Method Article

Transmissionselektronenmikroskopie als Visualisierungstechnik zur Analyse der zirkadianen synaptischen Plastizität im Fasskortex der Maus

DOI:

10.3791/68385

⸱

August 19th, 2025

 ,  , 
1Department of Cell Biology and Imaging, Institute of Zoology and Biomedical Research, Faculty of Biology, Jagiellonian University, 2Department of Histology, Jagiellonian University Medical College

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das vorgestellte Protokoll beschreibt den Einsatz der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) zur Quantifizierung zirkadianer Veränderungen im Zylinderkortex der Maus, wobei der Schwerpunkt auf der Synapsenzahl und der Morphologie der dendritischen Wirbelsäule liegt.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Untersuchung der zirkadianen synaptischen Plastizität erfordert die Unterbringung von Mäusen unter verschiedenen Lichtbedingungen (Hell-Dunkel-Zyklus, LD 12:12 und konstante Dunkelheit, DD), den Zugang zu Laufrädern und deren Opferung zu vier definierten Zeitpunkten innerhalb von 24 Stunden - zu Beginn und Mitte des Tages/subjektiven Tages und zu Beginn und Mitte der Nacht/subjektive Nacht. Das Gehirn wird dann für die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) richtig fixiert. Der Fasskortex mit seiner präzisen somatotopischen Organisation bietet ein ideales Modell für eine solche Analyse. Um den erforderlichen Gehirnbereich zu erhalten, werden die Gehirne tangential mit einem Vibratom geschnitten, und dann werden Abschnitte, die den Fasskortex enthalten, ausgewählt und in Polybed-Harz eingebettet. Aus den vorbereiteten Blöcken, die die ausgewählten Fässer enthalten, werden aufeinanderfolgende ultradünne Abschnitte geschnitten. Die synaptische Dichte, exzitatorisch und inhibitorisch, wird anhand von elektronenmikroskopischen Aufnahmen mit der Methode des stereologischen Dissektors analysiert. Darüber hinaus werden TEM-Bilder für 3D-Rekonstruktionen von dendritischen Dornen verwendet. Veränderungen in der Form der dendritischen Dornen deuten auf einen Umbau der Neuronen im Laufe des Tages hin. Die Anzahl der exzitatorischen Synapsen ist bei Mäusen während des Schlafs (tagsüber) am höchsten, während die inhibitorischen Synapsen während ihrer Aktivitätsphase (mitten in der Nacht) ihren Höhepunkt erreichen.

Introduction

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Zirkadiane Rhythmen werden bei fast allen Prozessen in einem Organismus durch zirkadiane Uhren erzeugt. Bei Tieren und Menschen wurden sie sowohl auf molekularer, zellulärer und gesamter Ebene als auch in ihrem Verhalten nachgewiesen. Das zirkadiane System eines Organismus besteht aus der zirkadianen Hauptuhr (Herzschrittmacher) und den peripheren Uhren. Alle zirkadianen Uhren erzeugen zirkadiane Schwingungen durch die zyklische Expression von Uhrengenen, die von ihren Proteinen gesteuert werden. Der molekulare Mechanismus der Uhr erzeugt zirkadiane Rhythmen mit einer Periode von ~1 Tag (länger oder kürzer als 24 Stunden), aber unter Tag-/Nachtbedingungen ist die Periode der endogenen Rhythmen auf 24 Stunden synchronisiert. In der Physiologie des Nervensystems von Wirbellosen und Wirbeltieren wurden viele zirkadiane Rhythmen nachgewiesen; Einige Studien haben jedoch gezeigt, dass sie auch in der synaptischen und neuronalen Plastizität vorhanden sind, d.h. in Veränderungen in der Anzahl und Struktur von Synapsen und Dendriten 1,2,3,4.

Der somatosensorische Kortex der Maus bietet aufgrund seiner gut definierten Organisation und seiner direkten Verbindung zur Bewegungsaktivität der Tiere einen hervorragenden Ort für die Untersuchung der synaptischen Plastizität während des Tages 5,6,7,8,9. In Schicht IV des somatosensorischen Kortex gibt es ausgeprägte neuronale Strukturen (Fässer), die auch in einem ungefärbten Gehirn sehr auffällig sind10,11. Ihre Anordnung spiegelt die Morphologie und Organisation der Schnurrhaare an der Schnauze des Tieres wider und ermöglicht eine genaue Kartierung der sensorischen Reize. Die großen Fässer sind in fünf regelmäßigen Reihen angeordnet, die jeweils zwischen vier und sieben Fässer enthalten. Die Reihen von Barrels, die großen Schnurrhaaren entsprechen, sind mit Großbuchstaben von A bis E markiert und stellen die Schnurrhaare dar, die von der Augenpartie nach unten entlang der Schnauze angeordnet sind. Jedes Fass besteht aus zwei Hauptbereichen: der Mulde, dem zentralen Teil, der mit Neuropil gefüllt ist, und der Wand, die als Seite bezeichnet wird und von den Körpern der Sternzellen dominiert wird. Die Fässer sind durch Bereiche mit geringerer Zelldichte, sogenannte Septen, voneinander getrennt. Jedes Fass empfängt Impulse von einem bestimmten Schnurrbart, der sich an der kontralateralen Seite der Schnauze des Tieresbefindet 10,12.

Die Unterteilung in spezifische Fässer, die in regelmäßigen Reihen angeordnet sind, ermöglicht eine schnelle und einfache Identifizierung des gewählten Bereichs10,13. Die Auswahl der Fässer aus Reihe B für die Analyse zirkadianer Veränderungen basiert auf Studien zur aktivitätsabhängigen Plastizität 14,15,16,17. Reihe B zeichnet sich durch gut definierte somatotopische Grenzen aus und enthält nur vier unterschiedliche große Fässer, was die Position in den Proben vereinfacht. Aufgrund ihrer zentralen Position korreliert die neuronale Aktivität von Reihe B mit natürlichem Mausverhalten wie Umwelterkundung und Bewegungsaktivität. Für die Zählung von Synapsen an dendritischen Dornen und Schäften ist es wichtig, die zentralen Teile der Fässer auszuwählen, wo die Zellkörper spärlich sind 12,15,18.

Die Immunhistochemie in Kombination mit der konfokalen Mikroskopie ist eine Technik, die eine entscheidende Rolle bei der Aufklärung der Schlüsselmechanismen der synaptischen Plastizität bei Mäusen gespielt hat. Während die konfokale Mikroskopie hochauflösende Bilder mit reduzierter Hintergrundfluoreszenz und verbesserter Klarheit der Zellstruktur liefert, leidet sie unter Photobleaching und erfordert eine komplexe Probenvorbereitung, die den Zustand biologischer Gewebe verändern kann. Die Abhängigkeit von fluoreszierenden Markern kann aufgrund ihrer Überlappung die Arten von Proteinen, die gleichzeitig untersucht werden können, einschränken. Die konfokale Immunfluoreszenzmikroskopie bietet die Möglichkeit, spezifische Proteine, ihre Expressionsniveaus und die Lokalisation, die mit der synaptischen Aktivität verbunden sind, zu markieren, indem Antikörper zum Nachweis von Zielantigenen in fixierten Gewebeschnitten verwendet werden. Obwohl diese Methode Spezifität und Flexibilität bei der Untersuchung verschiedener Proteine bietet, die an der Neurotransmission beteiligt sind, ist sie durch ihre Unfähigkeit, Echtzeitdaten über dynamische Prozesse zu liefern, aufgrund des beteiligten Fixationsschritts eingeschränkt. Die Inkonsistenz in der Antikörperbindung könnte auch zu unzuverlässigen Ergebnissen führen 19,20,21.

Der Einsatz der Elektronenmikroskopie anstelle von Immunfluoreszenzmethoden mit Lichtmikroskopie ermöglicht eine deutlich höhere Auflösung und höhere Präzision sowohl bei der Auswahl der Lokalisation als auch bei der Unterscheidung neuronaler Strukturen. Schnitte der seriellen Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) helfen dabei, die synaptische Struktur auf ultrastruktureller Ebene sichtbar zu machen und haben den Vorteil, dass sie zur Untersuchung der Synapsenbildung oder -eliminierung verwendet werden können. TEM ermöglicht es Forschern, die physikalischen Eigenschaften von Synapsen und Veränderungen in der Dichte und Struktur, die als Plastizität von Synapsen bezeichnet werden, zu analysieren. Obwohl die Probenvorbereitung und die Bildgebung arbeitsintensiv sind, bietet TEM ein detaillierteres Verständnis der Veränderungen, die während des Lernens, der Gedächtnisbildung und der Verarbeitung sensorischer Informationen sowie während des Tages, des Jahres und des Tieralters auftreten.

Unsere Methode zielt darauf ab, die zirkadiane Dynamik der synaptischen Dichte und Morphologie zu untersuchen, indem wir einen auf mindestens vier Zeitpunkten basierenden Ansatz in Kombination mit der stereologischen Dissektorierungsmethode auf der Grundlage serieller TEM-Bilder verwenden. Die stereologische Dissektorionsmethode ermöglicht eine zuverlässige Schätzung der Synapsenzahlen, selbst wenn nur wenige ultradünne serielle Abschnitte 22,23,24,25,26 verwendet werden. Die gut definierte somatotopische Organisation des Zylinderkortex gewährleistet eine präzise anatomische Auswahl der Untersuchungslokalisationen, während die serielle TEM die Unterscheidung von Synapsentypen (exzitatorisch und inhibitorisch) und deren Lokalisationen (an dendritischen Dornen und Schäften) ermöglicht. Diese Methode stellt ein wertvolles Werkzeug für Forscher dar, die die tägliche und zirkadiane Neuroplastizität untersuchen, und ermöglicht es zu erforschen, wie Umwelt- und interne Faktoren die synaptische Dynamik beeinflussen. Die einzelnen Komponenten unserer Methode ermöglichen ihre Anwendung für die Analyse von Veränderungen der Neuroplastizität in einem viel breiteren Spektrum von Studien, die nicht unbedingt auf zirkadiane Veränderungen beschränkt sind.

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Protocol

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Alle Versuchsverfahren mit Tieren wurden von der zuständigen institutionellen Ethikkommission genehmigt und im Einklang mit der Richtlinie 2010/63/EU des Europäischen Parlaments und des Rates zum Schutz der für wissenschaftliche Zwecke verwendeten Tiere sowie den nationalen Vorschriften durchgeführt. Es wurden alle Anstrengungen unternommen, um das Leiden der Tiere zu minimieren und die Anzahl der verwendeten Tiere zu reduzieren.

1. Vorbereitung des Gehirngewebes

  1. Opfern Sie Mäuse zu vier verschiedenen Zeitpunkten alle 6 Stunden über einen 24-Stunden-Zyklus, sowohl bei hell/dunkler (LD 12:12) als auch bei konstanter Dunkelheit (DD) (Abbildung 1). Unter LD 12:12-Bedingungen beziehen Sie sich auf die Zeitgeberzeit (ZT), wobei ZT0 dem Beginn der Lichtphase und ZT12 dem Beginn der Dunkelphase entspricht. Bei ständiger Dunkelheit beziehen Sie sich auf die zirkadiane Zeit (CT), wobei CT0 den Beginn des subjektiven Tages und CT12 den Beginn der subjektiven Nacht darstellt.
    HINWEIS: Die Zeitpunkte sind ZT0/CT0 (Tagesanfang, subjektiver Tag), ZT6/CT6 (Mitte des Tages, subjektiver Tag), ZT12/CT12 (Beginn der Nacht, subjektive Nacht) und ZT18/CT18 (Mitte der Nacht, subjektive Nacht).
  2. Perfundieren und fixieren Sie das Gehirn von Mäusen mit 2,5 % Glutaraldehyd und 2 % Paraformaldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,4).
  3. Jedes Gehirn aus dem Schädel entfernen und in einer Fixierlösung (2,5 % Glutaraldehyd und 2 % Paraformaldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,4) für 24 h bei 4 °C belassen.
  4. Um das Gehirn auf die Teilung vorzubereiten, schneiden Sie das Kleinhirn ab und teilen Sie das Gehirn in zwei Hemisphären (Abbildung 2A, B).
  5. Wählen Sie eine Hemisphäre (rechts oder links) und richten Sie sie so aus, dass die Abschnitte tangential zum Zylinderkortex geschnitten werden. Montieren Sie die ausgewählte Halbkugel auf das Vibrationsfutter und kleben Sie sie fest (Abbildung 2C).
  6. Schneiden Sie Schnitte mit einer Dicke von 60 μm (Geschwindigkeit des Vibrationsabschnitts: 7,10 und Frequenz: 5,00) (Abbildung 2D) und übertragen Sie die Abschnitte dann in die Mischung aus 0,1 M Phosphatpuffer und Fixierlösung (Verhältnis 1:5).
  7. Untersuchen Sie Schnitte unter einem Lichtmikroskop mit 4-facher Vergrößerung und sammeln Sie für den nächsten Schritt nur diejenigen mit dem sichtbaren Tonnenfeldkortex (Abbildung 2E). Verwenden Sie den konkaven Schieber, um sicherzustellen, dass der Abschnitt ständig in Flüssigkeit bleibt.

2. Fixierung und Sektion des Gehirns

  1. Verwenden Sie einen Pinsel und geben Sie das Taschentuch vorsichtig in eine kleine Petrischale aus Glas. Spülen Sie anschließend die Gehirnabschnitte 3 x 5 min lang mit dem 0,1 M Cacodylat-Puffer (BC, pH 7,4).
  2. Die Abschnitte in 1 % Osmiumtetroxid (OsO4) in 0,1 M BC mit 1,5 % Kaliumferricyanid fixieren und 1 h bei +4 °C stehen lassen.
    HINWEIS: Bereiten Sie die OsO4-Lösung unmittelbar vor der Verwendung vor, da OsO4 instabil ist und seine Aktivität mit der Zeit abnimmt.
  3. Nachträgliche Schnitte in 1 % OsO4 in 0,1 M BC-Lösung für 1 h bei Raumtemperatur herstellen.
    HINWEIS: Führen Sie alle diese Schritte mit Schutzhandschuhen und unter dem Abzug mit gut funktionierender Belüftung durch, da OsO4 sehr giftig ist.
    Der Abfall sollte in einer separaten Flasche mit dichtem Verschluss aufbewahrt werden. Lassen Sie das Produkt nicht in die Abflüsse gelangen.
  4. Nach der Fixierung die Abschnitte 2 x 5 min in destilliertem Wasser abspülen.
  5. Im nächsten Schritt werden die Hirnschnitte 40 Minuten lang in der Lösung von 70 % Ethanol mit 1 % Uranylacetat inkubiert. Verwenden Sie nach dem Mischen eine Spritze mit einem Filter (25 mm) und gießen Sie langsam 2 ml der Lösung mit den Geweben in jede Petrischale.
  6. Dehydrieren Sie das Gewebe in aufsteigenden Alkoholkonzentrationen: 70 %, 80 % und 90 % Ethanol für jeweils 5 Minuten und 100 % Ethanol jeweils 3 x 5 Minuten.
    HINWEIS: Es ist möglich, Taschentücher über Nacht bei +4 °C in 70%igem Ethanol zu belassen.
  7. Tücher in Propylenoxid 2 x 10 Min. waschen.
    HINWEIS: Propylenoxid ist eine stark korrosive Chemikalie; Verwenden Sie es mit Vorsicht, während Sie Schutzhandschuhe tragen und unter dem Abzug arbeiten. Die Verwendung eines Glasbehälters (Petrischale aus Glas) ist für diesen Schritt von entscheidender Bedeutung.
    Propylenoxid ist eine hochentzündliche Flüssigkeit und Dampf. Die Abfälle müssen in einem separaten, dicht verschlossenen Glasbehälter aufbewahrt werden. Lassen Sie das Produkt nicht in die Abflüsse gelangen, da Explosionsgefahr besteht.
  8. Ersetzen Sie Propylenoxid durch eine Mischung aus Polybed-Harz und Propylenoxid (Verhältnis 1:1). Gießen Sie mindestens 2 ml der Lösung in jede Petrischale mit den Abschnitten, decken Sie sie mit einem Deckel ab und inkubieren Sie sie 40 Minuten lang.
  9. Zum Schluss betten Sie Hirnschnitte in die Mischung aus Polybed-Harz und Propylenoxid (Verhältnis 3:1) ein. Verwenden Sie mindestens 2 ml der Mischung pro Petrischale, decken Sie sie ab und lassen Sie sie 1,5 h einwirken.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Taschentücher vollständig eingetaucht sind und stellen Sie sicher, dass sie nicht über der Flüssigkeit schwimmen.
  10. Schneiden Sie die Aclar-Folie in Stücke in der Größe eines Objektträgers. Tragen Sie mit einer Kunststoffpipette eine kleine Menge Harz auf die Aclar-Folie auf und übertragen Sie die Gehirnabschnitte aus der Petrischale mit einem Pinsel auf das Harz. Betten Sie jeden Abschnitt zwischen zwei Aclar-Folien ein und inkubieren Sie ihn 48 Stunden lang in einem 65 °C-Ofen, um zu polymerisieren.

3. Bildgebung und Schnitt des Fasskortex

  1. Fotografieren Sie Hirnschnitte bei 2-facher Objektivvergrößerung mit einem Lichtmikroskop (Abbildung 2F).
  2. Sammeln Sie alle Bilder und importieren Sie sie in Grafiksoftware.
    1. Um Bilder zu öffnen, klicken Sie auf Datei |Öffnen Sie die Bilder und wählen Sie sie mit Umschalttaste |Öffnen. Die Bilder werden in separaten Fenstern geöffnet.
    2. Beginnen Sie mit dem Stapeln von Bildern aus dem Kortex (dem kleinsten Stück) und fahren Sie fort, bis alle Abschnitte korrekt ausgerichtet sind.
    3. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf Layer 1 |Duplizieren Sie die Ebene auf jedem Bild. Geben Sie im Dialogfeld die Bildnummer als Namen ein, wählen Sie ein Bild als Zieldatei aus und klicken Sie auf OK. Wiederholen Sie diese Schritte für alle Bilder und duplizieren Sie sie in dieselbe Zieldatei.
    4. Richten Sie die Bilder aus, um das Tonnenfeld zu rekonstruieren und die richtige anatomische Reihenfolge zu gewährleisten. Verwenden Sie das Verschieben-Werkzeug, um jede Ebene manuell zu positionieren, und klicken Sie dann auf Bearbeiten |Transformieren |Drehen oder Spiegeln, um die Ausrichtung bei Bedarf anzupassen. Um die Ausrichtung zu optimieren, verwenden Sie Bearbeiten | Transformieren | Verzerren und verschieben Sie die Ecken des Bildes, um sie unabhängig voneinander an die anatomischen Strukturen anzupassen. Um die Ausrichtung zu erleichtern, stellen Sie den Füllmodus der obersten Ebene im Ebenenbedienfeld auf "Überlagerung" ein.
    5. Vergleichen Sie anatomische Orientierungspunkte wie Fassumrisse und Blutgefäße, um eine korrekte Positionierung zu gewährleisten. Um den Stack zu speichern, klicken Sie auf Datei |Speichern unter, benennen Sie die Datei und wählen Sie ihr Format (PSD oder TIFF); Klicken Sie dann auf OK.
  3. Überprüfen Sie die verschiedenen Abschnitte, die das Fassfeld enthalten, nacheinander, und identifizieren Sie in jedem Abschnitt sichtbare Fässer.
  4. Umreißen Sie jedes sichtbare Fass manuell auf einer zusätzlichen gemeinsamen Schicht, um die Rekonstruktion des gesamten Lauffeldes zu gewährleisten. Um einen zusätzlichen Layer zu erstellen, klicken Sie auf Layer |Neu |Layer, benennen Sie den Layer, und klicken Sie auf OK. Wählen Sie das Pinselwerkzeug aus der Symbolleiste aus und zeichnen Sie auf der neuen Ebene manuell jedes sichtbare Fass.
    1. Für eine höhere Präzision verwenden Sie den Zoom und passen Sie die Pinselgröße nach Bedarf an. Um das Bild zu vergrößern und zu verkleinern, verwenden Sie das Zoom-Werkzeug oder drücken Sie Strg + "+" / Strg + "-". Um die Pinselgröße zu ändern, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Leinwand, während das Pinselwerkzeug aktiv ist, und verschieben Sie den Schieberegler Größe .
  5. Identifizieren Sie das ausgewählte Fass anhand dieser Rekonstruktion.
  6. Finden Sie das ausgewählte Fass unter dem Lichtmikroskop anhand des Musters des Fassfeldes (fünf Reihen mit jeweils vier bis sieben Zylindern) und der Anordnung der Blutgefäße, die seine Position innerhalb des Fassfeldes anzeigen.
  7. In jedem Schnitt mit einem sichtbaren Zylinderkortex wird der ausgewählte Zylinder unter einem Stereomikroskop identifiziert und zusammen mit dem angrenzenden mit einer Rasierklinge ausgeschnitten.
  8. Entferne das kleine Stück aus dem Abschnitt, klebe es auf einen Harzblock und lege es zum Trocknen weg. Schneiden Sie später das überschüssige Harz ab, das das Gewebe umgibt.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Sie das Stück Taschentuch flach auf die Oberfläche des Harzes legen.
  9. Verwenden Sie ein Ultramikrotom und ein Diamantmesser, um ultradünne aufeinanderfolgende Abschnitte (3-6 Abschnitte, 65 nm Dicke) zu schneiden (Abbildung 3A) und auf formvar-beschichteten Nickelgittern mit einem Schlitz (2 x 0,75 mm) zu sammeln.
  10. Nach dem Trocknen werden die Proben 3 min lang mit 2 % Uranylacetat und 1,5 min mit 0,03 % Bleicitrat kontrastiert.
    HINWEIS: Als Kontrast dazu ist es wichtig, die Gitter ein paar Mal zu waschen und sie nach jedem Schritt vollständig trocknen zu lassen. Verwenden Sie Spritzen mit Filtern für Uranylacetat und Bleicitrat.
  11. Nehmen Sie aufeinanderfolgende Bilder aus dem Hohlraum des ausgewählten Zylinders (z. B. B2) unter einem TEM (80 kV Beschleunigungsspannung bei 4K- oder 8K-Vergrößerung, je nach dem für die Analyse erforderlichen Bereich und Volumen) auf.
    HINWEIS: In der Regel wird mindestens ein Gesamtvolumen von 100μm 3 pro Tier analysiert.

4. Bildanalyse

HINWEIS: Das Erstellen und Ausrichten von Stapeln von TEM-Bildern kann auf die gleiche Weise sowohl mit freier (wie GIMP) als auch mit kommerzieller Software (z.B. Photoshop) erfolgen. Auch Rekonstruktionen können auf die gleiche Weise sowohl mit kommerzieller Software (z.B. 3D Studio Max) als auch mit völlig kostenlosen Programmen wie Blender durchgeführt werden.

  1. Um die Dichte der Synapsen zu schätzen, stapeln Sie mindestens drei TEM-Bilder in der Grafiksoftware (Abbildung 6). Je größer die Anzahl der Serienbilder, desto höher die Genauigkeit der Berechnungen.
    1. Um Bilder zu öffnen, klicken Sie auf Datei |Öffnen Sie die Bilder und wählen Sie sie mit Umschalttaste |Offen; Die Bilder werden in separaten Fenstern geöffnet.
    2. Klicken Sie für jedes Bild mit der rechten Maustaste auf Layer 1 |Ebene duplizieren. Geben Sie im Dialogfeld die Bildnummer als Namen ein, wählen Sie ein Bild als Ziel aus und klicken Sie auf OK. Wiederholen Sie die gleichen Schritte für alle Bilder und duplizieren Sie sie am selben Zielort.
    3. Um den Stack zu speichern, klicken Sie auf Datei |Speichern unter, benennen Sie die Datei, wählen Sie das Format (PSD oder TIFF) und klicken Sie auf OK.
  2. Um TEM-Bilder auszurichten, wählen Sie die oberste Bildebene aus und stellen Sie den Mischmodus im Ebenenbedienfeld auf Überlagerung ein. Verwenden Sie Bearbeiten |Transformieren |Drehen oder das Flip-Werkzeug, um die Bildausrichtung anzupassen. Verwenden Sie das Verschieben-Werkzeug , um Strukturen auszurichten.
    1. Für genauere Anpassungen verwenden Sie Bearbeiten |Transformieren | Verzerren , um die Ecken des Bildes unabhängig voneinander zu verschieben. Um die Genauigkeit zu erhöhen, halten Sie die Strg-Taste gedrückt, und ziehen Sie einzelne Eckpunkte. Verwenden Sie Änderungen in der Größe und Form der Mitochondrien und axonalen Myelinscheiden zwischen aufeinanderfolgenden TEM-Bildern, um die korrekte Reihenfolge der Bilder zu überprüfen.
  3. Verwenden Sie eine Dissektormethode zum Zählen von Synapsen.
    1. Fügen Sie dem EM-Bildstapel eine Ebene hinzu, indem Sie auf Ebene |Neu |Ebene |In Ordnung. Stellen Sie sicher, dass die neue Ebene transparent ist (ohne Hintergrundfüllung).
    2. Um den Analysebereich zu definieren, klicken Sie auf Layer |Neu |Ebene |In Ordnung; wählen Sie dann das Rechteck-Werkzeug aus, gehen Sie zu Ebene |Ebenenstil |Kontur, legen Sie die Konturfarbe, die Dicke (Größe) und die Position (Innen empfohlen) fest, klicken Sie auf OK und zeichnen Sie ein Rechteck. Wählen Sie Füllung: 0 %. Markieren Sie alle Synapsen, die in den TEM-Bildern vorhanden sind und zwei benachbarte ausgewählte Kanten des Rechtecks nicht kreuzen (z. B. rechts und unten oder oben und links).
    3. Fügen Sie einen neuen Layer für Anmerkungen hinzu, indem Sie auf Layer |Neu |Ebene |In Ordnung. Verwenden Sie das Pinselwerkzeug , um Synapsen auf der neuen Ebene zu markieren. Verwenden Sie das Zoom-Werkzeug und das Handwerkzeug für eine präzise Markierung.
    4. Wählen Sie eine Farbe, um exzitatorische Synapsen zu markieren, und eine andere für inhibitorische Synapsen. Um die Farbe zu ändern, klicken Sie auf das Feld für die Vordergrundfarbe in der Symbolleiste, wählen Sie eine Farbe im Farbwähler-Fenster aus und klicken Sie auf OK.
  4. Wenn TEM-Bilder große Strukturen enthalten (z. B. myelinisierte Nervenfasern, große Dendriten oder Teile des Zellkörpers), verwenden Sie ein Gitter mit mehreren Quadraten. Dies ermöglicht den Ausschluss von Quadraten, die vollständig von großen Strukturen belegt sind.
    1. Fügen Sie eine neue transparente Ebene hinzu, indem Sie auf Ebene |Neu |Ebene |In Ordnung. Aktivieren Sie die Rasteransicht , indem Sie auf Ansicht |Anzeigen |Raster und aktivieren Sie das Einrasten am Raster, indem Sie auf Ansicht |Fangen an |Raster.
    2. Legen Sie den Rasterabstand fest, indem Sie auf Bearbeiten |Einstellungen |Hilfslinien, Raster & Scheiben. Wählen Sie das Linienwerkzeug aus, stellen Sie den Modus auf "Form " oder "Pixel" ein, legen Sie die Linienstärke fest (z. B. 1 px) und zeichnen Sie vertikale und horizontale Linien entlang des sichtbaren Rasters, um den gesamten Bildbereich abzudecken.
  5. Definieren Sie die Abschnitte "top" und "bottom" für jeden Image-Stack. Zählt nur Synapsen, die im letzten Bild nicht vorhanden sind, aber in den vorherigen Bildern vorhanden sind. Dies ermöglicht eine genaue Identifizierung von Synapsen, ohne ihre Anzahl zu überschätzen.
  6. Verwenden Sie die Skala auf dem Bild und berechnen Sie das Volumen der Probe (Stapel von TEM-Bildern). Messen Sie den Bereich, in dem die Synapsen gezählt werden, und multiplizieren Sie ihn mit der Anzahl der TEM-Bilder im Stapel und der Dicke der ultradünnen Schnitte.
  7. Teilen Sie die Anzahl der Synapsen durch das Volumen, um die Synapsendichte pro Volumeneinheit zu bestimmen.
  8. Verwenden Sie alle TEM-Bilder, die einen dendritischen Dorn enthalten (in der Regel 10-12 aufeinanderfolgende elektronenmikroskopische Aufnahmen), um einen dendritischen Dorn und die von ihm gebildeten Synapsen zu rekonstruieren.
    1. Öffnen Sie den Bildstapel in der Grafiksoftware. Wählen Sie das Freistellungswerkzeug aus, markieren Sie den Bereich mit dem dendritischen Rücken im Stapel und drücken Sie die Eingabetaste. Der ausgewählte Bereich wird in allen sichtbaren Ebenen beschnitten. Machen Sie jeweils nur eine Ebene sichtbar, blenden Sie andere Ebenen mit dem Augensymbol im Ebenenbedienfeld aus.
    2. Speichern Sie jedes zugeschnittene Bild separat, indem Sie auf Datei |Speichern unter, benennen Sie die Datei, wählen Sie ein Format (JPG empfohlen) und klicken Sie auf OK. Wiederholen Sie den Vorgang für jede Ebene im Stapel.
      HINWEIS: Bevor Sie die Bilder in eine 3D-Rekonstruktionssoftware übertragen, ist es am besten, zuerst die Elemente, die rekonstruiert werden, mit Farben zu markieren.
    3. Fügen Sie einen neuen Layer für die Beschriftung hinzu, indem Sie auf Layer | Neu |Ebene | In Ordnung.
    4. Stellen Sie die Deckkraft der Ebene im Ebenenbedienfeld auf 30-50 % ein.
    5. Wählen Sie das Pinselwerkzeug aus, wählen Sie für jede Struktur eine andere Farbe (z. B. dendritischer Stachel, Synapse) und markieren Sie die Elemente. Arbeiten Sie nur an der neuen Ebene, um das Originalbild beizubehalten. Wenn Sie fertig sind, führen Sie die Anmerkungsebene mit dem Bild zusammen, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die oberste Ebene, und führen Sie sie nach unten zusammen. Wiederholen Sie diese Schritte für jedes TEM-Bild, das einen Querschnitt der dendritischen Wirbelsäule enthält.
  9. Übertragen Sie die TEM-Bilder mit sichtbaren Querschnitten des dendritischen Dorns in eine 3D-Rekonstruktionssoftware. Um das Standard-Cube-Objekt zu löschen, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Objekt, und löschen Sie es. Um die Perspektive des Ansichtsfensters vor dem Hochladen von Bildern auszurichten, klicken Sie auf dem Navigations-Gizmo auf Z oder drücken Sie Ziffernblock 7. Um Bilder hochzuladen, klicken Sie auf Hinzufügen |Bild |Referenz, wählen Sie das erste Bild aus und doppelklicken Sie zur Bestätigung darauf. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jedes Bild, um sicherzustellen, dass die Perspektive des Ansichtsfensters durchgehend konsistent bleibt.1
    HINWEIS: Um die Ansicht zu drehen, halten Sie die mittlere Maustaste gedrückt und bewegen Sie die Maus, oder verwenden Sie das Navigationsgerät. Um die Ansicht zu schwenken, halten Sie Umschalttaste + mittlere Maustaste gedrückt, bewegen Sie die Maus, oder verwenden Sie Ansicht verschieben.
  10. Ordnen Sie die TEM-Bilder unter Berücksichtigung der Dicke der ultradünnen Schnitte im entsprechenden Abstand an (Abbildung 4A). Um das letzte TEM-Bild entlang der Z-Achse zu positionieren, klicken Sie auf das Bild, klicken Sie auf Objekteigenschaften (rechte Seitenleiste) und geben Sie den Wert in Position Z ein. Die Bilder können nun zwischen dem ersten und dem letzten Bild verteilt werden. Um sie zu verteilen, wählen Sie alle Bilder aus, drücken Sie N , um das N-Panel zu öffnen, und klicken Sie auf die Registerkarte Bearbeiten (im N-Panel) | Dist Z.
    HINWEIS: Bevor Sie Anpassungen vornehmen, richten Sie die Perspektive des Ansichtsfensters aus, und klicken Sie auf dem Navigations-Gizmo auf Z, oder drücken Sie Ziffernblock 7.
    Das Werkzeug Verteilen muss aktiviert sein, um die Bilder zu verteilen. Um es zu aktivieren, gehen Sie zu Bearbeiten | Einstellungen | Holen Sie sich Erweiterungen, suchen Sie nach "Verteilen" und klicken Sie auf Installieren. Nach der Aktivierung bleibt das Werkzeug "Verteilen" sitzungsübergreifend aktiv und muss nicht erneut aktiviert werden, solange dieselbe Version des Programms verwendet wird.
  11. Umreißen Sie die Form des dendritischen Dorns auf jedem Bild manuell mit einer einzigen Kurve pro TEM-Bild (Abbildung 4B, C).
    1. Stellen Sie sicher, dass nur das erste TEM-Bild sichtbar ist. Blenden Sie in der Szenensammlung alle anderen Objekte mit dem Augensymbol aus. Um eine Basiskurve für den Umriss zu erstellen, klicken Sie auf Hinzufügen |Kurve |Kreis. Verschieben Sie das BézierKreis-Objekt, halten Sie G gedrückt, bewegen Sie die Maus, und klicken Sie, um die Änderungen zu übernehmen .
    2. Um die Größe des dendritischen Stachelprofils anzupassen, skalieren Sie das Objekt, halten Sie S gedrückt, bewegen Sie die Maus, und klicken Sie. Rufen Sie die Registerkarte Modellierung auf, während das Objekt Bézierkreis ausgewählt ist. Richten Sie die Perspektive des Ansichtsfensters erneut aus, und klicken Sie auf dem Navigations-Gizmo auf Z , oder drücken Sie Ziffernblock 7.
    3. Um die Form der Kurve anzupassen, wählen Sie einen Steuerpunkt aus, halten Sie G gedrückt, bewegen Sie die Maus und klicken Sie.
    4. Um die Richtung und Stärke der Griffe anzupassen, wählen Sie einen Griffpunkt aus, drücken Sie G zum Verschieben oder S zum Skalieren und klicken Sie zur Bestätigung. Wiederholen Sie den Vorgang für jeden Punkt.
    5. Um einen neuen Kontrollpunkt hinzuzufügen, wählen Sie zwei vorhandene Steuerpunkte aus, halten Sie die Umschalttaste gedrückt, und klicken Sie auf jeden Punkt, klicken Sie mit der rechten Maustaste, und wählen Sie Unterteilen. Wenn die Kurve ausreichend mit der Begrenzung des dendritischen Spine-Profils übereinstimmt, rufen Sie die Registerkarte Layout auf, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Bézierkreis-Objekt und das Objekt duplizieren und klicken Sie, ohne die Maus zu bewegen. Erstellen Sie die gleiche Anzahl von Béziercircle-Kopien, wie TEM-Bilder für die Rekonstruktion verwendet werden. Richten Sie diese mit dem Verteilen-Werkzeug wie in Schritt 4.10 an den angeordneten TEM-Bildern aus.
    6. Passen Sie jede Bézierkreis-Kurve auf der Registerkarte Modellierung an das dendritische Wirbelsäulenprofil in jedem Bild an. Stellen Sie sicher, dass jeweils nur das aktuell bearbeitete BézierKreis-Objekt und das entsprechende TEM-Bild sichtbar sind.
      HINWEIS: Alle Rechtsklickaktionen, die für bestimmte Schritte erforderlich sind, müssen innerhalb der Szenengrenze ausgeführt werden. Die aufeinanderfolgenden Kurven müssen den Grenzen aufeinanderfolgender dendritischer Dornabschnitte entsprechen und die gleiche Anzahl von Kontrollpunkten enthalten.
  12. Verbinden Sie benachbarte Linien mit der 3D-Rekonstruktionsfunktion, um eine durchgehende Oberfläche zu bilden und die endgültige 3D-Form zu erstellen (Abbildung 4D).
    1. Stellen Sie sicher, dass nur die BézierKreis-Objekte sichtbar sind. Blenden Sie in der Szenensammlung alle anderen Objekte mit dem Augensymbol in der Seitenleiste aus.
    2. Um das dendritische Spine-Objekt zu erstellen, wechseln Sie zur Registerkarte Layout , wählen Sie alle BézierKreis-Objekte aus, klicken Sie mit der rechten Maustaste, und klicken Sie auf Verbinden. Konvertieren Sie das verbundene Objekt in ein Netz, indem Sie mit der rechten Maustaste klicken und Konvertieren in |Netz.
    3. Um die Kanten des verbundenen Objekts zu verbinden, rufen Sie die Registerkarte Modellierung auf, drücken Sie 2 , um den Kantenauswahlmodus aufzurufen |Auswählen |Alle |Rechtsklick |Kantenschleifen überbrücken.
    4. Um die Lücke am oberen Rand des Objekts zu füllen, heben Sie die Auswahl auf, indem Sie neben dem Objekt klicken, halten Sie die Alt-Taste gedrückt und klicken Sie auf einen Kantenabschnitt der oberen Kante, klicken Sie mit der rechten Maustaste, wählen Sie Kanten extrudieren, ziehen Sie auf der Z-Achse nach oben, drücken Sie S und bewegen Sie die Maus , um die neue Kantenschleife zu verkleinern, klicken Sie, um die Änderung zu übernehmen. Während die neue Kantenschleife noch ausgewählt ist, klicken Sie mit der rechten Maustaste, und wählen Sie Neue Fläche aus Kanten aus. Füllen Sie den unteren Spalt mit der gleichen Methode.
    5. Um das Objekt zu glätten, rufen Sie die Registerkarte Layout auf, klicken Sie mit der rechten Maustaste, und wählen Sie Schattierung glätten aus. Um die Form weiter zu glätten, gehen Sie zu Modifikatoren (rechte Seitenleiste) |Modifikator "Hinzufügen" |Generieren |Unterteilungsfläche. Legen Sie sowohl die Ansichtsfenster - als auch die Renderebene auf denselben Wert fest (empfohlen 1).
  13. Wiederholen Sie die Schritte 4.11-4.12 für die Synapsenrekonstruktion (Abbildung 4E,F).
  14. Weisen Sie jeder Struktur eine Farbe zu und verwenden Sie die Rendering-Funktion, um das endgültige Bild vorzubereiten (Abbildung 4G,H). Gehen Sie zum Menü Ansichtsfensterschattierung und wählen Sie Gerendert, um eine Vorschau der Materialänderungen anzuzeigen. Wählen Sie das Objekt aus, das eingefärbt werden soll, und klicken Sie auf Material (rechte Seitenleiste) |Neu |Grundfarbe anpassen.
    1. Um das Erscheinungsbild des Materials zu verfeinern, passen Sie die Schieberegler "Rauheit " oder "Metallic " nach Bedarf an. Verwenden Sie diese Methode, um jeder Struktur eine eigene Farbe zuzuweisen.
    2. Um die Szenenbeleuchtung anzupassen, klicken Sie auf das Lichtobjekt, halten Sie G gedrückt und bewegen Sie die Maus, um es neu zu positionieren. Um die Lichtintensität zu ändern, gehen Sie zu Daten (rechte Seitenleiste) und passen Sie den Leistungswert an.
    3. Um die Kamera zu positionieren, richten Sie das Ansichtsfenster so aus, dass es auf die rekonstruierte Wirbelsäule zeigt, wie sie im endgültigen Bild aussehen sollte, und drücken Sie Strg + Alt + Ziffernblock 0. Wählen Sie den sichtbaren Kamerarahmen aus, halten Sie G gedrückt und bewegen Sie die Maus, um ihn bei Bedarf neu zu positionieren.
    4. Um das Rendern vorzubereiten, gehen Sie zur Ausgabe (rechte Seitenleiste) und ändern Sie die Auflösungswerte X und Y , um sie an das gewünschte Bild anzupassen. Um die Bildqualität zu verbessern, gehen Sie zu Rendern (rechte Seitenleiste) |Rendern, passen Sie den Samples-Wert auf 120 bis 250 an. Um einen transparenten Hintergrund zu erhalten, gehen Sie zu Rendern |Film |Aktivieren Sie Transparent. Um das Bild zu rendern, drücken Sie F12 oder gehen Sie zu Rendern (oberes Menü) |Bild rendern.

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Results

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Um unsere Methode richtig auf die Analyse zirkadianer synaptischer Veränderungen anzuwenden, ist es notwendig, zunächst mindestens vier Zeitpunkte in gleichen Abständen auszuwählen, mit zwei Punkten für jede Phase der Aktivität der Tiere (alle 6 Stunden). Zu diesen festgelegten Zeitpunkten werden die Tiere geopfert und ihre Gehirne gesammelt. Dieser Ansatz ermöglicht die Identifizierung von täglichen oder zirkadianen Mustern der synaptischen Plastizität und verknüpft sie mit Veränderungen in der Bewegungsaktivität der Ti...

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Discussion

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In dieser Arbeit stellten wir die Methodik vor, die zur Untersuchung der zirkadianen Plastizität von Synapsen und der Rekonstruktion dendritischer Stacheln in der Fassrinde von Mäusen verwendet wird. Um zuverlässige Ergebnisse zu gewährleisten, sollte die Studie zur zirkadianen Plastizität mindestens vier Zeitpunkte umfassen. Unsere Forschung zeigte, dass Daten von zwei Zeitpunkten -- einer während der Ruhephase (Tag) und einer während der Aktivitätsphase (Nacht) -- Informationen über di...

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Disclosures

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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte anzugeben.

Acknowledgements

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Diese Arbeit wird durch Zuschüsse des Nationalen Wissenschaftszentrums in Polen, NCN OPUS20 nr UMO-2020/39/B/NZ7/03366 an EP und des Medizinischen Kollegs der Jagiellonen-Universität, nr N41/DBS/001129 an MJ unterstützt.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Aclar FilmAgar wissenschaftlichAGL4458
Blender-Software Version: v. 2.91.2
Cacodylsäure, NatriumsalztrihydratPolywissenschaften01131-100
Konkave RutscheMenzel9.161 151
Diamantmesser Kieselalge15-USAMesserwinkel: Ultra 45°;  
Digitalkamera Nikon DXM 1200 F
Di-Natriumhydrogenphosphat DodecahydratPOCH799280115
Einbetten von HarzPolywissenschaften08792-1Luft-Formulierung 
EthanolPol-AuraPA-11-0004
GIMP-SoftwareVersion: v 3.0.4
BleicitratTAABNr. L018
Lichtmikroskopie Nikon Optiphot
Osmiumtetroxid Polywissenschaften0223C-10Kristallin (99,95%)
Pinsel
Photoshop-SoftwareAusführung: CS5
KaliumferricyanidSigmaaldrichNr. P8131
Propylenoxid Sigmaaldrich82320puriss. p.a., ≥ 99,5 % (GC)
Raster mit einem SchlitzAgar wissenschaftlichAGG25252 x 0,75 mm oder 2 x 1 mm
Natriumchlorid Chempur117941206
Natriumdihydrogenphosphat-DihydratChempur117991808
StereomikroskopPZO
Spritzenfilter BiosensBS25PES045
TEM JoelJEM-2100
UltramikrotomLeicaUC7
UranylacetatLachema
VibratomLeicaVT1000 S

References

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