Wir beschreiben ein Protokoll zur Messung von Kontakten zwischen Zellen in benachbarten Epithelschichten in lebenden Drosophila-Flügel-Imaginalscheiben unter Verwendung eines GFP-rekonstitutionsbasierten Ansatzes.
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Methodenartikel
Ein GFP-komplementäres Dual-Expressionssystem zur Beurteilung des durch Cytoneme vermittelten Zell-Zell-Kontakts in lebenden Drosophila-Flügel-Imaginalscheiben
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Das Wachstum und die Musterbildung von embryonalem Gewebe werden weitgehend durch Signale gesteuert, die lokal zwischen Zellpopulationen innerhalb des Gewebes selbst ausgetauscht werden. Cytoneme sind eine Art von Signal-Filopodien, die zuerst in Drosophila identifiziert wurden und den Austausch zwischen signalproduzierenden und signalempfangenden Zellen verbinden und vermitteln. In der sich entwickelnden Imaginalscheibe des Drosophila-Flügels sind Zytoneme am Signalaustausch zwischen verschiedenen Zellpopulationen innerhalb des eigentlichen Bandscheibenepithels (DP), das den adulten Flügel bilden wird, sowie zwischen DP-Zellen und Zellen in benachbarten Bandscheiben-assoziierten Geweben beteiligt. Cytoneme synapsieren mit Zielzellen, um intime Membrankontakte zu bilden.
In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll zur Quantifizierung des Zytonem-vermittelten Kontakts zwischen DP-Zellen und Zellen des benachbarten Epithels der peripodialen Membran (PerM) vor, das durch das Scheibenlumen von den DP-Zellen getrennt ist, unter Verwendung eines GFP-Rekonstitutionsansatzes in lebenden Flügelscheiben. Unter Verwendung der GAL4-UAS- und LexA-LexAop-Systeme werden komplementäre Fragmente von Split-GFP (spGFP1-10, spGFP11), die jeweils mit der Transmembrandomäne von CD4 fusioniert sind, auf beiden Seiten des Scheibenlumens exprimiert. Die Bildgebung der rekonstituierten GFP-Fluoreszenz in lebenden Flügelscheibenpräparationen mittels konfokaler Mikroskopie wird dann verwendet, um Bildstapel zu erzeugen, aus denen die rekonstituierte GFP-Fluoreszenz lokalisiert und quantifiziert werden kann. Mit diesem System ist es möglich, proteinkodierende oder RNA-Interferenz-Transgene entweder in Zytonem-produzierenden Zellen als auch in Zielzellen zu koexprimieren, um deren Wirkung auf DP-PerM-Zellkontakte zu messen. Dieses System, das sich leicht an andere Gewebe anpassen lässt, ermöglicht so die Identifizierung von Faktoren, die für die Bildung oder Funktion von Zytonemen wichtig sind.
Einleitung
Die Entwicklung embryonaler Gewebe wird von Zellen gesteuert, die sich in "Organisationszentren" befinden, die entfernten Zellen innerhalb eines Gewebes Signale geben und ihre Entscheidungen zur Vermehrung (d. h. zum Wachsen und Teilen) oder zur Annahme bestimmter Schicksale steuern1. Diese zellnicht-autonome Signalübertragung wird durch Liganden vermittelt, die von der Organisation von Zentrumszellen produziert werden, die Konzentrationsgradienten durch das Gewebe bilden und konzentrationsabhängige Reaktionen hervorrufen. In vielen Fällen werden diese Liganden entweder durch lange Aktin-basierte Signal-Filopodien, sogenannte Zytoneme, abgegeben oder aufgenommen, die signalsendende und -empfangende Zellen in Geweben verbinden 2,3. Zuerst in der Imaginalscheibe4 des Drosophila-Flügels entdeckt, wurden Zytoneme auch in Säugetieren und anderen Wirbeltieren identifiziert 5,6,7,8,9. Ein besseres Verständnis der Rolle von Zytonemen bei der nicht-autonomen Signalübertragung von Zellen in einem frühen Stadium ist entscheidend, um zu entschlüsseln, wie Zellen kommunizieren, um sich in Geweben zu organisieren, und wie diese Kommunikationslinien bei verschiedenen pathologischen Zuständen, einschließlich Entwicklungsfehlbildungen und Krebs, verändert werden.
Cytoneme können sich von Quellzellen ausbreiten, um Liganden an Zielzellen zu liefern, oder von Zielzellen, um Liganden in der Nähe ihrer Quellen zu empfangen 2,3. Cytoneme stellen enge Kontakte mit ihren Zielen her, wo sie vermutlich synapsenähnliche Strukturen bilden, in denen ein Ligandentransfer stattfinden kann 3,10,11. Dieser Kontakt kann zwischen den Spitzen von Ausgangs- und Zielzytonemen oder zwischen Zytonemen und Zellkörpern stattfinden3. Obwohl nicht umfassend charakterisiert, ist die Zelladhäsion durch Adhäsionsmoleküle oder durch Rezeptor-Liganden-Wechselwirkungen in einigen Fällen für die ordnungsgemäße Aktivierung nachgeschalteter Signalereignisse erforderlich 12,13,14, was dies zu einem wichtigen Aspekt der Zytonembiologie macht.
Mehrere Studien haben die "GFP reconstitution across synaptic partners" (GRASP) Technik auf die Analyse von Zytonemkontakten angewendet. Diese Methode wurde entwickelt, um synaptische Partner in komplexen Nervensystemen zu identifizieren und zu kartieren15. Es basiert auf der Expression der beiden komplementären Fragmente von Split-GFP (spGFP1-10 und spGFP11), die jeweils mit der extrazellulären Region einer Transmembrandomäne (z.B. von CD4) in verschiedenen Zellpopulationen fusioniert sind. Wenn die Plasmamembranen der Zellen in diesen beiden Populationen in direkten Kontakt kommen, bringt dies die komplementären Domänen von spGFP in die Nähe, was zur Rekonstitution der GFP-Fluoreszenz führt. Dieser Ansatz wurde bei Drosophila verwendet, um das Vorhandensein von Zytonemkontakten zwischen Zellen innerhalb der Flügelscheibe und zwischen der Flügelscheibe und anderen eng beieinander liegenden Geweben zu identifizieren 12,16,17,18,19,20,21.
In dieser Arbeit wird die Anwendung von GRASP zur Charakterisierung von Kontakten zwischen zwei morphologisch unterschiedlichen Epithelschichten der Drosophila-Flügel-Imaginalscheibe, der eigentlichen Scheibe (DP) und der peripodialen Membran (PerM), beschrieben. Diese Epithelschichten bilden einen Sack, der ein zentrales Lumen umgibt, wobei sich die pseudostratifizierten säulenförmigen DP-Zellen auf der einen Seite und die plattenepitheliven PerM-Zellen auf der anderen Seite befinden, wobei beide mit ihren apikalen Membranen nach innen zum Lumen hin zeigen (Abbildung 1A). Es gibt einige Hinweise auf translumenale Signalwege zwischen den beiden Schichten 22,23,24,25, und wir haben kürzlich die Signalübertragung aus dem DP dokumentiert, um die Proliferation von PerM-Zellen zu kontrollieren, die durch apikale Zytone in der DP vermittelt wird 21. Dieses Protokoll beinhaltet die Verwendung der Transgen-Expressionssysteme GAL4/UAS und LexA/LexAop, um komplementäre Fragmente von spGFP, die mit CD4 fusioniert sind, auf den Membranen von DP- und PerM-Zellen zu exprimieren. Es verwendet rekonstituierte GFP-Fluoreszenz, um den Membrankontakt zwischen den beiden Zellpopulationen auszulesen.
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Protokoll
Der nubbin-GAL4-Treiber wird verwendet, um CD4-spGFP1-10 spezifisch in der Flügeltaschenregion des DP zu exprimieren (Abbildung 1A). Der PerM-LexA-Treiber21 wird verwendet, um CD4-spGFP11 spezifisch im PerM zu exprimieren (Abbildung 1A). Diese beiden Expressionssysteme sind unabhängig voneinander und ermöglichen die gleichzeitige und spezifische Expression verschiedener Transgene in DP und PerM (Abbildung 1B,C).
Das grundlegende genetische Schema beinhaltet die Kreuzung von Fliegen, um Larven des Genotyps nub-GAL4/UAS-CD4-spGFP1-10 zu erzeugen; PerM-LexA/LexAop-CD4-spGFP11. Als Negativkontrolle lassen wir das Transgen LexAop-CD4-spGFP11 aus. Andere Transgene (z. B. proteinkodierende, doppelsträngige RNA) können beliebig in der DP-Schicht (unter der Kontrolle von UAS-Sequenzen ) oder in der PerM (unter der Kontrolle des LexA-Operators) exprimiert werden.
Dabei handelt es sich um ein Live-Imaging-Protokoll, das nicht unterbrochen werden kann. Die Materialvorbereitung wird auf ~10 min geschätzt. Dissektionen sollten nicht länger als 20 Minuten am Stück vor der Bildgebung durchgeführt werden. Die Bildgebung dauert ~30 Minuten und sollte nicht länger als ~1 Stunde dauern. Bei mehreren Erkrankungen oder einer hohen Anzahl von Proben muss das Verfahren in mehreren Runden durchgeführt werden, um die besten Ergebnisse zu erzielen.
1. Materialvorbereitung
- Reinigen Sie vor dem Sezieren eine Pinzette, eine 9-Well-Glas-Depressions-Spotplatte (oder einen anderen Behälter, der zum Sammeln und Reinigen von Larven geeignet ist) und eine wiederverwendbare Sylgard (Silikon)-beschichtete Petrischale, die zum Sezieren mit 70 % Ethanol verwendet wird.
- Bereiten Sie Objektträger vor, indem Sie eine 70%ige Ethanolwäsche durchführen und dann einen Abstandshalter auf den getrockneten Objektträger kleben. Schneiden Sie einzelne Vertiefungen mit einer Schere aus dem 8-Well-Streifen heraus und schneiden Sie sie in zwei Hälften (Abbildung 2A). Entfernen Sie die Schutzrückseite von einer Seite jeder Hälfte und kleben Sie Abstandshalter in leichtem Abstand auf die Schiene, um in der Mitte einen geschützten Raum zu schaffen, in dem die Scheiben platziert werden (Abbildung 2B).
HINWEIS: Unserer Erfahrung nach vereinfacht dies die Probenmontage, da das genaue Volumen des auf den Objektträger übertragenen Mediums weniger kritisch ist. Jedes kleine überschüssige Volumen fließt beim Eindecken einfach durch den Spalt heraus. Da wir nur für eine relativ kurze Zeit (in der Regel ~1 h) abbilden, hatten wir keine Probleme mit der mittleren Trocknung. - Tauen Sie das Live-Imaging-Medium (unergänztes Schneider's Drosophila Medium, gelagert in gefrorenen 10-ml-Aliquoten) auf und bewahren Sie es in einem Eiskübel griffbereit auf.
- Mischen Sie in einem 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen 1,5 mL Medium mit 20 μl 200 μg/mL Hoechst 33342 (Endkonzentration 2,7 μg/mL). Halten Sie die Tube auf Eis.
HINWEIS: Diese spezielle Form des Hoechst-Farbstoffs wird verwendet, da er sehr membrandurchlässig ist. ACHTUNG: Beim Umgang mit Hoechst 33342 sollten Handschuhe verwendet werden. Werkzeuge sollten nach Gebrauch gewaschen werden.
2. Dissektion der Flügelscheibe und Vorbereitung des Objektträgers
- Nach der genetischen Kreuzung und Aufzucht bei 25 °C nehmen Sie wandernde Larven des dritten Stadiums aus der Röhre und waschen Sie sie in kaltem Lebendbildgebungsmedium in einer 9-Well-Glas-Depressions-Spotplatte.
HINWEIS: Cytoneme sind sehr zerbrechlich. In den folgenden Schritten sollte darauf geachtet werden, das Gewebe um die Bandscheiben herum zu manipulieren, wobei versucht werden sollte, einen direkten Kontakt zwischen den Bandscheiben und den Präparierwerkzeugen zu vermeiden. Wir bereiten drei oder vier Larven auf einmal vor, da die Beschädigung einiger weniger Scheiben unvermeidlich ist und sich dies möglicherweise erst in den bildgebenden Schritten bemerkbar macht. - Unter dem Präpariermikroskop werden die Larven in einen Tropfen Live-Imaging-Medium auf einer silikonbeschichteten Petrischale überführt und mit zwei Präparierzangen mit dem Präparieren begonnen. Halten Sie dazu zunächst den Kopf und den vorderen Körperteil fest, indem Sie die Larven mit einer Pinzette in etwa einem Drittel der Körperlänge (von vorne) einklemmen. Mit der zweiten Pinzette kneifen Sie den Körper direkt hinter der ersten Pinzette zusammen. Ziehen Sie dann den hinteren Teil der Larven weg, um die vordere "Hälfte" zu isolieren.
- Drehen Sie die vordere Hälfte um, indem Sie sie mit einer Pinzette auf beiden Seiten des abgeschnittenen Endes befestigen und den Kopf mit dem anderen Paar durchschieben (wie beim Umdrehen einer Socke auf links), um die inneren Strukturen freizulegen, einschließlich der imaginalen Scheiben, der Luftröhre, der Speicheldrüsen, des Fettkörpers und des Darms.
- Entfernen Sie vorsichtig die Speicheldrüsen, den Fettkörper und den Darm und achten Sie darauf, die seitlichen Stämme der Luftröhre nicht zu stören, die über den Flügelscheiben liegen und diese schützen sollten.
- Die gereinigten vorderen Hälften mit den angebrachten Flügelscheiben vorsichtig mit einer Pinzette in einen Tropfen sauberes Live-Imaging-Medium mit Hoechst übertragen, das zwischen den Abstandshaltern auf einem vorbereiteten Objektträger platziert wird (Abbildung 2C). Isolieren Sie die Flügelscheiben vom Rest des Gewebes, indem Sie sie vorsichtig stumpf von den feinen Ästen der Luftröhre entfernen, die mit der Scheibe verbunden sind, entweder mit einer Klinge der Präparierzange oder mit einem feinen Wolframdraht, der an einem Präpariernadelhalter befestigt ist. Den Rest des Schlachtkörpers entsorgen.
- Richten Sie die Scheiben mit einer Klinge der Präparierzange oder der Präpariernadel aus Wolframdraht aus. Aufgrund ihrer abgeflachten, tropfenartigen Form fallen die Flügelscheiben entweder mit dem DP oder dem PerM nach oben. Richten Sie für dieses Protokoll alle Discs mit der PerM-Seite nach oben aus.
- Passen Sie das Mediumvolumen so an, dass es die Vertiefung vollständig ausfüllt, bis es leicht über dem Niveau des Abstandshalters liegt, indem Sie das Medium nach Bedarf hinzufügen oder entfernen. Entfernen Sie die Schutzfolie von der Oberseite jeder Abstandshalterhälfte und senken Sie dann vorsichtig ein Deckglas über die Probe. Drücken Sie vorsichtig auf das Deckglas an der Stelle, an der es die Abstandshalter berührt (z. B. mit dem abgerundeten Ende einer Präparierzange), um sicherzustellen, dass das Deckglas am Abstandshalter haftet.
HINWEIS: Die mittlere Ebene sollte etwas über der Höhe des Abstandshalters liegen, um Luftblasen nicht einzuschließen, aber nicht so hoch, dass beim Absenken des Deckglases ein erheblicher Durchfluss erzeugt wird.
3. Bildgebung
- Nehmen Sie Proben bei Raumtemperatur mit einem konfokalen Mikroskop (Argon-Ionen-Laser mit einer Wellenlänge von 488 nm für GFP, UV-Laser mit 350 nm Wellenlänge für Hoechst) ab, das mit einer 40x/1,30 NA-Ölimmersionslinse und einer Mikroskopie-Software ausgestattet ist. Erfassen Sie Bildstapel mit einer Schrittweite von 1 μm, die sich von knapp über dem höchsten PerM-Wert (wo die Hoechst-Fluoreszenz abnimmt) bis zur basalen Seite des DP erstrecken, was in der Regel mehr als 100 Bildern pro Stapel entspricht. Erfassen Sie wiederholte Bildstapel, um Zeitrafferfilme zu erstellen.
HINWEIS: Wir bilden eine Folie nicht länger als ~1-2 Stunden ab. - Für die Einstellungen der Mikroskopsoftware erfassen Sie Bilder mit 8-Bit-Codierung, Zeilenmittelung von 2, Detektorverstärkung im Allgemeinen zwischen 650 und 750 und getrennten Kanalspuren, um Signaldurchscheinen zu reduzieren. Verwenden Sie für alle Bedingungen identische Laser- und Detektoreinstellungen, die durch vorherige Tests für jede Bedingung festgelegt werden.
HINWEIS: Bei 40-facher Vergrößerung haben unsere Bilder eine Auflösung von 5,0386 Pixel pro μm (Pixelgröße: 0,1985 x 0,1985 μm2). In unserem Setup umfassten die optimalen konfokalen Mikroskopeinstellungen die höchstmögliche Laserintensität (ohne das Gewebe zu beschädigen), um so viel Signal wie möglich einzufangen und gleichzeitig eine geringe bis gar keine Sättigung zu erzielen. und das geringstmögliche Rauschen, wie es anhand von Negativkontrollen bewertet wird, erreicht durch Reduzierung des Detektor-Offsets und der Erfassungsgeschwindigkeit (falls erforderlich). Wir verwenden in der Regel weniger als 5 % Laserleistung und maximale Scankopfgeschwindigkeit ("9" in den Einstellungen der Zen-Software). Die Erfassung eines einzelnen Bildstapels dauert in der Regel ~1 Minute 45 Sekunden, und Bilder werden alle 2-3 Minuten für Zeitrafferanalysen aufgenommen.
4. Bildanalyse
- Projekt-Stacks mit der maximalen Projektionsfunktion des Softwarepakets ImageJ (klicken Sie auf Bild | Stapel | Z-Projekt, wählen Sie im Menü Maximale Intensität ).
- Bestimmen Sie in den MIP-Bildern die Flügeltaschenfläche basierend auf dem Muster der Flügelscheibenfaltung (unter Verwendung des Hoechst-Kanals) mithilfe der Polygonauswahl. Verwenden Sie die gleiche Auswahl auf dem GFP-Kanal mit der Funktion "Außen löschen " (klicken Sie auf Bearbeiten | Außen löschen), um jeden äußeren Pixelwert auf 0 zu setzen.
- Verwenden Sie in den MIP-Bildern den Hoechst-Kanal, um die GFP-Bilder zu bereinigen, insbesondere um alle künstlichen Flecken zu entfernen, die in beiden Kanälen auftreten, indem Sie den betreffenden Pixelwert auf 0 setzen (klicken Sie auf Polygonauswahl, dann auf Bearbeiten | Löschen).
- Verwenden Sie in den bereinigten MIP-Bildern die Funktion Histogramm (klicken Sie auf Analysieren | Histogramm | Liste), um die Liste aller Pixelwerte abzurufen und in eine Tabelle in einer Tabelle in einer Tabelle zu kopieren.
- Legen Sie einen Schwellenwert fest, der auf der Analyse des Hintergrundsignals in Negativkontrollen basiert (und dann in anderen Stichproben überprüft wird; siehe Diskussion).
- Berechnen Sie den prozentualen Anteil der GFP-positiven Oberfläche mit der folgenden Formel:
%GFP-positive Oberfläche =
× 100 - Normalisieren Sie die Daten am Ende, indem Sie jeden Wert durch den Mittelwert der Referenzbedingung dividieren (die auf 1 festgelegt ist).
HINWEIS: Gültiges Pixel = Pixel mit einem Wert ≥ 1, wobei alle gelöschten Pixel, deren Wert auf 0 gesetzt wurde, ignoriert werden. Pixelwerte von 0 treten nicht natürlich auf. - Um zu bestimmen, wo in den Scheiben das rekonstituierte GFP-Signal lokalisiert ist, verwenden Sie XZ-Schnitte von Bildstapeln, um die apikobasale Achse des Scheibenepithels zu betrachten. Führen Sie die Reslices in Fidschi ohne Interpolation durch und erhöhen Sie die Bildhöhe in der Z-Achse mit der Skalierungsfunktion mit bilinearer Interpolation, um die Sichtbarkeit zu verbessern.
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Ergebnisse
Um die Nützlichkeit des GRASP-Verfahrens für die Messung von Kontakten zwischen DP- und PerM-Zellen zu testen, untersuchten wir Flügelscheiben von vier verschiedenen Genotypen: Wildtyp-Negativkontrollscheiben (Genotyp: w1118), die nur Hintergrundwerte der Autofluoreszenz im GFP-Kanal anzeigen; Scheiben, die das CD4-spGFP1-10 in der DP-Schicht exprimieren, aber das CD4-spGFP11-Transgen nicht vorhanden ist, was das von GFP1-10 allein erzeugte Fluoreszenzniveau zeigt (von dem wir erwartet hatten, dass es...
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Diskussion
Cytoneme spielen eine wichtige Rolle bei der Verteilung von Liganden und steuern das Wachstum und die Organisation von sich entwickelnden Geweben. Der Signalaustausch findet dort statt, wo die Zytonemspitzen engen Membrankontakt mit ihren Zielen herstellen. In diesem Protokoll beschreiben wir eine einfache Methode zur Analyse von Zytonem-vermittelten Kontakten zwischen Epithelschichten in der Flügelscheibe mit Hilfe der GRASP-Technik.
Die hier vorgestellte Tec...
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine konkurrierenden Interessen zu erklären.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde durch ein CIHR-Stipendium (PJT-162109) an D.H. M.J. unterstützt. Er hatte ein Promotionsstipendium der Stiftung Institut de Recherches Cliniques de Montréal und des Molecular Biology Program der Universität Montreal. Die Autoren danken der IRCM-Mikroskopie- und Bildgebungsplattform für die Unterstützung.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Discovery V12 Präpariermikroskop | Zeiss | Mikroskop zum Sezieren | |
| Dumont #55 Pinzette, Biologie Tipps | Werkzeuge für die Feinwissenschaft | 11255-20 | Pinzette zum Präparieren |
| EP-Slik (slik20358) | BDSC GmbH | Panneton et al. 2015 | Fliegenstamm zum Ausdrücken von Slik |
| FIDSCHI | Schindelin J. et al. (2012) | Bildanalyse-Software | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher Scientific | H3570 | Live-Bildgebung von nuklearen Flecken |
| LexAop-CD4-spGFP11 | BDSC GmbH | 93018 | Fliegen-Stamm |
| LSM 700 Konfokalmikroskop | Zeiss | Konfokales Mikroskop | |
| nub-GAL4 | Bloomington Drosophila Stock Centre (BDSC) | 86108 | Fliegen-Stamm |
| PerM-LexA | Rambaud, Joseph et al., 2025 | Fliegen-Stamm | |
| PYREX 9-Depression Glas-Spotplattesell | Corning Biowissenschaften | 7220-85 | zum Sammeln und Waschen von Larven |
| Schneider-Drosophila Medium | ThermoFisher Scientific | 21720024 | Live-Imaging-Medium |
| SecureSeal Abstandshalter für die Bildgebung, 8 Wells, 0,12 mm dick | Grace Bio-Labore | 654008 | Abstandhalter |
| SYLGARD 184 Silikonelastomer-Kit | Sylgard | 3097358-1004 | zur Herstellung von Sezierplatten |
| UAS-CD4-spGFP1-10 | BDSC GmbH | 93017 | Fliegen-Stamm |
| Zen Schwarz | Zeiss | Software zur Akquisition |
Referenzen
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