Konstruktion von klebstoffbasierten Gewebe-Microarrays für die Tumor- und Krankheitsforschung

Summary

Dieses Protokoll beschreibt eine kostengünstige und effiziente Validierungsmethode für die klebstoffbasierte TMA-Konstruktion und bietet eine komfortable pathologische Diagnoseplattform für die Tumor- und Krankheitsforschung.

Abstract

Die Tissue Microarray-Technologie (TMA) ist eine Hochdurchsatzplattform für den gleichzeitigen Nachweis und die Analyse mehrerer Gewebeproben, die eine effiziente Erforschung von Tumor- und Krankheitsbiomarkern ermöglicht. Herkömmliche TMA-Baumethoden stoßen jedoch oft auf Einschränkungen wie betriebliche Komplexität, zeitaufwändige Verfahren und variable Genauigkeit. Um diese Herausforderungen zu meistern, wurde eine klebstoffbasierte TMA-Konstruktionsmethode entwickelt, die eine verbesserte Fixierung des Gewebekerns und eine verbesserte strukturelle Stabilität bietet. Die systematische Validierung umfasste die histologische Bewertung (HE-Färbung), die immunhistochemische Profilierung von Zielproteinen und die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungsanalyse (FISH). Die Ergebnisse zeigten, dass die klebstoffbasierte Methode eine hervorragende Schichtintegrität beibehielt, das Signal-Rausch-Verhältnis verbesserte und eine konsistente Reproduzierbarkeit von Charge zu Charge gewährleistete. Obwohl der Ansatz auf den manuellen Betrieb beschränkt ist, stellt er eine zuverlässige und kostengünstige Option für die TMA-Produktion mit moderatem Durchsatz dar. Diese Methode eignet sich besonders für Forschungsumgebungen, in denen Flexibilität und Probenvielfalt Vorrang vor groß angelegter Automatisierung haben, wodurch der Nutzen von TMA in akademischen und diagnostischen Umgebungen erweitert wird.

Introduction

Tissue Microarray (TMA) ist eine Hochdurchsatztechnik zur Analyse von Gewebeproben ^1,2,3. Es werden mehrere Spendergewebekerne gewonnen, und Spenderparaffinblöcke werden in Empfängergewebeblöcke übertragen, um gleichzeitig eine differentielle und vergleichende molekulare Analyse unter theoretisch gleichen Leistungsbedingungen^{durchzuführen 2,4}. Die klassische Art, einen Gewebe-Microarray (TMA) zu konstruieren, besteht darin, mit einem Locher Gewebekerne aus einer Spendergewebeprobe zu extrahieren und sie nacheinander in einem Empfängerparaffinblock anzuordnen. Diese Methode eignet sich für Spenderparaffinblöcke ähnlicher Tiefe und ermöglicht die effiziente Analyse mehrerer Proben auf einer einzigen Schnitte, wodurch die Effizienz der Studie und die Konsistenz der Daten erheblich verbessert^{werden 5,6,7}. Dennoch weist diese Methode nach wie vor gewisse Einschränkungen auf, u.a. eine unzureichende Handhabung des Gewebekerns während des Einbettungsprozesses, die bei nachfolgenden Analysen zu einer inkonsistenten Färbung der Proben führen kann⁸.

Die zweite Methode der TMA-Konstruktion ist die Tape-Methode ^9,10. Bei diesem Verfahren wird der Bauprozess invertiert, indem der Block um invertierte aufrechte Kerne gegossen wird, die nach Fertigstellung unabhängig von der Kernlänge^11,12 bündig mit der Oberseite des TMA abschließen. Diese Methode erfordert jedoch die Sicherstellung der korrekten Platzierung des Gewebekerns und der Wirksamkeit des Tapes und begrenzt auch die Anzahl der Proben, die im Vergleich zu herkömmlichen Techniken verarbeitet werden können.

Diese Studie schlägt eine innovative Klebemethode für die Konstruktion von TMA vor, die darauf abzielt, Probleme wie die unzureichende Stabilität von Gewebekernen und komplexe Abläufe zu lösen, die bei traditionellen Techniken auftreten¹³. Bei dieser Methode werden mehrere Gewebekerne mit Klebstoff präzise miteinander fixiert und sie haben die Vorteile einer einfachen Bedienung und einer hohen Probenfestigkeit. Im Vergleich zu den herkömmlichen Schnitt- oder Klebemethoden kann die Klebemethode die Retentionsrate von Gewebekernen erhöhen und die Kosten senken. Diese Methode ist anwendbar für klinische Studien mit einer mittleren Stichprobengröße und eignet sich besonders für Forschungsdesigns, die eine flexible Anpassung des Versuchsplans erfordern. Es ist jedoch zu beachten, dass die Verarbeitungskapazität dieses Verfahrens nicht den Anforderungen eines ultrahohen Durchsatzes entspricht⁹. In der Zwischenzeit muss im eigentlichen Anwendungsprozess ein vollständiger Satz standardisierter Betriebsnormen und Qualitätskontrollsysteme etabliert werden. Die Bediener müssen systematisch geschult werden und professionelle Bewertungen bestehen, um die Standardisierung der technischen Abläufe und die Wiederholbarkeit der Ergebnisse zu gewährleisten. Eine umfassende Analyse zeigt, dass diese Technologie eine gute Balance zwischen betrieblicher Flexibilität, Wirtschaftlichkeit und technischer Zuverlässigkeit erreicht und sich besonders für Forschungsszenarien eignet, in denen die Ressourcen begrenzt sind, aber dennoch die Qualitätskontrolle gewährleistet werden muss.

Protocol

Alle Spenderblöcke wurden aus pathologischen Archivproben gewonnen, die zwischen 2016 und 2018 im angeschlossenen Huai'an No.1 People's Hospital der Nanjing Medical University gesammelt wurden. Die Proben wurden vor der Verwendung anonymisiert und in Übereinstimmung mit genehmigten Protokollen verarbeitet (die Ethikkommission des angeschlossenen Huai'an No.1 People's Hospital der Nanjing Medical University, KY-2024-250-01).

1. Beurteilung und Kennzeichnung von Spendergewebe

1. Wählen Sie Gewebeblöcke mit einer Dicke von ≥5 mm und einer Fläche von ≥15 mm × 15 mm. Stellen Sie sicher, dass an den Rändern ein Sicherheitsabstand von 2 mm eingehalten wird, und schließen Sie Regionen mit Nekrose, Blutungen oder Verkalkungen aus, um die Integrität des Gewebes zu erhalten.
2. Identifizierung und Markierung des Zielbereichs
   1. Bewerten Sie die H&E-gefärbten Schnitte mit einem optischen Mikroskop. Lokalisieren Sie den Zielbereich durch Scannen mit geringer Leistung und wechseln Sie dann zu hoher Leistung, um die morphologischen Eigenschaften der Zellen zu bestätigen. Markieren Sie die Grenzen des Zielbereichs auf den Folien.
   2. Ordnen Sie die Koordinaten des ausgewählten Bereichs der Oberfläche des Paraffinblocks zu, um die Markierungskonvertierung abzuschließen.

2. Extraktion des Gewebekerns

1. Punktionsvorbereitung und Probenvorbehandlung
   1. Wählen Sie einen Handlocher mit einem Durchmesser von 2 mm und bestätigen Sie die Glätte seiner Schneide und die einfache Bedienung.
   2. Legen Sie den Spenderparaffinblock für 15 Minuten bei 4 °C auf eine kalte Plattform.
2. Richten Sie die Nadel senkrecht auf den markierten Punkt aus und üben Sie gleichmäßigen Rotationsdruck aus, um die Grenztiefe zu erreichen. Vermeiden Sie Kippen oder Vibrieren während des Prozesses⁷ (Abbildung 1A).
3. Drehen Sie die Nadel vorsichtig gegen den Uhrzeigersinn (≤2 Umdrehungen/s), um sie zurückzuziehen. Werfen Sie den Gewebekern vorsichtig aus der Nadel aus und geben Sie ihn in eine einzelne Vertiefung einer vorgekühlten 96-Well-Platte. Notieren Sie die Kernposition in jeder Vertiefung (Abbildung 1B).
   HINWEIS: Wenn die Unterseite des Gewebekerns uneben ist, richten Sie ihn mit einer Klinge aus. Überprüfen Sie nach dem Trimmen erneut die Unversehrtheit.
4. Notieren Sie alle Spendernummern und die entsprechenden Positionen der ELISA-Plattenvertiefung (A1-H12) im Registrierungsformular. Überprüfen Sie während der Operation erneut, um sicherzustellen, dass die Anzahl der Spender und die Positionen der Vertiefung genau übereinstimmen.
5. Überprüfen Sie die Kerne sofort auf Unversehrtheit. Entsorgen Sie Bohrkerne, die gebrochen oder gebogen sind oder Durchmesserabweichungen >0,1 mm aufweisen.
   HINWEIS: Stellen Sie die Konsistenz der Kernlänge (Variationskoeffizient, CV ≤5%) sicher und vermeiden Sie Oberflächenkratzer oder Kompressionsartefakte.

3. Fixierung des Gewebekerns

1. Zeichnen Sie mit einem wasserfesten Marker ein Gitter direkt auf die Formoberfläche, um klare und gleichmäßig verteilte Linien zu gewährleisten.
   1. Verwenden Sie eine Standardform mit einer effektiven Bodenfläche von 3,0 cm × 2,5 cm und reservieren Sie auf jeder Seite einen leeren Begrenzungsbereich von 1,5 mm.
   2. Zeichnen Sie mit einem wasserfesten 0,5-mm-Marker mit feiner Spitze neun gleichmäßig verteilte parallele Linien horizontal und vertikal, die ein 9 × 9-Positionierungsraster (insgesamt 81 Schnittpunkte) bilden.
      HINWEIS: Reinigen Sie vor dem Start das Innere der Form mit einem mit Xylol getränkten Wattestäbchen, um Paraffinreste zu entfernen, die zu einer Delamination führen können. Verwenden Sie während des Zeichnens ein Stahllineal, um eine gleichmäßige Linienstärke und klar unterscheidbare Schnittpunkte zu gewährleisten.
2. Ziehen Sie mit einer Pipette 5 μl Kleber auf und platzieren Sie ihn vorsichtig in der Mitte des vorbeschrifteten Objektträgers, um ein einzelnes Tröpfchen zu bilden. Nehmen Sie sofort mit einer feinen Pinzette den Gewebekern im 90°-Winkel vertikal auf und drücken Sie ihn langsam senkrecht in den Leimtropfen (Abbildung 1C).
3. Führen Sie die Kerne mit einer Pinzette in die entsprechenden Rasterschnittpunkte an der Form ein. Üben Sie 5 s lang sanften Druck aus, um eine sichere Haftung zu gewährleisten (Abbildung 1D).
4. Wenn sich der Gewebekern verschiebt, fein abstimmen und sofort mit einer feinen Pinzette zurücksetzen, bevor der Kleber erstarrt (innerhalb von 30 s). Verwerfen Sie verfestigte, falsch ausgerichtete Kerne, um die Präparationsqualität zu erhalten und gleichzeitig wertvolle Proben weitestgehend zu erhalten.

4. Kassetteneinbau und Paraffineinbettung

1. Platzieren Sie die Tissue-Kassette vertikal über der Stahlform und stellen Sie sicher, dass sie ohne Kompression mit den Kernspitzen in Kontakt kommt. Befestigen Sie die Kassette mit Magnetklammern an allen vier Ecken und versiegeln Sie die Nähte mit geschmolzenem Paraffin.
2. Geschmolzenes Paraffin in einem Winkel von 45° in einem Zickzackmuster infundieren und dabei eine Flussrate von 1 ml/s beibehalten. Stellen Sie sicher, dass der Paraffingehalt die Kernspitzen um 2 mm übersteigt (Abbildung 1E).
3. Kühlen Sie den Block auf einer 4 °C kalten Platte 5 Minuten lang schnell ab, um eine starre Stützschicht zu bilden. Bringen Sie den Block für 20 Minuten in eine 22 °C-Umgebung, um die innere Belastung zu reduzieren. Verwenden Sie abschließend eine 40 °C heiße Heißluftpistole, um die Oberfläche sanft zu glätten und Schrumpfungsflecken zu beseitigen.
4. Erhitzen Sie das Paraffin leicht, um es weich zu machen, und schneiden Sie dann vorsichtig entlang der Kassettenkanten, um den Block zu lösen. Heben Sie die Kassette vorsichtig an und entfernen Sie alle Paraffinreste, um die Unversehrtheit der Gewebekerne zu gewährleisten (Abbildung 1F).

Results

In der vorliegenden Studie wurden hochwertige Gewebe-Microarrays mit der Klebemethode hergestellt. Um die Wirksamkeit der Methode zu überprüfen, wurde eine Reihe von Experimenten durchgeführt, darunter die H&E-Färbung, der immunhistochemische Nachweis spezifischer Proteine und die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungsanalyse (FISH). Eine kritische Komponente des Konstruktionsprozesses ist das Vorhandensein von Gewebekernpunkten an den erwarteten Positionen und Abständen zueinander, was durch visuelle Inspektio...

Discussion

Als innovatives Verfahren zur Konstruktion von Gewebe-Microarrays (TMA) hat das Klebeverfahren aufgrund seiner einfachen Konstruktionsverfahren und seiner Kosteneffizienz erhebliche Vorteile gezeigt. Im Vergleich zur traditionellen Nadelarray-Methode, die auf hochentwickelten Instrumenten^{beruht 14,15}, ermöglicht die Klebemethode die Fixierung der Probe durch Kleben, die mit nur grundlegenden Werkzeugen durchgeführt werden kann, w...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Brustkrebs HER2 Detection Kit	Anbiping	2502001	Brustkrebs HER2 Detection Kit
CDHR4 Antikörper	Abcam	ab166914	CDHR4 Antikörper
CDK1 Antikörper	Abcam	ab265590	CDK1 Antikörper
CRTAC1 Antikörper	Abcam	ab254691	CRTAC1 Antikörper
DNASE1L3	Abcam	ab203669	DNASE1L3
Antikörper-Einbettungsmaschine	P.S.J MEDICAL	BM450A	Einbettungsmaschine
Vollautomatischer Gewebe-Dörrautomat	Leica Biosystems	ASP3005	Vollautomatischer Gewebe-Dörrautomat
Glas-Objektträger	Citotest	250124A1	Glas-Objektträger
Kleber	TIZO	200	Kleber
GPR146 Antikörper	Abcam	ab117104	GPR146 Antikörper
IGSF10 Antikörper	Abcam	ab197671	IGSF10 Antikörper
ITIH1 Antikörper	Abcam	ab233032	ITIH1 Antikörper
Low Profile Mikrotom Klingen	Thermo Fisher	3052835	Low Profile Microtome Blades
Marker	Pen Deli	SK109	Marker
Pen Mikrotom	Leica Biosystems	HistoCore BIOCUT	Mikrotom
Paraffinwachs	Solarbio	YA0012	Paraffinwachs
SMAD9 Antikörper	Abcam	ab262940	SMAD9 Antikörper
TARBP1 Antikörper	Abcam	ab115896	TARBP1 Antikörper
ZCCHC24 Antikörper	Abcam	ab88756	ZCCHC24