Dieses Protokoll bietet eine detaillierte Beschreibung der Entstehung, Kultur und Analyse von Mantelzell-Lymphomen in 3D-gedruckten Hydrogel-Tumorschnitten.
Methodenartikel
Bioprinting von Hydrogel-Tumorschnitten als 3D-Modell für das Mantelzell-Lymphom
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Das Mantelzell-Lymphom (MCL) ist eine seltene, aggressive B-Zell-Neoplasie, die häufig rezidiviert und nur bedingt auf eine konventionelle Chemotherapie anspricht. Eine große Herausforderung in der MCL-Forschung ist die Kultivierung primärer MCL-Zellen ex vivo, da Zellen bei der Kultivierung in 2D-Suspensionskulturen zur spontanen Apoptose neigen. Obwohl bekannt ist, dass 3D-Modelle die In-vivo-Situation solider Tumoren besser rekapitulieren können, ist ihre Anwendung bei Lymphomen noch wenig erforscht. Die Entwicklung von 3D-Modellen, die die In-vivo-Bedingungen von MCL im Lymphknoten replizieren, könnte deren Überleben verbessern, die Untersuchung der MCL-Tumor-Mikroumgebungs-Crosstalk erleichtern und die In-vivo-Reaktion auf Medikamente nachahmen. Hier wurde ein 3D-gedrucktes Modell von MCL in Form von Hydrogel-Tumorschnitten etabliert, zusammen mit einer optimierten Kulturmethode. Es wurde ein standardisiertes Verfahren unter Verwendung von MCL-Zelllinien oder primären MCL-Zellen entwickelt, bei dem die Zellen in ein Hydrogel getaucht werden, das Alginat, Typ-I-Kollagen und Basalmembranmatrix enthält, indem sie Bioprinting in ein Gelatine-Stützbad betreiben. Die resultierenden MCL-Hydrogel-Tumorschnitte werden auf einem Filterträger kultiviert, um ihre Stabilität während der gesamten Kulturperiode zu erhalten. Medikamentöse Behandlungen können auf das System angewendet werden. Die Reaktion einzelner Zellen innerhalb der Hydrogel-Tumorscheibe kann durch vierfarbige Live-3D-Fluoreszenzbildgebung verfolgt werden. Primäre MCL-Zellen zeigten eine stabile Lebensfähigkeit, wenn sie in den Hydrogel-Tumorschnitten kultiviert wurden. Dieses Protokoll bietet eine detaillierte Beschreibung der Erzeugung, Kultur und Analyse von MCL-Zellen in Hydrogel-Tumorschnitten. Durch die genaue Nachahmung der Tumormikroumgebung und die Verwendung einer Luft-Flüssigkeits-Grenzflächenkultur erhöht das vorgestellte Modell die physiologische Relevanz im Vergleich zur traditionellen 2D-Kultur. Es bietet ein erhebliches Potenzial für die Weiterentwicklung sowohl biologischer als auch therapeutischer Studien von MCL.
Einleitung
Das Mantelzell-Lymphom (MCL) ist ein seltenes und aggressives B-Zell-Non-Hodgkin-Lymphom, das aus der Mantelzone der Lymphknoten stammt1. Die Mantelzone besteht aus einem Ring kleiner Lymphozyten, der das Keimzentrum des B-Zellfollikels umgibt. Typischerweise zeigt das MCL einen aggressiven klinischen Verlauf mit häufigen Rückfällen nach der initialen Chemotherapie. Aufgrund eines verbesserten Verständnisses der Krankheitsentstehung1 und der Entwicklung neuartiger Therapien, darunter die Immunchemotherapie2, Bruton-Tyrosinkinase-Inhibitoren3 oder Antikörper-Wirkstoff-Konjugate4, haben die Behandlungsoptionen für MCL-Patienten zu verbesserten Ansprechraten und einem verlängerten progressionsfreien Überleben geführt. Medikamentenresistenzen und Rückfälle machen die Krankheit jedoch immer noch unheilbar5. Dies ist zum Teil eine Folge seiner Heterogenität und des Einflusses der Tumormikroumgebung auf die Tumorentwicklung und die Arzneimittelresistenz6. Eine Herausforderung bei der Untersuchung von MCL ist die Schwierigkeit, primäre MCL-Zellen in Suspensionskulturzu kultivieren 7, da die Zellen ex vivo eine spontane Apoptose durchlaufen 4,5. Dies unterstreicht den Bedarf an alternativen Ansätzen, um MCL in präklinischen Modellen besser zu modellieren.
In vivo sind Tumore dreidimensionale (3D) Strukturen, die sich aus verschiedenen zellulären Komponenten zusammensetzen, darunter Tumorzellen, Immunzellen und Stromazellen sowie nicht-zelluläre Komponenten wie die extrazelluläre Matrix (EZM). Die EZM, die aus Makromolekülen wie Kollagen und Laminin besteht, bildet ein komplexes faseriges Geflecht aus elastischen Fasern, das stark hydrophil ist und eine gelartige Umgebung schafft 2,8,9,10. Um diese in vivo Zustände von Tumoren ex vivo besser nachbilden zu können, wurde eine Vielzahl von 3D-Modellen entwickelt. In den letzten Jahren sind diese Modelle für die Erforschung der Pharmakologie und Biologie von Krebs von entscheidender Bedeutung geworden, wobei der Schwerpunkt auf soliden Tumoren liegt11.
Bisher ist dieses Gebiet bei Lymphomen noch wenig erforscht, da hämatologische Krebszellen die Fähigkeit haben, sowohl in Suspension als auch in stromalen Umgebungen wie Lymphknoten, Knochenmark oder sekundärem lymphatischem Gewebe zu wachsen12. In vivo disseminieren sich MCL-Zellen aus der Mantelzone der Lymphknoten in das Blut oder das Knochenmark, obwohl sie sich hauptsächlich in den Lymphknoten vermehren, aus denen sie stammen13,14. Innerhalb der Lymphknoten sind MCL-Zellen von T-Zellen, Makrophagen und mesenchymalen Stromazellen umgeben, von denen gezeigt wurde, dass sie das Überleben oder die Arzneimittelreaktion von MCL-Zellen kontrollieren 14,15,16,17,18. Darüber hinaus sind der Crosstalk zwischen MCL und Tumormikroumgebung sowie die Porosität und die mechanischen Eigenschaften wichtige Faktoren, die das Ansprechen und die Resistenz von Medikamenten beeinflussen können 6,14. Daher sind standardisierte und reproduzierbare 3D-Tumormodelle von MCL erforderlich, die die native Mikroumgebung simulieren, um primäre MCL zu untersuchen. Bisher wurden hauptsächlich zellbasierte Modelle wie Sphäroide oder Organoide von primären MCL-Zellen etabliert 6,19. Sie verbessern erfolgreich die Lebensfähigkeit und Langzeitkultur von primären MCL-Zellen. Die extrazelluläre Matrix ist in diesen Modellen jedoch unterrepräsentiert. In diesem Zusammenhang bietet das fortschrittliche 3D-Bioprinting einen vielversprechenden Ansatz. Durch die direkte Assemblierung von lebenden Zellen und Hydrogelen ermöglicht diese Technologie die Generierung physiologisch relevanter Hydrogel-basierter 3D-Lymphknotenmodelle.
Hier wurde ein 3D-Bioprint-Modell von MCL in Form von Hydrogel-Tumorschnitten etabliert, zusammen mit einer optimierten Kulturmethode. Die Zellen werden in Kollagen-Typ-I-, Alginat- und Matrigel-basierte Hydrogelschnitte eingebettet, indem das Bioprinting von suspendierten Hydrogelen (FRESH) in freier Form reversibles Embedding20 erfolgt. Die Hydrogel-Tumorschnitte werden auf einem Filterträger kultiviert, der es den MCL-Zellen ermöglicht, in einer Umgebung zu wachsen, die die In-vivo-Bedingungen des Lymphknotens genau rekapituliert.
Dieses Protokoll bietet eine detaillierte Beschreibung der Erzeugung, Kultivierung und Analyse von MCL-Zellen in Hydrogel-Tumorschnitten. Durch die Verwendung von vierfarbiger Live-3D-Fluoreszenzbildgebung kann die Lebensfähigkeit oder Wirkstoffreaktion einzelner Zellen innerhalb der Hydrogel-Tumorscheibe verfolgt werden. Primäre MCL-Zellen zeigten ein verbessertes Überleben, wenn sie in den Hydrogel-Tumorschnitten kultiviert wurden. Dieses Modell bietet ein Werkzeug zur Untersuchung der Biologie und des Ansprechens auf die Behandlung von MCL und ebnet den Weg zum Verständnis von Mikroumwelteinflüssen und der Variabilität von MCL-Patienten.
Protokoll
Die Arbeit mit primären MCL-Zellen muss von der lokalen Ethikkommission genehmigt werden. In dieser Studie hat die Ethikkommission der Medizinischen Fakultät, der Eberhard-Karls-Universität und des Universitätsklinikums Tübingen die Entnahme und Aufarbeitung von Patienten- und gesunden Spenderproben (Projektnummer 159/2011BO2) genehmigt und die schriftliche Einverständniserklärung der Patienten gemäß der Deklaration von Helsinki eingeholt. Die hier verwendeten primären MCL-Zellen wurden aus ganzen Lymphknoten von MCL-Patienten isoliert und umfassten somit nicht nur MCL-Zellen, sondern auch andere Zellen wie Immunzellen und Fibroblasten.
1. Vorbereitung der Gelatineaufschlämmung für das Stützbad
HINWEIS: Die Gelatineaufschlämmung dient als Stützbad während des 3D-Bioprinting-Prozesses. Es induziert die Vernetzung der Biotinte, wodurch eine 3D-Struktur gebildet werden kann. Die Aufbereitung der Gelatineaufschlämmung muss unter sterilen Bedingungen in einer Zellkulturhaube erfolgen.
- Bereiten Sie eine 4,5%ige (w/v) Gelatinelösung in 10 mM HEPES und 11 mM CaCl2 vor, indem Sie 6,75 g Gelatinepulver in 1,5 mL 1 M HEPES, 15 mL 110 mM CaCl2 und 133,5 mL sterilem H2O in einem sterilen Einmachglas mit Deckel auflösen. Stellen Sie sicher, dass das Einmachglas für das Mischen in einem Hochleistungsmixer geeignet ist.
- Die Lösung wird bei 37 °C 4 Stunden lang inkubiert oder bis beim Rühren der Lösung keine Schlieren mehr zu sehen sind, was darauf hinweist, dass die Gelatine vollständig aufgelöst ist. Die Gelatine über Nacht oder mindestens 12 h bei 4 °C abkühlen lassen.
- Bereiten Sie einen sterilen Waschpuffer vor, der aus 10 mM HEPES und 14,4 mM CaCl2 besteht. Kühlen Sie den Waschpuffer auf 4 °C vor.
- Die erstarrte 4,5%ige Gelatine mit einem sterilen Löffel in mehrere Stücke brechen.
- Füllen Sie das Einmachglas mit der 4,5%igen Gelatine vollständig mit dem vorgekühlten Waschpuffer und stellen Sie sicher, dass der Puffer während des gesamten Prozesses der Zubereitung der Gelatineaufschlämmung kalt bleibt.
- Frieren Sie das gelatinehaltige Einmachglas bei -20°C für 45-60 min ein, bis die Gelatinesuspension 0°C erreicht, aber noch nicht begonnen hat, Eiskristalle zu bilden. Verwenden Sie ein Thermometer, um die Temperatur zu überwachen.
- Befestigen Sie den Mixerdeckel und die Klinge am Einmachglas und montieren Sie dann das Einmachglas auf den Mixer. Die Gelatinesuspension 120 s lang mit der Impulseinstellung pürieren.
HINWEIS: Die Einstellungen des Mixers müssen möglicherweise angepasst werden, wenn ein anderer Mixertyp verwendet wird. - Übertragen Sie die gemischte Suspension in vorgekühlte 50-ml-Röhrchen. Zentrifugieren bei 3.800 x g für 2 min bei 4°C. Stellen Sie sicher, dass die Suspension in eine feste Gelatineaufschlämmung unten und den flüssigen Waschpuffer oben getrennt ist.
- Führen Sie den folgenden Schritt auf Eis aus: Waschen Sie die Gelatineaufschlämmung. Saugen Sie die oberste Flüssigkeitsschicht an und versuchen Sie, die auf dem Waschpuffer sichtbaren Blasen zu entfernen. Geben Sie 20 ml frischen Waschpuffer bei 4 °C in das Röhrchen. Wirbeln Sie das Rohr vortexen, um die Gelatineaufschlämmung mit dem Waschpuffer zu vermischen.
- Wiederholen Sie den Zentrifugations- und Waschvorgang mindestens 3x oder bis oben auf dem Waschpuffer keine Blasen mehr sichtbar sind. Entfernen Sie nach der letzten Wäsche alle verbleibenden Waschpuffer durch Aspiration. Die Gelatineaufschlämmung kann mehrere Wochen bei 4°C gelagert werden.
2. Herstellung von zellbeladener Biotinte
- Bereiten Sie 1-2 Tage vor dem Druck eine sterile 5%ige Alginatlösung vor. Geben Sie 1 g Alginat zu 20 mL sterilem PBS in einem 50 mL Röhrchen. Um trockene Rückstände von Alginatpulver zu vermeiden, fügen Sie das PBS in kleinen Schritten hinzu und wirbeln Sie es zwischen den Zugaben. Die Lösung wird entweder in einem 37 °C warmen Wasserbad für mehrere Stunden oder über Nacht auf einer Röhrenwalze bei Raumtemperatur inkubiert. Sobald das Alginat vollständig aufgelöst ist, lagern Sie die Lösung bis zur Verwendung bei 4 °C.
- Wenn Sie mit einer MCL-Zelllinie arbeiten, kultivieren Sie die Zellen in Suspension in einem T75-Kolben. Stellen Sie am Tag des Drucks sicher, dass 1,4 x 107 Zellen für die Herstellung von 1 ml Biotinte zur Verfügung stehen, was 9-10 Hydrogel-Tumorscheiben ergibt.
- Bei der Arbeit mit primären MCL-Zellen müssen die Zellen vor dem Bioprinting nicht in Suspensionskultur kultiviert werden. Tauen Sie die kryokonservierten primären MCL-Zellen direkt vor dem Bioprinting auf. Übertragen Sie die primären MCL-Zellen in ein 50-ml-Röhrchen mit Kulturmedium. Um das restliche Gefriermedium zu entfernen, zentrifugieren Sie das Röhrchen sofort bei 340 x g für 5 min, dann entfernen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 20 ml frischem Medium für die Zellzählung.
- Bereiten Sie am Tag des Drucks die Biotinte vor, die für die interessierenden Zellen geeignet ist. Bereiten Sie für Jeko-1-Zellen eine Biotinte vor, die aus 0,5 % (w/v) Alginat, 20 % (v/v) Typ-I-Kollagen, 1x RPMI und 2 mM HEPES besteht. Mischen Sie 100 μl 5 % Alginat, 200 μl Typ-I-Kollagen, 100 μl 10x RPMI, 200 μl 10 mM HEPES und 350 μl PBS für 1 ml Biotinte. Zellen werden in Schritt 2.6 hinzugefügt.
- Bereiten Sie für primäre MCL-Zellen eine Biotinte vor, die aus 0,5 % (w/v) Alginat, 20 % (v/v) Typ-I-Kollagen, 1x RPMI und 0,5 mM HEPES besteht. Mischen Sie 100 μl 5 % Alginat, 200 μl Typ-I-Kollagen, 100 μl 10x RPMI, 50 μl 10 mM HEPES und 500 μl Basalmembranmatrix für 1 mL Biotinte. Zellen werden in Schritt 2.6 hinzugefügt. Wenn Sie mit einer MCL-Zelllinie arbeiten, übertragen Sie die Zellsuspension aus dem Kulturkolben in ein 50-ml-Röhrchen.
- Mischen Sie die Zellen mit 0,4% Trypanblau im Verhältnis 1:1. Zählen Sie die lebensfähigen Zellen (ungefärbt) mit einem Zellzähler oder einer Neubauer-Kammer. Berechnen Sie das Volumen der Zellsuspension für 1 ml Biotinte, was 1,4x107 Zellen entspricht. Übertragen Sie das berechnete Volumen in ein neues 50 mL Röhrchen. Bei 340 x g 5 min zentrifugieren, dann den Überstand entfernen. Resuspendieren Sie das Zellpellet in der vorbereiteten Biotinte, um die endgültige zellbeladene Biotinte zu erzeugen.
HINWEIS: Es wurde geschätzt, dass das Zellpellet ein Volumen von 50 μl Medium hat. Zusammen mit der in Schritt 2.4 vorbereiteten Biotinte ergibt dies 1 ml Biotinte.
3. Bioprinting im Bad
HINWEIS: Wenn möglich, führen Sie den 3D-Druckprozess in einer sterilen Umgebung durch, z. B. unter einer Zellkulturhaube. Der verwendete 3D-Drucker wurde für den FRESH-Druck modifiziert, indem ein Spritzenpumpen-Extender hinzugefügt wurde, wie in Hinton et al.20 beschrieben.
- Schalten Sie den Bioprinter ein und verbinden Sie ihn mit der 3D-Drucker-Software. Öffnen Sie die .stl-Datei, die den Bauplan für die Hydrogel-Tumorschnitte enthält. Es können bis zu 5 Scheiben gleichzeitig gedruckt werden. Stellen Sie sicher, dass jede Hydrogel-Tumorscheibe einen Durchmesser von 8 mm und eine Höhe von 1,5 mm hat. Stellen Sie die Fülldichte auf 85 % ein. Bringen Sie den Druckkopf an den Start.
HINWEIS: Die STL-Datei wurde mit Fusion 360 erstellt und befindet sich in der ergänzenden Codierungsdatei 1. Für den 3D-Druck wurde die Software Cura Version 15.04.5 verwendet. - Übertragen Sie die zuvor vorbereitete Gelatineaufschlämmung in eine Petrischale mit einem Durchmesser von 35 mm, bis sie halb voll ist. Stellen Sie sicher, dass keine Luftspalten in der Gelatineaufschlämmung verbleiben. Ziehen Sie überschüssiges Wasser mit Einweg-Präzisionstüchern aus der Gülle, um ein Gelatine-Stützbad zu erzeugen, das pastös ist und die Form beibehält, bis genügend Kraft ausgeübt wird.
- Übertragen Sie die mit Zellen beladene Biotinte in eine 2,5-ml-Glasspritze und verbinden Sie sie mit einer stumpfen 0,8-mm-Düse. Drehen Sie die Spritze um und stoßen Sie überschüssige Luft und Luftblasen vorsichtig aus. Sobald die Spritze vorbereitet ist, setzen Sie sie in den Biodrucker ein. Extrudieren Sie mit der 3D-Drucker-Software die Biotinte, bis sie aus der Düse ausgestoßen wird. Wischen Sie den ausgestoßenen Biotintentropfen mit einem Einweg-Präzisionstuch von Science ab, um ein Verstopfen der Düse zu verhindern.
- Platzieren Sie das Gelatinestützbad direkt unter der Spritzendüse. Senken Sie den Druckkopf ab, bis sich die Düse in der Gelatineaufschlämmung befindet, 2 mm über dem Boden des Stützbads.
- Starten Sie den Druckvorgang über die 3D-Drucker-Software.
- Sobald der Druckvorgang abgeschlossen ist, entfernen Sie überschüssige Gelatineaufschlämmung aus der Düse, um ein Verstopfen zu vermeiden. Nehmen Sie das Stützbad mit den Hydrogel-Tumorscheiben heraus und decken Sie es mit einem Deckel ab, um die Sterilität zu erhalten.
- Inkubieren Sie das Stützbad mit den gedruckten Hydrogel-Tumorscheiben bei 37 °C, damit die Gelatine schmelzen kann. In diesem Schritt werden die gedruckten Hydrogel-Tumorscheiben aus dem Stützbad gelöst.
- Den Waschpuffer und das Zellkulturmedium auf 37 °C vorwärmen. Während die Gelatine schmilzt, bereiten Sie eine 6-Well-Platte zum Waschen der Hydrogel-Tumorscheiben vor. Füllen Sie zwei Vertiefungen mit 10 mM HEPES, 14,4 mM CaCl2 Waschpuffer (derselbe Puffer, der zum Waschen der Gelatineaufschlämmung verwendet wird) und zwei Vertiefungen mit Zellkulturmedium.
- Sobald die Gelatine geschmolzen ist, verwenden Sie einen sterilen Spatel, um die Hydrogel-Tumorscheiben in den Waschpuffer zu übertragen. Waschen Sie die Scheiben jeweils 1 Minute lang, zuerst in den beiden Vertiefungen mit Waschpuffer, dann in den beiden Vertiefungen mit Medium. Die zellbeladenen Hydrogel-Tumorschnitte sind nun bereit für die Kultur.
- Bewahren Sie die restliche Biotinte auf, um den Druckvorgang zu wiederholen.
4. Hydrogel-Tumorscheibenkultur und -behandlung
- Um die Hydrogelscheiben zu kultivieren, geben Sie sie auf einen Filterträger (0,4 μm Porengröße), der sich in einer 6-Well-Platte befindet. Kultivieren Sie bis zu 5 Hydrogelscheiben auf einem einzigen Filterträger. Geben Sie 1,5 ml Zellkulturmedium unter die Filterhalterung. Geben Sie einen Tropfen Medium auf die Hydrogel-Tumorscheiben, um ein Austrocknen zu verhindern.
- Für die medikamentöse Behandlung von Hydrogel-Tumorscheiben geben Sie die gewünschte Menge des Arzneimittels in das Zellkulturmedium. Hier wurden Hydrogel-Tumorschnitte mit 0,33 μM-27 μM Doxorubicin für 48 h bzw. 72 h behandelt. Kultivieren Sie immer einen Satz Scheiben ohne Behandlung als Kontrolle.
- Legen Sie die 6-Well-Platte mit den Hydrogel-Tumorscheiben für die gewünschte Kultivierungszeit bei 37 °C und 5 % CO2 in einen Zellkultur-Inkubator.
5. Viabilitätsanalyse von Zellen mittels Trypanblau-Ausschlussassay
- Um die Lebensfähigkeit der Zellen nach der Kultur oder Behandlung zu beurteilen, lösen Sie die Hydrogel-Tumorscheiben auf. Übertragen Sie eine Hydrogel-Tumorscheibe in ein 1,5-ml-Röhrchen. Geben Sie 500 μl pro Scheibe eines Auflösungspuffers hinzu, der 30 mM EDTA, 55 mM Natriumcitrat und 150 mM Natriumchlorid (pH 6,8) enthält. Pipettieren Sie auf und ab, bis sich das Hydrogel vollständig aufgelöst hat.
- Zentrifugieren Sie die Lösung bei 340 x g für 5 min. Aspirieren Sie den Überstand. Resuspendieren Sie die Zellen in 500 μl Medium pro gelöster Hydrogelscheibe.
- Mischen Sie die Zellsuspension im Verhältnis 1:1 mit 0,4 % Trypanblau. Zählen Sie die lebensfähigen (ungefärbten) und toten Zellen (gefärbt) mit einem Zellzähler oder einer Neubauer-Kammer. Notieren Sie die Anzahl der lebenden und toten Zellen für die weitere Analyse.
6. Vierfarbige Live-3D-Fluoreszenzbildgebung
HINWEIS: Die hier verwendete vierfarbige Färbung ermöglicht die Unterscheidung zwischen lebenden Zellen (TMRM-positiv), apoptotischen Zellen (fluorogene Caspase-3-Substrat-positiv) und toten Zellen (PicoGreen-positiv)21,22,23. Zellkerne werden mit DRAQ5 detektiert. Dieses Protokoll kann jedoch an jeden anderen photostabilen, spezifischen Fluoreszenzfarbstoff angepasst werden, um die Biomarker, zellulären Strukturen oder Zelltypen der Wahl zu detektieren. Stellen Sie vor dem Färben sicher, dass das Mikroskop in der Lage ist, die Wellenlängen der für die Färbung verwendeten Fluorophore zu erkennen.
- Für eine vierfarbige Färbung einer Hydrogel-Tumorscheibe bereiten Sie eine Färbelösung vor, indem Sie TMRM, DRAQ5 und fluorogenes Caspase-3-Substrat zu 1 ml Zellkulturmedium in einer Endkonzentration von 0,5 μM, 5 μM bzw. 2 μM hinzufügen.
- Übertragen Sie mit einem sterilen Spatel eine Hydrogel-Tumorscheibe auf ein Deckglas mit Kammerglas. Geben Sie die vorbereitete Färbelösung auf die Hydrogelscheibe, bis sie vollständig bedeckt ist. Inkubieren Sie die Probe 20 Minuten lang bei 37 °C im Dunkeln.
- Nach der ersten Inkubation die Färbelösung, die die Hydrogel-Tumorscheibe bedeckt, auffangen und 0,7 μl/ml PicoGreen hinzufügen. Pipettieren Sie die Färbelösung zurück in die Hydrogelscheibe und inkubieren Sie sie weitere 10 Minuten bei 37 °C im Dunkeln.
- Entfernen Sie nach der Inkubation vorsichtig das überschüssige Medium und lassen Sie dabei genügend Färbelösung, um die Hydrogelscheibe feucht zu halten.
- Analysieren Sie die Scheibe sofort mit einem konfokalen Mikroskop. Um Phototoxizität und Photobleiche zu verhindern, minimieren Sie die angewendete Photonendosis, indem Sie die Laserintensität und die Anregungszeit reduzieren. Die Anregungs-/Emissionsspektren der oben beschriebenen Färbungen sind in Tabelle 1 zu finden.
- Um einen Überblick über die zelluläre Verteilung der Zelle im Hydrogel zu erhalten, erfassen Sie Z-Schnitte. Wenn während der Bildgebung Z-Schnitte gemacht wurden, generieren Sie mit der entsprechenden Software 3D-Rekonstruktionen der Hydrogel-Tumorschnitte. Diese Rekonstruktionen ermöglichen eine gründliche Analyse der räumlichen Verteilung und des zellulären Status der Zellen in den Hydrogel-Tumorschnitten.
- Befolgen Sie die Anweisungen und das Skript in der Zusatzdatei 1 und der Zusatzdatei 2 , um die Zellsegmentierung und -rekonstruktion durchzuführen.
Ergebnisse
Die Hydrogel-Tumorschnitte, die MCL-Zellen enthalten, wurden mit dem oben beschriebenen Protokoll erzeugt. Die Schritte des Arbeitsablaufs für den 3D-Druck und die Kultivierung der Hydrogel-Tumorschnitte sind in Abbildung 1A dargestellt. Der verwendete 3D-Drucker wurde für den FRESH-Druck durch Zugabe eines Spritzenpumpen-Extenders modifiziert, wie in Hinton et al.20 beschrieben (Abbildung 1B). Es wurden bis zu fünf Scheiben auf einmal gedruckt (Abbildung 1C) und auf einem Filterträger kultiviert (Abbildung 1D). Unterhalb der Filterhalterung wurde Medium zugegeben, um die Hydrogel-Tumorscheiben mit Nährstoffen zu versorgen. Auf jede Hydrogel-Tumorscheibe wurde ein Tropfen Medium gegeben, um ein Austrocknen zu verhindern. Eine Übersicht über fünf Hydrogel-Tumorschnitte, die auf einem Filterträger kultiviert wurden, ist in Abbildung 1E dargestellt, zusammen mit Nahaufnahmen einer Hydrogelscheibe. Während eines Kulturzeitraums von 3 Tagen waren die Hydrogel-Tumorschnitte stabil und behielten ihre Struktur bei (Abbildung 2A). Direkt nach dem Druck waren Luftblasen in den Hydrogel-Tumorschnitten vorhanden, die jedoch während der Kultivierung verschwanden (Abbildung 2A).
Die Lebensfähigkeit der MCL-Zelllinie Jeko-1, die in Hydrogel-Tumorschnitten (3D) kultiviert wurde, im Vergleich zu Jeko-1-Zellen, die in Suspensionskultur (2D) kultiviert wurden, wurde mittels Trypanblau-Ausschlussassay bewertet (Abbildung 2B). Nach 3-tägiger Kultivierung waren 80 % der Zellen lebensfähig, verglichen mit einer anfänglichen Lebensfähigkeit von 88 % der Jeko-1-Zellen vor dem Druck. Jeko-1-Zellen, die in 2D kultiviert wurden, behielten die anfängliche Lebensfähigkeit von 88 % bei. Es gab keinen signifikanten Unterschied zwischen Jeko-1-Zellen, die in 2D und 3D kultiviert wurden. Um zu beurteilen, ob Jeko-1-Zellen in den Hydrogelscheiben proliferieren, wurde die mittlere Zellzahl von Jeko-1-Zellen pro Hydrogelscheibe bestimmt (Abbildung 2C). Während direkt nach dem Druck (d0) 5x105 Jeko-1 Zellen in jeder Scheibe enthalten waren, verdoppelte sich diese Zahl nach 3 Tagen Kultur auf 9,3x105 Zellen.
Die Verteilung und der Status von Jeko-1-Zellen, die in Hydrogelscheiben kultiviert wurden, wurden durch vierfarbige Lebendfluoreszenzbildgebung (Abbildung 2D) direkt nach dem Drucken oder nach 3 Tagen Kultur bewertet. Nach dem Druck zeigten 3D-Rekonstruktionen der Jeko-1-Hydrogel-Scheiben eine homogene Verteilung der Zellen. Die Mehrzahl der Zellen war positiv für TMRM, einen Marker für das mitochondriale Membranpotential22. Eine Minderheit der Zellen war positiv für die Caspase-3-Aktivität, einen Marker für die Apoptose-Induktion23, sowie für den Marker für tote Zellen PicoGreen21. Nach 3-tägiger Kultivierung wurde eine Zunahme der Zellzahl neben der Bildung von Zellclustern beobachtet. Die meisten Zellen blieben TMRM-positiv, während nur wenige Zellen positiv auf Caspase-3-Aktivität oder PicoGreen gefärbt waren (Abbildung 2C).
Um zu analysieren, ob MCL-Zellen in Hydrogelschnitten auf Chemotherapeutika ansprechen, wurden Jeko-1-Zellen, die entweder in Suspensionskultur (2D) oder in Hydrogelschnitten (3D) kultiviert wurden, mit dem Chemotherapeutikum Doxorubicin behandelt, das Teil der Standardbehandlung für MCL-Patienten ist24. Die Gesamtstruktur der Hydrogelscheiben blieb während der Behandlung mit Doxorubicin erhalten (Abbildung 3A). Die Lebensfähigkeit von Jeko-1-Zellen, die in Hydrogelscheiben kultiviert wurden, nahm als Reaktion auf die Behandlung mit Doxorubicin dosisabhängig ab. Der IC50 von Doxorubicin in Jeko-1-Zellen war erhöht, wenn Zellen in Hydrogelscheiben (IC50 = 5,8 μM) kultiviert wurden, verglichen mit Jeko-1-Zellen, die in 2D-Suspensionskulturen kultiviert wurden (IC50 = 2,0 μM; Abbildung 3B). Die vierfarbige Live-Fluoreszenzbildgebung zeigte ein reduziertes TMRM- und ein erhöhtes PicoGreen-Signal in Jeko-1-Zellen, die in Hydrogelscheiben kultiviert wurden, als Reaktion auf die Doxorubicin-Behandlung, was eine behandlungsinduzierte Verringerung der Lebensfähigkeit bestätigt. Bilder, die aus der vierfarbigen Live-Fluoreszenzbildgebung gewonnen wurden, wurden 3D-rekonstruiert, basierend auf dem DRAQ5-Kernsignal segmentiert und mit dem in der Zusatzdatei 1 beschriebenen Python-Skript analysiert. Eine beispielhafte Segmentierungsmaske ist in der ergänzenden Abbildung 1 dargestellt. Die aus dem DRAQ5-Signal identifizierte Zellzahl wurde verwendet, um die Gesamtzellzahl zu bestimmen. Die Zellzahl, die positiv für die TMRM-, PicoGreen- und Caspase-3-Aktivität war, wurde verwendet, um den Prozentsatz der lebensfähigen, toten bzw. apoptotischen Zellen zu identifizieren. Die Quantifizierung der vierfarbigen Lebendfluoreszenzfärbung von Jeko-1-Zellen, die 3 Tage lang in Hydrogelscheiben mit oder ohne 9 μM Doxorubicin kultiviert wurden, zeigten eine vergleichbare Viabilität wie der Trypanblau-Ausschlussassay (Tabelle 2).
Zusätzlich zu den etablierten MCL-Zelllinien wurden primäre MCL-Zellen von drei verschiedenen MCL-Patienten entweder in 2D-Suspensionskultur oder in 3D-Hydrogelschnitten kultiviert (Abbildung 4, Ergänzende Abbildung 2). Wie von einem Pathologen bestätigt, waren alle drei MCLs (Patient 1-3) von klassischer/häufiger Morphologie mit Ki67-Indizes von 20%-50%. Die primären MCL-Zellen umfassten alle Zelltypen, die aus Lymphknoten von MCL-Patienten isoliert wurden, und enthielten somit nicht nur MCL-Zellen, sondern auch andere Arten von Immunzellen oder Stromazellen. Die Lebensfähigkeit der primären MCL-Hydrogel-Scheiben wurde mit dem Trypanblau-Ausschlussassay bewertet. Nach 4-tägiger Kultivierung behielten primäre MCL-Zellen in Hydrogelschnitten eine Lebensfähigkeit von 43,6 % (45,7 % an Tag 3) bei, verglichen mit einer Ausgangsviabilität von 71,0 % vor dem Druck (Abbildung 4A). Dies stellt eine erhöhte Lebensfähigkeit im Vergleich zu in Suspension kultivierten Zellen (2D) dar, die nach viertägiger Kultur ein Überleben von 19,6 % (28,4 % an Tag 3) hatten. Diese Viabilität wurde durch vierfarbige Lebendfluoreszenzbildgebung visualisiert, bei der die meisten Zellen TMRM-positiv und lebensfähig waren, während eine Subpopulation positiv für Caspase-3-Aktivität und PicoGreen war, was auf Apoptose bzw. Zelltod hinweist (Abbildung 4B). Die Quantifizierungsdaten in Abbildung 4B sind in Tabelle 2 dargestellt. Primärzellen von zwei weiteren MCL-Patienten zeigten ein erhöhtes Überleben der Zellen, wenn sie in den Hydrogelschnitten (3D) kultiviert wurden, verglichen mit der jeweiligen 2D-Suspensionskultur (Ergänzende Abbildung 1).
Abbildung 1: Arbeitsablauf des 3D-Drucks von Hydrogel-Tumorschnitten . (A) Arbeitsablauf des 3D-Drucks und der Kultivierung von Zellen in Hydrogel-Tumorschnitten. (B) Drucker-Setup für den 3D-Biodruck von Hydrogel-Scheiben in einem Gelatine-Stützbad. (C) Drucken eines Bauplans in der 3D-Drucker-Software. Es wurden bis zu fünf Hydrogel-Scheiben auf einmal gedruckt. (D) Schematische Darstellung der Hydrogel-Scheibenkultur. Die Hydrogel-Scheiben wurden auf einem Filterträger in einer 6-Well-Platte kultiviert. Auf jede Hydrogelscheibe wurde ein Tropfen Medium gegeben, um ihre Feuchtigkeit zu erhalten. Auf einem Filterträger können bis zu fünf Hydrogelscheiben kultiviert werden. (E) 3D-gedruckte Hydrogelscheiben, die auf einem Filterträger kultiviert wurden, wie auf einem Übersichtsbild oder in Nahaufnahmen zu sehen ist. Die Maßstabsbalken stellen je nach Angabe 5 mm, 1 mm oder 200 μm dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Kultur einer Zelllinie des Mantelzell-Lymphoms (MCL) in 3D-gedruckten Hydrogel-Schnitten. (A) Nahaufnahme einer repräsentativen Hydrogel-Scheibe mit der MCL-Zelllinie Jeko-1 nach dem Drucken (d0) oder nach 3-tägiger Kultur (d3). Der Maßstabsbalken stellt 1 mm dar. (B) Lebensfähigkeit von Jeko-1-Zellen, die 2 Tage lang in Suspension (2D) oder in Hydrogelscheiben (3D) kultiviert wurden, bewertet durch einen Trypanblau-Ausschlusstest. Dargestellt ist die mittlere ± SD von drei unabhängigen Bioprinting-Experimenten. (C) Jeko-1-Zellzahl, die in jeder Hydrogelscheibe direkt nach dem Drucken (d0) oder nach bis zu 3 Tagen Kultur (d1-d3) enthalten ist. Dargestellt ist die mittlere ± SD von drei unabhängigen Bioprinting-Experimenten. Es wurde kein statistisch signifikanter Unterschied beobachtet (n.s., p > 0,05, Mann-Whitney-Test). (D) Dreidimensionale Rekonstruktion von Jeko-1-Hydrogel-Scheiben am Tag des Drucks (d0) oder nach 3 Tagen Kultur (d3). Das Modell wurde aus Z-Stacks einer vierfarbigen Live-3D-Fluoreszenzbildgebung generiert. Lebende Zellen sind in Rot (TMRM), apoptotische Zellen in Gelb (Caspase-3-enzymatische Aktivität), tote Zellen in Grün (PicoGreen) und Zellkerne in Blau (DRAQ5) dargestellt. Der Maßstabsbalken stellt 50 μm dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Medikamentöse Behandlung einer Zelllinie des Mantelzell-Lymphoms (MCL) in Hydrogel-Schnitten. (A) Nahaufnahme einer repräsentativen Hydrogel-Scheibe mit der MCL-Zelllinie Jeko-1, die 3 Tage lang mit 3 μM Doxorubicin behandelt wurde (d3). Der Maßstabsbalken stellt 1 mm dar. (B) Jeko-1-Zellen, die in Suspension (2D) oder in Hydrogelscheiben (3D) kultiviert wurden, wurden 2 Tage lang mit steigenden Konzentrationen des Chemotherapeutikums Doxorubicin behandelt. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde mit dem Trypanblau-Ausschlussassay bewertet. Es wird die mittlere ± SD von vier unabhängigen Bioprinting-Experimenten gezeigt. (C) Dreidimensionale Rekonstruktion von Jeko-1-Hydrogel-Schnitten, die 3 Tage lang mit 9 μM Doxorubicin (Doxo) behandelt wurden (d3). Das Modell wurde aus Z-Stacks einer vierfarbigen Live-3D-Fluoreszenzbildgebung generiert. Lebende Zellen sind in Rot (TMRM), apoptotische Zellen in Gelb (Caspase-3-enzymatische Aktivität), tote Zellen in Grün (PicoGreen) und Zellkerne in Blau (DRAQ5) dargestellt. Der Maßstabsbalken stellt 50 μm dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Kultur von primären MCL-Zellen in 3D-gedruckten Hydrogelscheiben. (A) Lebensfähigkeit von primären MCL-Zellen, die in Suspension (2D) oder in Hydrogelscheiben (3D) für bis zu 4 Tage kultiviert wurden, beurteilt durch einen Trypanblau-Ausschlusstest. Die mittlere Lebensfähigkeit eines Experiments wird dargestellt. (B) Dreidimensionale Rekonstruktion von primären MCL-Zellen, die 3 Tage lang in Hydrogelscheiben (3D) kultiviert wurden. Z-Stacks wurden aus Hydrogelscheiben erzeugt, die mit einer vierfarbigen Lebendfärbung gefärbt und mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (CLSM) analysiert wurden. Lebende Zellen sind in Rot (TMRM), apoptotische Zellen in Gelb (Caspase-3-enzymatische Aktivität), tote Zellen in Grün (PicoGreen) und Zellkerne in Blau (DRAQ5) dargestellt. Der Maßstabsbalken stellt 50 μm dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Fleck | TMRM | DRAQ5 | NucView405 Caspase-3 Substrat | PicoGreen |
| Anregung/Emission | 548 nm/574 nm | 647 nm/681 nm | 429 nm/ 469 nm | 488 nm/ 520 nm |
Tabelle 1: Anregungs-/Emissionsmaxima der Färbungen, die für die vierfarbige Live-3D-Fluoreszenzbildgebung verwendet werden.
| Probe | % der Zellen | ||
| TMRM (Lebensfähige Zellen) | PicoGreen (Abgestorbene Zellen) | Caspase-3 (Apoptotische Zellen) | |
| Jeko-1 Strg | 83 | 23.6 | 18.3 |
| Jeko-1 Doxo 9 μM | 27.6 | 81.3 | 86.6 |
| Primärer MCL-Patient 1 | 75.2 | 31.1 | 33.1 |
Tabelle 2: Quantifizierung von 3D-Rekonstruktionen von vierfarbigen Lebendfärbungen von kultivierten Hydrogel-Tumorschnitten . Hydrogel-Tumorschnitte wurden 3 Tage lang kultiviert und enthielten entweder Jeko-1-Zellen, die mit oder ohne Behandlung mit 9 μM Doxorubicin kultiviert wurden, oder primäre MCL-Zellen (Patient 1).
Ergänzende Abbildung 1: Zellidentifikation aus 3D-Rekonstruktionen von vierfarbigen Lebendfärbungen. 3D-Rekonstruktionen eines mit DRAQ5 beschrifteten konfokalen Bildes, das aus (A) einer vierfarbigen Lebendfärbung und (B) einem segmentierten Bild auf diesem Kanal gewonnen wurde, das mit der Python-Bildgebungsanalyse-Pipeline erstellt wurde. Der Maßstabsbalken steht für 200 μm. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.
Ergänzende Figure 2: Kultur von primären MCL-Zellen der Patienten 2 und 3 in Hydrogel-Tumorschnitten . Lebensfähigkeit von primären MCL-Zellen von (A) Patient 2 oder (B) Patient 3, die in Suspension (2D) oder in Hydrogelscheiben (3D) für bis zu 4 Tage kultiviert wurden, beurteilt durch einen Trypanblau-Ausschlusstest. Die mittlere Lebensfähigkeit eines Experiments wird dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.
Ergänzende Datei 1: Anleitung zur Analyse von 3D-Rekonstruktionen, die aus der vierfarbigen Lebendfärbung gewonnen wurden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Datei 2: Python-Skript zur Analyse von 3D-Rekonstruktionen, die aus vierfarbigen Live-Färbungen gewonnen wurden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Kodierung File 1: Stl.-Datei mit dem Bauplan für die Hydrogel-Tumorschnitte. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Diskussion
Die in diesem Protokoll beschriebenen Hydrogel-Tumorschnitte bieten ein MCL-Modell, das die Lymphknotenstruktur nachahmt und die Untersuchung des Überlebens und der Wirkstoffreaktion von MCL-Zellen in einer durch Bioprinting erzeugten 3D-Tumormikroumgebung ermöglicht.
Die am weitesten verbreiteten Bioprinting-Verfahren basieren auf der Extrusion, bei der Biotinte durch ein Dosiersystem ausgestoßen wird. Beim Tintenstrahldruck beispielsweise werden Biotinten nach der Abscheidung schnell zu 3D-Strukturen vernetzt25. Dieser Ansatz ist jedoch mit Einschränkungen verbunden, insbesondere in Bezug auf die Viskosität der verwendeten Materialien und die Möglichkeit, Schichten zu stapeln. Im Gegensatz dazu wendet das eingebettete spritzenbasierte Extrusions-3D-Bioprinting, wie das in diesem Protokoll verwendete FRESH-Bioprinting, einen Gel-in-Gel-Ansatz an. Dies ermöglicht den Druck von niedrigviskosen Biotinten wie Kollagen in stabile Konstrukte, wodurch es möglich wird, die komplexe Tumormikroumgebung nachzuahmen20,26. Während 3D-Drucker, die speziell für das Bioprinting entwickelt wurden, teuer sein können, bietet die hier vorgestellte Methode einen zugänglicheren Einstiegspunkt. Es kann mit relativ einfachen Modifikationen an Standard-Extrusionsdrucker angepasst werden. Diese Modifikationen können mit erschwinglichen Filamenten in 3D gedruckt werden, und die Designs sind als Open-Source-Ressourcen verfügbar, z. B. von Hinton et al.20. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass die Vorbereitung des Hydrogel-Stützbades für das FRESH-Bioprinting sehr temperaturempfindlich ist und bei der Slurry-Vorbereitung besondere Aufmerksamkeit erfordert.
Häufig werden 3D-gedruckte Tumormodelle in schwimmenden Systemen kultiviert, denen der in vivo Sauerstoffgradient25 fehlt, oder in mikrofluidischen Chipkulturen27, die ein hohes Maß an Komplexität erfassen, aber einen geringen Durchsatz aufweisen und einen hohen Wartungsaufwand erfordern. Diese Hürden können mit den hier beschriebenen Hydrogel-Tumorschnitten überwunden werden. Der Aufbau der Kultivierung von bis zu fünf Hydrogel-Tumorschnitten auf einer Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche leitet sich aus der Kultur von präzisionsgeschnittenen Tumorschnitten solider Tumorenab 28. Die Membran des in diesem Protokoll verwendeten Filterträgers besteht aus einer Polytetrafluorethylen (PFTE)-Membran mit einer Porengröße von 0,4 μm, die den Nährstoffaustausch ermöglicht, aber die zelluläre Anheftung oder Zellmigration verhindert29. Die Kultur auf der PTFE-Membran bietet eine physische Unterstützung für die Scheiben, um ihre Stabilität zu erhalten und zu verhindern, dass sie reißen oder zerfallen. Darüber hinaus stellen sie eine Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche dar, die Sauerstoff hauptsächlich aus der Luft darüber und Nährstoffe aus dem Medium unterhalb des Filters30 liefert. Das System berücksichtigt somit raumzeitliche Schwankungen der Nährstoffversorgung, der Zellproliferation und der Sauerstoffversorgung, wie sie in vivo auftreten können 25. Kultiviert in den Hydrogel-Tumorschnitten auf einem Filterträger behielten die primären MCL-Zellen 4 Tage lang eine Lebensfähigkeit von über 40 % bei, was der in 2D-Suspensionskulturen beobachteten Lebensfähigkeit überlegen war (Abbildung 3A, Ergänzende Abbildung 2). Weitere Untersuchungen sollten sich mit der Frage befassen, ob eine verlängerte Lebensfähigkeit durch die Zugabe von Zytokinen oder eine Co-Kultivierung mit CD40L-exprimierenden Fibroblasten erreicht werden kann, wie sie bei Sphäroiden und Organoiden des primären B-Zell-Lymphomtumors 6,19,30 oder in Co-Kulturen von primären MCL-Zellen mit CD40L-exprimierenden Fibroblasten-L-Zellen beschrieben wurde 14. Die Integration solcher Ansätze in die Hydrogel-Tumorschnitte sollte in Betracht gezogen werden, um die Kultur der primären MCL-Zellen sowie die Ähnlichkeit mit der nativen Mikroumgebung zu verbessern.
Lymphknoten enthalten ein gut entwickeltes Netzwerk aus extrazellulären Matrixfasern. Aufgrund ihres Musters werden sie als retikuläre Fasern bezeichnet. Diese Fasern bestehen hauptsächlich aus Kollagen- und Basalmembran-spezifischen Komponenten 31,32,33. Um eine Matrix zu erzeugen, die der In-vivo-Situation in Lymphknoten ähnelt, besteht die Biotinte, die zur Erzeugung der Hydrogel-Tumorschnitte verwendet wird, aus Kollagen Typ I und Matrigel, das aus den vier Haupt-Basalmembran-EZM-Proteinen Laminin, Kollagen IV, Entactin und Perlecan34 besteht. Des Weiteren wird der Biotinte Alginat zugesetzt, um die Hydrogel-Tumorschnitte zu stabilisieren, was eine verlängerte Kultur und den Transport von einem Gefäß zum anderen mit einem Spatel ermöglicht. Die Prüfung verschiedener Hydrogele, die Kollagen und Alginat enthalten, zeigte die höchste zelluläre Lebensfähigkeit in Kombination mit einer stabilen und haltbaren Hydrogelscheibe bei Verwendung einer Biotinte mit 0,5 % Alginat und 20 % Kollagen (Daten nicht gezeigt). Neben den Komponenten ähnelt der Hydrogel-Tumorschnittdurchmesser von 0,8 cm dem mittleren Lymphknotendurchmesser von 1 cm35. Die Live-3D-Bildgebung der Hydrogel-Tumorschnitte zeigte außerdem eine gleichmäßige Verteilung der Zellen (Abbildung 2C).
Hier zeigte sich die Fähigkeit, die Hydrogelscheiben medikamentös zu behandeln, durch die Behandlung mit Doxorubicin, das Teil der R-CHOP-Therapie (Rituximab, Cyclophosphamid, Doxorubicin, Vincristin, Prednison) ist, einer Standardtherapie für ältere MCL-Patientenuntergruppen24. Im Vergleich zu 2D-Kulturen können die Einflüsse der Tumormikroumgebung auf die Behandlungseffekte in den Hydrogel-Tumorschnitten untersucht werden. Wie in Abbildung 3 gezeigt, waren Jeko-1-Zellen, die in Hydrogelscheiben kultiviert wurden, resistenter gegen die Behandlung mit Doxorubicin als 2D-kultivierte Zellen. Dies steht im Einklang mit Beobachtungen, dass die extrazelluläre Matrix die Arzneimittelreaktionen beeinflussen und häufig die Arzneimittelresistenz erhöhen kann, indem sie die Tumorsteifigkeit36, die Zell-Zell-Kommunikation37 und die Wirkstoffabgabe38 moduliert. Darüber hinaus können die durchflusszytometrische Analyse sowie immunhistochemische oder Multiplex-Immunfluoreszenzfärbungen tiefere Einblicke in das Ansprechen einzelner Zellen in den Hydrogel-Tumorschnitten auf die Behandlung geben.
Zusammenfassend beschreibt dieses Protokoll die Erzeugung und Kultivierung von Hydrogel-Tumorschnitten, die ein 3D-Lymphknotenmodell darstellen, das die native dreidimensionale Lymphknotenstruktur nachahmt. Es hat das Potenzial, die Anwendung von MCL-Zellen auf andere primäre Lymphom-Indikationen auszuweiten.
Offenlegungen
Die Studie wurde gefördert von der Robert-Bosch Stiftung und dem Ministerium für Wissenschaft, Forschung und Kunst Baden-Württemberg (3R-Netzwerk BW).
Danksagungen
Wir danken Kerstin Willecke für ihre hervorragende technische Unterstützung und Yang Zhang für seine wertvolle Unterstützung bei der 3D-Bildanalyse.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| µ-slide 8 Well Glasboden | ibidi GmbH | 80827 | Objektträger mit Glasboden, die für die Live-Bildgebung von Hydrogelscheiben verwendet werden |
| 10x PBS | Carl Roth GmbH + Co.KG | 9150.1 | Bioink-Komponente |
| 10X RPMI-1640 mittel | Sigma-Aldrich | Nr. R1145 | Bioink-Komponente |
| 2,5 ml gasdichte Spritze Modell 1002 TLL | Hamilton | 81420 | Spritze für Bioprinting |
| 3D-Extrusionsdrucker, PrintrBot Simple | Printrbot | Selbstmodifiziert, um den Druck von Biotinten zu ermöglichen | |
| 6-Well-Platte | Th. Geyer GmbH & Co.KG | 7696790 | Kultur der Hydrogelscheiben |
| Flaschenaufsatz-Vakuumfiltrationssysteme, PES-Membran, 500 ml, 0,22 & Mikro; M Porengröße, 70 Membran mit mm Durchmesser | Corning Inc. | 513-3355 | Sterilfiltration von Puffern |
| Calciumchlorid-Dehydrierung | Carl Roth GmbH + Co.KG | Nr. T885.2 | Bestandteil von Waschpuffer und Gelatineaufschlämmung |
| Kollagen I aus der Ratte | Corning Inc. | CLS354249 | Bioink-Komponente |
| Cura Version 15.04.5 Software für den 3D-Druck | Ultimaker | Software für den 3D-Druck | |
| DRAQ5 | Biostatus GmbH | DR50050 | Beizmittel für die Live-Bildgebung von Hydrogel-Scheiben |
| Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) Dinatriumsalzdihydrat | Sigma-Aldrich | Nr. E5134 | Bestandteil des Alginat-Lösepuffers |
| EVE Automatischer Zellzähler | Nano EnTek Inc. | 10027-452 | Zell-Zähler |
| Falcon Bakteriologische Petrischalen mit Deckel, 35 mm Durchmesser | Falke | 351008 | Gefüllt mit Gelatineaufschlämmung zur Bildung des Stützbades für das Bioprinting |
| Falcon Röhrchen, 50 mL | Sarstedt AG & Co.KG | 62.547.254 | |
| Fötales Kälberserum | Sigma-Aldrich | Nr. S0615 | Nahrungsergänzungsmittel für Zellkulturmedium |
| Gelatine aus Schweinehaut | Sigma-Aldrich | Nr. G1890 | Hauptbestandteil der Gelatineaufschlämmung |
| HEPES, Freie Säure, Molekularbiologische Qualität | Merck KGaA | CAS-Nr. 7365-45-9 | Bestandteil von Waschpuffer und Gelatineaufschlämmung |
| Jeko-1 MCL-Zelllinie | ATCC | CRL-3006 | MCL-Zelllinie |
| KIMTECH Science Präzisionstücher | Kimberly Clark Gesellschaft | 7551 | Wird verwendet, um überschüssiges Wasser aus der Gelatineaufschlämmung zu ziehen und Tröpfchen aus der 3D-Druckerdüse zu entfernen |
| LAS X Softwareversion 3.5.7.23225 | Leica | Software für 3D-Rekonstruktionen | |
| Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop Leica TCS SP8 | Leica | TCS SP8 | Konfokales Mikroskop für Live-Bildgebung |
| Einmachglas Normales Pint 16 oz | Ball Corporation | Nr. G001 | Glas, in dem die Gelatineaufschlämmung zubereitet wird |
| Matrigel Wachstumsfaktor reduziert (GFR) Basalmembran-Matrix | Corning Inc. | 356231 | Bioink-Komponente |
| Millicell-Zellkultureinsatz, 0,4 & Mikro; M Porengröße | Merck KGaA | PICMORG 50 | Filterhalterung für Hydrogelscheiben |
| NucView 405 Caspase-3 Substrat, 1 mM in 1x PBS | Biotium | 10405 | Beizmittel für die Live-Bildgebung von Hydrogel-Scheiben |
| Oster Professional Series Mixer | Oster | BPST02-B00 | Mixer zur Erzeugung von Gelatineschlämme |
| Penicillin/Streptamycin | Gibco | 15140163 | Ergänzung für MCL-Zellkulturmedium |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay-Kits und dsDNA-Reagenzien | Invitrogen | Nr. P7589 | Beizmittel für die Live-Bildgebung von Hydrogel-Scheiben |
| Rotina 35 R | Hettich | 24573 | Zentrifugation von Zellen |
| ROTINA 38/38R Zentrifuge | Hettich | Z720109 | Zentrifugation von Gelatineaufschlämmung |
| RPMI-1640+GlutaMAX | Gibco | 61870036 | Basis des Kulturmediums für MCL-Zellen |
| Natriumalginat | FMC-Kooperation | GQ9109901 | Bioink-Komponente |
| Natriumchlorid | Merck KGaA | 1.06404 | Bestandteil des Alginat-Lösepuffers |
| Natriumcitrat | Carl Roth GmbH + Co.KG | 3580.1 | Bestandteil des Alginat-Lösepuffers |
| Sterican stumpfe Applikationskanülen 21G 0,8x22 mm | B.Braun | 9180109 | Düse für den 3D-Druck |
| Tetramethylrhodamin-Methylester-Perchlorat (TMRM) | Sigma-Aldrich | Nr. T5428 | Beizmittel für die Live-Bildgebung von Hydrogel-Scheiben |
| Trypanblau, 0,4 % | Sigma-Aldrich | Nr. T8154 | Beize für die Viabilitätsanalyse |
| Wasserdichtes Thermometer | VWR | 620-2099 | Thermometer zur Überwachung der Temperatur der Gelatineaufschlämmung |
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