Method Article

Live-Bildgebung und Charakterisierung der Mikroglia-Dynamik und Wechselwirkungen mit Synapsen in erkrankter Maus-Netzhaut

DOI:

10.3791/68420

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January 16th, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, University of California, San Francisco, 2Jules Stein Eye Institute, University of California, Los Angeles

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit demonstriert eine Methode zur Visualisierung und Quantifizierung der Mikroglia-Motilität und des Kontakts mit postsynaptischen Puncta in der Netzhaut mittels rotierender Scheiben-Konfokalmikroskopie.

Abstract

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Mikroglia sind die ansässigen Makrophagen des zentralen Nervensystems (ZNS), die auf Gewebeinfektionen und Verletzungen reagieren. Neben ihrer Rolle bei der Entzündung spielen Mikroglia auch eine entwicklungsbezogene Rolle bei der Verfeinerung der Schaltkreise durch synaptische Beschneidung. Die Mechanismen des synaptischen Prunings bei Neuroinflammation und Neurodegeneration sind jedoch weiterhin unbekannt. In diesem Protokoll verwenden wir ein Modell der Netzhauut-Explantation mit der Maus, um die Dynamik der Mikroglia ex vivo zu untersuchen. Um die Beweglichkeit der Mikroglia und deren Wechselwirkungen mit postsynaptischen Proteinen zu untersuchen, markieren wir Synapsen mit AAV-PSD95-RFP und zeichnen Zeitraffervideos von beweglichen Mikroglia, die mit postsynaptischen Proteinen kolokalisiert sind, mittels rotierender Scheibenkonfokalmikroskopie. Anschließend erstellen wir Oberflächen- und Fleckrekonstruktionen von Mikroglia und PSD95 mit Bildanalysesoftware. Daten wie die Verschiebungslänge der Mikroglia, Prozessgeschwindigkeit und der Kontakt mit postsynaptischen Puncta können dann von diesen Oberflächen extrahiert werden, um das Verhalten der Mikroglia sowohl in homöostatischen Zuständen als auch nach neuronaler Verletzung zu verstehen. Dieses Protokoll kann nützlich sein, um die Rolle der Mikroglia bei der synaptischen Beschneidung bei retinalen neurodegenerativen Erkrankungen zu untersuchen.

Introduction

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Schaltkreisfunktion und Homöostase beruhen auf hoch regulierter Synapsenaktivität und anderen einzigartigen Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Zelltypen1. Als die ansässigen Makrophagen des zentralen Nervensystems (ZNS) sind Mikroglia eine nicht-neuronale Population in der Netzhaut, die eine einzigartige Rolle beim synaptischen Beschneiden spielen. Während der Entwicklung des ZNS schneiden Mikroglia nicht-funktionale oder schwache Synapsen, um die neuronale Schaltkreise2 zu verfeinern. Mikroglia im sich entwickelnden Gehirn untersuchen ihre Umgebung und sind während kritischer Phasen auf eine neuroprotektive Rolle vorbereitet3. In der Entwicklung des visuellen Systems sind Mikroglia Schlüsselregulatoren bei der Entwicklung von kortikalen Neuronen und Interneuronen und zeigen neben morphologischen Veränderungen während kritischer Phasen der synaptischen Remodellierung4. Ähnlich entfernen Mikroglia in der sich entwickelnden Netzhaut apoptotische Zellen, um Platz für neue synaptische Verbindungen zu schaffen, bestätigt durch eine Hochregulation des homöostatischen Markers P2Ry12 während dieser Clearing-Ereignisse5. Jüngste Erkenntnisse zeigen jedoch, dass Mikroglia möglicherweise keine eindeutige Rolle bei der Verfeinerung der neuronalen Schaltkreise im sich entwickelnden visuellen System6 spielen, und betonen, dass es Kontroversen über die Rolle der Mikroglia in der Entwicklung visueller Schaltkreise gibt.

In Verletzungskontexten verändern Mikroglia die Morphologie in einen aktiven Zustand und können eine neurodegenerative Rolle spielen. Beispielsweise zeigten Mikroglia in Alzheimer-Modellen eine erhöhte Einschließung von Amyloid-Beta-Plaques7 und synaptischen Markern wie SPH und PSD958. Bei der retinalen Neurodegeneration haben viele Forschungsgruppen Mikroglia mit eingeschlossenem synaptischem Material gefunden, aber keine eindeutigen Hinweise auf eine aktive Einschluckung intakter Synapsen 9,10,11,12,13. So fanden He et al., dass Mikroglia in einem Modell von Retinitis pigmentosa9 zunehmen und das Volumen des verschlungenen synaptischen Materials aufweisen, aber es ist unklar, ob es eine Phagozytose intakte Synapsen oder eine Räumung von Trümmern gab. Außerdem sind traditionelle Mikroglialklassifikationen – wie "Ruhe vs. aktiviert" oder "M1 vs. M2" – vereinfacht und zunehmend ungenau angesichts moderner Erkenntnisse. Mikroglia existieren in einem Zustandsgradienten, nicht in diskreten Kategorien12. Daher forderten Paolicelli et al. einen Wechsel von veralteten binären Klassifikationen hin zu einer nuancierteren, streng definierten Nomenklatur für Mikroglialzustände, um die Morphologie und Aktivität der Mikroglia besser zu verstehen und zu definieren12. Daher werden Strategien zur Bewertung der Mikroglia-Funktion ex vivo und in vivo die Fähigkeit des Fachgebiets verbessern, Mikroglia-Zustände und -aktivität sowohl in Entwicklungs- als auch in Krankheitskontexten zu erkennen.

Obwohl es Strategien zur Untersuchung der Mikrogliafunktion sowohl ex vivo als auch in vivo gibt, hat die ex-vivo Live-Bildgebung mehrere Vorteile. Erstens behindert die Hornhautklarheit oder die Entwicklung des Grauen Stares die Netzhautbildgebung nicht, wodurch eine klare Visualisierung winziger Prozesse und synaptischer Puncta entsteht. Darüber hinaus erfordert die In-vivo-Bildgebung mehr technische Fertigkeit, was Ex-vivo-Präparaten zu einer höheren Durchsatzstruktur macht und zu mehr Tieraufnahmen pro Experiment führt. Trotz der theoretischen Vorteile, die die In-vivo-Bildgebung bieten kann, ist eine hohe Laserleistung (100–230 μW) erforderlich, um die Mikroglia-Prozessmotilität für die longitudinale Bildgebung14,15 zu erfassen. Ex-vivo-Bildgebung von Mikroglia mit geringerer Laserleistung und ausreichenden Bildgebungsmedien kann jedoch bei der richtigen Vorbereitung die gleiche Bildqualität wie in vivo liefern, obwohl das Gewebe nicht mehr vor Ort ist.

Wir haben nachgewiesen, dass Mikroglia in Anzahl, Komplexität und Prozessbewegung nach einer Erhöhungvon 10 durch den transienten intraokularen Druck (IOP) zunehmen. Im fixierten Gewebe führt diese Mikrogliose zu einer erhöhten Kolokalisation mit synaptischen Proteinen10. Frühere Arbeiten haben auch einen frühen Synapsenverlust und eine dendrite Degeneration von retinalen Ganglienzellen (RGCs) im murinen laserinduzierten okulären Hypertensionsmodell (LIOH) und anderen neurodegenerativen Modellen 10,16,17,18,19,20 nachgewiesen. Es ist jedoch weiterhin unbekannt, ob sie eine aktive Rolle beim Beschneiden von Synapsen spielen oder eine eher passive Rolle bei der Beseitigung von Zellresten, einschließlich zerlegter Synapsen. Da die Synapsenzersetzung ein frühes Merkmal der Neurodegeneration ist, ist das Verständnis der Mikroglia-Dynamik und ihrer Rolle bei der Synapse-Demontage entscheidend 8,10. Hier verwenden wir Live-Imaging, um die Mikroglia-Dynamik und deren Wechselwirkung mit dem exzitatorischen postsynaptischen Dichteprotein-95 (PSD95) auf den Dendriten von RGCs zu verstehen.

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Protocol

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Die Tiere wurden an der University of California, San Francisco, unter Lichtzyklen von 12 Stunden hell und 12 Stunden dunkel gehalten und erhielten Wasser sowie eine Standardernährung ad libitum, sofern nicht anders angegeben. Alle Verfahren wurden von den Institutional Animal Care and Use Committees der University of California, San Francisco, genehmigt. Siehe die Materialtabelle für Materialien und Instrumente, die in diesem Protokoll verwendet werden. Ein Überblick über das experimentelle Verfahren, von der intravitrealen Injektion bis zur Bildgebung und Analyse, ist in Abbildung 1 dargestellt.

1. AAV-PSD95-TagRFP-Virusproduktion und Effizienz

  1. Konstruiere AAV-PSD95-tagRFP, indem du die PSD-95pTagRFP-Sequenz (Addgene-Plasmid #52671; RRID:Addgene_52671) und es stromabwärts des CMV-Promotors in AAV-CMV-GFP nach Entfernung des GFP einzufügen (Addgene-Plasmid #67634; RRID: Addgene_67634).
  2. Bereiten Sie das Virus mit dreifach transfektiertem HEK293T vor, gereinigt mit PEG/Chloroform und konzentriert auf einen Titer von 1012 ip/mL (wie in Negrini et al. beschrieben).21.
    HINWEIS: Diese virale Produktionsmethode erzeugt typischerweise einen niedrigeren Titer als Ultrazentrifugation, aber für diese Experimente ist es wünschenswert, spärlich infizierte Zellen21 zu haben. Die in diesen Experimenten verwendete Kapsid-/Serotyp-Version war 7m8, (Addgene Plasmid # 64839; RRID: Addgene_64839).
    1. Testen Sie die Effizienz des AAV, bevor Sie mit dem vollständigen Bildgebungsprotokoll fortfahren.
      HINWEIS: Leser, die dieses Protokoll anwenden, sollten auf eine spärliche Markierung der RGCs achten, da das Ziel darin besteht, einzelne RGC-Dendriten zu identifizieren und zu isolieren.
  3. Überprüfen Sie eine erfolgreiche Transfektion und fixieren Sie dann die Netzhaut in 2 % PFA in 1x ACSF. Bei synaptischen Proteinen wird das Signal unter einem konfokalen Mikroskop bei 63x überprüft, um die klare Auflösung der fluoreszierenden Markierung zu überprüfen.
    HINWEIS: Die geringere Fixationskonzentration hilft, die Markierung für synaptische Proteine zu erhalten. Wenn das verwendete AAV nicht für synaptische Komponenten gilt, können Leser stattdessen 4 % PFA verwenden.

2. Maushaltung und AAV-PSD95-TagRFP intravitreale Injektionen

  1. Kreuze männliche und weibliche CD-1-Albino-Mäuse (Stamm 022) mit B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J (Stamm 005582), um CD-1-Albino-Mäuse mit EGFP-exprimierender Mikroglia zu erzeugen. Warte mindestens vier Generationen Rückkreuzung, um die männlichen und weiblichen Cx3cr1 heterozygoten Mäuse in Experimenten einzusetzen. Den Stamm erhalten und nach 10 Generationen wieder auf den CD-1-Hintergrund zurückführen, um genetische Drift zu verhindern.
  2. Betäuben Sie Tiere (P30-P60) mit Isofluran-Anästhesie über eine Induktionskammer mit 3–5 % Anästhetikum in Sauerstoff und einer Durchflussrate von 1 L/min Sauerstoff. Stellen Sie das Tier unter ein Stereomikroskop, wobei Isofluran kontinuierlich durch einen Nasenkegel verabreicht wird. Um sicherzugehen, dass das Tier betäubt ist, kneifen Sie mindestens dreimal den Zeh, um sicherzugehen.
  3. Gib vor der Injektion des AAV einen Tropfen 0,5 % Proparacain hinzu. Injizieren Sie 2 μL AAV-PSD95-RFP langsam intravitries in beide Augen am superotemporalen Limbus mit einer 26s G 10 μL Spritze. Entfernen Sie die Nadel langsam, um einen Rückfluss des AAV durch die Injektionsstelle zu verhindern. Tragen Sie nach der Injektion eine antibiotische Salbe auf die Augen auf.
  4. HINWEIS: Die Nadel sollte nicht mehr als die Hälfte durch den Umfang der Glaskörperkammer gehen. Dadurch können Netzhaut und Linse durch die Nadelspitze beschädigt werden, was zu einer fleckigen oder sogar erfolglosen Transfektion führt. Die Entwicklung oder Blutung des Grauen Stars ist ein Hinweis auf eine fehlerhafte Injektionstechnik.
  5. Nach der Injektion sollten Sie sicherstellen, dass die Tiere wach sind, bevor Sie sie in ihre ursprünglichen Käfige und Unterbringungsräume zurückbringen. Wenn ein Tier nach der Injektion Schmerzen zeigt, verabreichen Sie Buprenorphin per intraperitonealer Injektion. Warte 3 Wochen auf die AAV-Expression. Wenn ein induzierbares Modell verwendet wird, um den Augeninnerdruck zu erhöhen (oder andere Manipulationen durchzuführen), warten Sie 3 Wochen, bevor der Augendruck in einem Auge erhöht wird, wobei das kontralaterale Auge oder die Augen eines naiven Tieres als Kontrolle verwendet werden.

3. Euthanasie und Netzhautflachung

  1. Bereiten Sie eine frische 1x Lösung künstlicher Gehirnspinalflüssigkeit (ACSF, pH 7,4) in 1x PBS vor, das folgende Komponenten in mM enthält: 119 NaCl, 2,5 KCl, 1,3 MgCl2,6H 2O, 2,5 CaCl2,2H 2O, 1 NaHPO4, 11 Glukose und 20 HEPES.
  2. Oxygenieren Sie die Lösung mindestens 15 Minuten lang, bevor Sie sie für die akute Dissektion verwenden. Schließen Sie den Schlauch an einen Sauerstofftank an und setzen Sie eine Kappe mit einem Loch in der Mitte, um das Entweichen des Gases zu verhindern.
  3. Die Maus wird mit mindestens 1 ml Isofluran-Anästhesie in einer kleinen Induktionskammer eingeschläfert, gefolgt von zervikaler Verrenkung. Markieren Sie die Nasenseite der Hornhaut mit einem Marker, bevor Sie enukleieren, damit die Standorte der Netzhaut während des gesamten Experiments verfolgt werden kann.
    1. Um mikroperleninjizierte oder lasergelaserte Augen zu enukleieren, führen Sie eine begrenzte Bindehautperitomie durch und setzen Sie die Schere hinter das Auge, um das Auge an der Basis des Sehnervs zu sezieren. Dadurch bleibt das empfindliche Auge intakt.
  4. Mit einem Dissektionsmikroskop wird mit einer 23- oder 25-G-Nadel ein kleines Loch in die Hornhaut gestochen, wodurch das sauerstoffreiche ACSF das Auge durchströmen kann. Führe eine Schere in dieses Loch ein, um am Nasenende einen treuen Schnitt zu machen.
  5. Schneide den Rest der Hornhaut und Iris am Limbus ab.
  6. Entfernen Sie die Iris und die Linse. Wenn die Netzhaut an der Linse haftet, trenne sie mit einer Pinzette.
  7. Trennen Sie die Netzhaut von der Sklera, indem Sie mit einer Pinzette vorsichtig zwischen der RPE und der neuronalen Netzhaut sezieren.
  8. Legen Sie die Netzhaut auf die nicht gerasterte Seite eines Mixed-Cellulose-Esters (MCE) Membranfilterpapiers für eine klare Visualisierung und Bildgebung.
  9. Machen Sie kleine, entspannende Schnitte in der Netzhaut in den anderen drei Quadranten, wobei der längste Schnitt in der Nasennetzhaut zur Verfolgung der Netzhautopfposition dient.
    HINWEIS: Die Netzhaut sollte wie ein vierblättriger Klee aussehen.
  10. Übertragen Sie die Netzhaut vom Filterpapier auf ein Labortuch. Benutze einen Tropfen ACSF, um die Netzhaut zu befeuchten, und trockne dann das Filterpapier mit dem Tuch. Wiederhole das mit mindestens 8–10 Tropfen, damit die Netzhaut am Filterpapier haftet.
  11. Setzen Sie die Netzhaut in eine sauerstoffspendende Kammer, während Sie das kontralaterale Auge sezieren.
  12. Sobald das Bild fertig ist, trocknen Sie das Filterpapier wie in Schritt 3.10 erwähnt und wenden Sie die Netzhaut auf eine Matek-Petrischale um. Beschwere die Netzhaut entweder mit Metallperlen oder einem Ring. Gib 3-5 Tropfen ACSF dazu.
    HINWEIS: Kleine Metallperlen, wie solche aus einem Metall-Perlenbad oder einem Ring, sind von ausreichender Größe und Gewicht, um Drift zu verhindern, ohne die Netzhautintegrität zu beeinträchtigen.
  13. Man formt einen Ring, indem man einen Stahldraht und gespannte Nylonsaiten nimmt, klebt und ein Gewicht anlegt, um einen Ring mit festen, straffen parallelen Saiten zu erhalten.
    1. Wickle den Draht um einen 1/2 Zoll großen Zylinder und ziehe ihn straff mit einer Zange. Schneide jeden Ring aus dem Zylinder und glätte ihn zwischen einem Schraubstock.
    2. Schleife den Ring auf einer Seite, damit er eine raue, flache Seite hat. Spanne Nylonfäden über die Öffnung einer Flasche mit 1–2 Zoll Durchmesser und halte sie mit Gummibändern fest.
    3. Legen Sie den Ring auf die Nylonsaiten und kleben Sie ihn vorsichtig an die Nylonsaiten, indem Sie kleine Mengen Kleber entlang des inneren Rings auftragen. Anschließend legt man ein leichtes Gewicht auf den Ring, zum Beispiel eine Münze oder einen dünnen Metalldraht, um den Ring an Ort und Stelle zu halten.
    4. Nach dem Trocknen schneiden Sie die Nylonsaiten mit einer Präzisionsschere vom äußeren Rand des Rings ab. Das Ergebnis sind feste, parallele Saiten, die den Durchmesser des Rings straff verlängern.
    5. Wenn die Dichte der Nylonsaiten im Ring zu hoch ist, schneiden Sie einzelne Saiten mit einer Mikrodissektionsfeder-Schere, um den Anforderungen des Experiments gerecht zu werden.
      HINWEIS: Der Teil- und Montageprozess sollte nur ~5 Minuten dauern. Je schneller es dauert, bis das Gewebe ex vivo in ausgeglichene physiologische Bedingungen gebracht wird, desto gesünder ist das Gewebe.

4. Konfokalaufnahme der rotierenden Scheibe

HINWEIS: Schalten Sie die Luftfeuchtigkeitskammer mit 5 % CO2ein und lassen Sie sie mindestens eine Stunde vor der Bildgebung laufen. Wenn das System und die Probe das thermische Gleichgewicht erreichen, hilft es, Drift zu reduzieren.

  1. Beginnen Sie, das Okular bei 10x zu scannen, um die Mikroglia zu fokussieren. Beim Scannen des Gewebes nach abbildenden Bereichen verwenden Sie den Mikrogliakanal als Referenz und konzentrieren Sie sich nur auf Mikroglia mit hellen synaptischen Puncta, die kolokalisiert sind (innerhalb von 10–20 μm). Da die AAV-Markierung nicht im gesamten Gewebe homogen ist, scannt man Bereiche, in denen sowohl Mikroglia als auch Puncta in derselben Ebene kolokalisiert sind. Sobald ein Bereich gefunden wurde, der diese Kriterien erfüllt, schalten Sie auf 60x zum Fokussieren und schalten Sie durch Klicken auf die Kamerataste in den Kameramodus.
    1. Mit der Bildsystemsoftware klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den Bildschirm, um xy-navigation zu finden. Ein Vorschaubildschirm erscheint, der das Gewebe scannen kann, indem man einen Rahmen von 3 x 3, 5 x 5 oder einer individuellen Größe erstellt, um optimale Bereiche zu prüfen. Verwenden Sie die Rahmengröße 3 x 3 oder 5 x 5 und den Bildschirm mit einem Referenzkanal, um kontinuierliches Photobleaching zu verhindern.
      HINWEIS: Für dieses Protokoll haben wir den Mikroglia-Kanal verwendet.
  2. Fotografieren Sie die montierte Netzhaut umgehend mit einem rotierenden Scheibenkonfokalmikroskop mit 60x-Objektiv (NA 1.49).
  3. Um die Probe vorzusehen, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den Bildschirm, wählen Sie Live und klicken Sie auf die Auto-Adjust-Taste , damit das System die Ansicht basierend auf den aktuellen LUTs anpassen kann. Um die Lasereinstellungen anzupassen, wählen Sie zuerst jeden Kanal einzeln aus und passen die Laserleistung sowie die Belichtung nach Bedarf an. Klicken Sie dann mit der rechten Maustaste auf das Fluorophor, um Einstellungen dem Mikroskop zuzuweisen und die benutzerdefinierten Einstellungen zu speichern, da die Software sie beim Wechsel zu einem anderen Kanal nicht speichert.
    1. Wechsle zum nächsten Kanal und passe es bei Bedarf an. Rechtsklick auf das Fluorophor, um die Einstellungen zu speichern. Wenn Sie mehrere Kanäle im selben Bild aufnehmen, geben Sie die gleichen Werte ein, die nach der Vorschau jedes einzelnen Kanals verwendet werden. Rechtsklick auf das Fluorophor, um die Einstellungen zu speichern.
    2. Für die Multi-Channel-Akquise wählen Sie die interessanten Kanäle unter dem Lambda-Tab aus. Für Live-Imaging werden alle Kanäle zu einem Kanal kombiniert, um eine schnelle Erfassung der feinen Bewegung aus der interessierten Zelle zu ermöglichen, sodass jeder Kanal gleichzeitig aufgenommen werden kann, anstatt einzeln, was je nach Zellengeschwindigkeit zu einer Verzögerung im Zeitraffer führen kann.
  4. Fahren Sie mit dem Beschaffen eines Zeitraffers für die gewünschte Zeit fort.
    1. Im Zeittab unten links gib du eine Zeitrafferzeit von 5–10 Minuten mit einem Intervall von 20 Sekunden ein.
    2. Unter dem Reiter Aufnahmeeinstellungen rechts stellen Sie die Bildauflösung auf 608 x 832 mit einer Pixelgröße von 0,12 μm ein.
    3. Sammeln Sie Bilder in 10 bis 20 μm mit einer Schrittweite von 0,3 μm , um eine akzeptable Auflösung feiner Mikrogliaprozesse und synaptischer Puncta entlang der z-Achse sicherzustellen. Um eine erfolgreiche Zellverfolgung zu gewährleisten, halten Sie das Zeitintervall zwischen den Frames bei 20 bis 30 Sekunden.
      HINWEIS: Aufgrund der Zerbrechlichkeit des Gewebes ex vivo wird empfohlen, die experimentelle Netzhaut zuerst und nicht länger als eine Stunde zu fotografieren. Dies dient dazu, den Zustand des kontralateralen Kontrollauges zu normalisieren, das während der Bildgebung der ersten Netzhaut in einer sauerstoffreichen Kammer sitzen sollte.
  5. Verwenden Sie dieses Protokoll, um die oberflächlicheren Schichten der Netzhaut abzubilden. Durch die Erfassung von Zeitraffern größer als 20 μm wird es schwieriger, feine Prozessbewegungen während der 20-Sekunden-Intervalle zu erfassen. Daher sollten nur Mikroglia abbilden, die in den 20-μm-Stack passen.

5. Nachverfolgungsanalyse und Datenexport

  1. Oberflächenrendering für Mikroglia
    1. Konvertiere die Zeitrafferdatei mit der Dateikonverter-Software in das IMS-Format. Geben Sie folgende Voxelgrößen basierend auf den Bildeigenschaften aus Schritt 4.2 ein: x = 0,1272423 Mikron, y = 0,1272423 Mikron, z = 0,3 Mikron.
    2. Nach dem Start startet die Analysesoftware in Arena. Klicken Sie auf den Ordner Beobachten , um die zuvor konvertierte Datei zu öffnen. Stellen Sie sicher, dass das Bild in 3D-Ansicht ist.
    3. Um ganze einzelne Mikroglia zu erkennen, klicken Sie auf das blaue Oberflächensymbol in der Objekt-Symbolleiste . Wählen Sie unter Algorithmuseinstellungen die letzten drei Optionen aus: Verfolgungsflächen (über die Zeit), Flächen klassifizieren und Objekt-Objekt-Statistik. Klicken Sie auf den blauen Play-Button , um zum nächsten Schritt zu gelangen.
      1. Im Falle mehrerer Mikroglia wählen Sie Segment nur eine Region von Interesse (ROI), um sicherzustellen, dass einzelne Mikroglia innerhalb eines Oberflächenobjekts existieren. Stellen Sie die x-, y- und z-Parameter entsprechend so ein, dass nur eine Fläche der einzelnen interessierten Mikroglia entsteht.
    4. Wählen Sie den Kanal aus, für den ein Oberflächenrendering erstellt wird. Wenn gewünscht, wählen Sie Glatt, um die Oberflächenerschaffung zu glätten, und verwenden Sie ein Verhältnis von 1:1 bis 1,25 zur Voxelgröße des Bildes. Zum Beispiel, wenn das Bild eine Voxelgröße von 0,12 x 0,12 x 0,3 μm hat, setzen Sie das Oberflächendetail auf 0,15 - 0,16 μm. Unter der Schwellenwertung wählen Sie Machine Learning Segmentation, um die Software darin zu trainieren, die interessierten Zellen zu erkennen.
      HINWEIS: Dieser nächste Schritt besteht darin, Trainingsdaten per Machine Learning Segmentation an Imaris AI zu liefern.
    5. Beobachten Sie unter Trainingsdaten die beiden Pinselwerkzeuge: Hintergrund (zum Erkennen des Hintergrunds) und Vordergrund (zur Erkennung des wahren Signals der Probe). Zeichne Pinselstriche, indem du den gewünschten Pinsel auswählst und den Shift + Linksklick benutzt. Stellen Sie sicher, dass die Interpolationsanzeige unter Einstellungen ausgewählt ist. Wählen Sie Train and Predict aus, um Trainingsdaten aus den gemachten Pinselstrichen einzugeben.
      HINWEIS: Das Einführen von mehr als sechs Strichen führt zu einer längeren Verarbeitungszeit für die KI und zu einer ungenauen Erfassung der Zelle.
      1. Benutze den gelben Zeiger in der Mitte, um über den Z-Stapel zu bewegen. Zeichnen Sie mehrere Pinselstriche über die x-, y- und z-Ebenen sowie in einigen (nicht allen) Zeitabschnitten des Zeitraffers. Mach pro Eintrag 3-5 kurze Pinselstriche, da die KI am besten mit kleinen Informationsstücken auf einmal lernt. Passen Sie diesen Schritt iterativ bei jedem Eintrag an, bis eine genaue Zelloberfläche erstellt wird.
      2. Wählen Sie das gelbe Rechteck aus, um zwischen der Trainingsanzeige und der tatsächlich erstellten Oberfläche als letzte Kontrolle umzuschalten. Überprüfe außerdem im Zeitraffer, ob die Oberfläche die Zelle genau repräsentiert.
    6. Sobald das genaue Oberflächenrendering erreicht ist, geht der nächste Schritt weiter. Deaktiviere geteilte Objekte.
    7. Passen Sie die Anzahl der Voxel im Histogramm an. Verschieben Sie die Schwelle so, dass kleine Objekte entfernt werden, die nicht mit der Hauptfläche verbunden sind.
      HINWEIS: Dieser Schritt wird verwendet, um kleine unerwünschte Oberflächen zu entfernen, die durch Hintergrundgeräusche entstanden sind. Das Ziel ist es, alle Flächen zu entfernen, die nicht mit dem Hauptzellkörper von Interesse verbunden sind.
    8. Als Nächstes bearbeite ich die Oberfläche nach Bedarf. Entfernen Sie alle Objekte, die nicht Teil der Hauptfläche oder Schnittkanten sind, manuell mit dem Scherenwerkzeug nach Bedarf.
    9. Falls gewünscht, setzen Sie eine Schwelle der erlaubten Lücken, die dennoch mit dem Objekt verknüpft werden können. Wählen Sie den Tracking-Algorithmus für die bewegte Zelle aus.
      HINWEIS: Autoregressive Bewegung ist das am häufigsten verwendete Werkzeug zur Zellverfolgung, da es die kontinuierliche Bewegung während des Zeitraffers verfolgt.
      1. Der maximale Abstand und die maximale Lückengröße sind benutzerdefinierte Zahlen, die signifikante Punkte festlegen, von denen die Oberfläche abweichen kann. Setze eine maximale Lückenentfernung von 0,96 μm und eine maximale Lückengröße von 3 (Standardeinstellungen).
    10. Ähnlich wie Oberflächenobjekte in Schritt 5.1.7 gefiltert wurden, werden Spuren gefiltert, die nicht mit der Hauptoberfläche verbunden sind. Dies wird auch durch ein Histogramm angepasst. Definieren Sie, wo der Schwellenwert eingestellt werden soll, indem Sie darauf achten, wann kleine Spotspuren, die nicht länger als fünf Zeitrahmen dauern, aus den Filteranpassungen entfernt werden.
    11. Als Nächstes richten Sie bei Bedarf Klassifizierungen ein. Zum Beispiel kann die Verschiebungslänge zwischen 0 - 1 μm und 1+ μm kategorisiert werden, um kleine Prozessbewegungen oder signifikant große Prozess- oder Zellverschiebungen zu bestimmen.
    12. Setzen Sie schließlich bestimmte Ereignisse mit den Klassifikationen des vorherigen Schritts auf die richtigen Etiketten.
      HINWEIS: Dieser Schritt wird am besten genutzt, sobald Spots für das postsynaptische Signal erzeugt wurden.
  2. Spot-Klassifikation für PSD95
    1. Um ganze einzelne Mikroglia zu erkennen, klicken Sie auf das blaue Oberflächensymbol in der Objekt-Symbolleiste . Wählen Sie unter Algorithmuseinstellungen die letzten drei Optionen aus: Verfolgungsflächen (über die Zeit), Flächen klassifizieren und Objekt-Objekt-Statistik. Klicken Sie auf den blauen Play-Button , um zum nächsten Schritt zu gelangen.
    2. Wählen Sie den Quellkanal für den synaptischen Marker aus. Schalte den Slicer und alle anderen Kanäle aus, um nur PSD95 zu visualisieren. Verwenden Sie die Strg-Taste und das Zeiger-Auswahltool , um den xy-Durchmesser der Puncta abzuschätzen.
      1. Wähle ein paar helle Puncta, die während des Zeitraffers anhalten (Größe zwischen 0,6 μm und 1,2 μm).
      2. Schalte die Hintergrundsubtraktion aus. Wenn das Bild eine Hintergrundsubtraktion erfordert, verwenden Sie das Hintergrundsubtraktionswerkzeug unter Bildverarbeitung , bevor Sie den Zeitraffer verarbeiten.
    3. Als Nächstes fügen Sie einen Filter basierend auf der Punktqualität hinzu. Ziehen Sie das Histogramm so, dass alle PSD95-Puncta während des Zeitraffers genau erfasst werden.
      HINWEIS: Die Qualität basiert auf der Intensität des Zentrums der Spot9. Dieser Filter erfasst das tatsächliche Signal von PSD95 am genauesten im Vergleich zur Anzahl der Voxelfilter oder Durchmesserfilter.
    4. Entferne anschließend alle durch Rauschen erzeugten Stellen mit dem Bearbeitungsschritt. Wechsle zwischen dem Würfel-Cursor und dem Kreis-Cursor, um einzelne bzw. mehrere Stellen zu entfernen, die aufgrund von Rauschen nur für 1-2 Zeitfenster erscheinen.
    5. Falls gewünscht, setzen Sie eine Schwelle der erlaubten Lücken, die dennoch mit dem Objekt verknüpft werden können. Wählen Sie den passenden Tracking-Algorithmus für den synaptischen Marker aus.
      1. Der maximale Abstand und die maximale Lückengröße sind benutzerdefinierte Zahlen, die signifikante Punkte festlegen, von denen die Punkte abweichen können. Setze eine maximale Lückenentfernung von 14,6 μm und eine maximale Lückengröße von 3 (Standardeinstellungen).
    6. Ähnlich wie Spotobjekte in Schritt 5.2.3 gefiltert wurden, werden Spuren gefiltert, die nicht mit unterschiedlichen Puncta verknüpft sind. Dies wird auch durch ein Histogramm angepasst. Um zu definieren, wo der Schwellenwert eingestellt werden soll, achte darauf, wann kleine Objektspuren entfernt werden.
    7. Richten Sie bei Bedarf Klassifizierungen ein. Unterscheide zum Beispiel zwischen verschlungener, kontaktierter oder unkontaktierter Puncta mit der Klassifikation der kürzesten Entfernung zur Oberfläche. Eingeschlossen als jede Puncta < 0 μm innerhalb der Oberfläche, kontaktiert zwischen 0 und 0,5 μm von der Oberfläche oder unkontaktiert als 0,5+ μm von der Oberfläche.
    8. Setzen Sie schließlich bestimmte Ereignisse mit den Klassifikationen des vorherigen Schritts auf die richtigen Etiketten.
  3. Sobald Oberflächen und Punkte die interessierten Mikroglia und Puncta genau darstellen, exportiere alle Statistiken von jedem Objekt unter dem Statistik-Reiter. Stellen Sie sicher, dass detaillierte Statistiken extrahiert werden, darunter Verdrängungslänge, Geschwindigkeit und Kontaktereignisse als klassifiziert.
    1. Viele Statistiken, wie Fläche, Volumen, Verdrängungslänge und Geschwindigkeit, stammen aus Imaris. Exportieren Sie die Länge und Geschwindigkeit der Oberflächenverschiebung, um die Dynamik der Mikroglia im Experiment zu definieren.
      1. Definieren Sie die Verschiebungslänge als den Abstand zwischen der Anfangsposition und der Endposition der Oberfläche, gemessen in μm22.
      2. Definieren Sie Geschwindigkeit als die momentane Geschwindigkeit der Oberfläche von einem Zeitintervall zum nächsten, gemessen in μm/s22.
        HINWEIS: Kontaktereignisse sind ein Phänomen, das von den Autoren als intakte postsynaptische Puncta beschrieben wird, die eine Entfernung von 0 μm zwischen einzelnen Mikroglia für mindestens fünf konsistente Zeitrahmen innerhalb des Zeitraffers teilen.

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Results

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Mikroglia von CX3CR1-GFP-Mausnetzhauten wurden mit dem beschriebenen Protokoll abgebildet. Die Mäuse reichten zum Zeitpunkt der AAV-PSD95-RFP-Injektion von P30 bis P60, und es waren mindestens 21 Tage vergangen, um die AAV-Expression zu ermöglichen. Repräsentative Bilder von Mikroglia und deren Wechselwirkungen mit der PSD95-Puncta vor und nach der Analyse sind in Abbildung 2 dargestellt. Um die Mikroglia-Aktivierung zu induz...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll ermöglicht die Visualisierung und Verfolgung der Interaktion einzelner Mikroglia mit postsynaptischen Stellen entlang der Dendriten von RGCs. Bei einer neurodegenerativen Erkrankung wie dem Glaukom kolokalisieren Mikroglia mit Synapsen in der inneren plexiformen Schicht (IPL) der Netzhaut. Die Rolle der Mikroglia bei der Synapsenzersetzung ist nicht gut verstanden. Mikroglia tragen jedoch potenziell über mehrere potenzielle Mechanismen bei, darunter aberrantes Verschling...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PSD-95pTagRFP war ein Geschenk von Johannes Hell (Addgene-Plasmid #52671; RRID: Addgene_52671), während die Kapsidversion, 7m8, ein Geschenk von John Flannery und David Schaffer war (Addgene Plasmid # 64839; RRID: Addgene_64839). Wir möchten Aparna Lakkaraju danken, dass sie uns erlaubt haben, das Drehscheibenmikroskop ihres Labors zu nutzen, und Nilsa La Cunza für die Unterstützung bei der Live-Bildgebung. Wir möchten auch Felice Dunn, Annika Balraj und Luca Della Santina für hilfreiche Diskussionen und Kommentare zu diesem Manuskript danken. Wir danken Suling Wang für die Unterstützung bei der Datenanalyse zu Imaris. Diese Arbeit wurde von NIH-NEI EY028148 und EY034973 an Y.O., den ARVO David L. Epstein Award an Y.O. und NIH-NEI EY034973-S1 an C.F. finanziert. Diese Forschung wurde auch teilweise durch die UCSF Vision Core gemeinsame Ressource des NIH-NEI P30 EY002162/EY037668 sowie durch ein uneingeschränktes Stipendium von Research to Prevent Blindness in New York, NY, unterstützt. Abbildung 1 wurde am biorender.com erstellt.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
25-Gauge-NadelAlcon8065420920
26er Spurweite 10 & Mikro; L-SpritzeHamilton701RNWG
7m8Addgene64839http://n2t.net/addgene:64839
Bend-and-Stay Mehrzweckdraht 304 EdelstahldrahtStanford Fortgeschrittene MaterialienSS3368Stahldraht zur Herstellung von Ringen
Calciumchlorid-HexahydratSigma-AldrichC5080-500G
SektionsmikroskopAmscopeNetzhauten zu sezieren und zu montieren
SektionsschereFST15024-10
D-(+)-GlukoseSigma-AldrichG7528-250G
PinzetteDumont11252-21
HEPESSigma-AldrichH3375-500G
Imaris 10.0.2Oxford InstrumentsAnalysesoftware
Imaris-DateikonverterOxford Instruments
Loctite Sekundenkleber Ultra Gel ControlLoctite1363589Leim zum Ringen machen
MagnesiumchloridhexahydratSigma-AldrichM9272-100G
MCE-Membranfilterpapier (13 mm)MilliporeHABG013000,45 μ m Porengröße
MikroumweltkammerTokai HitSTXG-TIZBX-SET
Nikon Eclipse Ti2-E Invertiertes MikroskopNikon
NIS-ElementeNikon
Neomycin und Polymyxin B Sulfaes und Bacitracin Zink Opthalamische Lösung Salbe, USPBausch + Lomb24208-780-55
Pinselgröße 00Amazon
Prism 8.0GraphPad
Proparacain-Hydrochlorid-Opthalmische Lösung USP, 0,5 %Sandoz61314-0016-01
PDL-beschichtete Petrischale (35 mm)MatekP35GC-1.5-14-CNr. 1.5 Deckzettel
PSD95_pTagRFPAddgene52671http://n2t.net/addgene:52671
KaliumchloridSigma-AldrichP9333-500G
NatriumchloridSigma-AldrichS7653-1KG
Natriumphosphat monobasisches MonohydratSigma-AldrichS9638-25G

References

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