Dieses Protokoll beschreibt die CTAB-Methode zur Gewinnung hochwertiger DNA aus Mykobakterien und überwindet Herausforderungen durch ihre robusten, mykolsäurereichen Zellwände. Der Prozess umfasst enzymatische Verdauung, Zelllyse mit CTAB und DNA-Reinigung durch organische Extraktion und Ethanol-Fällung. Diese Methode erzeugt DNA, die für molekulare Studien geeignet ist und für mykobakterielle Forschung zuverlässig ist.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
Ganzgenom-Deoxyribonukleinsäureextraktion aus Mycobacterium-Arten mittels der Cetyltrimethylammoniumbromid-Technik
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Eine effiziente und zuverlässige DNA-Extraktion ist ein grundlegender Schritt in der Molekularbiologie und liefert hochwertiges genetisches Material für nachgelagerte Anwendungen wie PCR, Sequenzierung und genomische Analysen. Die einzigartige Zellwandzusammensetzung der Mykobakterien, reich an Lipiden und Mykolsäuren, stellt jedoch erhebliche Herausforderungen für eine effiziente DNA-Isolierung dar. Die Cetyltrimethylammoniumbromid-(CTAB)-Methode wird aufgrund ihrer Effizienz bei der Gewinnung hochreiner DNA aus mykobakteriellen Arten, einschließlich schneller und langsam wachsender Stämme, weit verbreitet eingesetzt. Die Technik beinhaltet enzymatische Zerstörung bakterieller Zellen mittels Lysozym und Proteinase K, gefolgt von der Lyse der Zellkomponenten mittels CTAB, das selektiv bindet und einen Komplex mit Polysacchariden und Proteinen bildet. DNA-Reinigung und -Konzentration werden durch organische Lösungsmittelextraktion und Ethanol-Präzipitation erreicht. Laut unseren Daten liefert das CTAB-Protokoll hohe Mengen DNA (200 - 1000 ng/μL) mit hoher Qualität und minimaler Kontamination, wie durch Gelelektrophorese und NanoDrop-Analyse nachgewiesen wurde. Die aus verschiedenen mykobakteriellen Arten gewonnene DNA ist von hoher Reinheit und für verschiedene molekulare Studien geeignet. Diese Studie demonstriert die prozeduralen Schritte der CTAB-Methode und hebt ihren Nutzen zur Überwindung der einzigartigen Herausforderungen bei der mykobakteriellen DNA-Extraktion hervor.
Einleitung
Die Gewinnung hochwertiger DNA ist ein grundlegender Schritt der Molekularbiologie, der für nachgelagerte Anwendungen wie PCR, Ganzgenomsequenzierung und andere genomische Studien unerlässlich ist. Für Mycobacterium, eine Gattung, die sowohl pathogene Arten wie Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) als auch nicht-pathogene Umweltarten wie Mycobacterium smegmatis (M. smegmatis) umfasst, kann die DNA-Gewinnung aufgrund ihrer dicken, lipidreichen und hydrophoben Zellwände 1,2,3 schwierig sein. Diese harte Zellwand erfordert den Einsatz spezieller Lyseverfahren, um die Zellen zu stören und genomische DNA effektiv freizusetzen.
Die Cetyltrimethylammoniumbromid-(CTAB)-Methode hat sich als zuverlässig erwiesen, um hochwertige DNA verschiedener mykobakterieller Artenzu isolieren 4,5. CTAB, ein kationisches Tensid, bindet an Polysaccharide und andere Zellkomponenten und erleichtert deren Entfernung während des Extraktionsprozesses6. Selbst bei schwierigen Proben gewährleistet das CTAB-basierte Protokoll die effiziente Isolierung intakter und reiner DNA, insbesondere in Kombination mit enzymatischer Lyse, Wärmebehandlung und organischen Lösungsmittelextraktionen 7,8. Die CTAB-Methode spielte eine entscheidende Rolle bei der effizienten DNA-Extraktion aus mykobakteriellen Arten, insbesondere für die Forschung zur Ganzgenomsequenzierung, Metagenomik und molekularer Diagnostik, die reines und hochwertiges DNA-Eingabematerialbenötigt 9,10. Im Vergleich zu anderen DNA-Extraktionstechniken wie Bead-Beating oder kommerziellen Kits bietet das hier vorgestellte CTB-Protokoll einen deutlichen Vorteil bei der Erhaltung der DNA-Integrität, ein wesentlicher Faktor für Long-Read-Sequenzierung und epigenetische Anwendungen. Während frühere Studien geringere DNA-Erträge bei CTAB im Vergleich zu mechanischen Störungsmethoden berichtet haben, betonen sie auch seine Fähigkeit, DNA-Scheren zu minimieren und die DNA-Integritätzu erhalten. Um Einschränkungen in Reinheit und Ertrag zu beheben, wurde das aktuelle Protokoll mit verkürzten Inkubationszeiten und verbesserter Konsistenz über verschiedene Probentypen optimiert. Diese Verfeinerung wurde durch Erkenntnisse von Opperman et al. gestützt, die zeigten, dass CTAB-extrahierte DNA aus Mycobacterium avium-Kulturen eine ausreichende Konzentration und Qualität für nachgelagerte Anwendungen wie 16S-rRNA-Sequenzierung und Linienprobe-Assays aufweist, was die Anwendung des CTB-Protokolls als vielseitiges und skalierbares Werkzeug für mykobakterielle Forschung unterstützt, insbesondere in Studien, die intakte genomische DNA für fortgeschrittene molekulare Analysen erfordern13. Zusätzlich erfordert Next-Generation-Sequenzierung (NGS) in der Regel 100–1000 ng hochwertiger genomischer DNA14, und im Fall von Long-Read-Sequenzierung, wie der PacBio-Sequenzierung, ≥5 μg hochwertiger DNA15, daher bleibt CTAB bei großen Mengen hochwertiger und unversehrter DNA eine effektiveMethode 16.
Die Entwicklung effizienter, konsistenter und wirkungsvoller DNA-Extraktionsmethoden aus schwer zu lysierenden Mikroben ist notwendig, um Reproduzierbarkeit und Zuverlässigkeit in verschiedenen Laboren sicherzustellen, insbesondere für die Stammerkennung und epidemiologische Studien 5,7. Dieses Protokoll liefert Details zur Extraktion von Ganzgenom-DNA aus Mykobakterien mittels der CTAB-Methode. Das aktuelle Protokoll zielt darauf ab, Forschern zu ermöglichen, konsistente und zuverlässige Ergebnisse in ihren molekularbiologischen Arbeitsabläufen zu erzielen, indem die Fallstricke angegangen und die Herausforderungen durch die markante mykobakterielle Zellwand17 überwunden werden.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Protokoll
Die repräsentativen Ergebnisse wurden mit Zustimmung des REC: BES Ethikkomitees der Universität Stellenbosch (BES-2024-22504) erstellt. Die Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.
1. Herstellung der mykobakteriellen Kultursuspension
HINWEIS: Je nach untersuchter Art muss dieser Schritt entweder in einem Biosicherheitslabor der Stufe 2 (BSL-2) oder einem Biosicherheits-Laboratoire der Stufe 3 (BSL-3) durchgeführt werden. Die Inkubationszeit und die Bedingungen der Kultur hängen ebenfalls von den Wachstumsanforderungen der mykobakteriellen Art ab, da ihre unterschiedlichen Wachstumsraten und physiologischen Eigenschaften ausgeprägt sind.
- Bereiten Sie 5 mL bzw. 8 mL Bakterienkultur in Middlebrook 7H9 Flüssigmedium bzw. MGIT-Medien vor, ergänzt mit OADC, und inkubieren Sie bei 37 °C für den erforderlichen Zeitraum, um das Bakterienwachstum zu ermöglichen. Langsam wachsende Mykobakterien benötigen 10–14 Tage, während schnell wachsende Mykobakterien etwa 2–5 Tage benötigen.
HINWEIS: Eine Suspension von mykobakteriellen Zellen kann hergestellt werden, indem man eine Schlaufe voller Kolonien in steriles, doppelt destilliertes Wasser schabt, wenn die Ausgangskultur aus festen Agarplatten stammt (z. B. Middlebrook 7H10 Agar). - Gieße die flüssige Kultur in 15-mL-Röhren.
- Heizen Sie die Kultur bei 80 °C für 1 Stunde im Inkubator.
- Im Fall von Mycobacterium tuberculosis oder anderen pathogenen Arten, die BSL-3 benötigen, werden die hitzeabgetöteten Kulturen ins BSL-2-Labor übertragen.
2. Zellwandverdauung und DNA-Extraktion
HINWEIS: Sobald die Kultur hitzeinaktiviert ist, können die folgenden Schritte sicher in einem Biosicherheitslabor der Stufe 2 (BSL-2) durchgeführt werden. Wenn das Ziel die Extraktion für Long-Read-Sequenzierungen oder alternative Anwendungen mit hohem Molekulargewicht ist, sollten Sie Breitrohrpipelettenspitzen verwenden und bei Vortexschritten den Vortex durch Inversion oder Pipettenmischung ersetzen.
- Zentrifugiere das 15-mL-Rohr bei 3220 x g für 15–30 Minuten bei Raumtemperatur (RT). Entsorge das klare Überstandsmittel (achte darauf, dass das gesamte Medium entfernt ist).
- Die Kulturkugel wird gründlich in 300 μL Tris-EDTA (TE)-Puffer erneut suspendiert.
- Übertragen Sie das umgespannte Pellet in ein 2-mL-Rohr.
- Gib 100 μL Lysozym (10 mg/mL) hinzu und mixe durch Pipettieren auf und ab fünfmal, dann klopfe vorsichtig auf das Rohr, um eine gleichmäßige Verteilung zu gewährleisten.
- Inkubieren Sie das Gemisch bei 37 °C über Nacht in einem Rotationsinkubator (~16 H; eine geringere Inkubationszeit kann die Lyseeffizienz verringern und somit zu geringer DNA-Ausbeute führen).
- Am folgenden Tag bereiten Sie eine Mischung aus 5 μL Proteinase K (10 mg/mL) und 70 μL 10 % SDS vor. Wenn zum Beispiel fünf Proben vorhanden sind, bereiten Sie 350 μL 10 % SDS und 25 μL Proteinase K vor. Mischen Sie durch Invertieren des Rohrs, um Schaumbildung zu vermeiden.
- Fügen Sie jeder Probe 75 μL der Mischung hinzu.
- Mischen Sie durch Anklopfen und inkubieren Sie bei 65 °C für 10 Minuten in einem Inkubator oder Heizblock, mit intermittierendem Mischen durch Inversion.
- Fügen Sie 100 μL 5 M NaCl hinzu.
- Fügen Sie 100 μL vorgeheizte CTAB/NaCl-Lösung bei 65 °C hinzu.
HINWEIS: Erhitze die CTAB/NaCl-Lösung auf 65 °C, bevor du die Pipettgenauigkeit sicherstellst, wobei die Viskosität der Substanz bei RT berücksichtigt wird. - Rühren Sie durch Anklopfen, bis die Lösung milchig wird.
- Inkubieren Sie bei 65 °C für 10 Minuten in einem Inkubator oder Heizblock, mit intermittierendem Mischen durch Inversion.
- Gib jeder Probe ein gleiches Volumen (~ 675 μL) Chloroform/Isoamylalkohollösung (24:1) hinzu und mische durch Anklopfen.
HINWEIS: Führen Sie diesen Schritt in einer Dampfhaube durch, da Chloroform beim Einatmen giftig ist und vorsichtige Handhabung erfordert. - Zentrifugiere die Proben bei 12.000 x g für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
- Saugen Sie vorsichtig 550–600 μL der wässrigen (oberen) Phase in sterile 1,5-mL-Röhren und beschriften Sie diese entsprechend.
HINWEIS: Seien Sie vorsichtig, die anderen Schichten nicht zu stören. Wenn versehentlich Schichten zerstört werden, zentrifugiere das Rohr erneut.
3. DNA-Präzipitation und -Elution
- Fügen Sie ein gleiches Volumen (550–600 μL) eiskaltes Isopropanol hinzu und mischen Sie durch Invertieren der Röhren.
HINWEIS: Wenn die DNA-Konzentration hoch ist, kann sich beim Mischen weiße Niederschlagung bilden. - Inkubieren Sie die Röhren bei -20 °C für 30 Minuten bis 1 Stunde.
HINWEIS: Längere Inkubationszeiten können die DNA-Niederschlagung18 erhöhen, können aber auch zur Koprecipitation von Salzen führen. Daher kann eine nächtliche Inkubation durchgeführt werden, wenn eine niedrige DNA-Konzentration erwartet wird. - Zentrifugiere bei höchster Geschwindigkeit (~21130 x g) bei Raumtemperatur 30 Minuten lang, um die unlösliche DNA zu pelletieren.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Vorderseite der 1,5-Röhren im Zentrifugenrotor nach innen zeigt. In diesem Schritt fällt die DNA am Boden und entlang der Rückseite der Röhren aus. Dies ist wichtig, um im nächsten Schritt das möglicherweise unsichtbare Pellet nicht zu stören. Ein weißer Niederschlag oder ein Pellet kann sichtbar sein, wenn die DNA-Konzentration hoch ist. Das Fehlen einer Kugel weist nicht auf eine fehlgeschlagene Extraktion hin; Fahren Sie mit den restlichen Schritten fort. - Aspirieren Sie das Supernatant von der Vorderseite des Röhrchens, ohne das DNA-Pellet zu stören oder es schnell zu dekantieren, wobei das Pellet unberührt bleibt.
HINWEIS: Es ist besser, das Supernatant zu aspirieren, wenn die Ausgangskultur klein ist und eine niedrige DNA-Konzentration erwartet wird. - Fügen Sie 1000 μL eiskaltes 75%iges Ethanol hinzu.
- Mische die Röhren mehrmals.
- Zentrifugiere bei 12.000 × g für 30 Minuten (in derselben Ausrichtung wie in Schritt 3).
- Saugen oder dekantieren Sie das gesamte Ethanol, ohne das Pellet zu stören.
HINWEIS: Die Schritte 5–8 können wiederholt werden, wenn eine hohe Salz-Coprecipitation erwartet wird. - Lass die Röhren bei RT über Nacht oder mindestens 30 Minuten an der Luft trocknen.
- Fügen Sie jedem Röhrchen 25–50 μL TE-Puffer (pH 8) hinzu, um die DNA wieder zu suspendieren.
HINWEIS: Die DNA kann in einem Tris-Puffer (10 mM, pH 8) oder nukleasefreiem Wasser neu suspendiert werden, sofern nachgelagerte Anwendungen auf EDTA empfindlich sind. - Lassen Sie das DNA-Pellet über Nacht bei 4 °C nachziehen.
- Lagern Sie 2-3 Tage bei 4 °C, bevor eine Qualitätskontrolle durchgeführt wird.
- Lagere sie langfristig bei -80 °C.
4. DNA-Quantifizierung und Qualitätskontrolle
HINWEIS: Die Qualitätskontrolle der DNA erfolgt in der Regel mit einem Mikrovolumenspektrophotometer und der Gelelektrophorese. Ein fluoreszenzbasiertes Quantifizierungssystem kann ebenfalls verwendet werden, um extrahierte DNA zu quantifizieren.
- Spektrophotometer-Methode
- Missen Sie die DNA-Konzentration und bestimmen Sie die Qualität gemäß den Anweisungen des Herstellers.
HINWEIS: Eine DNA-Probe hat idealerweise ein Verhältnis von 260/280 zwischen 1,7 und 2,0. Ein Wert von 1,8 gilt normalerweise als rein für DNA. Werte unterhalb dieses Bereichs deuten auf eine Kontamination durch Restproteine, Guanidin oder andere Reagenzien hin, die bei oder nahe 280 nm stark aufgenommen werden. Ein Verhältnis von 260/230 zwischen 2,0 und 2,2 ist ideal. Ist das Verhältnis niedriger als erwartet, kann dies auf das Vorhandensein von Schadstoffen hinweisen, die bei 230 nm aufgenommen werden, wie EDTA, Phenol und Kohlenhydrate. Überprüfen Sie auch die für die Probe erhaltenen Absorptionsgraphen.
- Missen Sie die DNA-Konzentration und bestimmen Sie die Qualität gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Gelelektrophorese
- Durchführung der Agarosegel-Elektrophorese19 , um die DNA-Integrität zu bewerten und festzustellen, ob Fragmentierung oder Abbau stattgefunden hat.
- Um DNA im UV-Gel-Dokumentationssystem zu visualisieren, verwenden Sie einen 1,0%igen Agarosegel mit SYBR Safe-Farbstoff. Das Gel 45 Minuten bei 80 V laufen lassen.
HINWEIS: Das Ziel ist es, klare, markante, hochmolekulare Bänder über dem höchsten Band der DNA-Leiter zu haben. Benutze jedes Mal einen frischen 1× TAE-Puffer.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ergebnisse
Dieses DNA-Extraktionsprotokoll mit der CTAB-Methode (Abbildung 1) wurde an verschiedenen mykobakteriellen Arten wie M. tuberculosis, M. abscessus und M. chelonea untersucht. DNA wurde extrahiert und hinsichtlich des Ertrags, der Reinheit und der Integrität der gewonnenen DNA in verschiedenen Proben verglichen.
Die DNA-Konzentration variierte zwischen den mykobacterialen Arten und lag zwischen 190–600 ng...
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
Repräsentative Ergebnisse zeigen den Nutzen der CTAB-Methode zur DNA-Gewinnung von mykobakteriellen Arten und zur Bewältigung der Herausforderungen bei der DNA-Gewinnung dieser Organismen. Mykobakterien sind bekannt für ihre komplexen und lipidreichen Zellwände2. Die aktuellen Ergebnisse heben mehrere entscheidende Aspekte hervor, die zum Erfolg dieser Technik beitragen, da sie hochkonzentrierte, hochwertige intakte DNA liefert, die für nachgelagerte Anwendungen w...
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte, die offengelegt werden müssen.
Danksagungen
Die Autoren sprechen dem TB-Genomik-Team Nabila Ismail, Melanie Grobbelaar, Emylin Costa und Rob M Warren ihren aufrichtigen Dank für ihre Beiträge zur Entwicklung und Optimierung dieses Protokolls sowie für ihre unschätzbare Unterstützung während der gesamten Studie aus. Diese Arbeit und die beteiligten Personen wurden durch Fördermittel und Fördermittel des South African Medical Research Council (SAMRC), der National Research Foundation (NRF) und der Universität Stellenbosch (SU) unterstützt. Die Geldgeber hatten keine Rolle bei der Studienplanung, Datenerhebung, Analyse oder Manuskripterstellung.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 1-mL-Pipettenspitzen | Jeder Anbieter | ||
| 10 & Mikro; L-Pipettenspitzen | Jeder Anbieter | ||
| 10 % Natriumdodecylsulfat (SDS) | Merck (Sigma-Aldrich) | 71736-100 ML | |
| 15-mL-Polypropylenrohre | Jeder Anbieter | ||
| 2-ml-Röhrchen und 1,5-ml-Röhrchen | Jeder Anbieter | ||
| 200 & Mikro; L-Pipettenspitzen | Jeder Anbieter | ||
| 2-PROPANOL, BIOREAGENZ, FÜR MOLEKULARE B& | Merck (Sigma-Aldrich) | I9516-1L | Kaufen Sie in -20 °C; C |
| 37 Grad; C-Inkubator | Jeder Anbieter | ||
| 5 M NaCl | Merck (Sigma-Aldrich) | S6546 - 100 ML | |
| 65 Grad; C-Inkubator | Jeder Anbieter | ||
| Agarosegel | Merck (Sigma-Aldrich) | ||
| Bio-Rad UV-Gel-Dokumentationssystem, | BioRad | ||
| Zentrifuge (für 15-ml-Röhren oder 50 ml) und Mikrofuge (für 2-ml-Röhren) | Jeder Anbieter | ||
| CHLOROFORM ZUR ANALYSE EMPARTA® ACS | Merck (Sigma-Aldrich) | 1070242500 | |
| Chloroform/Isoamylalkohol (24:1) | In einer Abzughaube 384 ml Chloroform und 16 ml Isoamylalkohol mischen | ||
| CTAB/NaCl-Lösung | Merck (Sigma-Aldrich) | 52370-100 G | 4,1 g NaCl in 80 ml destilliertem Wasser auflösen. Beim Rühren 10 g CTAB hinzufügen. Wärmelösung in 65°F; C-Inkubator. Stell das Volumen mit destilliertem Wasser auf 100 ml ein. Lagere bis zu 6 Monate bei Zimmertemperatur. |
| DNA 1 Kb Leiter | Thermo Fisher Scientific | ||
| ETHYLALKOHOL, REIN, 200 PROOF, FÜR MOL& | Merck (Sigma-Aldrich) | E7023-500ML | Mische 75 ml Absolute Ethanol und 25 ml destilliertes Wasser |
| Lysozym (10 mg/ml) | Merck (Sigma-Aldrich) | 10837059001 | Rekonstituierte das lyophilisierte Lysozym (auf Zimmertemperatur gebracht) mit destilliertem Wasser auf 10 mg/ml |
| Middlebrook 7H9 Medien | Merck (Sigma-Aldrich) | M0178 | Folgen Sie den Herstellerrichtlinien zur Herstellung des flüssigen Mediums |
| MIDDLEBROOK OADC ANREICHERUNG 6 x 100 ml F | BD | 212240 | |
| Mycobacteria Growth Indicator Tube (MGIT)-Medien | BD | 245122 | |
| NanoDrop-System | Thermo Fisher Scientific | ||
| P10-Pipette | Jeder Anbieter | ||
| P1000-Pipette | Jeder Anbieter | ||
| P200-Pipette | Jeder Anbieter | ||
| Proteinase K, Recomb, PCR grd 2x250mg | Merck (Sigma-Aldrich) | 3115801001 | Rekonstituierte das Fläschchen der lyophilisierten Proteinase K mit destilliertem Wasser auf 10 mg/ml. Aliquots in 2-ml-Röhrchen bei -20 °C einfrieren; C |
| SYBR-sicher | Thermo Fisher Scientific | ||
| Tris/EDTA (TE) Puffer pH 8,0 | Merck (Sigma-Aldrich) | 8890-OP oder 382499997 | |
| Vortex | Jeder Anbieter |
Referenzen
- FBouso, J. M., Planet, P. J. Complete non-tuberculous mycobacteria whole genomes using an optimized DNA extraction protocol for long-read sequencing. BMC Genomics. 20 (1), 793(2019).
- Daffé, M., Marrakchi, H. Unraveling the structure of the mycobacterial envelope. Microbiol Spectr. 7 (4), 7.4.1(2019).
- Wayne, L. G., Sohaskey, C. D. Nonreplicating persistence of Mycobacterium tuberculosis. Annu Rev Microbiol. 55 (1), 139-163 (2001).
- Mohammadi, S., et al. Optimal DNA isolation method for detection of non-tuberculous mycobacteria by polymerase chain reaction. Adv Biomed Res. 6 (1), 133(2017).
- Van Soolingen, D., et al. Occurrence and stability of insertion sequences in Mycobacterium tuberculosis complex strains: Evaluation of an insertion sequence-dependent DNA polymorphism as a tool in the epidemiology of tuberculosis. J Clin Microbiol. 29 (11), 2578-2586 (1991).
- Wilson, K. Preparation of genomic DNA from bacteria. Curr Protoc Mol Biol. 56 (1), 2.4.1-2.4.5 (2001).
- Van Embden, J. D., et al. Strain identification of Mycobacterium tuberculosis by DNA fingerprinting: Recommendations for a standardized methodology. J Clin Microbiol. 31 (2), 406-409 (1993).
- Wang, W. -F., et al. Genomic analysis of Mycobacterium tuberculosis isolates and construction of a Beijing lineage reference genome. Genome Biol Evol. 12 (2), 3890-3905 (2020).
- Epperson, L. E., Strong, M. A scalable, efficient, and safe method to prepare high quality DNA from mycobacteria and other challenging cells. J Clin Tuberc Other Mycobact Dis. 19, 100150(2020).
- Warren, R., et al. Safe Mycobacterium tuberculosis DNA extraction method that does not compromise integrity. J Clin Microbiol. 44 (1), 254-256 (2006).
- Amaro, A., Duarte, E., Amado, A., Ferronha, H., Botelho, A. Comparison of three DNA extraction methods for Mycobacterium bovis, Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium avium subsp. avium. Lett Appl Microbiol. 47 (1), 8-11 (2008).
- Arslan, N., Demiray-Gurbuz, E., Ozkutuk, N., Esen, N., Özkütük, A. A. Comparison of four different DNA isolation methods from MGIT culture for long-read whole genome sequencing of Mycobacterium tuberculosis. Jundishapur J Microbiol. 17 (9), e148070(2024).
- Opperman, C. J., et al. Mycobacterium avium DNA extraction: Implications for NTM identification and amplicon sequencing. South Afr J Infect Dis. 40 (1), 5(2025).
- Froenicke, L. Illumina and Aviti sample and library requirements. DNA Technol Core. , https://dnatech.ucdavis.edu/illumina-aviti-sample-and-library-requirements (2015).
- Froenicke, L. PacBio Revio and Sequel II library prep & sequencing. DNA Technol Core. , https://dnatech.ucdavis.edu/pacbio-revio-and-sequel-ii-library-prep-sequencing (2016).
- Dippenaar, A., et al. Droplet-based whole genome amplification for sequencing minute amounts of purified Mycobacterium tuberculosis DNA. Sci Rep. 14, 9931(2024).
- Doig, C. The efficacy of the heat-killing of Mycobacterium tuberculosis. J Clin Pathol. 55 (10), 778-779 (2002).
- Li, Y., et al. A systematic investigation of key factors of nucleic acid precipitation toward optimized DNA/RNA isolation. Biotechniques. 68 (4), 191-199 (2020).
- Green, M. R., Sambrook, J., Sambrook, J. Molecular cloning: A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. N.Y. (2012).
- Van Soolingen, D., Hermans, P. W., De Haas, P. E., Van Embden, J. D. Insertion element IS1081-associated restriction fragment length polymorphisms in Mycobacterium tuberculosis complex species: A reliable tool for recognizing Mycobacterium bovis BCG. J Clin Microbiol. 30 (7), 1772-1777 (1992).
- Doig, C., Seagar, A. L., Watt, B., Forbes, K. J. The efficacy of the heat killing of Mycobacterium tuberculosis. J Clin Pathol. 55 (10), 778-779 (2002).
- Dippenaar, A., et al. Exploring the potential of Oxford Nanopore Technologies sequencing for Mycobacterium tuberculosis sequencing: An assessment of R10 flowcells and V14 chemistry. PLOS ONE. 19 (6), e0303938(2024).
- Chang, A., et al. Metagenomic DNA sequencing to quantify Mycobacterium tuberculosis DNA and diagnose tuberculosis. Sci Rep. 12, 16972(2022).
- Forbes, J. D., Knox, N. C., Ronholm, J., Pagotto, F., Reimer, A. Metagenomics: The next culture-independent game changer. Front Microbiol. 8, 1069(2017).
- Marshall, J. E., et al. Methods of isolation and identification of non-tuberculous mycobacteria from environmental samples: A scoping review. Tuberculosis. 138, 102291(2023).
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
