Ein GFP-komplementäres Dual-Expressionssystem zur Beurteilung des durch Cytoneme vermittelten Zell-Zell-Kontakts in lebenden Drosophila-Flügel-Imaginalscheiben

Summary

Wir beschreiben ein Protokoll zur Messung von Kontakten zwischen Zellen in benachbarten Epithelschichten in lebenden Drosophila-Flügel-Imaginalscheiben unter Verwendung eines GFP-rekonstitutionsbasierten Ansatzes.

Abstract

Das Wachstum und die Musterbildung von embryonalem Gewebe werden weitgehend durch Signale gesteuert, die lokal zwischen Zellpopulationen innerhalb des Gewebes selbst ausgetauscht werden. Cytoneme sind eine Art von Signal-Filopodien, die zuerst in Drosophila identifiziert wurden und den Austausch zwischen signalproduzierenden und signalempfangenden Zellen verbinden und vermitteln. In der sich entwickelnden Imaginalscheibe des Drosophila-Flügels sind Zytoneme am Signalaustausch zwischen verschiedenen Zellpopulationen innerhalb des eigentlichen Bandscheibenepithels (DP), das den adulten Flügel bilden wird, sowie zwischen DP-Zellen und Zellen in benachbarten Bandscheiben-assoziierten Geweben beteiligt. Cytoneme synapsieren mit Zielzellen, um intime Membrankontakte zu bilden.

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll zur Quantifizierung des Zytonem-vermittelten Kontakts zwischen DP-Zellen und Zellen des benachbarten Epithels der peripodialen Membran (PerM) vor, das durch das Scheibenlumen von den DP-Zellen getrennt ist, unter Verwendung eines GFP-Rekonstitutionsansatzes in lebenden Flügelscheiben. Unter Verwendung der GAL4-UAS- und LexA-LexAop-Systeme werden komplementäre Fragmente von Split-GFP (spGFP1-10, spGFP11), die jeweils mit der Transmembrandomäne von CD4 fusioniert sind, auf beiden Seiten des Scheibenlumens exprimiert. Die Bildgebung der rekonstituierten GFP-Fluoreszenz in lebenden Flügelscheibenpräparationen mittels konfokaler Mikroskopie wird dann verwendet, um Bildstapel zu erzeugen, aus denen die rekonstituierte GFP-Fluoreszenz lokalisiert und quantifiziert werden kann. Mit diesem System ist es möglich, proteinkodierende oder RNA-Interferenz-Transgene entweder in Zytonem-produzierenden Zellen als auch in Zielzellen zu koexprimieren, um deren Wirkung auf DP-PerM-Zellkontakte zu messen. Dieses System, das sich leicht an andere Gewebe anpassen lässt, ermöglicht so die Identifizierung von Faktoren, die für die Bildung oder Funktion von Zytonemen wichtig sind.

Introduction

Die Entwicklung embryonaler Gewebe wird von Zellen gesteuert, die sich in "Organisationszentren" befinden, die entfernten Zellen innerhalb eines Gewebes Signale geben und ihre Entscheidungen zur Vermehrung (d. h. zum Wachsen und Teilen) oder zur Annahme bestimmter Schicksale steuern¹. Diese zellnicht-autonome Signalübertragung wird durch Liganden vermittelt, die von der Organisation von Zentrumszellen produziert werden, die Konzentrationsgradienten durch das Gewebe bilden und konzentrationsabhängige Reaktionen hervorrufen. In vielen Fällen werden diese Liganden entweder durch lange Aktin-basierte Signal-Filopod....

Protocol

Der nubbin-GAL4-Treiber wird verwendet, um CD4-spGFP1-10 spezifisch in der Flügeltaschenregion des DP zu exprimieren (Abbildung 1A). Der PerM-LexA-Treiber²¹ wird verwendet, um CD4-spGFP11 spezifisch im PerM zu exprimieren (Abbildung 1A). Diese beiden Expressionssysteme sind unabhängig voneinander und ermöglichen die gleichzeitige und spezifische Expression verschiedener Transgene in DP und PerM (Abbildung 1B,C).

Das grundlegende genetische Schema beinhaltet die Kreuzung von Fliegen, um Larven des Genoty....

Results

Um die Nützlichkeit des GRASP-Verfahrens für die Messung von Kontakten zwischen DP- und PerM-Zellen zu testen, untersuchten wir Flügelscheiben von vier verschiedenen Genotypen: Wildtyp-Negativkontrollscheiben (Genotyp: w¹¹¹⁸), die nur Hintergrundwerte der Autofluoreszenz im GFP-Kanal anzeigen; Scheiben, die das CD4-spGFP1-10 in der DP-Schicht exprimieren, aber das CD4-spGFP11-Transgen nicht vorhanden ist, was das von GFP1-10 allein erzeugte Fluoreszenzniveau zeigt (von dem wir erwartet hatten, dass es.......

Discussion

Cytoneme spielen eine wichtige Rolle bei der Verteilung von Liganden und steuern das Wachstum und die Organisation von sich entwickelnden Geweben. Der Signalaustausch findet dort statt, wo die Zytonemspitzen engen Membrankontakt mit ihren Zielen herstellen. In diesem Protokoll beschreiben wir eine einfache Methode zur Analyse von Zytonem-vermittelten Kontakten zwischen Epithelschichten in der Flügelscheibe mit Hilfe der GRASP-Technik.

Die hier vorgestellte Tec.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Discovery V12 Präpariermikroskop	Zeiss		Mikroskop zum Sezieren
Dumont #55 Pinzette, Biologie Tipps	Werkzeuge für die Feinwissenschaft	11255-20	Pinzette zum Präparieren
EP-Slik (slik20358)	BDSC GmbH	Panneton et al. 2015	Fliegenstamm zum Ausdrücken von Slik
FIDSCHI		Schindelin J. et al. (2012)	Bildanalyse-Software
Hoechst 33342	ThermoFisher Scientific	H3570	Live-Bildgebung von nuklearen Flecken
LexAop-CD4-spGFP11	BDSC GmbH	93018	Fliegen-Stamm
LSM 700 Konfokalmikroskop	Zeiss		Konfokales Mikroskop
nub-GAL4	Bloomington Drosophila Stock Centre (BDSC)	86108	Fliegen-Stamm
PerM-LexA		Rambaud, Joseph et al., 2025	Fliegen-Stamm
PYREX 9-Depression Glas-Spotplattesell	Corning Biowissenschaften	7220-85	zum Sammeln und Waschen von Larven
Schneider-Drosophila Medium	ThermoFisher Scientific	21720024	Live-Imaging-Medium
SecureSeal Abstandshalter für die Bildgebung, 8 Wells, 0,12 mm dick	Grace Bio-Labore	654008	Abstandhalter
SYLGARD 184 Silikonelastomer-Kit	Sylgard	3097358-1004	zur Herstellung von Sezierplatten
UAS-CD4-spGFP1-10	BDSC GmbH	93017	Fliegen-Stamm
Zen Schwarz	Zeiss		Software zur Akquisition