Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

Herstellung eines SARS-CoV-2 Virus ähnlichen Partikelsystems zur Untersuchung viraler Lebenszyklen in vitro

1.4K Aufrufe

⸱

DOI:

10.3791/68389

⸱

6. Juni 2025

 ,  ,  , 
1School of Life Sciences, Beijing University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir stellen ein optimiertes In-vitro-Protokoll zur Herstellung von SARS-CoV-2-Virus-ähnlichen Partikeln vor, die das authentische Virus genau nachahmen. Dieser Ansatz ermöglicht die Untersuchung von Virusinfektions-, Assemblierungs- und Austrittsmechanismen, ohne dass ein Labor der Biosicherheitsstufe 3 erforderlich ist.

Zusammenfassung

Die Methode des schweren akuten respiratorischen Syndroms-Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) virusähnliche Partikel (SC2-VLP) bietet ein leistungsstarkes und zugängliches Werkzeug für die Untersuchung des Lebenszyklus von SARS-CoV-2, ohne dass Laboratorien der Biosicherheitsstufe 3 (BSL-3) erforderlich sind. Dieses System ahmt kritische Phasen des viralen Lebenszyklus, einschließlich Assemblierung, Genomverpackung und Ausgang, effektiv nach, indem es einen Luciferase-Reporter verwendet, der mit dem T20-Signal fusioniert ist, um die Produktion von Viruspartikeln empfindlich und präzise zu detektieren. SC2-VLPs werden durch die Co-Expression von SARS-CoV-2-Strukturproteinen, einschließlich Membran (M), Nukleokapsid (N), Hülle (E) und Spike (S), zusammen mit dem RNA-Verpackungssignal in HEK-293T-Zellen erzeugt. Im Gegensatz zu herkömmlichen virusähnlichen Partikelsystemen gewährleistet die SC2-VLP-Methode eine genaue Quantifizierung und eine größere Genauigkeit des natürlichen Lebenszyklus des Virus. Darüber hinaus bietet das SC2-VLP-System im Vergleich zu lentiviralen Pseudotypisierungsmethoden, die sich auf die Untersuchung des Viruseintritts durch den Einbau des S-Proteins in HIV-basierte lentivirale Partikel beschränken, eine umfassendere Plattform für die Erforschung mehrerer Stadien der SARS-CoV-2-Biologie. Mit dieser Methode werden die Risiken des Umgangs mit lebenden Viren umgangen und die Zugänglichkeit erweitert. Die SC2-VLP-Methode stellt einen bedeutenden Fortschritt in der antiviralen Forschung und der Entwicklung von Therapiestrategien gegen SARS-CoV-2 dar.

Einleitung

Die COVID-19-Pandemie hat sich zu einer der verheerendsten globalen Gesundheitskrisen der modernen Geschichte entwickelt, die weltweit Millionen von Todesfällen geforderthat 1. Das verantwortliche Virus, SARS-CoV-2, durchläuft einen komplexen Lebenszyklus, der Schlüsselstadien wie Infektion, Genomreplikation, Assemblierung und Austritt umfasst. Der Infektionsprozess beginnt, wenn das virale Spike-Protein (S) an den Wirtszellrezeptor Angiotensin-Converting-Enzym 2 (ACE2) bindet und so die Freisetzung des viralen Genoms in die Wirtszelleerleichtert 2,3. Die virale RNA-abhängige RNA-Polymerase (RdRp) katalysiert dann die Replikation der genomischen RNA. Diese RNA bildet im Komplex mit dem Nukleokapsidprotein (N) eine stabile Struktur, die vom Membranprotein (M) erkannt wird. Das M-Protein spielt eine zentrale Rolle bei der viralen Assemblierung, indem es den RNA-N-Komplex S und das Hüllprotein (E)4,5 rekrutiert. Nach dem Assemblieren schließt das Virion seinen Austritt über einen nicht-kanonischen Lysosomen-vermittelten Transportwegab 6.

Als Reaktion auf die Pandemie wurden erhebliche globale Ressourcen mobilisiert, um Impfstoffe, neutralisierende Antikörper und antivirale Medikamente zu entwickeln. Die Evaluierung dieser Interventionen war für die Weiterentwicklung der SARS-CoV-2-Forschung von entscheidender Bedeutung7. Die Untersuchung des lebenden Virus stellt jedoch erhebliche logistische Herausforderungen dar, da Experimente mit dem Virus in Labors der Biosicherheitsstufe 3 (BSL-3) durchgeführt werden müssen. Die begrenzte Verfügbarkeit von BSL-3-Einrichtungen hat das Tempo der Forschung zum Verständnis und zur Bekämpfung von SARS-CoV-2 eingeschränkt.

Um diesen Herausforderungen zu begegnen, wurden zwei wichtige Systeme – virusähnliche Partikel (VLP) und lentivirale Pseudotypisierung – in der SARS-CoV-2-Forschung weitgehend eingesetzt, die beide kein BSL-3-Containment8 erfordern. Das VLP-System beinhaltet die Co-Transfektion von Zellen mit Genen, die für virale Strukturproteine wie M, S, E und N kodieren, die zusammen virusähnliche Partikel erzeugen. Diese Partikel ahmen die strukturellen und funktionellen Eigenschaften des Virus nach und sind damit ein wertvolles Werkzeug für die Untersuchung wichtiger Prozesse im SARS-CoV-2-Lebenszyklus und sogar ein wirksames Antigen für die Impfstoffentwicklung 9,10,11.

Umgekehrt beinhaltet das lentivirale Pseudotypisierungssystem den Ersatz des G-Proteins des Vesikulären Stomatitis-Virus (VSV) im Lentivirus durch das SARS-CoV-2 S-Protein, wodurch die Produktion von lentiviralen Partikeln ermöglicht wird, die Reportergene wie Luciferase oder GFP einbauen können. Dieses System ist besonders nützlich für die Untersuchung neutralisierender Antikörper, die die S-ACE2-Interaktion blockieren12. Die lentivirale Pseudotypisierung spiegelt jedoch nicht die Assemblierung oder den Ausgang von SARS-CoV-2-Viren wider, da HIV-Strukturproteine verwendet werden, die die Partikelfreisetzung an der Plasmamembran vermitteln.

Um diese Einschränkungen zu überwinden, haben Syed et al. kürzlich das SARS-CoV-2-Verpackungssignal in seinem RNA-Genom identifiziert, was die Spezifität des N-Proteins für die virale Genomerkennung demonstriert13. Durch die Fusion dieses Verpackungssignals mit Reportergenen ist es möglich, diese Gene effizient in SARS-CoV-2-Virus-ähnliche Partikel (SC2-VLPs) einzubauen13. Diese Strategie repliziert nicht nur die SARS-CoV-2-Assemblierungs- und -Austrittsprozesse, sondern ermöglicht auch die empfindliche Messung von Infektionsschritten. In dieser Studie stellen wir die experimentelle Methodik für die Verwendung des SC2-VLP-Systems vor und beleuchten wichtige Überlegungen zur Durchführung dieses Ansatzes.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

1. Erzeugung von SC2-VLPs

  1. Aussaat von ~3,0 × 106 HEK-293T-Zellen in einer Gewebekulturplatte mit 10 cm Durchmesser mit DMEM-Komplettmedium, ergänzt mit 10 % v/v FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin.
    HINWEIS: Um eine hohe Transfektionseffizienz und eine optimale SC2-VLP-Produktion zu gewährleisten, sollten HEK-293T-Zellen bei niedrigen Passagezahlen von ~10 gehalten werden.
  2. Kultivieren Sie die HEK-293T-Zelle bei 37 °C, 5 % CO2 für ca. 24 h und überprüfen Sie die Zellkonfluenz unter dem Mikroskop. Fortfahren, wenn ~70% zusammenfließen.
  3. Verdünnen Sie 60 μl PEI von 1 mg/ml Stammmaterial auf 200 μl mit serumfreiem Medium.
  4. Geben Sie 6,7 μg N-Plasmid, 10 μg Luc-T20-Plasmid, 0,016 μg S-Plasmid und 3,3 μg M-IRES-E-Plasmid in 200 μl serumfreies Medium (siehe Zusatzdatei 1).
  5. Das verdünnte PEI aus Schritt 1.3 wird vorsichtig in die Lösung gegeben, die Plasmide enthält, die für virale Strukturproteine aus Schritt 1.4 kodieren, und 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren. Dies ist die Transfektionslösung.
  6. Lassen Sie die Transfektionslösung aus Schritt 1.5 vorsichtig auf die HEK-293T-Zellen fallen und schwenken Sie die Gewebekulturplatte vorsichtig, um sie gründlich zu mischen.
  7. Tauschen Sie das Zellkulturmedium 6 h nach der Infektion gegen das DMEM-Komplettmedium aus und inkubieren Sie die transfizierten HEK-293T-Zellen 48 h lang bei 37 °C, 5 % CO2 .
  8. Sammeln Sie den Überstand der infizierten HEK-293T-Zellen, der die SC2-VLPs enthält, und filtrieren Sie den Überstand dann durch einen 0,45-μm-Spritzenfilter, um Zelltrümmer zu entfernen. Dies ist das SC2-VLP-Medium.
    HINWEIS: Wir haben versucht, SC2-VLPs in HeLa-, Vero E6- und Caco2-Zelllinien herzustellen, aber es wurde kein messbarer Virustiter erhalten, was auf die Spezifität des Protokolls für HEK-293T-Zellen hinweist.

2. Prüfung der Wirksamkeit von SC2-VLP

HINWEIS: Die HEK-293T-Zelllinie, die ACE2 und TMPRSS2 stabil exprimiert, wurde unter Verwendung eines lentiviralen Transduktionsansatzes etabliert14,15. Die Proteinexpression sowohl von ACE2 als auch von TMPRSS2 wurde durch Western-Blot-Analyse bestätigt, die einem Protokoll folgte, das dem in Schritt 3 beschriebenen (SC2-VLP-Zusammensetzungsanalyse) ähnelte.

  1. Keimen Sie 4.0 × 104 HEK-293T-Zellen mit stabiler Expression von ACE2 und TMPRSS2 in einer 96-Well-Platte und fügen Sie 50 μl SC2-VLP-Medium aus Schritt 1.8 hinzu.
  2. Die 96-Well-Gewebekulturplatte wird bei 37 °C mit 5 % CO2 24 h inkubiert.
  3. Nehmen Sie das Medium von der 96-Well-Platte und waschen Sie es einmal mit 100 μl PBS-Puffer bei 37 °C, der 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 und 1,8 mM KH2PO4 enthält.
  4. Lysieren Sie die HEK-293T ACE2/TMPRSS2-Zellen mit 20 μl passivem Lysepuffer und wiegen Sie die Probe 15 Minuten lang sanft auf einem Orbitalschüttler bei Raumtemperatur.
    HINWEIS: Der Lysepuffer enthält 25 mM Tris-Phosphat (pH 7,8), 2 mM DTT, 2 mM 1,2-Diaminocyclohexan-N,N,N',N'-Tetraessigsäure, 1,25 mg/ml Lysozym, 2,5 mg/ml BSA, 10 % Glycerin und 1 % Triton X-100).
  5. Schleudern Sie die 96-Well-Platte bei 4.000 × g für 15 Minuten bei 4 °C in einer gekühlten Mikrotiterplatten-Zentrifuge und geben Sie die Platte dann sofort in ein Eisbad.
  6. Nehmen Sie 100 μl rekonstituierten Luciferase-Assay-Puffer auf eine undurchsichtige weiße 96-Well-Platte und fügen Sie 20 μl Lysat aus Schritt 2.5 hinzu. Mischen Sie sie kurz, indem Sie sie 2-3x auf und ab pipettieren.
  7. Messen Sie die Lumineszenz mit einem Plattenlesegerät mit den folgenden Parametern: Detektionsmodus: Lumineszenz; Wellenlängenbereich: Vollspektrum; Plattenformat: 96-Well-Standard-Undurchsichtige Platte; Integrationszeit: 200 ms.

3. Untersuchung der Zusammensetzung des SC2-VLP

  1. 1,36 ml PEG 8000-Lösung, die 50 % PEG 8000 und 2,2 % NaCl enthält, werden zu 10 ml SC2-VLP-Medium aus Schritt 1.8 gegeben.
  2. Bewahren Sie die Mischung auf einem Orbitalschüttler auf und mischen Sie die Lösung langsam über Nacht bei 4 °C.
  3. Die Lösung wird 30 Minuten lang bei 4 °C und 2.000 × g zentrifugiert und das SC2-VLP-Pellet für die Western-Blotting-Analyseaufgefangen 16.
    HINWEIS: Für die Western-Blotting-Analyse sind alle Informationen zu den Antikörpern in der Materialtabelle aufgeführt.

4. Subzelluläre Lokalisationsanalyse von S und seinen Mutanten in SC2-VLP-produzierenden Zellen

  1. ~3,0 × 106 HEK-293T-Zellen gleichmäßig in der Kulturschale mit Glasboden und 15 mm Durchmesser säen und dann die Zellen anhaften und wachsen lassen, bis ~70% Konfluenz erreicht sind, bevor sie transfektioniert werden.
  2. Wiederholen Sie das Transfektionsverfahren wie in den Schritten 1.3 bis 1.7 beschrieben, und ändern Sie nur die Plasmidmengen wie folgt: N-Plasmid: 1,3 μg, Luc-T20-Plasmid: 2 μg, S-Plasmid: 0,0032 μg und M-IRES-E-Plasmid: 0,66 μg.
  3. Waschen Sie die Kulturschale zweimal vorsichtig mit 1 ml eiskaltem PBS und fügen Sie dann 1 ml 4%ige Paraformaldehyd (PFA)-Fixierlösung bei Raumtemperatur (RT) für 15 Minuten hinzu.
  4. Waschen Sie die Zellen 2 x 5 Minuten lang mit 1 ml PBS bei RT und permeabilisieren Sie die Zellen dann, indem Sie 1 ml 0,25% Triton X-100 bei RT für 10 Minuten hinzufügen.
  5. Waschen Sie die Zellen 2 x 5 Minuten lang mit 1 ml PBS bei RT und fügen Sie dann 1 ml 5% Rinderserumalbumin (BSA) bei RT für 1 h hinzu, um unspezifische Antikörperwechselwirkungen zu blockieren.
  6. ~200 μl Primärantikörperlösung (genug, um den Glasboden zu bedecken) hinzufügen und über Nacht bei 4 °C inkubieren.
    HINWEIS: Die Primärantikörperlösungen werden durch Verdünnung in 5 % BSA, gelöst in PBS, bei den folgenden Verdünnungsverhältnissen hergestellt: der Maus-Anti-S-Antikörper bei 1:200, der Kaninchen-Anti-Sec61β-Antikörper bei 1:200, der Kaninchen-Anti-GM130-Antikörper bei 1:200 und der Kaninchen-Anti-ERGIC53-Antikörper bei 1:200. Die 5%ige BSA/PBS-Lösung diente sowohl als Verdünnungsmittel als auch als Blockierungspuffer, um unspezifische Bindungen bei nachfolgenden Immunfluoreszenz-Färbeverfahren zu minimieren.
  7. Entfernen Sie die primäre Antikörperlösung und waschen Sie die Zellen dann 3 x 5 Minuten lang mit 1 ml PBS bei RT.
  8. Geben Sie fluoreszenzkonjugierte Sekundärantikörperlösung bei RT für 1 h hinzu und waschen Sie die Zellen dann 3 x 5 Minuten lang mit 1 ml PBS bei RT.
    HINWEIS: Alle nachfolgenden Schritte müssen im Dunkeln oder bei minimaler Lichteinwirkung durchgeführt werden, um ein Photobleichen von fluoreszierenden Konjugaten zu verhindern und die Signalintegrität zu erhalten. Zwei Arten von fluoreszenzkonjugierten Sekundärantikörpern, die von Maus oder Kaninchen stammen, werden verwendet, um entweder das S-Protein oder Zellorganellen-Markerproteine zu färben.
  9. Färben Sie die Zellkerne 5 min lang mit 2,5 μg/mL Hoechst-Lösung bei RT und waschen Sie die Zellen dann 3 x 5 min lang mit 1 mL PBS bei RT.
  10. Beobachten Sie die Färbung von S-Proteinen oder Organellen und nehmen Sie Bilder mit einem konfokalen Mikroskop mit den folgenden Parametern auf: PMT-Modus eingestellt auf VBF (keine Mittelwertbildung, zeilensequenzieller Scan) mit autokonfokaler Blende. Verwenden Sie für Kanal 1 (FITC) den 488-nm-Laser mit 25 % Leistung und 500 - 548 nm Emission, HV 525 V, Verstärkung 1x und Offset 5 %. Verwenden Sie für Kanal 2 (Alexa Fluor 594) den 594-nm-Laser mit 25 % Leistung und 610 - 670 nm Emission, HV 500 V, Verstärkung 1x und Offset 5 %. Verwenden Sie für Kanal 3 (DAPI) den 405-nm-Laser mit 25 % Leistung und 430 - 470 nm Emission, HV 490 V, Verstärkung 1x und Offset 5 %.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Die Austritts- und Assemblierungsschritte des SARS-CoV-2-Lebenszyklus sind weniger untersucht als die Infektions- und Replikationsschritte17,18. Bevor die SC2-VLP-Methode entwickelt wurde, konnten diese Prozesse nur mit lebendem SARS-CoV-2 untersucht werden, so dass die Forschung auf BSL-3-Laboratorien beschränkt war13. Der in Abbildung 1 gezeigte SC2-VLP-Workflow skizziert das experimentelle Protokoll und ver...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Eine einfache und effektive Methode zur Modellierung des SARS-CoV-2-Lebenszyklus in Zellkultursystemen ohne die Einschränkungen der BSL-3-Laboratorien stellt einen entscheidenden Fortschritt für die Anti-SARS-CoV-2-Forschung dar. Die SC2-VLP-Methode erfüllt diese Anforderung und bietet eine robuste und zugängliche Plattform. In dieser Studie stellen wir ein detailliertes Protokoll für die SC2-VLP-Methode vor, das kritische experimentelle Schritte zur Herstellung von SC2-VLPs skizziert. D...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch das Startup-Fund-Programm an der Beijing University of Chinese Medicine (BUCM) (90011451310011) unterstützt. Wir danken allen Mitgliedern des Dr. Ma Labors an der BUCM für die unschätzbare Diskussion und Unterstützung bei den Experimenten.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Rinderserumalbumin (BSA)Cell Signaling Technology9998S
Konfokales Laser-Scanning-MikroskopOlympusFV3000
DMEMCorning10-013-CV
Fötales Rinderserum (FBS)ThermofisherA5670402
Ziege Anti-Maus-IgG H& L (Alexa Fluor 488) AntikörperInvitrogenA11001Verdünnungsverhältnis: IF 1:1000
Ziege Anti-Kaninchen IgG H& L (Alexa Fluor 594) AntikörperAbcamab150080Verdünnungsverhältnis: IF 1:1000
HEK-293T ZelllinieNational Infrastructure of Cell Line Resource (NICR)NICR-293T-001Um eine hohe Transfektionseffizienz und eine optimale SC2-VLP-Produktion zu gewährleisten, sollten HEK-293T-Zellen bei niedrigen Passagezahlen (≤ S. 10).
Hoechst 33342InvitrogenH1399Arbeitskonzentration: 2,5 μ g/mL
Luciferase Reporter Assay SystemPromegaE1500
Luc-T20Addgene177941
Maus monoklonal anti-GAPDHProteintech60004-1-IgVerdünnungsverhältnis: WB 1:20.000
Maus monoklonal anti-S RBDAbklonalA23771Verdünnungsverhältnis: IF 1:200
OptiMEMThermofisher31985070serumfreies Medium für die Transfektion
PEG3350Sigma-AldrichP3635
PEG8000Sigma-AldrichP2139
Penicillin-StreptomycinThermofisher15140122
Polyethylenimin (PEI)Thermofisher43896.01
Promega passiver LysepufferPromegaE1941
Polyklonales Kaninchen-Anti-ACE2-Proteintech21115-1-AP-Verdünnungsverhältnis: WB 1:1000
Polyklonales Kaninchen-Anti-ERGIC53Proteintech13364-1-AP-Verdünnungsverhältnis: IF 1:200
Polyklonales Kaninchen-Anti-GM130Proteintech11308-1-AP-Verdünnungsverhältnis: IF 1:200
Polyklonales Kaninchen-Anti-S-Anti-SAbcamab272504Verdünnungsverhältnis: WB 1:1000
Polyklonales Kaninchen Anti-Sec61βProteintech15087-1-APVerdünnungsverhältnis: IF 1:200
Kaninchen polyklonales Anti-TMPRSS2Abcamab109131Verdünnungsverhältnis: WB 1:1000
SARS-CoV-2 M-IRES-EPlasmid Addgen177938
SARS-CoV-2 N PlasmidAddgen177959
SARS-CoV-2 Nukleoprotein Kaninchen mAbAbklonalesA21042Verdünnungsverhältnis: WB 1:4000
SARS-CoV-2 SPlasmid Addgen177960
Sekundärantikörper, HRP, Ziege Anti-Maus IgG (H+L)Invitrogen31460Verdünnungsverhältnis: WB 1:5000
Sekundärer Antikörper, HRP, Ziege Anti-Kaninchen IgG (H+L)Invitrogen31430Verdünnungsverhältnis: WB 1:5000
SpectraMax i3x Plattenleser Molekulare BauelementeSpectraMax i3x

Referenzen

  1. Narayanan, S. A., et al. A comprehensive SARS-CoV-2 and COVID-19 review, Part 2: host extracellular to systemic effects of SARS-CoV-2 infection. Eur J Hum Genet. 32 (1), 10-20 (2024).
  2. Shang, J., et al. Structural basis of receptor recognition by SARS-CoV-2. Nature. 581 (7807), 221-224 (2020).
  3. Lan, J., et al. Structure of the SARS-CoV-2 spike receptor-binding domain bound to the ACE2 receptor. Nature. 581 (7807), 215-220 (2020).
  4. Zhang, Z., et al. Structure of SARS-CoV-2 membrane protein essential for virus assembly. Nat Commun. 13 (1), 4399(2022).
  5. Han, Y., et al. SARS-CoV-2 N protein coordinates viral particle assembly through multiple domains. J Virol. 98 (11), e0103624(2024).
  6. Ghosh, S., et al. beta-coronaviruses use lysosomes for egress instead of the biosynthetic secretory pathway. Cell. 183 (6), 1520-1535.e14 (2020).
  7. Andrews, H. S., Herman, J. D., Gandhi, R. T. Treatments for COVID-19. Annu Rev Med. 75, 145-157 (2024).
  8. Crawford, K. H. D., et al. Protocol and reagents for pseudotyping lentiviral particles with SARS-CoV-2 spike protein for neutralization assays. Viruses. 12 (5), 513(2020).
  9. Sultana, R., Stahelin, R. V. Strengths and limitations of SARS-CoV-2 virus-like particle systems. Virology. 601, 110285(2025).
  10. Xu, R., Shi, M., Li, J., Song, P., Li, N. Construction of SARS-CoV-2 virus-like particles by mammalian expression system. Front Bioeng Biotechnol. 8, 862(2020).
  11. Plescia, C. B., et al. SARS-CoV-2 viral budding and entry can be modeled using BSL-2 level virus-like particles. J Biol Chem. 296, 100103(2021).
  12. Cruz-Cardenas, J. A., et al. A pseudovirus-based platform to measure neutralizing antibodies in Mexico using SARS-CoV-2 as proof-of-concept. Sci Rep. 12 (1), 17966(2022).
  13. Syed, A. M., et al. Rapid assessment of SARS-CoV-2-evolved variants using virus-like particles. Science. 374 (6575), 1626-1632 (2021).
  14. Hoffmann, M., et al. SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by a clinically proven protease inhibitor. Cell. 181 (2), 271-280 (2020).
  15. Matsuyama, S., et al. Enhanced isolation of SARS-CoV-2 by TMPRSS2-expressing cells. Proc Natl Acad Sci USA. 117 (13), 7001-7003 (2020).
  16. Alegria-Schaffer, A., Lodge, A., Vattem, K. Performing and optimizing Western blots with an emphasis on chemiluminescent detection. Methods Enzymol. 463, 573-599 (2009).
  17. V'Kovski, P., Kratzel, A., Steiner, S., Stalder, H., Thiel, V. Coronavirus biology and replication: implications for SARS-CoV-2. Nat Rev Microbiol. 19 (3), 155-170 (2021).
  18. Yang, H., Rao, Z. Structural biology of SARS-CoV-2 and implications for therapeutic development. Nat Rev Microbiol. 19 (11), 685-700 (2021).
  19. Katiyar, H., Arduini, A., Li, Y., Liang, C. SARS-CoV-2 assembly: Gaining infectivity and beyond. Viruses. 16 (11), 1648(2024).
  20. Klein, S., et al. SARS-CoV-2 structure and replication characterized by in situ cryo-electron tomography. Nat Commun. 11 (1), 5885(2020).
  21. Li, Y., et al. SARS-CoV-2 spike host cell surface exposure promoted by a COPI sorting inhibitor. Acta Pharm Sin B. 13 (7), 3043-3053 (2023).
  22. Dey, D., et al. A single C-terminal residue controls SARS-CoV-2 spike trafficking and incorporation into VLPs. Nat Commun. 14 (1), 8358(2023).
  23. Christie, S. M., et al. Single-virus tracking reveals variant SARS-CoV-2 spike proteins induce ACE2-independent membrane interactions. Sci Adv. 8 (49), eabo3977(2022).
  24. Guo, L., et al. Targetable elements in SARS-CoV-2 S2 subunit for the design of pan-coronavirus fusion inhibitors and vaccines. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 197(2023).
  25. Mi, D., Hu, J., Qian, Z. A lentiviral pseudotype system to characterize SARS-CoV-2 glycoprotein. Methods Mol Biol. 2610, 187-199 (2023).
  26. Swann, H., et al. Minimal system for assembly of SARS-CoV-2 virus like particles. Sci Rep. 10 (1), 21877(2020).
  27. Xia, B., et al. Extracellular vesicles mediate antibody-resistant transmission of SARS-CoV-2. Cell Discov. 9 (1), 2(2023).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Weitere Artikel entdecken

SARS-CoV-2-VLPsvirusähnliche Partikelviraler LebenszyklusHEK-293T-ZellenSpike-ProteinPlasmid-TransfektionWestern Blotkonfokale MikroskopieACE2 TMPRSS2Luciferase-Assay
Herstellung eines SARS-CoV-2 Virus ähnlichen Partikelsystems zur Untersuchung viraler Lebenszyklen in vitro
Kontaktieren Sie uns
Der Bibliothek empfehlen

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Urheberrecht © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.