszenz zu erhalten.

4. Bildaufnahme mit ganzer Montierung

1. Positionieren Sie das Organoid mit einer Glaspipette in einer Petrischale mit Glasboden und einem Tropfen BABB. Stellen Sie sicher, dass die Probe die Oberfläche des Deckglases berührt.
   ACHTUNG: Achten Sie darauf, dass der BABB-Tropfen, der die Probe enthält, nicht mit den Kunststoffkanten der Schale in Berührung kommt, da er sonst den Kunststoff schmilzt und die Probe und die Qualität der Bildgebung beeinträchtigt.
2. Mit einem inversen konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop, das mit Objektiven mit niedriger und hoher Vergrößerung ausgestattet ist, können Sie Z-Stapel-Bilder aufnehmen, um einen vollständigen 3D-Einblick in die Probe mit zellulären Details zu erhalten.
   HINWEIS: Für diese Studie wurden ein Luftobjektiv mit 10x numerischer Apertur (NA) 0,4 und ein 63x NA 1,4 Objektiv mit einer Schrittweite von 3,5 μm bzw. 1 μm verwendet.

5. Bildverarbeitung

Abbildung 1: Vergleich von drei Clearing-Methoden. Links: Hellfeldbilder von (A) ungeklärten und (B-D) geklärten Proben. Rechts: Z-Stack mit orthogonalen Ansichten von xz und yz von 90 DIV-Netzhautorganoiden, die mit dem Kernmarker DRAQ5 (gelb) gefärbt wurden, aufgenommen mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop, das mit einem 10-fachen Luftobjektiv (RI = 1,00) ausgestattet war. (A) Ungeklärtes Netzhaut-Organoid (N = 3). PFA-fixierte Netzhautorganoide sind nicht transparent genug für eine 3D-Visualisierung. (B) Fruktose/Glycerin-geklärtes Organoid (N = 3). (C) ECi-cleariertes Organoid (N = 3). (D) FluoClear BABB-cleariertes Organoid (N = 3). Maßstabsleisten = 100 μm. Abkürzungen: BF = Hellfeld; CLSM = konfokales Laser-Scanning-Mikroskop; RI = Brechungsindex; PFA = Paraformaldehyd; ECi = Ethylzimt; BABB = Benzylalkohol/Benzylbenzoat; DIV = Tage in vitro. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Vergleich optischer Clearing-Methoden für Immunfluoreszenzstudien an neuroretinalen Organoiden

Im Folgenden präsentieren wir die Ergebnisse von drei Clearing-Methoden, um die Wirksamkeit von FluoClear BABB bei der Transparenz von Netzhautorganoiden zu demonstrieren. In Abbildung 1 sehen wir retinale Organoide, die mit Fruktose/Glycerin (Abbildung 1B), ECi (Abbildung 1C) und FluoClear BABB (Abbildung 1D) beseitigt wurden. Die getesteten Clearing-Methoden wurden ausgewählt, weil sie sich alle als kompatibel mit der Immunfluoreszenzfärbung erwiesen haben10,11 und die Fluoreszenz von endogenen Proteinen (z. B. GFP in GCaMPs) erhalten.

Fruktose/Glycerin12 ist ein ungiftiges, einfaches Immersionsreinigungsprotokoll, das keine Dehydrierung erfordert, wodurch die Verarbeitungszeit im Vergleich zu anderen Methoden erheblich verkürzt wird. Es wurde berichtet, dass es bei der Transparenz von Organoiden, die aus verschiedenen Geweben stammen, wirksam ist: Atemwege, Niere, Leber und menschlicher Brustkrebs12.

ECi (Ethylcinnamat)11 ist ein von der FDA zugelassener Lebensmittelgeschmacks- und Zusatzstoff für Kosmetika13,14, gilt als harmlos und hat sich als hervorragendes Clearing-Reagenz für Säugetiergewebe erwiesen. Es ist bekannt für seine schnelle Clearing-Fähigkeit und minimale Gewebeverzerrung. Es wird als hydrophobe Clearing-Methode eingestuft, ist aber im Vergleich zu BABB-basierten Lösungsmitteln ungiftig und bewahrt die Fluoreszenz von fluoreszierenden Proteinen länger (bis zu 14 Tage). Wie in den meisten Clearing-Protokollen üblich, erfordert ECi einen vorherigen Dehydratisierungsschritt. Um optimale Ergebnisse zu erzielen, wird dieser Schritt erreicht, indem die Probe in Lösungen mit progressiv ansteigenden Alkoholkonzentrationen getaucht wird. Da ECi nicht schädlich ist, kann die Probe, sobald sie freigegeben ist, sicher manipuliert und in Kunststoffbehältern aufbewahrt werden. Die Dehydratisierungsschritte werden jedoch mit 1-Propanol durchgeführt, einem organischen Lösungsmittel, das unter einem Abzug manipuliert und in Glasbehältern gelagert werden muss.

FluoClear BABB10 ist eine Variante eines hydrophoben Protokolls auf Basis von Benzylalkohol/Benzylbenzoat (BABB) als Brechungsindex-Matching-Lösung. Es ist bekannt, dass es sehr giftig und ätzend ist, daher muss es mit Vorsicht behandelt werden. FluoClear BABB wurde als verbesserte Version beschrieben, die GFP und RFP besser konserviert als frühere Versionen und die Verwendung von entweder 1-Propanol oder tert-Butanol als Dehydratisierungsmittel ermöglicht.

Um die Leistung der drei Clearing-Methoden zu beurteilen, haben wir Z-Ebenen mit einem konfokalen Mikroskop abgebildet, das mit einem 10x NA0,4 Luftobjektiv ausgestattet war, das ein großes Sichtfeld (FoV) von 2,5 x 2,5 x 2,56 mm bietet, um das gesamte Volumen des retinalen Organoids zu erfassen. Wir verwendeten retinale Organoide in einem Zwischenstadium der Reifung (90 Tage in vitro (DIV)), die alle retinalen Neuronen (Ganglienzellen, Bipolarzellen und Photorezeptoren) enthalten, wodurch die zelluläre Dichte und Verdichtung erreicht wurde und somit undurchsichtig war. Wie in der Einleitung erläutert, wird das optische Clearing erreicht, wenn RI über das gesamte abzubildende Objekt abgestimmt wird. Daher wirken sich die für die Bildgebung verwendeten Immersionsmedien drastisch auf die erreichte Transparenz aus. Tabelle 2 zeigt die RI von Immersionsmedien und die getesteten Räumlösungen.

Tabelle 2: Brechungsindex (RI) der am häufigsten für die Lichtmikroskopie verwendeten Immersionsmedien und die für die Reinigung von Netzhautorganoiden getesteten optischen Clearing-Methoden. Abkürzung: RI = Brechungsindex.

Beim Vergleich der resultierenden konfokalen Bilder (Abbildung 1, rechtes Bild) führte die Fructose/Glycerin-Behandlung zu der geringsten Verbesserung der Transparenz, was die Visualisierung der Netzhautschichten einschränkte und die Visualisierung des Organoidkerns verhinderte. ECi erreichte eine bessere Transparenz, die die Visualisierung der Netzhautschichten ermöglichte, aber immer noch eine eingeschränkte Visualisierung des retinalen Organoidkerns aufgrund von Lichtstreuung, die die Fluoreszenzdetektion aus den inneren Teilen der Probe behinderte. FluoClear BABB bot die größte Verbesserung der Transparenz und ermöglichte eine klare Visualisierung sowohl des Kerns als auch der Rinde des Netzhautorganoids bei höherer Auflösung bei ähnlicher Fluoreszenzintensität.

Es ist erwähnenswert, dass sowohl das ECi- als auch das FluoClear-BABB-Protokoll eine bemerkenswerte Probenschrumpfung induzierten, wie die entsprechenden Hellfeldbilder jedes gereinigten retinalen Organoids veranschaulichen (Abbildung 1, linkes Bild). Die Schrumpfung der Probe ist auf die vorherigen Dehydratisierungsschritte zurückzuführen, bei denen Wasser entfernt wird, und das ist der Grund, warum das Fruktose/Glycerin-Protokoll die Probe nicht schrumpft. Diese Schrumpfung bietet jedoch eine einzigartige Gelegenheit für eine tiefere Exploration. Es komprimiert zwar die Gesamtgröße des Organoids und unterschätzt möglicherweise die internen Abstände, erhöht aber auch die Kompaktheit. Diese isotrope Kompaktheit, die in alle Richtungen relativ gleichmäßig ist, ermöglicht es uns, Objektive mit hoher Vergrößerung und überlegenem Auflösungsvermögen (aufgrund ihrer größeren NA) zu nutzen, die sonst aufgrund ihrer kürzeren Arbeitsabstände (WD) nur die äußerste Zellschicht abbilden würden. So bietet ein 10x NA 0,4 Luftobjektiv einen WD von 2,53 mm, während ein 63x NA 1,4 Ölobjektiv mit deutlich besserer Auflösung einen WD von nur 0,14 mm hat. Durch die Verwendung von BABB-freien, kompakteren Organoiden können wir diese Einschränkung effektiv überwinden und eine hochauflösende Abbildung tieferer Strukturen erreichen, wie z. B. der Ganglienzellschicht im Inneren des Organoids (Abbildung 2).

Abbildung 2: 3D-Rekonstruktionen eines retinalen Organoids (200 DIV), aufgenommen mit FluoClear BABB, aufgenommen mit einem Laserscanning-Konfokalmikroskop. Das Mikroskop war mit einem (A) 10x NA 0,4 Luftobjektiv und (B) einem 63x NA 1,5 Ölobjektiv ausgestattet. Das Clearing und die Bildgebung ermöglichen die Visualisierung des gesamten Organoids und gleichzeitig die detaillierte Abbildung einiger interessanter Regionen. DRAQ5 (Kerne), Opsin B+GR (Zapfen) und TUJ1 (Neuronen). Abkürzungen: DIV = Tage in vitro; BABB = Benzylalkohol/Benzylbenzoat; NA = numerische Apertur. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass wir uns für die Klärung für FluoClear BABB entschieden haben, da es eine hervorragende Visualisierung des gesamten retinalen Organoids mit hoher Auflösung und hohem Signal-Rausch-Verhältnis bietet. Wichtig ist, dass die BABB-induzierte Schrumpfung, die das Organoid isotrop verdichtet. Diese Kompaktheit ermöglichte es uns, Objektive mit hoher Vergrößerung für die detaillierte Erkundung tieferer Strukturen zu nutzen. Schließlich sorgte die Kompatibilität von BABB mit Ölimmersionsobjektiven für minimale Lichtstreuung und eine qualitativ hochwertige Bildgebung über Vergrößerungen hinweg.

Identifizierung und räumlich-zeitliche Verteilung von Netzhautzellen innerhalb der Organoide während der Reifung

In Anlehnung an die hier beschriebene Methodik und unter Verwendung von Whole-Mount-Bildgebung an Organoiden, die mit den in Tabelle 1 beschriebenen spezifischen Antikörpern immunmarkiert wurden, untersuchten wir, wie die Neuroretina von Organoiden zu verschiedenen Reifungspunkten geformt ist, von frühen Entwicklungsstadien (40 DIV) bis hin zu reiferen Stadien (bis zu 250 DIV), die eine gut definierte 3D-Struktur aufweisen. Dieser Ansatz ermöglichte es uns, die Bildung und Organisation verschiedener retinaler Komponenten, die in diesem Abschnitt beschrieben werden, sichtbar zu machen.

Tabelle 1: Primäre Antikörper, die in Netzhaut-Organoiden aus verschiedenen Reifungsstadien getestet wurden. Abkürzungen: Huhn = Ch; Maus = Frau; Kaninchen = Rb.

Die Immunmarkierung mit verschiedenen Markern ermöglichte die Identifizierung der Zellen, die dieser Schichtstruktur entsprechen. TUJ1 ist ein neuronenspezifisches Beta-Tubulin der Klasse III (Tabelle 1), das aufgrund seiner Häufigkeit typischerweise in geschnittenen Proben zur Markierung von retinalen Ganglienzellen (RGCs)15 verwendet wird. TUJ1 ist in allen retinalen Neuronen16 und in frühen Stadien der neuronalen Differenzierung17 vorhanden. Die TUJ1-Expression wurde in allen Reifungsstadien an der Rinde des Organoids gefunden, was die Nachverfolgung der Organisation von Netzhautzellen in Schichten ermöglicht. In Abbildung 3 können wir beobachten, dass TUJ1 in frühen Entwicklungsstadien (40 DIV) gleichmäßig in einer einzigen, dünnen und gleichmäßigen Schicht verteilt ist. Ab 90 DIV wird die apikale Region des Organoids dichter und kompakter, da sie mit viel mehr Zellen besiedelt ist, die sich in der apikalen Region ansammeln. Bei 170 DIV erhielt das retinale Organoid eine 3D-geschichtete Netzhautstruktur mit einer diskreten apikalen Schicht. Bei 200 DIV können wir sehen, dass es andere Zellkörper gibt, die lange Projektionen ausdehnen, die viel weniger zahlreich sind und tiefer im Inneren des Organoids zu finden sind. Bei 250 DIV ist schließlich die Struktur in drei Kernschichten offensichtlich, die folgendem entsprechen: (1) der äußeren Kernschicht (ONL), die von reifen Photorezeptoren gebildet wird, (2) der inneren Kernschicht (INL), die hauptsächlich von Bipolarzellen besiedelt ist, und (3) der Ganglienzellschicht (GCL), die von RGCs gebildet wird, wie in Abbildung 3 (unten rechts) gezeigt.

Abbildung 3: Organisation von Neuronen bei der Reifung von retinalen Organoiden in einer schichtgeschichteten Struktur. Z-Stapel-Projektionen von konfokalen Bildern von FluoClear BABB-clearierten Netzhautorganoiden, die mit TUJ1 gefärbt wurden. Bei 40 DIV bilden sich keine Schichtaufbauten. Ab 170 DIV schichtet sich die Neuroretina in Schichten. Die retinalen Kernschichten sind indiziert: ONL, INL und GCL (gelbe Pfeilspitzen). Maßstabsleisten = 25 μm (links) und 10 μm (rechts). Abkürzungen: BABB = Benzylalkohol/Benzylbenzoat; DIV = Tage in vitro; ONL = äußere Kernschicht, INL = innere Kernschicht; GCL = Ganglienzellschicht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Mit dieser Methode könnten wir auch über die Assemblierung von Axonbündeln berichten. Wie in den vergrößerten Bereichen (Abbildung 4) zu sehen ist, beobachteten wir Faserbündel, die sich vom inneren Kern des Organoids zur Peripherie hin erstreckten und in Bereiche projizierten, die weit voneinander entfernt waren (bis zu 1 mm). Interessanterweise fand die Bildung dieser Fasern in verschiedenen Reifestadien statt. Wenn das Organoid wächst, verdicken sich die Fasern, werden komplexer und sammeln mehr Zellprojektionen (Abbildung 4 [250 DIV] und ergänzendes Video S1). RGCs sind die ersten Zellen, die sich während der Netzhautentwicklung differenzieren, und können daher ihre Projektionen bereits in sehr frühen Entwicklungsstadien anordnen. RGCs können die Neuritenerweiterung einleiten, noch bevor sie ihre endgültige Position innerhalb des Organoids eingenommen haben. Unsere Ergebnisse stimmen mit früheren Berichten18 überein, die die Bildung einer Sehnerven-ähnlichen Struktur in Co-Kulturen von Netzhaut- und Gehirnorganoiden zeigen.

Abbildung 4: Zusammenbau neuronaler Projektionen in verschiedenen Stadien der Reifung. Die Fasern erstrecken sich von den inneren Ebenen des retinalen Organoids in Richtung Peripherie. Die Bildung dieser Fasern erfolgte über verschiedene Reifestadien, von 40 DIV bis zum ältesten untersuchten Reifezeitpunkt (250 DIV). Maßstabsleisten = 25 μm (obere Reihe) und 100 μm (untere Reihe). Abkürzungen: DIV = Tage in vitro. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

An der apikalen Stelle von Netzhaut-Organoiden reifen einige Photorezeptoren zu Stäbchen heran, die Rhodopsin in den äußeren Segmenten enthalten, um monochromatisches Sehen bei schwachem Licht zu erkennen, während andere zu Zapfen heranreifen, die blaue, grüne und rote Opsine exprimieren und für Farbe und Hochschärfe bei hellem Licht verantwortlich sind. Abbildung 5 (oben) zeigt die Population von Zapfen-Photorezeptoren innerhalb des retinalen Organoids, die blaue und/oder grüne/rote Opsine exprimierten (OPSIN B und GR, Tabelle 1). Diese Zellen weisen eine längliche Morphologie auf, wobei die verschiedenen Opsine im gesamten Zellkörper verteilt sind, mit Ausnahme des Zellkerns. Bemerkenswert ist, dass die äußere Spitze dieser Zellen heller erscheint und möglicherweise dem äußeren Segment des Photorezeptors ähnelt, der die Scheiben enthält. Um sowohl blaue als auch grün/rote Zapfen mit einem einzigen Kanal für die Fluoreszenzdetektion sichtbar zu machen, wurden Sekundärantikörper gegen blaues Opsin (OPSIN B, Kaninchen) und grün/rotes Opsin (OPSIN GR, Huhn) mit demselben Fluorophor markiert, wodurch die Kanalnutzung optimiert und der Bildgebungsprozess rationalisiert wurde, während spektrale Überlappungen vermieden wurden. Eine Untergruppe von Photorezeptorzellen in Abbildung 5 (unten) exprimierte Rhodopsin (RHO, Tabelle 1 und ergänzendes Video S2), was eindeutig auf ihre Identität als Stäbchen hinweist. Diese Stäbchenzellen teilen sich die zuvor beschriebene längliche Morphologie, wobei der Zellkern mittig positioniert ist und der opsinreiche Zellkörper zur Peripherie des Organoids hin ausgerichtet ist.

Abbildung 5: Retinale Organoide aus späteren Entwicklungsstadien. Oberseite: ausgereifte Zapfen, unten: Stäbe. Z-Projektion von konfokalen Bildern von FluoClear BABB-clearierten Netzhautorganoiden, die mit TUJ1 (Neuronen), DRAQ5 (Zellkernen), Opsin-B+GR (Zapfen) und RHO (Stäbchen) gefärbt wurden. Schematische Zeichnungen werden als Referenz gezeigt. Maßstabsleisten = 100 μm (links) und 10 μm (rechts). Abkürzungen: DIV = Tage in vitro; BABB = Benzylalkohol/Benzylbenzoat. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die bipolaren Zellen und ihre räumlich-zeitliche Verteilung wurden identifiziert, indem die Chx10-Expression (auch als Vsx2 bekannt) über 250 DIV der Reifung verfolgt wurde (Abbildung 6). Chx10 (Tabelle 1) ist ein Transkriptionsfaktor, der für die Proliferation von Vorläuferzellen und die Bestimmung bipolarer Zellen in der sich entwickelnden Netzhaut entscheidend ist19,20. Als Homöobox-Gen wird es in frühen Entwicklungsstadien in Neuroblasten exprimiert, und in der reifen Netzhaut kommt es ausschließlich in bipolaren Zellen vor. Abbildung 6 zeigt die Verteilung von Chx10-positiven Zellen innerhalb des sich entwickelnden Organoids. Zunächst werden zahlreiche Chx10-positive Zellen beobachtet, die sich von der neuroretinalen Peripherie in Richtung Zentrum erstrecken. Mit zunehmender Reife des Organoids werden diese Zellen weniger häufig und ziehen in das INL um, wo sich die bipolaren Zellen befinden.

Abbildung 6: Chx10-Expression über 250 DIV Reifung. Konfokale Z-Projektionsbilder eines FluoClear BABB-clearierten Netzhautorganoids, das mit DRAQ5 (Zellkerne) und Chx10 (Neuroblasten und reife bipolare Zellen) gefärbt wurde. Maßstabsleiste = 100 μm. Abkürzungen: DIV = Tage in vitro; BABB = Benzylalkohol/Benzylbenzoat. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Schließlich zeigen wir, dass das endogene GFP aus GCaMP-Calciummarkern nach dem Clearing mit dieser Methode erhalten bleibt. In Abbildung 7 sehen wir die Neuroretina von 70 DIV-Netzhautorganoiden, die mit Ad5-CMV-GCaMP6s infiziert und mit Anti-GFP immunmarkiert sind (Tabelle 1), um die Fluoreszenz nach Langzeitfixierung zu verbessern.

Abbildung 7: Endogenes GCaMP, das in der FluoClear BABB-Clearingmethode konserviert wurde. Ein 70 DIV-Netzhautorganoide, das mit Ad5-CMV-GCaMP6s infiziert ist, immunmarkiert mit Anti-GFP (GCaMP-exprimierende Zellen), Chx10 (Neuroblasten und bipolare Zellen im Frühstadium) und DRAQ5 (Zellkerne). Maßstabsleisten = 100 μm (links) und 25 μm (rechts). Abkürzungen: BABB = Benzylalkohol/Benzylbenzoat; DIV = Tage in vitro. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzendes Video S1: 3D-Rekonstruktion eines retinalen Organoids, das eine Ansammlung von neuronalen Projektionen zeigt. Z-Projektion von konfokalen Bildern von FluoClear BABB-clearierten retinalen Organoiden bei 250 DIV, gefärbt mit TUJ1 (Neuronen), dargestellt in violett und DRAQ5 (Zellkerne) in gelb. Abkürzungen: BABB = Benzylalkohol/Benzylbenzoat; DIV = Tage in vitro. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Ergänzendes Video S2: 3D-Rekonstruktion der in der Oberfläche eines retinalen Organoids ausgerichteten Stäbchen in späten Entwicklungsstadien (200 DIV). Z-Projektion von konfokalen Bildern von FluoClear BABB-clearierten Netzhautorganoiden bei 200 DIV, gefärbt mit RECOV (Photorezeptoren) in grün und RHO (Stäbchen) in violett. Abkürzungen: DIV = Tage in vitro; BABB = Benzylalkohol/Benzylbenzoat. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte anzugeben.