Eine schrittweise Anleitung zur Isolierung und Analyse von Blattoberfläche und apoplastischer RNA mit Hilfe von Arabidopsis-Rosetten

Zusammenfassung

Wir beschreiben eine einfache, aber hochgradig reproduzierbare Methode, um extrazelluläre RNA aus der Blattoberfläche und dem Apoplasten von Arabidopsis-Pflanzen zu isolieren.

Zusammenfassung

Die Oberfläche der Pflanzenblätter und der interzelluläre Raum innerhalb der Blätter (der Apoplast) dienen als wichtige Schnittstellen für den molekularen Austausch zwischen Pflanzen und ihren interagierenden Mikroben. In früheren Arbeiten haben wir das Vorhandensein einer Vielzahl von RNA-Spezies im Apoplast von Arabidopsis-Rosetten nachgewiesen. In jüngerer Zeit zeigten unsere Ergebnisse, dass Arabidopsis-Pflanzen auch aktiv RNA auf ihre Blattoberflächen absondern. Um dies zu untersuchen, haben wir eine hochgradig reproduzierbare Methode entwickelt, um sowohl Blattoberflächenwaschmittel (LSW) als auch apoplastische Waschflüssigkeit (AWF) aus demselben Satz von Arabidopsis-Pflanzen zu sammeln. Darüber hinaus untersuchten wir eine nicht-invasive Technik mit Blattoberflächenabstrich (LSS), die es uns ermöglichte, RNA zu sammeln, indem wir die Blattoberfläche vorsichtig mit sterilen Wattestäbchen abtupften. Um das Risiko einer mikrobiellen Kontamination zu minimieren, haben wir LSW-, AWF- und LSS-Fraktionen gefiltert, bevor wir die extrazelluläre RNA (exRNA) isoliert haben. Bei der Analyse der gereinigten exRNA mittels denaturierender RNA-Gelelektrophorese beobachteten wir eine Vielzahl von langen und kleinen RNA-Spezies in LSW-, LSS- und AWF-RNA-Proben. Die weitere Quantifizierung und vergleichende Analyse zwischen exRNA-Proben und experimentellen Bedingungen wurde mit der frei zugänglichen Software ImageJ durchgeführt. Dieses Protokoll bietet einen effizienten und kostengünstigen Ansatz für die Isolierung und Analyse kleiner Mengen an exRNA aus Pflanzenblättern. Diese RNA-Präparate können durch Sequenzierung und andere molekulare Analysen weiter charakterisiert werden, was Einblicke in die dynamische Rolle von exRNA bei Pflanzen-Mikroben-Interaktionen bietet.

Einleitung

Die Blätter werden von einer Vielzahl von Mikroben besiedelt, darunter Bakterien, Pilze, Oomyceten und Protisten, die dazu beitragen können, Pflanzen vor biotischen und abiotischen Stressoren zu schützen und letztendlich das Wachstum und die Entwicklung der Pflanzen zu fördern 1,2,3,4. Das Pflanzenblatt hat zwei Hauptkompartimente, in denen sich die interagierenden Mikroben befinden: epiphytisch (Blattoberfläche) und endophytisch (Apoplast)². Die Blattoberfläche wird durch eine hydrophobe Nagelhautschicht geschützt, die Wasserverlust verhindert und Bestandteile wie Wachs und Cutin enthält. Die obere (adaxiale) Blattoberfläche enthält oft spezialisierte haarähnliche Epidermiszellen, die Trichome genannt werden, die vor UV-Licht schützen, die Temperatur regulieren und als Abschreckung für Pflanzenfresser dienen. Im Gegensatz dazu erleichtert der Apoplast den Gas- und Wasseraustausch für die Photosynthese und sorgt für eine feuchte Umgebung, die der mikrobiellen Besiedlung förderlich ist⁵. Trotz dieser Unterschiede begünstigen beide Blattkompartimente bestimmte Mikroben, wobei epiphytische mikrobielle Netzwerke im Vergleich zu den endophytischen mikrobiellen Netzwerken in Bezug auf die Diversität komplexer sind⁵. Wie die Zusammensetzung dieser mikrobiellen Gemeinschaften in jedem extrazellulären Kompartiment reguliert wird, ist noch wenig verstanden. Wir spekulieren, dass die Struktur der mikrobiellen Gemeinschaft zum Teil durch extrazelluläre RNA (exRNA) bestimmt wird, die von der Wirtspflanze sezerniert wird.

In unserer jüngsten Studie berichteten wir über das Vorhandensein verschiedener RNA-Spezies auf der Blattoberfläche, die sich von der RNA im Apoplasten oder den Zelllysaten^{unterscheiden 6}. Während sich die meisten Forschungen zu exRNAs in Pflanzen auf kleine nicht-kodierende RNAs wie microRNAs (miRNAs) und kleine interferierende RNAs (siRNAs) konzentriert haben, wurde anderen RNA-Spezies, wie z. B. rRNA- und tRNA-abgeleiteten Fragmenten, die möglicherweise zelluläre Prozesse unabhängig von der Sequenzkomplementarität regulieren können, weniger Aufmerksamkeit geschenkt, insbesondere bei Spezies ohne RNA-Interferenzmechanismen ^{7,8. 9}. Urheberrecht

Die hier beschriebene Methode ermöglicht die sequentielle Isolierung von RNA sowohl aus Leaf Surface Wash (LSW) als auch aus apoplastischer Waschflüssigkeit (AWF) unter Verwendung desselben Satzes von Arabidopsis-Pflanzen. Darüber hinaus beschreiben wir eine nicht-invasive orthogonale Technik mit einem Blattoberflächentupfer (LSS), der die Entnahme von RNA durch sanftes Abtupfen der besprühten Blattoberfläche mit sterilen Wattestäbchen ermöglicht⁶. Um das Risiko einer mikrobiellen Kontamination zu minimieren, filtern wir sowohl die LSW- als auch die AWF-Fraktion, bevor wir die extrazelluläre RNA isolieren. Um die Mengen- und Größenverteilung von exRNA-Proben zu beurteilen, beschreiben wir ein Protokoll, das die denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese in Kombination mit der Bildanalyse mit der frei zugänglichen Software ImageJ verwendet. Dieses Protokoll bietet einen effizienten und kostengünstigen Ansatz für die Isolierung und Analyse kleiner Mengen an exRNA. Diese RNA-Präparate können durch Sequenzierung und molekulare Analysen weiter charakterisiert werden und bieten Einblicke in die dynamische Rolle extrazellulärer RNA bei Pflanzen-Mikroben-Interaktionen.

Das im Folgenden beschriebene Protokoll unterscheidet sich von unserem zuvor beschriebenen Protokoll zur Isolierung von RNA aus pflanzlichen extrazellulären Vesikeln¹⁰. Das derzeitige Protokoll erfordert keine Ultrazentrifugationsschritte und ermöglicht die Isolierung von RNA aus der gesamten extrazellulären Waschflüssigkeit, nicht nur aus extrazellulären Vesikel. Am wichtigsten ist, dass es zwei orthogonale Methoden zur Isolierung von RNA von der Blattoberfläche bietet. Unseres Wissens nach wurde die Isolierung von RNA von Blattoberflächen vor unserer jüngsten Veröffentlichung⁶ nicht beschrieben.

Protokoll

1. Puffervorbereitung und Sterilisation

1. Bereiten Sie einen Vesikelisolationspuffer (VIB) vor, der 20 mM 2-(N-Morpholino)-Ethansulfonsäure (MES), pH 6,0, 2 mM CaCl₂ und 0,01 M NaCl in 1 l destilliertem Wasser enthält.
   HINWEIS: Geringfügige Anpassungen der NaCl-Konzentration in VIB wurden von 0,1 M auf 0,01 M vorgenommen, um die Ionenkonzentration des Blattapoplasten nachzuahmen.
2. Autoklavieren Sie das VIB für 20 min bei 121 °C, Flüssigkeitskreislauf. Alternativ können Sie das VIB mit einem 0,45-μm-Vakuumfilter filtersterilisieren.
   HINWEIS: Mit diesem Schritt soll sichergestellt werden, dass der Puffer steril ist, da jede mikrobielle Kontamination zur Auslösung von Pflanzen und damit zu Schwankungen in den Ergebnissen führen kann. Dieser Puffer kann bei Raumtemperatur (ohne Öffnen des Deckels nach der Sterilisation) für die kurzfristige Lagerung oder bei 4 °C für die Langzeitlagerung gelagert werden.

2. Pflanzenmaterial und Wachstumszustand

1. Säen Sie Arabidopsis thaliana Col-0 Wildtyp-Samen (WT) in runde 4-Zoll-Plastiktöpfe, die eine Standard-Blumenerde enthalten. Nach der Aussaat die Samen mit einem biologischen Fungizid (600 mg/L) einweichen, mit einer durchsichtigen Kunststoffkuppel abdecken und 3 Tage lang bei 4 °C im Dunkeln aufbewahren, um eine synchrone Keimung zu induzieren.
2. Setze die Töpfe mit den Samen in eine temperaturkontrollierte Kurztag-Wachstumskammer um, die auf 24 °C und eine 9 h helle/15 h dunkle Photoperiode mit einer photosynthetischen Photonenflussdichte von 150 μmol·m^−2,s−1 auf Pflanzenebene eingestellt ist (50:50 Mischung aus 3.500 und 5.000 K Spektrum 32-Watt-Leuchtstofflampen).
3. Nach etwa 10 Tagen füllst Du die einzelnen Sämlinge in 36-Zellen-Tray-Einsätze mit Blumenerde und bedeckst sie für 1-2 Wochen mit einer durchsichtigen Plastikkuppel.
   HINWEIS: Ein typisches Experiment erfordert ~12-24 gesunde Pflanzen für jeden Genotyp/jede Behandlung. Es wurde festgestellt, dass 6-7 Wochen alte Pflanzen die optimale Menge an LSW- und AWF-RNA mit dem geringsten Risiko einer zellulären Kontamination liefern.
4. Je nach verwendeter Blumenerde gießen Sie die Pflanzen alle 10-15 Tage, um Trockenheit oder Überschwemmungsstress zu vermeiden.

3. Entnahme von RNA der Blattoberfläche

1. Zentrifugationsbasierte Methode (Leaf Surface Wash; LSW)
   1. Verwenden Sie für jedes Replikat 6-7 Wochen alte Arabidopsis-Pflanzen.
   2. Fügen Sie Silwet-L77 (im Folgenden als Netzmittel bezeichnet) dem sterilen VIB in einer Endkonzentration von 0,001 % (1 μl in 100 mL VIB) hinzu, bevor Sie mit der Isolierung von LSW beginnen.
      HINWEIS: Silwet-L77 ist ein Netzmittel, das die Oberflächenspannung reduziert und es dem Puffer ermöglicht, Blattoberflächen zu beschichten.
   3. Übertragen Sie 100 mL VIB in eine 500 mL Sprühflasche.
   4. Arabidopsis-Rosetten vorsichtig mit einer feinen Schere von ihren Wurzeln lösen.
   5. Entfernen Sie überschüssige Erde mit einer weichen Bürste vom Blattstiel.
   6. Legen Sie die Rosetten mit der abaxialen Fläche nach oben auf ein flaches Tablett.
   7. Besprühen Sie die abaxiale Oberfläche mit VIB + Netzmittel mit fünf Pumpstößen der Sprühflasche.
   8. Drehen Sie die Rosetten vorsichtig um und besprühen Sie die adaxiale Fläche fünfmal mit VIB + Netzmittel.
   9. Um LSW zurückzugewinnen, legen Sie die gesprühten Rosetten vorsichtig in nadellose 60-ml-Spritzen mit Löchern am Boden (pro Spritze passen maximal zwei 6 Wochen alte Rosetten), die in 250-ml-Zentrifugenflaschen platziert sind. Wickeln Sie die Spritze mit Parafilm um den Hals, um die Spritzenspitze über dem Boden der Flasche aufzuhängen (siehe Abbildung 1 als Referenz).
      HINWEIS: Einzelheiten zur Vorbereitung der 60-ml-Spritzen mit Löchern finden Sie im zuvor veröffentlichten Protokoll¹¹.
   10. Die beladenen Flaschen bei 100 g für 10 min bei 4 °C zentrifugieren (JA-14 Rotor).
   11. Filtrieren Sie das LSW durch einen 0,22 μm Spritzenvorsatzfilter und sammeln Sie das Filtrat in einem 50 mL Zentrifugationsröhrchen, das auf Eis gestellt wird.
       HINWEIS: Normalerweise würden 12 Pflanzen am Ende mit diesem Protokoll etwa 30 mL LSW liefern. Dies ist jedoch nur eine Schätzung, die auf der Anzahl der Sprühstöße basiert, die bei jedem Schritt durchgeführt werden. Dieses Volumen ist in der Regel geringer als das gesprühte Volumen, da ein Teil des gesprühten Puffers während der Handhabung verloren geht.
2. Methode des Blattoberflächenabstrichs (LSS)
   1. Die abgelösten Rosetten mit VIB + Netzmittel besprühen, wie im vorherigen Abschnitt (Schritte 3.1.1-3.1.7) beschrieben.
   2. Um LSS zu gewinnen, tupfen Sie die adaxialen und abaxialen Oberflächen mit sterilen Wattestäbchen ab und drücken Sie die getränkten Spitzen gegen die Innenwand eines 15-ml-Zentrifugationsröhrchens, um die Flüssigkeit herauszudrücken.
      HINWEIS: Die adaxialen und abaxialen LSS-Proben können je nach Versuchsaufbau und erwartetem Ergebnis in separaten Röhrchen entnommen werden.
   3. Filtern Sie die LSS-Proben durch einen 0,22-μm-Spritzenvorsatzfilter in ein 15-ml-Zentrifugationsröhrchen, das auf Eis gestellt wird.
      HINWEIS: Abhängig von der Anzahl der abtupfenden Pflanzen können pro Versuch unterschiedliche Mengen an LSS entnommen werden.

Abbildung 1: Werkzeuge für die Oberflächenreinigung von Blättern und die Isolierung apoplastischer Waschflüssigkeit. (A) Zur Sammlung von LSW und AWF werden zwei ganze Arabidopsis thaliana-Rosetten in eine 60-ml-Spritze mit acht zusätzlichen Löchern gegeben, die mit einer beheizten Pinzette in das Ende der Spritze eingeschmolzen werden, um Kanäle zu schaffen, durch die die Waschung fließen kann. (B) Diese nadellose Spritze wird dann wie abgebildet im Halsbereich mit Parafilm umwickelt. (C) Dieser Schritt ermöglicht es, dass die Spritze in eine 250-ml-Zentrifugenflasche passt, ohne den Boden der Flasche zu berühren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

4. Sammlung von apoplastischer Waschflüssigkeit (AWF)

1. Legen Sie die gleichen Pflanzen, die für die LSW- oder LSS-Isolierung verwendet werden, in ein Becherglas und spülen Sie sie vorsichtig zweimal mit destilliertem Wasser ab.
2. Die Rosetten mit VIB für 20 s wie folgt vakuuminfiltrieren:
   ANMERKUNG: Obwohl der Prozess der Vakuuminfiltration in einem früher veröffentlichten Protokoll¹¹ gut beschrieben ist, wurde er hier wiedergegeben, um das vorliegende Protokoll klarer zu machen.
   1. Legen Sie die Rosetten vorsichtig in eine French-Press-Kaffeemaschine mit 300-500 ml VIB. Setzen Sie den Deckel auf die French Press und senken Sie den Kolben vorsichtig ab, bis die Pflanzen vollständig untergetaucht sind.
   2. Stellen Sie die French Press mit Pflanzen und Puffer in eine Vakuumkammer. Wenden Sie mit einer Vakuumpumpe ein Vakuum für 20 s an. Der Puffer sollte gerade anfangen zu kochen.
   3. Lassen Sie das Vakuum los und nehmen Sie die French Press aus der Vakuumkammer, nehmen Sie den Deckel ab und gießen Sie das VIB in ein separates 500-ml-Kunststoffbecherglas. Entfernen Sie die Rosetten von der French Press.
      HINWEIS:Das VIB kann am selben Tag für einen Genotyp mehrmals wiederverwendet werden, aber sobald es für die Vakuuminfiltration verwendet wurde, sollte es nicht für die Verwendung an einem anderen Tag gelagert werden.
   4. Entfernen Sie überschüssiges VIB von den Pflanzen, indem Sie die Blätter vorsichtig schütteln und dann über ein Papiertuch streichen.
3. Entfernen Sie überschüssigen Puffer von den Blattoberflächen, indem Sie sie vorsichtig mit Löschpapier abtupfen.
4. Um die apoplastische Waschflüssigkeit (AWF) aufzufangen, legen Sie die Rosetten in nadellose 60-ml-Spritzen, die sich in 250-ml-Zentrifugenflaschen befinden, wie für die LSW-Entnahme beschrieben, und zentrifugieren Sie sie 30 min lang bei 600 × g mit langsamer Beschleunigung.
5. Filtrieren Sie das gepoolte AWF durch einen 0,22 μm Spritzenvorsatzfilter und sammeln Sie das Filtrat in einem 15 mL Zentrifugenröhrchen, das auf Eis gestellt wird.
   HINWEIS: Normalerweise würden 12 Pflanzen am Ende mit diesem Protokoll etwa 6 mL AWF liefern. Gefilterte LSW, AWF und LSS können sofort verwendet oder bis zur weiteren Verwendung bei -80 °C gelagert werden.
6. Notieren Sie das Frischgewicht (FW) der Pflanzen, die für jedes Replikat nach der AWF-Isolierung verwendet werden. Verwenden Sie anschließend diesen Messwert, um die RNA-Menge in jeder Probe zu normalisieren (Abbildung 2).

Abbildung 2: Schematische Darstellungen des Protokolls und der Methode des Blattoberflächenabstrichs. (A) Schematische Darstellung des schrittweisen Protokolls für die Isolierung von Blattoberflächenwaschmittel und apoplastischer Waschflüssigkeit unter Verwendung von Arabidopsis-Rosetten. (B) Schematische Darstellung der Methode des Blattoberflächenabstrichs (LSS) zur Isolierung von Blattoberflächen-RNA. Die Abbildungen wurden von Abbildung S1 und Abbildung S4 von Borniego et al., 2025^{6 übernommen}. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

5. Ausfällung von RNA

1. Fältitieren Sie RNA, indem Sie das erforderliche Volumen an AWF, LSW oder LSS mit 0,1 Volumen 3 M Natriumacetat (pH 5,2) und 1,0 Volumen kaltem Isopropanol in einem 15-ml-Zentrifugationsröhrchen mischen.
2. Glykogen (20 mg/ml-Stamm) bis zu einer Endkonzentration von 20 μg/ml hinzufügen.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Zentrifugenröhrchen, die zur Ausfällung der RNA verwendet werden, bei einer hohen Geschwindigkeit von 13.000 × g zentrifugiert werden können. Ein Bruch der Röhrchen in diesem Schritt kann zum Verlust von RNA-Proben führen.
3. Inkubieren Sie die Mischung bei -20 °C für mindestens 1 h oder über Nacht.
4. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 13.000 × g für 30 min bei 4 °C (JA-25.50 Rotor).
5. Waschen Sie das Pellet zweimal mit eiskaltem 70% EtOH und lassen Sie es nicht länger als 10 Minuten an der Luft trocknen.
6. Resuspendieren Sie die Pellets in 100 μl hochreinem DNase/RNase-freiem Wasser oder VIB und übertragen Sie die RNA in 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen.
   HINWEIS: Nach diesem Schritt kann die gefällte RNA bis zu 2 Wochen bei -80 °C gelagert werden.

6. TRIzol-basierte RNA-Isolierung

1. Geben Sie 1 ml TRIzol-Reagenz in jedes Röhrchen und mischen Sie es durch Schütteln auf einem Rotator.
   ACHTUNG: Verwenden Sie TRIzol für den Umgang mit TRIzol in einem Abzug, tragen Sie Handschuhe und einen Augenschutz.
2. Legen Sie die Röhren für 10 Minuten bei Raumtemperatur (RT) auf einen Tischrotator.
3. Geben Sie 200 μl Chloroform in jedes Röhrchen, gefolgt von einem kurzen, aber kräftigen Vortexing-Schritt.
   ACHTUNG: Verwenden Sie es für den Umgang mit Chloroform in einem Abzug, tragen Sie Handschuhe und einen Augenschutz.
4. Lassen Sie die Röhrchen ca. 3 min bei RT stehen und zentrifugieren Sie dann bei 13.000 × g für 15 min bei 4 °C.
5. Die wässrige Phase wird in markierte 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen überführt und 10 μg RNase-freies Glykogen und ein Volumen kaltes Isopropanol hinzugefügt.
   ACHTUNG: Bei anfallenden biogefährlichen Abfällen (z. B. Phenolabfällen) sammeln Sie organische Lösungsmittel in den dafür vorgesehenen Abfallbehältern gemäß den institutionellen Richtlinien.
6. Die Röhrchen nicht länger als 1 h bei -20 °C inkubieren.
   HINWEIS: Eine Ausfällung der RNA für mehr als 1 h in diesem Schritt verringert die Effizienz der RNA-Isolierung und führt zu einer sehr geringen RNA-Konzentration.
7. Um die RNA zu pelletieren, zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 13.000 × g für 20 min bei 4 °C.
8. Waschen Sie die RNA-Pellets zweimal mit eiskaltem 70% EtOH und lassen Sie sie an der Luft trocknen, bevor Sie sie in 10-20 μl hochreinem DNase/RNase-freiem Wasser resuspendieren.
9. Lagern Sie die resuspendierte RNA bei -20 °C bzw. -80 °C für die Kurz- bzw. Langzeitlagerung.

7. Entfernung von Phenol- oder Guanidin-Verunreinigungen

1. Um Phenol- oder Guanidinkontaminationen aus den RNA-Proben zu entfernen, führen Sie eine oder zwei serielle Fällungen mit 96 % EtOH und Ammoniumacetat durch.
2. 1 μg Glykogen zu 10 μl RNA-Proben geben und mit 0,5 Volumen 7,5 M Ammoniumacetat mischen, bevor 2,5 Volumen 96-100 % EtOH hinzugefügt werden.
   HINWEIS: Die Endkonzentration von EtOH sollte bei diesem Schritt 70-75 % des gesamten Volumens betragen.
3. Die Mischung 30 min lang bei -80 °C inkubieren und 20 min bei 4 °C bei 13.000 × g zentrifugieren.
4. Waschen Sie das RNA-Pellet zweimal mit 70 % EtOH und resuspendieren Sie es in 10 μl hochreinem DNase/RNase-freiem Wasser.

8. RNA-Gelelektrophorese zur Quantifizierung und zum Vergleich

1. Bereiten Sie ein Mini-Gel (7,2 cm x 8,6 cm x 0,75 mm) mit 10 % oder 15 % Polyacrylamid und 7 M Harnstoff in 1x Tris-Borsäure EDTA (FSME, pH 8,4) unter Verwendung von 40 % Acrylamid/Bis-Lösung, 37,5:1 vor. Alternativ kann ein handelsübliches denaturierendes Mini-Gel (15% FSME-Harnstoff-Gel) zur Durchführung der RNA-Proben verwendet werden.
2. RNA-Proben (1:1) mit 2x denaturierendem Ladepuffer (95 % Formamid, 10 mM EDTA, 0,02 % SDS, 0,02 % Bromphenolblau und 0,01 % Xylolcyanol) mischen, 5 min bei 65 °C denaturieren und sofort auf Eis legen.
3. Die RNA-Proben werden in 0,5x FSME-Laufpuffer bei RT bei 220 V für ca. 1 h und 15 min aufgelöst.
4. Verwenden Sie für Größenstandards eine 1:1-Mischung aus ssRNA mit niedrigem Bereich und 14-30 nt ssRNA-Leitermarkern.
5. Das Gel mit 1x SYBR Gold-Nukleinsäure-Gelfärbung in 0,5x FSME für 10 min färben, zweimal mit destilliertem Wasser waschen und mit einem Bildgebungssystem abbilden (Abbildung 3).
6. Um die in jeder Spur aufgelöste RNA zu quantifizieren, verwenden Sie die Gelanalysemethode, die in der ImageJ-Dokumentation unter dem Untertitel "Gelanalyse" beschrieben ist: https://imagej.net/ij/docs/menus/analyze.html
7. Da jedes Mal 100 ng/μl CL-RNA geladen werden, um das Bandenmuster zwischen CL- und exRNA-Proben zu vergleichen, schätzen Sie die Konzentration der exRNA-Proben im Verhältnis zur CL-RNA (Abbildung 4).

Abbildung 3: Pflanzenblätter sind mit diverser RNA beschichtet. 100 ng RNA aus Blattzelllysat (CL) und 2 μl RNA, isoliert aus AWF und LSW, wurden auf einem 15%igen denaturierenden Polyacrylamidgel getrennt und mit SYBR Gold Nukleinsäurefärbung gefärbt, um die RNA-Bandenmuster zu visualisieren und zu vergleichen. RNA-Größenstandards werden in der Spur ganz links angezeigt. Densitometrie-Messungen, die mit der ImageJ-Gelanalyse durchgeführt wurden, sind am unteren Rand jeder Spur angegeben und zeigen die Menge an RNA im Verhältnis zur RNA in der gesamten Blattzelllysatspur an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Wiederholte Extraktion von LSW-RNA. LSW wurde zunächst unter Verwendung von VIB ohne Silwet L-77 oder unterschiedliche Konzentrationen von Silwet L-77 (0,001 % oder 0,01 %) isoliert. Die wiederholte Isolierung von LSW mit demselben Satz von Arabidopsis-Pflanzen kann zur Anreicherung von LSW-RNA mit VIB + Silwet L-77 (0,001%) verwendet werden. L1, L2 und L3 bezeichnen RNA-Proben, die mit LSW isoliert wurden und in drei aufeinanderfolgenden Zentrifugationsrunden nach dem Besprühen derselben Pflanzengruppe entnommen wurden. Eine Erhöhung der Konzentration des Netzmittels von 0,001 % auf 0,01 % verbesserte die Isolierung der LSW-RNA nicht. Densitometrie-Messungen, die mit der ImageJ-Gelanalyse durchgeführt wurden, sind am unteren Rand jeder Spur angegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

9. Alternative Methode zur Quantifizierung von RNA unter Verwendung einer Mikrotiterplatten-basierten Methode

1. Bereiten Sie Standard-RNA-Lösungen mit CL-RNA in hochreinem RNase/DNase-freiem Wasser her. Bestimmen Sie den geeigneten Konzentrationsbereich für die Standards auf der Grundlage der erwarteten Konzentration der Proben. Verwenden Sie die folgenden RNA-Konzentrationen: 0, 6,75, 12,5, 25, 50, 100, 200 ng/μl und bereiten Sie ein ausreichendes Volumen jedes Standards vor, um zwei technische Replikate zu ermöglichen.
2. Bereiten Sie 1,5x SYBR Gold Nukleinsäure-Gel-Färbung in 500 mM Tris HCl pH = 8 vor.
   HINWEIS: SYBR Gold ist pH-abhängig und hat eine optimale Färbeempfindlichkeit zwischen pH = 7,0 und 8,0.
3. Aufbau der Mikroplatten:
   1. 99 μl dH₂O in jede Vertiefung geben.
   2. Geben Sie 1 μl RNA in jede Vertiefung. Verwenden Sie 1 μl sowohl für RNA-Proben als auch für RNA-Standards.
   3. Geben Sie 50 μl 1,5x SYBR Gold in jede Vertiefung.
4. Stellen Sie die Parameter am Mikroplatten-Reader wie folgt ein:
   Shake - Linear oder orbital: 0:03 (MM:SS)
   Lesen Sie - Fluoreszenz-Endpunkt mit einer Anregungswellenlänge von 496 nm und einer Emissionswellenlänge von 540 nm.
5. Konstruieren Sie eine Kalibrierlinie mit den Werten der Normale. Berechnen Sie anhand der Kalibrierliniengleichung die RNA-Konzentrationen in den Proben.
   HINWEIS: Alternative Farbstoffe können zur Quantifizierung von RNA in TRIzol-isolierten Proben verwendet werden. Ähnliche Ergebnisse wurden mit dem Ribo488 RNA-Quantifizierungsreagenz erzielt. Für diesen Farbstoff stellt das Unternehmen eine ausführliche Anleitung zur Verfügung. Verdünnen Sie den Farbstoff kurz 1000x (1 bis 1000) mit 200 mM Tris pH = 8. Um die Messungen durchzuführen, fügen Sie dann 99 μl autoklaviertes dH₂O zu jeder Vertiefung hinzu + 1 μl RNA (Probe oder Standard) + 100 μl der Ribo488-Verdünnung, inkubieren Sie 5 Minuten und quantifizieren Sie die Fluoreszenz mit einem Plattenleser unter Verwendung von 480 nm Anregung und 520 nm Emission. Die Standardkurven, die mit den beiden RNA-Farbstoffen erhalten wurden, sind in Abbildung 5 dargestellt.

Abbildung 5: Standardkurven, die mit einer Mikrotiterplatten-basierten RNA-Quantifizierungsmethode erhalten wurden. Zwei verschiedene RNA-Farbstoffe, SYBR Gold (links) und Ribo488 (rechts), liefern konsistente Ergebnisse mit zwei technischen Replikaten pro Probe. Beide Methoden können zur Durchführung der RNA-Quantifizierung verwendet werden. Eine Standardkurve sollte jedoch jedes Mal erhalten werden, wenn RNA quantifiziert werden muss. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergebnisse

Abbildung 2A zeigt einen schematischen Überblick über das oben beschriebene schrittweise Protokoll zur Isolierung von Leaf Surface Wash (LSW) und apoplastischen Waschfraktionen (AWF) aus Arabidopsis-Pflanzen. Diese Methode ermöglicht die Extraktion von LSW und AWF aus nur drei bis sechs Pflanzen pro Replikat, während konstant gleiche Mengen an RNA aus beiden Fraktionen gewonnen werden. Um die RNA-Konzentration in Zelllysaten zu messen, verwenden wir die NanoDrop-Spektrophotometrie. Für die RNA-Proben, die aus LSW, LSS und AWF gewonnen werden, verlassen wir uns jedoch auf die densitometrische Quantifizierung von SYBR Gold-gefärbten Polyacrylamid-Gelen. Dieser Quantifizierungsschritt ist notwendig, da die extrazellulären Fraktionen eine unbekannte Kontaminante - wahrscheinlich Polysaccharide - enthalten, die manchmal coreinigen und absorptionsbasierte RNA-Quantifizierungsmethoden beeinträchtigen können, was zu einer Überschätzung der RNA-Konzentration führt. Um diese Einschränkung zu überwinden, planen wir, in unserer zukünftigen Arbeit nicht-phenolbasierte RNA-Aufreinigungsmethoden einzusetzen.

Die denaturierende RNA-Gelanalyse ergab das Vorhandensein einer breiten Palette von RNA-Spezies in LSW und AWF, einschließlich langer und kleiner RNAs (Abbildung 3). Bemerkenswert ist, dass äquivalente RNA-Mengen sowohl aus der Blattoberfläche als auch aus apoplastischen Fraktionen erfolgreich isoliert wurden, wobei die RNA-Mengen pro Frischgewicht (FW) der Pflanze normalisiert wurden. Überraschenderweise unterschieden sich die RNA-Größenprofile der LSW- und AWF-Fraktionen signifikant voneinander und vom Profil der Gesamtzelllysat-RNA (CL). Diese Unterschiede deuten darauf hin, dass die exRNA-Fraktionen nicht mit zellulärer RNA kontaminiert sind. Unter den drei Fraktionen wies die apoplastische RNA (AWF) die größte Diversität in der Größenverteilung auf, was darauf hindeutet, dass apoplastische RNA stärker abgebaut wird als Blattoberflächen-RNA.

Um das Vorhandensein von RNA auf der Oberfläche von Arabidopsis-Blättern weiter zu untersuchen, verwendeten wir Wattestäbchen. Diese Methode ermöglichte es uns, RNA getrennt und sequentiell von den adaxialen (oberen) und abaxialen (unteren) Blattoberflächen zu sammeln⁶. Diese Analysen zeigten, dass beide Blattoberflächen ähnliche Mengen an RNA enthielten. Darüber hinaus unterstützt die Fähigkeit, RNA einfach durch die Absorption von Puffer von der Blattoberfläche zu sammeln, ohne dass eine Zentrifugation erforderlich ist, die Schlussfolgerung, dass sich RNA tatsächlich auf der Blattoberfläche befindet und nicht während der Zentrifugation durch die Spaltöffnungen extrahiert wird.

Eine primäre Anpassung, die es uns ermöglichte, eine große Menge an Blattoberflächen-RNA zu extrahieren, war die Zugabe des Netzmittels. Wir haben fast doppelt so viel RNA zurückgewonnen, indem wir dem VIB Netzmittel (in einer sehr niedrigen Konzentration von 0,001%) zugesetzt haben. Dieser Unterschied in der Konzentration von RNA, die mit und ohne Silwet L-77 erhalten wurde, deutet darauf hin, dass die Verwendung eines Netzmittels die Auflösung der RNA auf der Blattoberfläche verbessert. Eine Erhöhung der Konzentration des Netzmittels von 0,001 % auf 0,01 % verbesserte die Isolierung der LSW-RNA jedoch nicht (Abbildung 4). Bemerkenswert ist, dass die Wiederholung der Isolierung von LSW-RNA aus denselben Blättern zusätzliche RNA lieferte (etwa 63 % der Rückgewinnung aus der ersten Wäsche), was darauf hindeutet, dass die Blätter kontinuierlich RNA an die Oberfläche sezernieren, wobei fast zwei Drittel davon innerhalb der etwa 30 Minuten ersetzt werden, die für die Verarbeitung der Blätter erforderlich sind. Um die Gesamtausbeute an LSW-RNA zu erhöhen, wenn das Pflanzenmaterial begrenzt ist, ist es daher möglich, dieselben Blätter mehrmals hintereinander zu waschen. Wir empfehlen jedoch nicht mehr als drei Wäschen, da die Handhabung zu kumulativen Schäden am Blattmaterial führen kann, die sich an der Grünfärbung der Waschflüssigkeit bemerkbar machen. Für diese Experimente wurde die RNA-Konzentration mit Hilfe einer RNA-Gel-basierten Densitometrie-Analyse geschätzt. Die oben beschriebene Mikrotiterplatten-basierte RNA-Quantifizierungsmethode kann jedoch für eine genaue Quantifizierung der RNA verwendet werden, wenn mehrere Proben gleichzeitig bewertet werden (Abbildung 5).

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt, wie Blattoberflächenreiniger (LSW), Blattoberflächentupfer (LSS) und apoplastische Waschflüssigkeit (AWF) aus gesunden Arabidopsis-Rosetten isoliert werden, gefolgt von einer RNA-Extraktion. Zu den kritischen Schritten gehören die Vorbereitung und Sterilisation von VIB vor der Durchführung des Experiments, der Anbau der Pflanzen unter kontrollierten Bedingungen und die Verwendung von Silwet-L77, um eine ordnungsgemäße Beschichtung der Blattoberfläche durch das VIB sicherzustellen. Diese Verfahren sollten gleiche Mengen an RNA aus LSW und AWF liefern, normiert durch das Frischgewicht der Blätter. Die Rückgewinnung von RNA aus diesen extrazellulären Fraktionen erfordert eine sorgfältige Handhabung, insbesondere im Hinblick auf RNA-Pellets nach Fällungsschritten.

Obwohl das obige Protokoll für Arabidopsis-Blätter optimiert wurde, haben wir es mit nur geringfügigen Modifikationen auch erfolgreich auf andere Pflanzenarten angewendet. Die RNA-Extraktion von der Blattoberfläche kann durch zwei primäre Anpassungen optimiert werden: erstens durch die Durchführung mehrerer Runden der LSW-Isolierung und zweitens durch Erhöhung der Konzentration des Netzmittels. Pflanzenarten mit sehr hydrophoben Blattoberflächen, wie z. B. Reis^12,13, können höhere Konzentrationen des Netzmittels benötigen.

Zusätzlich haben wir eine nicht-invasive Methode zur Gewinnung von Blattoberflächen-RNA mit Hilfe von Wattestäbchen beschrieben. Bei dieser Methode zur Isolierung von Blattoberflächen-RNA stellen wir sicher, dass das Entnahmeröhrchen in einen Eiskübel gelegt wird. Wenn man bedenkt, dass die RNA auf der Blattoberfläche bei Raumtemperatur sezerniert und akkumuliert wird, gehen wir davon aus, dass sie auch während des Entnahmeprozesses stabil bleibt. Wir haben auch die Bandenmuster von LSW- und LSS-RNA verglichen, und sie zeigen keinen großen Unterschied in Bezug auf den Abbau.

Das obige Protokoll verwendet das TRIzol-Reagenz, um RNA aus LSW, LSS oder AWF aufzureinigen. Dieses Reagenz verwendet Phenol, um Proteine zu entfernen. Wir haben jedoch festgestellt, dass die TRIzol-basierte Reinigung Polysaccharide wie Pektin, die in LSW und AWF⁶ reichlich vorhanden sind, nicht entfernt. Solche coreinigenden Moleküle können Probleme bei der RNA-Quantifizierung mittels Spektrophotometrie oder Fluorometrie verursachen. Wir stützen uns daher auf die RNA-Gel-basierte Densitometrie-Analyse, um die exRNA-Konzentrationen zu beurteilen. Wir untersuchen derzeit säulenbasierte Aufreinigungsmethoden, die eine bessere Trennung von RNA von Polysacchariden ermöglichen sollen. Diese Methoden schränken jedoch oft die Rückgewinnung kleiner RNAs ein, da die Kieselsäuremembran so optimiert ist, dass sie RNA-Moleküle bindet, die größer als ~200 Nukleotide sind. Kleine RNAs können während der Bindung die Membran passieren oder in Waschschritten verloren gehen. Daher verlassen wir uns bisher nur auf die TRIzol-basierte Methode für eine umfassendere Rückgewinnung aller RNA-Größen, einschließlich kleiner RNAs, obwohl sie eine sorgfältige Handhabung und Phasentrennung erfordert.

Darüber hinaus sehen wir bei der Durchführung von RNA-Gelanalysen keine Fragmente, die kleiner als 80 nt für zelluläre RNA-Proben im Vergleich zu AWF- und LSW-RNAs sind, hauptsächlich aufgrund der geringen Abundanz im Vergleich zu den großen Mengen an rRNA und tRNA. Das Vorhandensein kleinerer Banden in der AWF und LSW ist auf den Abbau der reichlich vorhandenen rRNAs und tRNAs zurückzuführen, der auf natürliche Weise nach der Sekretion von RNA im extrazellulären Kompartiment von Pflanzen erfolgt, und es handelt sich nicht um ein Artefakt, das bei der Entnahme und Handhabung von Pflanzen eingeführt wird, wie durch Sequenzierung und Northern-Blot-Analyse bestätigt^{wurde 6}.

Unsere Methode zur Isolierung der Blattoberflächenreinigung ist ein vielseitiges Werkzeug mit erheblichem Potenzial für eine Vielzahl von Forschungsanwendungen. Es soll die Isolierung von Biomolekülen wie RNA, Proteinen und anderen Metaboliten von der Blattoberfläche ermöglichen, die für das Verständnis der Wechselwirkungen zwischen Pflanzen und Mikroben von zentraler Bedeutung sein können. Wenn die Identifizierung der Mikroben, die in AWF und LSW vorhanden sind, gewünscht wird, kann dies durch den Wegfall der Filtration durch den 0,22-μm-Filter erreicht werden.

Pflanzen interagieren mit einer Vielzahl von Mikroben, darunter Bakterien, Pilze und Viren, die auf ihren Oberflächen komplexe Gemeinschaften bilden¹. Diese mikrobiellen Gemeinschaften können tiefgreifende Auswirkungen auf das Pflanzenwachstum, die Krankheitsresistenz und die Nährstoffaufnahme haben ^2,3,4. Durch die Isolierung und Analyse der Blattoberflächenwäsche mit dieser Methode können Forscher exRNA, mikrobielle Metaboliten, isolieren, mikrobielle Gemeinschaften auf der Blattoberfläche identifizieren und untersuchen, wie diese Gemeinschaften auf molekularer Ebene reguliert werden.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
14-30 nt ssRNA-Leitermarker	Takara	3416
1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen	VWR	20170-038
10 mL nadellose Spritze	BD	303347
15 mL Falken-Röhrchen	VWR	89039-668
15% Mini-PROTEAN FSME-Urea Gel, 10 Well/12 Well, 30 & Mikro; L/20 & Mikro; L	Bio-Rad	4566053 / 4566055
36-Zellen-Tray-Einsätze	Echter Blattmarkt
40%ige Acrylamid- und Bis-Acrylamid-Lösung, 37,5:1	Bio-Rad	1610148
Runde 4-Zoll-Töpfe	Echter Blattmarkt
50 mL Falcon Röhrchen	VWR	89039-656
50 mL nadellose Spritze	BD	309653
96-Well-Platte mit schwarzem Boden	Grenier	655090
Acrodisc 0.22 μ M Spritzenvorsatzfilter	Bahrtuch	4192
Acrodisc 0,45 μm M Spritzenvorsatzfilter	Bahrtuch	4454
Ammoniumpersulfat (APS)	Sigma-Aldrich	Nr. A3678
Calciumchlorid	Sigma-Aldrich	Nr. C1016
Chloroform (RNase-frei)	Macron Feinchemikalien	MK444110
Durchsichtige Kunststoffkuppeln	Hummert International	11 3348	Jede Kunststoffkuppel kann verwendet werden, um die Pflanzen abzudecken und die Feuchtigkeit aufrechtzuerhalten
Medizinischer Stick mit Baumwollspitze	Uline	Nr. S-21102
Ethanol (Rnase-frei)	Decon Laboratories, Inc.	2716GEA
French Press Kaffeemaschine, 24 fl oz	Schneegipfel	CS-111
Anzuchtschale ohne Löcher 10 x 20	Echter Blattmarkt
Eiskübel	Schuett-Biotech, Spongex	3-680 052
Isopropanol	Thermo Scientific	149320050
JA-14 Festwinkelrotor	Beckman Coulter; Modell: JA-14	339247
Kimwipes	KCWW, Kimberly-Clark	34120
ssRNA-Lader mit niedriger Reichweite	SCHNABEL	Nr. N0364S
MES-Hydrat	Sigma-Aldrich	M8250
Mikroplatten-Reader	BioTek	Synergie H1
Wunder-Gro	Wunder-Gro	24-8-16	Es ist ein Allzweck-Pflanzenfutter. Abhängig von der Bodenquelle, die für den Anbau der Pflanzen verwendet wird, kann die Anwendung angepasst werden.
Nalgene Zentifugenflasche 250 mL (ohne Verschluss)	Nalgene	3120
Papierhandtücher
ParaFilm  M Lab Film	Parafilm	Nr. S-25929
Kunststoffbecher (500 mL)	Uline	Nr. S-21658
RNase-freies Glykogen (20 mg/ml)	Thermo Scientific	Nr. R0561
RootShield Plus WP Biologisches Fungizid	BioWorks	68539-9
Schere
Silwet L-77	Phytotech-Labore	Nr. S7777	Silwet L-77 jeder Marke kann verwendet werden. Allerdings verliert Silwet mit der Zeit an Wirksamkeit. Es ist ideal, es einmal im Jahr auszutauschen.
Natriumchlorid	Sigma-Aldrich	Nr. S7653
Weicher Haarpinsel aus Nylon	UNS. Kunstbedarf	Nr. 6
Sprühflasche	Uline	Nr. S-7272	Jede Sprühflasche kann verwendet werden, aber die Sprüheinstellungen sollten auf der Dusche sein.
Sungro Professionelle Anbaumischung	Sungro
Sungro Anzuchtmischung	Sungro
SYBR Gold Nukleinsäure-Gel-Färbung (10.000x Konzentrat in DMSO)	Thermo Scientific	Nr. S11494
TEMED	Thermo Scientific	17919
TRIzol-Reagenz	Invitrogen	15596026
Hochreines Dnase/Rnase-freies Wasser	Invitrogen	10977015
Harnstoff	Sigma-Aldrich	Nr. U5378
Vakuumkammer, 0,20 Kubikfuß	SP Scienceware - Bel-Art Produkte - H-B Instrument	Nr. F42031-0000
Vakuumpumpe, 3,5 CFM	Ideale Vakuumprodukte	P101532
Waage	Escali	WBB480535	Dies ist nur ein Beispiel. Jede Waage kann verwendet werden.