Durchflusszytometrie und Einzelzellanalyse zur Charakterisierung der Mikroglia-Aktivierung in der frühen postnatalen Entwicklung des Gehirns von Mäusen

Summary

Dieses Protokoll kombiniert Durchflusszytometrie und Einzelzell-RNA-Sequenzierung, um Mikrogliazellzustände im Kleinhirn von frühen postnatalen Mäusegehirnen zu isolieren und zu charakterisieren. Es verwendet enzymatische Dissoziation, Percoll-Zentrifugation und Immunfärbung, um die Heterogenität der Mikroglia aufzudecken und das Verständnis ihrer Rolle bei der Kleinhirnentwicklung und -erkrankung zu verbessern.

Abstract

Mikroglia, die im Gehirn ansässigen Immunzellen, weisen während der Entwicklung und Erkrankung regionen- und kontextspezifische Transkriptionsprofile auf. Dieses Protokoll stellt zwei komplementäre Methoden zur Untersuchung von Mikrogliapopulationen im Kleinhirngewebe der Maus vor: Durchflusszytometrie und Einzelzell-RNA-Sequenzierung.

Als erste verwendete Methode ist das auf Durchflusszytometrie basierende Protokoll für frühe postnatale Gehirne optimiert und gewährleistet eine robuste Zellisolierung und Konsistenz unter experimentellen Bedingungen. Es beginnt mit der Gewebedissoziation mittels enzymatischer Verdauung, gefolgt von der Myelinentfernung mittels Percoll-Dichtegradientenzentrifugation, um eine hochwertige neurale Zellsuspension zu erhalten, und einer Gating-Strategie, die auf der CD45- und CD11b-Expression basiert. Die Lebend-/Totfärbung stellt die Lebensfähigkeit der Zellen sicher, und Fluorochrom-konjugierte Antikörper werden verwendet, um die Expression ausgewählter Oberflächenmarker auf Mikroglia zu profilieren. Kompensationskontrollen werden unter Verwendung von Latexkügelchen mit validierten Gating-Strategien unter Verwendung einer Fluoreszenz-Minus-Eins-Kontrolle (FMO) durchgeführt.

Die zweite Methode beinhaltet die Einzelzell-RNA-Sequenzierung mit 10X Genomics, wobei die gleichen vorgelagerten Isolationsschritte verfolgt werden, die ein transkriptomisches Profiling von Mikroglia unter verschiedenen Bedingungen ermöglichen. Mikroglia-Cluster werden mit Hilfe der Genexpressionsanalyse identifiziert, und zwischen den Versuchsgruppen wird eine differentielle Expressionsanalyse durchgeführt. Ein Random-Forest-Klassifikator wird ausschließlich zur Unterscheidung männlicher und weiblicher Stichproben angewendet, wenn gemultiplext wird.

Zusammen bieten diese reproduzierbaren und anpassungsfähigen Protokolle einen robusten Rahmen für die Untersuchung der Mikrogliadiversität im Kleinhirn während der frühen Gehirnentwicklung und ihrer möglichen Veränderung nach experimentellen Störungen.

Introduction

Die frühe postnatale Phase ist eine kritische Phase für die Entwicklung des Gehirns, die durch komplexe zelluläre und molekulare Prozesse gekennzeichnet ist, die die Grundlage für kognitive, emotionale und Verhaltensfunktionen legen¹. Diese Zeit ist jedoch auch von Vulnerabilität geprägt, da Störungen die neurologischen Entwicklungsverläufe verändern und zu langfristigen neurologischen oder psychiatrischen Störungen führen können. Mikroglia, die im Gehirn ansässigen Immunzellen, spielen eine zentrale Rolle bei der Gestaltung des sich entwickelnden Gehirns durch synaptische Beschneidung, Phagozytose, Immunüberwachung und Reaktionen auf Umwelteinflüsse ^2,3. Diese Zellen weisen eine bemerkenswerte Plastizität auf und nehmen transkriptionelle Profile an, die je nach Hirnregion, Entwicklungsstadium und pathologischem Kontext variieren ^4,5.

Eine genaue Analyse der Mikroglia-Aktivierung im sich entwickelnden Gehirn erfordert robuste und wiederholbare Methoden, die in der Lage sind, ihre dynamischen Phänotypen im Kontext von unreifem Hirngewebe zu analysieren. Die Durchflusszytometrie bietet eine zuverlässige Lösung, die die Hochdurchsatz-Charakterisierung von zellulären Populationen und der Markerexpression ermöglicht⁶. Seine Anwendung bei der Untersuchung von Mikroglia aus frühen postnatalen Gehirnen ist jedoch aufgrund der empfindlichen Beschaffenheit des Gewebes und der Notwendigkeit effizienter Zellisolierungs- und Anreicherungsprotokolle technisch anspruchsvoll ^7,8.

Das hier vorgestellte Protokoll kombiniert Durchflusszytometrie und Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) zur Isolierung und Charakterisierung von Mikroglia aus frühen postnatalen Mäusegehirnen, mit besonderem Fokus auf das Kleinhirn vom postnatalen Tag 3 (P3) bis zum postnatalen Tag 30 (P30)⁹, einer Region und einem Entwicklungsstadium, für die detaillierte methodische Referenzen begrenzt bleiben.

Dieser Arbeitsablauf umfasst die enzymatische Dissoziation, die Dichtegradientenzentrifugation zur Entfernung von Ablagerungen und die Zellanreicherung sowie die Immunfärbung mit einer Reihe von extrazellulären und intrazellulären Markern. Um die Diversität der Mikroglia zu charakterisieren, wird eine Reihe von Oberflächen- und intrazellulären Markern verwendet^10,11. Anstatt feste Labels (inflammatorisch oder reparativ) zuzuweisen, definiert das Protokoll Subpopulationen auf der Grundlage diskreter Markerexpressionsprofile. Zum Beispiel werden Mikroglia, die CD80, CD86 und iNOS, CD206 und Arg1, CD86 und CD64 oder CD163 und CD206 exprimieren, als molekular unterschiedliche Untergruppen identifiziert und analysiert. Diese Marker reflektieren unterschiedliche aktivierte Mikroglia-Zustände^10,11 und werden als Expressionsprofile dargestellt.

Diese multiparametrische Gating-Strategie ermöglicht die präzise Identifizierung von Mikroglia-Untergruppen auf der Grundlage der Oberflächenmarkerexpression und bietet einen optimierten Rahmen für die Analyse der Immunheterogenität während der postnatalen Gehirnentwicklung. Um das phänotypische Profiling zu erweitern und die transkriptionelle Diversität aufzudecken, wird nach der Zellisolierung eine Einzelzell-RNA-Sequenzierung durchgeführt. Diese Studie etabliert einen konsistenten und skalierbaren Arbeitsablauf, um das Verständnis der neurologischen Entwicklungsprozesse und der langfristigen Auswirkungen der Mikrogliaaktivierung zu verbessern. Durch die Integration von optimierter Durchflusszytometrie und scRNA-seq in einen entwicklungs- und regionalinformierten Rahmen dient dieses Protokoll als leistungsstarkes Werkzeug für die Untersuchung der Mikrogliabiologie im frühen Leben und ihrer Relevanz für die neurologischen Entwicklungsergebnisse.

Protocol

Alle tierexperimentellen Verfahren wurden von der Ethikkommission des CHU Sainte-Justine Research Centre überprüft und genehmigt und entsprechen den Richtlinien und Richtlinien des Ste-Justine Research Center und der University of Montreal (Montreal, Quebec, Kanada).

1. Zellisolierung aus dem Gehirn

1. Entfernen Sie nach Anästhesie-/Euthanasieverfahren schnell das gesamte Gehirn aus der Schädelhöhle und legen Sie es in ein 15-ml-Röhrchen mit Mikroglia-Zellkulturmedium (siehe Materialtabelle). Halten Sie die Tube auf Eis. Wiederholen Sie bei Bedarf den gleichen Vorgang für weitere Mäuse.
   Alle Mäuse, die in dieser Studie verwendet wurden, stammten aus hauseigenen Zuchtkolonien in Dr. Tremblays Labor. Die Versuchsmäuse wurden durch Kreuzung von B6.129-Cx3Cr1^{CreERT2-EYFP/WT-Mäusen} mit B6-Rosa26^{iDTR/WT-Mäusen} erzeugt, die beide ursprünglich von Jackson Laboratories stammten. Diese Züchtungsstrategie produzierte Nachkommen, die heterozygot für das IDTR-Allel waren, was eine bedingte Depletion von Cx3Cr1-exprimierenden Zellen (hauptsächlich Mikroglia) durch ein Tamoxifen-induzierbares Cre-loxP-System ermöglichte. Vor der Gewebeentnahme wurden die Mäuse durch intraperitoneale Injektion von Ketamin (150 μg/g) und Xylazin (10 μg/g) anästhesiert. Die Euthanasie wurde durch Enthauptung unter tiefer Betäubung in Übereinstimmung mit den Richtlinien der institutionellen Tierpflege und -verwendung durchgeführt.
2. Entweder das gesamte Gehirn erhalten oder mit der Dissektion bestimmter Regionen fortfahren, falls gewünscht. Führen Sie die Dissektion in einer kleinen Petrischale mit Mikroglia-Zellkulturmedium (siehe Materialtabelle) auf Eis durch, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten.
   HINWEIS: Dieses Protokoll wurde für das gesamte Gehirn und das Kleinhirn von P1 bis P30 validiert.
3. Entfernen Sie das Mikroglia-Zellkulturmedium und schneiden Sie das Hirngewebe mit einem Skalpell in einer Petrischale fein ab.
4. Für den enzymatischen Aufschluss wird das homogenisierte Gewebe in 5-ml-Röhrchen überführt. Fügen Sie 2 ml HBSS (1x) hinzu, ergänzt mit 2 mg/ml Kollagenase D und 14 μg/ml DNase I (siehe Tabelle 1). Verschließen Sie die Tubenkappen mit Parafilm. Inkubieren Sie die Röhrchen 15 min lang in einem 37 °C heißen Wasserbad und schütteln Sie das Röhrchen alle 5 min. Um die Verdauung zu stoppen, legen Sie die Röhrchen auf Eis.
5. Das Homogenat wird durch einen 140 μm Metallgewebefilter geleitet (siehe Materialtabelle), um große Ablagerungen zu entfernen. Verwende einen Glasstößel, um die Zellen zu dissoziieren.
6. Waschen Sie den Filter mehrmals mit Mikroglia-Zellkulturmedium (3 mL pro Waschgang).
7. Entnehmen Sie das Filtrat mit einer 10-ml-Pipette und geben Sie es in ein 15-ml-Röhrchen. Die Lösung wird bei 500 g für 7 min bei 4 °C zentrifugiert.
8. Entsorgen Sie den Überstand, indem Sie das Rohr vorsichtig umdrehen. Suspendieren Sie das Pellet wieder, indem Sie es vorsichtig auf einem Gestell kratzen.
9. Fügen Sie 10 ml einer 37%igen kolloidalen Medienlösung auf Siliziumdioxidbasis hinzu (siehe Tabelle 1), um Myelin und Ablagerungen zu entfernen. Die Lösung bei 500 g für 10 min bei 4 °C mit minimaler Bremskraft zentrifugieren.
10. Aspirieren Sie die Myelinschicht an der Oberseite der Lösung mit einer 10-ml-Pipette.
    HINWEIS: Eine kontinuierliche Aspiration verhindert, dass sich das Myelin wieder mit der Lösung vermischt.
11. Waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 10 mL HBSS (1x) und zentrifugieren Sie sie bei 500 × g für 7 min bei 4 °C.
12. Entsorgen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie das Pellet, indem Sie es vorsichtig mit einem Gestell abkratzen, und fügen Sie dann 10 ml Puffer für die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) hinzu (siehe Tabelle 1). Die Lösung wird bei 500 g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert.
13. Entsorgen Sie den Überstand, resuspendieren Sie das endgültige Pellet und behalten Sie die Zellen. Die isolierten Zellen sind nun bereit für die Durchflusszytometrie-Färbung oder Einzelzell-RNA-Sequenzierung.
14. Für die Isolierung von Einzelzell-RNA-Sequenzierung zählen Sie die Zellen unter einem Mikroskop mit Tisch-stabilen Fluoreszenzreagenzien (siehe Materialtabelle), um lebende und tote kernhaltige Zellen zusammen mit Trypanblau zu unterscheiden (siehe Materialtabelle). Stellen Sie sicher, dass sich die Zellen in einem ausgezeichneten Zustand befinden, mit einer Lebensfähigkeit von bis zu 90 % und einer Konzentration von 1000 Zellen/μl. Die nächsten Schritte sind in Abschnitt 9.1 beschrieben.
    HINWEIS: Bewahren Sie die Schläuche während des gesamten Protokolls auf Eis auf. Alle Zentrifugationsschritte müssen bei 4 °C mit einer maximalen Bremse durchgeführt werden, mit Ausnahme der Percoll-Stufe, bei der eine Mindestbremse vorgeschrieben ist. Um beste Ergebnisse zu erzielen, führen Sie das gesamte Protokoll am selben Tag durch. Für den Einzelzell-RNA-Seq-Protokollfilter werden alle zur Isolierung verwendeten Lösungen in Schritt 1.11 HBSS (1x) für die zweite Wäsche verwendet und in Schritt 1.12 70-100 μl der Zelllösung zurückgehalten.

2. Durchflusszytometrie extrazelluläres Färbeprotokoll

1. Übertragen Sie alle Zellen in eine 96-Well-Platte mit konischem Boden (siehe Materialtabelle). Die Platte bei 500 g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren.
2. Drehen Sie die Platte schnell um, um den Überstand in einer Bewegung zu entfernen.
3. Das Zellpellet wird in 25 μl Blockierungslösung resuspendiert (siehe Tabelle 1). 15 min bei Raumtemperatur (RT) inkubieren.
4. Zur Herstellung der extrazellulären Antikörper-Färbemischung (siehe Tabelle 2) zentrifugieren Sie Antikörperbestände bei 10.000 × g , um potenzielle Aggregate zu entfernen. Ohne das Pellet zu stören, saugen Sie vorsichtig das gewünschte Volumen aus dem Überstand ab, um die Färbemischung vorzubereiten, und stellen Sie das Volumen mit FACS-Puffer auf 25 μl ein.
5. Geben Sie 25 μl der extrazellulären Antikörpermischung in jede Vertiefung. 20 min bei RT inkubieren.
   HINWEIS: Vor der experimentellen Anwendung wurden alle Antikörper auf Kleinhirn- (oder Gehirn-) Einzelzellsuspensionen titriert, um die optimale Arbeitskonzentration zu bestimmen. Die Titration wurde durch serielle Verdünnungen durchgeführt, um eine Sättigungskurve zu erzeugen, und die Verdünnung, die einem Signalplateau mit minimalem Hintergrund entspricht, wurde für das Signalstaging ausgewählt.
6. Geben Sie ohne Mischen 150 μl FACS-Puffer in die Vertiefungen. Die Platte bei 500 × g 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Drehen Sie die Platte um, um den Überstand in einer Bewegung zu entfernen.
7. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 200 μl FACS-Puffer. Die Platte bei 500 × g 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Drehen Sie die Platte um, um den Überstand in einer Bewegung zu entfernen. Wiederholen Sie die Wäsche noch einmal mit 200 μl FACS-Puffer unter den gleichen Bedingungen.

3. Intrazelluläre Färbung

1. Resuspendieren Sie die Zellen in 100 μl Saponin-Paraformaldehyd (PFA)-Puffer (siehe Tabelle 1), um die Zellen zu fixieren und zu permeabilisieren. 10 min bei RT lichtgeschützt inkubieren.
2. Ohne Mischen 100 μl Saponinpuffer zugeben (siehe Tabelle 1). Die Platte bei 500 × g 6 min bei 4 °C zentrifugieren. Drehen Sie die Platte um, um den Überstand in einer Bewegung zu entfernen.
3. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 200 μl Saponinpuffer. Bereiten Sie Kompensationskontrollen vor, indem Sie 20 μl Kügelchen (siehe Materialtabelle) in 11 leere Vertiefungen geben. Die Platte bei 500 × g 6 min bei 4 °C zentrifugieren. Drehen Sie die Platte um, um den Überstand in einer Bewegung zu entfernen.
4. Zur Herstellung der intrazellulären Antikörper-Färbemischung (siehe Tabelle 3) zentrifugieren Sie Antikörperbestände bei 10.000 × g , um potenzielle Aggregate zu entfernen. Ohne das Pellet zu stören, das gewünschte Volumen vorsichtig aus dem Überstand absaugen, um die Färbemischung vorzubereiten, und das Volumen mit Saponinpuffer auf 50 μl einstellen.
5. Resuspendieren Sie das Pellet in 50 μl intrazellulärer Antikörpermischung (siehe Tabelle 3). Geben Sie 1 μl jedes Antikörpers in die Bead-Wells. 30 Minuten bei RT inkubieren.
6. Geben Sie ohne Mischen 150 μl Saponinpuffer in jede Vertiefung der Zellprobe und fügen Sie 100 μl FACS-Puffer in jede Vertiefung hinzu, die die Kompensationskontrollen zum Waschen der Kügelchen enthält. Die Platte bei 500 × g 6 min bei 4 °C zentrifugieren. Drehen Sie die Platte um, um den Überstand in einer Bewegung zu entfernen.
7. Das Zellpellet wird in 200 μl Saponinpuffer resuspendiert und die Ausgleichskontrollen werden in 200 μl FACS-Puffer resuspendiert. Die Platte bei 500 × g 6 min bei 4 °C zentrifugieren. Drehen Sie die Platte um, um den Überstand in einer Bewegung zu entfernen. Wiederholen Sie die Wäsche noch einmal mit 200 μl Saponinpuffer unter den gleichen Bedingungen.
8. Die Zellen und die Kompensationskontrollen werden in 200 μl FACS-Puffer resuspendiert. Die Suspension in ein FACS-Röhrchen überführen und bis zur Aufnahme der Durchflusszytometrie bei 4 °C lagern.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass alle Schritte, bei denen lichtempfindliche Reagenzien verwendet werden, bei minimalen Lichtverhältnissen durchgeführt werden. Ein Bead Well enthält keinen Antikörper, was dem ungefärbten Bead-Röhrchen entspricht.

4. Erfassung der Durchflusszytometrie

1. Schalten Sie das Durchflusszytometer und dann den Computer ein.
2. Öffnen Sie die Durchflusszytometer-Software und initiieren Sie den Start der Fluidik, indem Sie auf der Registerkarte Zytometer die Option Ausführen auswählen.
3. Erstellen Sie einen neuen Experimentordner, indem Sie auf Neuer Ordner klicken und einen Namen zuweisen. Klicken Sie dann auf Neues Experiment , um dem Experiment einen Namen zu geben, und wählen Sie Neues Röhrchen , um eine Probe und ein Probenröhrchen hinzuzufügen.

5. Richten Sie Vergütungskontrollen ein

1. Bereiten Sie einfach gefärbte Kompensationsperlen für jedes in der Platte verwendete Fluorochrom vor, zusammen mit einer ungefärbten Kontrolle.
2. Laden Sie die Kompensationsröhrchen auf das Zytometer. Stellen Sie die Spannungen für Forward Scatter (FSC) und Side Scatter (SSC) auf ca. 250 ein.
3. Passen Sie die Spannungen für jeden Fluoreszenzkanal so an, dass sich die negative Grundgesamtheit in der ersten Dekade der Achse befindet.
4. Erfassen Sie mindestens 5.000 Ereignisse pro Tube.
5. Verwenden Sie die Kompensationsmatrix, um die spektrale Überlappung anzupassen, bis alle positiven Peaks klar von der negativen Population getrennt und über 10⁴ auf der jeweiligen Achse zentriert sind.
   HINWEIS: Kompensationskontrollen müssen für jedes Experiment durchgeführt werden, da die Zytometereinstellungen oder die Fluorochromleistung die spektrale Überlappung erheblich beeinflussen können. Obwohl zellbasierte Kompensationskontrollen in einigen Hirngewebeanwendungen empfohlen werden, wurden in diesem Protokoll Antikörper-Capture-Kügelchen verwendet, da eine geringere Anzahl von Mikroglia aus dem P3-Kleinhirn der Maus gewonnen werden kann, was die Durchführbarkeit einer zellbasierten Kompensation einschränkt. Die Antikörperfluoreszenz wurde zunächst an aus dem Gehirn stammenden Zellen validiert und erwies sich als vergleichbar mit Bead-basierten Signalen. Nehmen Sie während der anfänglichen Panel-Optimierung eine ungefärbte Zellsuspension aus dem Gehirn auf, um die Autofluoreszenz des Gewebes zu beurteilen und die Signalpegel zu ermitteln. Diese Kontrolle ist wichtig, um negative Populationen in jedem Fluoreszenzkanal richtig einzustellen.

6. Vorbereiten und Erwerben von FMO-Kontrollen

1. Bereiten Sie für jeden Schlüsselmarker eine Fluoreszenz-Minus-Kontrolle (FMO) vor, die alle Antikörper mit Ausnahme des zu testenden Antikörpers enthält.
2. Führen Sie die FMO-Regler mit den gleichen Erfassungseinstellungen wie bei den vollständig gefärbten Proben aus.
3. Verwenden Sie FMO-Diagramme, um Gating-Schwellenwerte für niedrige oder überlappende Grundgesamtheiten zu definieren und um richtig positive Ergebnisse von Hintergrundrauschen zu unterscheiden.
   HINWEIS: FMO-Kontrollen sollten während der anfänglichen Panel-Optimierung durchgeführt werden, um genaue und zuverlässige Gating-Grenzen zu definieren, insbesondere in Geweben mit hoher Autofluoreszenz, wie z. B. dem Gehirn. Wenn das Färbepanel, die Geräteeinstellungen oder die Versuchsbedingungen geändert werden, müssen die FMO-Kontrollen wiederholt werden. Für nachfolgende Experimente mit denselben validierten Panel- und Zytometereinstellungen können zuvor definierte Gating-Schwellenwerte wiederverwendet werden, um die Konsistenz über biologische Replikate hinweg zu gewährleisten.

7. Vorbereiten und Erwerben von Isotyp-Steuerelementen

1. Färben Sie die Kontrollprobe mit Isotyp-Kontrollantikörpern, die in Fluorochrom und Konzentration auf die Testantikörper abgestimmt sind.
2. Erfassen Sie Daten mit denselben Zytometereinstellungen.
3. Verwenden Sie Isotypkontrollen nur, um eine mögliche unspezifische Bindung zu beurteilen, insbesondere im Fall von intrazellulären Markern oder schlecht charakterisierten Antikörpern. Verwenden Sie keine Isotypkontrollen für das Gating, da sie nicht die gleiche Bindungskinetik wie spezifische Antikörper widerspiegeln.
   HINWEIS: Isotyp-Steuerelemente eignen sich nicht für das Gating und sollten nicht zum Definieren von Populationen verwendet werden. Ihre Verwendung ist optional und sollte in ausgewählten Fällen der Validierung der Antikörperspezifität vorbehalten bleiben.

8. Gating-Strategie für die Durchflusszytometrie

1. Erstellen Sie die folgenden Punktdiagramme für sequenzielles Gating:
   FSC-A vs. SSC-A zum Ausschluss von Schmutz
   FSC-A vs. FSC-H zur Auswahl von Unterhemden.
   FSC-A vs. Amcyan (Viabilitätsfarbstoff) zur Schattierung lebender Zellen.
2. Identifizieren Sie Mikroglia als CD11b⁺CD45⁺ anhand von CD11b (FITC) vs. CD45 (AF700).
   HINWEIS: Aufgrund des Entwicklungsstadiums (P3-P15), des inflammatorischen Kontexts und der enzymatischen Verdauung waren TMEM119 und P2RY12 nicht zuverlässig für die eindeutige Trennung von Mikroglia von anderen myeloischen Populationen durch Durchflusszytometrie. Die CD11b⁺CD45⁺ Gating-Strategie, die zuvor im postnatalen Gehirn validiert wurde, wurde daher verwendet, um Mikroglia-Populationen zu identifizieren und gleichzeitig die Kontamination zu minimieren. Unter Kontrollbedingungen liegt die typische Ausbeute zwischen 30.000 und 200.000 Mikrogliazellen pro ganzem Gehirn von P3 bis P15. Bei Experimenten, die sich speziell auf das Kleinhirn konzentrieren, liegt die durchschnittliche Ausbeute bei etwa 5.000 Mikrogliazellen pro Gehirn.
3. Verwenden Sie FMO-Steuerelemente, um Gating-Schwellenwerte für Aktivierungsmarker zu definieren.
4. Identifizierung von Mikroglia-Subpopulationen basierend auf der Expression immunbezogener Marker:
   CD80⁺ (Superhell 436)
   CD86⁺ (PE)
   iNOS⁺ (PE-eFluor 610)
5. Weitere Charakterisierung von Mikroglia-Untergruppen durch Kombinationen der Markerexpression:
   CD206⁺ (APC)^{dann Arg1+} (PE-Cy7)
   CD86⁺ (PE)^{dann CD64+} (PerCP-eFluor 710)
   CD163⁺ (Super Bright 600)^{dann CD206+} (APC)
   HINWEIS: Markerkombinationen werden verwendet, um die molekulare Heterogenität innerhalb der Mikrogliapopulation zu beschreiben. Diese Untergruppen werden ausschließlich auf der Grundlage der Markerexpression berichtet und erhalten keine spezifischen funktionellen Rollen, in Übereinstimmung mit den aktuellen Standards zur Anerkennung der Mikrogliaplastizität und kontextabhängiger Phänotypen.
6. Laden Sie die experimentelle Probe. Legen Sie FSC auf 300 und SSC auf 200 fest. Verwenden Sie eine niedrige Durchflussrate und zeichnen Sie die gewünschte Anzahl von Ereignissen auf.
7. Waschen Sie nach der Erfassung das Zytometer und exportieren Sie die Daten als . FSC-Dateien für die Analyse.
8. Analysieren Sie die Daten mit einer Durchflusszytometer-Software.

9. Einzelzell-RNA-Sequenzierungsprobe

1. Unter Verwendung des gleichen Zellisolationsprotokolls, das für die Durchflusszytometrie beschrieben ist (siehe Schritt 1.14), resuspendieren Sie die dissoziierten Zellen in FACS-Puffer. Verwenden Sie FACS-Puffer in Sammelröhrchen und allen nachfolgenden Handhabungsschritten, um die Zellstabilität zu erhalten.
2. Führen Sie keine fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) durch, wenn das Ziel darin besteht, alle Zelltypen aus einer Gehirnregion zu erfassen. Wenn das Experiment jedoch eine Anreicherung für Mikroglia erfordert, sollte vor der Sequenzierung ein FACS-Sortierschritt durchgeführt werden.
3. Sofortige Beurteilung der Zellviabilität mit benchtop-stabilen fluoreszierenden Viabilitätsfarbstoffen und Trypanblau (siehe Materialtabelle). Zählen Sie die Zellen unter dem Mikroskop mit einem Hämozytometer (siehe Materialtabelle).
4. Stellen Sie sicher, dass die Zellsuspension eine Lebensfähigkeit von mindestens 90 % aufweist, und stellen Sie sie auf eine Endkonzentration von ca. 1.000 Zellen/μl ein, bevor Sie mit der Einzelzell-RNA-Sequenzierung fortfahren.
5. Bewahren Sie alle Proben auf Eis auf und verarbeiten Sie sie sofort nach der Dissoziation, um zellulären Stress und Transkriptionsveränderungen zu minimieren.
6. Multiplexieren Sie die Proben paarweise gemäß den Anweisungen des Herstellers.
   HINWEIS: Ein Männchen und ein Weibchen aus derselben Versuchsgruppe wurden zusammengelegt, um die Versuchskosten zu senken.
7. Bereiten Sie die scRNAseq-Bibliotheken vor (siehe Materialtabelle) und befolgen Sie die empfohlenen Herstellerrichtlinien.
   HINWEIS: Die Vorbereitung der Bibliothek wurde von der Genomics-Plattform des Institute for Research in Immunology and Cancer (IRIC) an der Universität Montreal durchgeführt.
8. Sequenzieren Sie die scRNA-seq-Bibliotheken mit einem Sequenzierungssystem bis zu einer durchschnittlichen Tiefe von 3200 M Reads pro Spur.
   HINWEIS: Die Sequenzierung wurde bei Genome Quebec in Montreal durchgeführt.

10. Einzelzell-RNA-Sequenzierungsanalyse

1. Führen Sie eine UMI-Analyse (Unique Molecular Identifier) mit der Cell Ranger-Software von 10X Genomics (v8.0.0) mit dem Referenzgenom der Maus GRCm39 2024-A durch. Verwenden Sie das Seurat R-Paket (v5.1) für die Downstreamanalyse.
2. Führen Sie eine Qualitätskontrolle durch, indem Sie Zellen mit mitochondrialer RNA ausschließen, die z. B. 30 % der Gesamt-RNA überschreiten (Abbildung 1A) oder einen strengeren Schwellenwert festlegen, der zur Entfernung von Zellen mit potenziellem Stress gewählt wurde. Filtern Sie Zellen von geringer Qualität mit log10GenesPerUMI von mehr als 0,75 (Abbildung 1B), einer Anzahl einzigartiger Merkmale ("nUMI") von weniger als 500 und einer Anzahl von Genen pro Zelle ("nGen") von mehr als 300 (Abbildung 1C) heraus. Entfernen Sie als Nächstes Droplets mit dem Paket "scDblFinder" in R. Mit einem Korrelationsdiagramm von nUMI und nGen, das die Schwellenwerte zeigt, sollte nun der Filtereffekt sichtbar sein (Abbildung 1D).
3. Mildern Sie Batch-Effekte, indem Sie 2.000 hochvariable Gene pro Probe mit der SelectIntegrationFeatures-Funktion von Seurat identifizieren.
4. Integrieren Sie Datensätze mit der kanonischen Korrelationsanalyse (CCA) und führen Sie die Hauptkomponentenanalyse (PCA) zur Reduzierung der Dimensionalität durch. Verwenden Sie die RunPCA-Funktion mit 50 Hauptkomponenten (PCs), skalieren Sie die Daten und beseitigen Sie unerwünschte Variationsquellen (z. B. mitochondriale Inhalte). Werten Sie die Anzahl der beibehaltenen PCs basierend auf dem Ellbogendiagramm und der JackStraw-Analyse aus.
5. Visualisieren Sie Cluster mit dem UMAP-Algorithmus (Uniform Manifold Approximation and Projection) über die Seurat RunUMAP-Funktion . Identifizieren Sie clusterspezifische Genexpressionsprofile mit der Funktion FindAllMarkers . Annotation von Clustern auf der Grundlage von transkriptionellen Signaturen durch Querverweise identifizierter Markergene mit kuratierten Einzelzellressourcen wie PanglaoDB und CellMarker (Abbildung 2). Zelltypen, einschließlich Mikroglia, werden aus diesen transkriptomischen Profilen und nicht aus vordefinierten Oberflächenmarkern abgeleitet.

11. Geschlechtsbasierte Zelltrennung

1. Identifizieren Sie männliche und weibliche Zellen anhand der Expression geschlechtsspezifischer Gene: vier frauenspezifische (Xist, Tsix, Usp9x, Eif2s3x) und drei männliche spezifische (Eif2s3y, Uty, Ddx3y).
2. Klassifizieren Sie männliche und weibliche Populationen, indem Sie Zellen filtern, die normalisierte UMI-Zahlen > 1 für eines dieser Gene ausdrücken, indem Sie die Seurat-Teilmengenfunktion verwenden.
3. Generieren Sie Seurat-Objekte, indem Sie männliche und weibliche Zellen getrennt voneinander unterteilen. Speichern und analysieren Sie diese Objekte unabhängig voneinander für nachgelagerte Vergleiche.
4. Validieren Sie die Klassifizierung, indem Sie die geschlechtsspezifische Genexpression mit den Funktionen FeaturePlot und VlnPlot visualisieren und so eine klare Trennung zwischen männlichen und weiblichen Zellpopulationen gewährleisten.
   HINWEIS: Die Schritte 12.1 und 12.2 sollten nur durchgeführt werden, wenn die Probe durch Mischen eines Steckers und eines Weibchens gemultiplext wurde.

12. Statistische modellbasierte Mikroglia-Klassifikation

1. Erstellen Sie fünf statistische Modelle in R (Random Forest, logistische Regression, naive Bayes, Support Vector Machine, Entscheidungsbaum) unter Verwendung eines Trainingssatzes von ~1.000 Zellen mit bekannten Gruppenbeschriftungen.
2. Bewerten Sie die Modellleistung mithilfe der 10-fachen Kreuzvalidierung und der ROC-Kurven (Receiver Operating Characteristic) (Abbildung 3). Identifizieren Sie Schlüsselgene, die zur Klassifizierung beitragen, mit der Funktion FindAllMarker in Seurat.
3. Wählen Sie das Modell mit der höchsten Fläche unter der ROC-Kurve (AUC) aus. Das Random-Forest-Modell wurde auf der Grundlage seines überlegenen AUC-Werts ausgewählt.
4. Wenden Sie das ausgewählte Modell mit der predict-Funktion aus dem RandomForest R-Paket auf nicht klassifizierte Zellen an. Führen Sie die vorhergesagten Klassifizierungen mit zuvor kommentierten Datensätzen in Seurat mithilfe von merge zusammen.
5. Validieren Sie Klassifikationen, indem Sie die Markergenexpression mit FeaturePlot und VlnPlot visualisieren. Um die Konsistenz der vorhergesagten Zellidentitäten sicherzustellen, bewerten Sie die Anreicherungen des Markergensatzes, die sich vor und nach dem Hinzufügen der klassifizierten Zellen überlappen, mit einem geeigneten statistischen Test (z. B. exakter Fisher-Test).

13. Analyse der differentiellen Genexpression von Mikroglia

1. Führen Sie eine differentielle Genexpressionsanalyse (DEG) zwischen zwei spezifischen Interessengruppen mit der Seurat-Funktion "FindMarkers" durch, wobei ident.1 die Interessengruppe und ident.2 die Referenzgruppe darstellt.
   HINWEIS: Die Ausgabe listet Gene auf, die in ident.1 im Vergleich zu ident.2 unterschiedlich exprimiert werden. In diesem Zusammenhang sind hochregulierte Gene solche mit höherer Expression in ident.1 im Vergleich zu ident.2, während herunterregulierte Gene in ident.1 eine geringere Expression aufweisen. Ihre Vergleiche werden verwendet, um Vulkandiagramme zu erstellen und zustandsspezifische Transkriptionsänderungen zu interpretieren.
2. Identifizieren Sie differentiell exprimierte Gene (DEGs) mit einem angepassten P-Wert≤ 0,05. Für Vergleiche zwischen zwei spezifischen Gruppen verwenden Sie die FindAllMarkers-Funktion mit den folgenden Kriterien: Gene, die in mindestens 10 % der Zellen exprimiert werden (min.pct = 0,1) und ein log2-Faltungsänderungsschwellenwert von 0,25 (logfc.threshold=0,25). Verwenden Sie für Vergleiche mit mehreren Gruppen über alle Mikroglia hinweg die Funktion FindAllMarker mit denselben Parametern. Gene mit einem adjustierten P-Wert ≤ 0,05 gelten als signifikant differentiell exprimiert. Um DEG-Ausdrucksmuster zu visualisieren, generieren Sie ein Vulkandiagramm mit der integrierten Funktion im EnhancedVolcano-Paket (Abbildung 4).
3. Vergleichen Sie die Ergebnisse der Durchflusszytometrie, indem Sie zunächst die zytometrischen Marker untersuchen, die zum Auffinden von Mikroglia verwendet werden, insbesondere CD45⁺ und CD11b⁺, die den Genen PtprcundItgam entsprechen. Bestätigen Sie die Genexpression mit den FeaturePlot-Funktionen in Seurat.
4. Bewerten Sie die Marker, die häufig mit unterschiedlichen Mikrogliazuständen assoziiert sind, einschließlich CD80undNOS2 sowie Mrc1, Arg1, Fcgr1 und CD163. Verwenden Sie die Seurat-Funktionen FeaturePlot und DotPlot , um ihre Expression über Zellcluster hinweg zu visualisieren.
5. Generieren Sie ein Punktdiagramm mit der Funktion DotPlot in Seurat, um Markerausdrücke zusammenzufassen und die Klassifizierung der Grundgesamtheit zu validieren.

Results

Dieses Protokoll nutzt die Durchflusszytometrie effektiv zur Charakterisierung von Mikroglia-Zellpopulationen in Gehirnproben von Mäusen, basierend auf der Expression ausgewählter Oberflächen- und intrazellulärer Marker. In den folgenden Abschnitten werden die Ergebnisse aus den wichtigsten Schritten des Arbeitsablaufs detailliert beschrieben, wobei die Verteilung und Heterogenität der Mikroglia-Untergruppen als Reaktion auf experimentelle Bedingungen hervorgehoben wird.

Validierung von Vergütungs- und Gating-Strategien
Kompensationsbeads wurden verwendet, um Fluoreszenzsignale zu kalibrieren und spektrale Überlappungen zwischen Fluorochromen zu korrigieren. Positive und negative Populationen für jedes Fluorochrom wurden klar getrennt, was eine genaue Generierung der Kompensationsmatrix ermöglicht. Die Gating-Schwellenwerte wurden zunächst mit der Fluoreszenz-Minus-Eins-Steuerung (FMO) während der Panel-Optimierung validiert, um das wahre Signal vom Hintergrund zu unterscheiden, insbesondere bei schlechten oder überlappenden Markern. Diese Schwellenwerte wurden anschließend in allen Experimenten mit denselben Färbepanel- und Zytometereinstellungen wiederverwendet, um die Konsistenz zu gewährleisten. Isotypkontrollen wurden einbezogen, um eine mögliche unspezifische Bindung zu überwachen, insbesondere für intrazelluläre Marker, wurden aber nicht für Gating-Entscheidungen verwendet.

Identifizierung von Mikrogliazellen
Die Leben/Tot-Zell-Gating-Strategie (Amcyan) schloss tote Zellen erfolgreich aus. Die Gating-Strategie isolierte effektiv Mikroglia-Zellpopulationen basierend auf der Expression von CD45 (AF700) und CD11b (FITC). Die Parameter Vorwärtsstreuung (FSC) und Seitenstreuung (SSC) wurden optimiert (FSC = 300, SSC = 200), um die Mikroglia-Population innerhalb des Punktdiagramms zu zentrieren (Abbildung 5).

Phänotypisierung von Mikrogliazellen
Die Dot-Plot-Analyse ermöglichte die Identifizierung von Mikroglia-Subpopulationen auf der Grundlage der unterschiedlichen Expression von Oberflächen- und intrazellulären Markern. Unter Verwendung spezifischer Gating-Strategien in der FlowJo-Software wurde eine Untergruppe von Mikrogliazellen identifiziert, die CD80 (Super Bright 436), CD86 (PE) und iNOS (PE-eFluor 610) exprimieren (Abbildung 6A). Double Gating wurde auch verwendet, um Untergruppen zu definieren, die CD206 (APC) und Arg1 (PE-Cy7) exprimieren (siehe Abbildung 6B). Weitere Populationen wurden durch die Koexpression von CD86 (PE) und CD64 (PerCP-eFluor 710) sowie CD163 (Super Bright 600) und CD206 (APC) charakterisiert (Abbildung 6C,D). Diese phänotypischen Profile spiegeln die markerdefinierte Heterogenität innerhalb der Mikroglia-Population wider und demonstrieren die Fähigkeit dieses Protokolls, mehrere transkriptionell und immunologisch unterschiedliche Untergruppen zu unterscheiden, ohne auf feste funktionelle Zustände zu schließen.

Mikroglia-Einzelzellanalyse
Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) wurde verwendet, um die zelluläre Heterogenität zu visualisieren und die Mikrogliazellcluster unter anderen Gehirnzelltypen zu identifizieren. Jeder Punkt steht für eine einzelne Zelle, und der Cluster ist basierend auf der transkriptionellen Ähnlichkeit farbcodiert (Abbildung 2).

Innerhalb des Mikroglia-Clusters wurde eine differentielle Expressionsanalyse durchgeführt, um Gene zu identifizieren, die unter experimentellen Bedingungen moduliert wurden. Gene mit einem adjustierten P-Wert ≤ 0,05 galten als differentiell exprimiert.

Es wurde ein Vulkandiagramm erstellt, um diese unterschiedlich exprimierten Gene von Mikrogliazellen zu visualisieren, wobei diejenigen mit hoher Faltungsänderung und statistischer Signifikanz hervorgehoben wurden (Abbildung 4).

Um diese Einzelzellergebnisse mit den Daten der Durchflusszytometrie zu vergleichen, wurde die Expression der Mikroglia-Marker CD45 und CD11b (Ptprc und Itgam) untersucht. Ein UMAP zeigt ihre Expression innerhalb verschiedener Zellpopulationen (Abbildung 7).

Schließlich wurde die Expression ausgewählter immunbezogener Marker untersucht, um die transkriptionelle Heterogenität zwischen Mikrogliazellen zu charakterisieren. Ein Violin-Diagramm zeigt die Expression von Genen wie CD80 und NOS- sowie von Mrc1, Arg1, Fcgr1 und CD163 auf Einzelzellebene (Abbildung 8). Diese Markerexpressionsmuster ermöglichen einen Vergleich mit durchflusszytometrischer Profilerstellung und verdeutlichen die molekulare Vielfalt von Mikroglia-Untergruppen unter experimentellen Bedingungen.

Abbildung 1: Qualitätskontrolle von Einzelzell-Transkriptomdaten. (A) Verteilung des mitochondrialen RNA-Gehalts über die Zellen. Zellen mit >30% mitochondrialer RNA wurden ausgeschlossen, um potenziell gestresste oder sterbende Zellen zu entfernen. (B) Zellen mit einem log10GenesPerUMI-> 0,75 wurden herausgefiltert, um ein konsistentes Gen-zu-UMI-Verhältnis zu gewährleisten und das Rauschen von Bibliotheken mit geringer Komplexität zu reduzieren. (C) Zellen mit weniger als 500 nachgewiesenen Transkripten (nUMI) oder mehr als 300 nachgewiesenen Genen (nGENE) wurden ebenfalls ausgeschlossen, um Zellen von schlechter Qualität oder mehrere Zellen zu eliminieren. (D) Korrelationsdiagramm von NUMI und nGen, das den Einfluss von Filterschwellen veranschaulicht. Nachgewiesene Dubletten wurden entfernt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: UMAP-Visualisierung von Einzelzell-Transkriptomen. UMAP-Diagramm, das die Verteilung einzelner Zellen auf der Grundlage von transkriptomischen Profilen von zwei einzelnen Tieren zeigt. Jeder Punkt stellt eine Zelle dar, die nach Clusteridentität farbcodiert ist. Der Mikroglia-Zellcluster wird unter anderen Zellpopulationen identifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: ROC-Kurve des Random Forest-Klassifikators, der durch Kreuzvalidierung ausgewertet wurde. Receiver Operating Characteristics (ROC)-Kurve, die die Leistung des Random-Forest-Modells veranschaulicht, das zur Unterscheidung von Mikroglia von anderen Gehirnzelltypen auf der Grundlage von Genexpressionsprofilen verwendet wird. Das Modell wurde mit einem Satz von ~1000 Zellen mit bekannten Labels trainiert und mittels 10-facher Kreuzvalidierung evaluiert. Unter den fünf getesteten statistischen Modellen (Random Forest, logistische Regression, naive Bayes, Support Vector Machine und Entscheidungsbaum) erreichte das Random Forest-Modell die höchste Klassifizierungsleistung. Die Fläche unter der Kurve (AUC) spiegelt die Genauigkeit des Modells wider. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Differentielle Genexpressionsanalyse in Mikrogliazellen. Das Vulkandiagramm stellt die log2-fache Veränderung gegenüber dem adjustierten P-Wert für Gene dar, die in Mikroglia zwischen den beiden Versuchsgruppen unterschiedlich exprimiert werden (Kontrolle vs. Kleinhirn-Hirn-Verletzung). Hochregulierte Gene werden in der interessierenden Gruppe stärker exprimiert (Ident.1), und herunterregulierte Gene zeigen eine verminderte Expression im Vergleich zur Referenzgruppe (Ident.2). Schlüssel, signifikant unterschiedlich exprimierte Gene werden markiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Gating-Strategie zur Identifizierung von Mikroglia mittels Durchflusszytometrie. (A) Gating-Strategie, angewendet auf Kleinhirnzellen einer Kontrollmaus am postnatalen Tag 3 (P3). (B) Singuletts wurden ausgewählt, um Dubletten auszuschließen. (C) Lebensfähige Zellen wurden unter Verwendung eines Lebensfähigkeitsfarbstoffs identifiziert; Ereignisse mit niedrigem FSC-A-Wert wurden ausgeschlossen, um Trümmer zu entfernen und die Analyse intakter Zellen sicherzustellen. (D) Mikroglia wurden als CD45⁺ und CD11b⁺ mit zwei unterschiedlichen Populationen identifiziert: CD45^{niedrig-CD11b int} für ruhende Mikroglia und CD45^int -CD11b^hoch für aktivierte Mikroglia. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6. Charakterisierung von Mikroglia-Marker-Expressionsprofilen mittels Durchflusszytometrie. (A) Sequentielles Gating von CD45⁺ CD11b⁺ Zellen basierend auf CD80-, CD86- und iNOS-Expression. (B) Identifizierung einer Teilmenge, die CD206 exprimiert, gefolgt von einem Gating basierend auf der Arg1-Expression. (C) Identifizierung einer Untergruppe, die CD86 exprimiert, gefolgt von einem Gating basierend auf der CD64-Expression. (D) Identifizierung einer Untergruppe, die CD163 exprimiert, gefolgt von einem Gating basierend auf der CD206-Expression. Diese Gating-Strategien veranschaulichen die phänotypische Heterogenität von Mikroglia-Populationen basierend auf der Expression von Oberflächen- und intrazellulären Markern. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 7: Bestätigung der Mikroglia-Identität anhand der Itgam - und Ptprc-Expression in Einzelzell-RNA-Sequenzierungsdaten. UMAP zeigt die Transkriptionslandschaft von Kleinhirnzellen bei P15, wobei die Genexpression von Itgam und Ptprc über Cluster hinweg überlagert ist. Die Co-Expression dieser kanonischen myeloischen Marker unterstützt die Identifizierung von Mikroglia-Populationen und stimmt mit Markern überein, die in der Durchflusszytometrie verwendet werden, was eine Kreuzvalidierung zwischen transkriptomischen und Proteinanalysen ermöglicht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 8: Expressionsprofile ausgewählter immunverwandter Gene in Mikrogliazellen, die durch Einzelzell-RNA-Sequenzierung identifiziert wurden. Violin-Plots zeigen die Verteilung der Genexpression für CD80, NOS2, Mrc1, Arg1, Fcgr1 und CD163 über einzelne Mikrogliazellen. Diese Marker werden häufig mit immunbezogenen Prozessen in Verbindung gebracht und verdeutlichen die transkriptionelle Heterogenität, die innerhalb der Mikrogliapopulation beobachtet wird. Es werden Daten sowohl für Kontroll- als auch für Kleinhirnhirnverletzungen (CBI) gezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Zusammensetzung der Lösungen, die für die Isolierung und Färbung von Nervenzellen verwendet werden. Diese Tabelle enthält eine detaillierte Zusammensetzung der Lösungen, die für die Zellisolierung und -färbung erforderlich sind, einschließlich ihrer jeweiligen Konzentrationen und Komponenten. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 2: Antikörper-Mix-Konzentrationen für die extrazelluläre Färbung. In dieser Tabelle sind die Konzentrationen von Antikörpern und lebender/toter Lösung, die für die extrazelluläre Färbung verwendet werden, aufgeführt, wobei die erforderlichen Volumina und Verdünnungen für jeden Antikörper in der Färbemischung für eine Probe angegeben sind. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 3: Antikörper-Mix-Konzentrationen für die intrazelluläre Färbung. In dieser Tabelle sind die Konzentrationen der Antikörper aufgeführt, die für die intrazelluläre Färbung verwendet werden, wobei die erforderlichen Volumina und Verdünnungen für jeden Antikörper in der Färbemischung für eine Probe angegeben sind. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Discussion

Diese Studie stellt ein detailliertes und optimiertes Protokoll vor, das Durchflusszytometrie und Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) für die Isolierung und Charakterisierung von Mikrogliazellen während der frühen postnatalen Gehirnentwicklung kombiniert. Während die Durchflusszytometrie nach wie vor eine kostengünstige und zugängliche Technik ist, bietet ihre Integration mit der Einzelzell-Transkriptomik komplementäre Erkenntnisse, indem sie die Markerexpression auf Proteinebene mit Transkriptionsprofilen auf Genebene verknüpft. Das Protokoll befasst sich mit den technischen Herausforderungen, die für unreifes Hirngewebe spezifisch sind, einschließlich effizienter Dissoziation, Entfernung von Ablagerungen und Myelin sowie optimierter Immunfärbestrategien, um die Reproduzierbarkeit und Zuverlässigkeit bei der Analyse von Mikrogliapopulationen über wichtige Entwicklungszeitpunkte hinweg zu gewährleisten.

Die Durchflusszytometrie wurde verwendet, um Mikroglia-Untergruppen basierend auf der Expression ausgewählter oberflächen- und intrazellulärer Marker zu identifizieren. Anstatt auf funktionelle Zustände zu schließen, wurden die Teilmengen anhand ihrer Markerexpressionsprofile unterschieden, wie z. B. CD80⁺/CD86⁺/iNOS⁺ ; CD206⁺/Arg1⁺ ; CD86⁺/CD64⁺ oder CD163⁺/CD206⁺ Phänotypen. Diese markerdefinierten Populationen spiegeln die molekulare Heterogenität innerhalb des Mikroglia-Kompartiments wider und bieten einen praktischen Ansatz für die Hochdurchsatz-Charakterisierung. Auch wenn diese auf Oberflächenmarkern basierenden Klassifikationen nicht die volle Komplexität der Mikroglia-Vielfalt erfassen, bleiben sie informativ, insbesondere in Kontexten, in denen hochdimensionale molekulare Werkzeuge möglicherweise nicht verfügbar sind. Binäre Klassifikationen wie das M1/M2-Paradigma wurden bewusst vermieden, um der spektrumartigen, kontextabhängigen Natur von Mikroglia-Phänotypen Rechnung zu tragen, wie sie in der neueren Literatur beschrieben^{wird 12}.

Diese Beobachtungen stimmen mit früheren Studien überein, die die Rolle von Mikroglia sowohl bei der normalen Gehirnreifung als auch bei der Reaktion auf Umwelt- oder pathologische Reize hervorheben^13,14. Die Fähigkeit, die Heterogenität der Mikroglia zu differenzieren, bietet wertvolle Einblicke in die Frage, wie die Polarisation von Mikrogliazellen zu neurologischen Entwicklungsstörungen beitragen kann^15,16.

Obwohl die Einzelzell-RNA-Sequenzierung eine höhere Auflösung bietet und die Identifizierung von transkriptionell unterschiedlichen Mikrogliazell-Subpopulationen ermöglicht, schränken ihre Kosten und ihre analytische Komplexität ihre Zugänglichkeit ein. Im aktuellen Datensatz, der am 15. postnatalen Tag nach einer perinatalen Verletzung erhoben wurde, ist der Höhepunkt der Entzündungsreaktion weitgehend aufgelöst, was zu einer geringen Anzahl aktivierter Mikroglia führt. Folglich konnten Techniken zur Dimensionalitätsreduktion wie UMAP keine gut getrennten Mikroglia-Subcluster wiederherstellen, und die Transkriptionsanalyse auf Clusterebene wurde in diesem Protokollmanuskript nicht berücksichtigt.

Eine wesentliche Innovation dieses Protokolls ist die Optimierung für die Isolierung und Charakterisierung von Mikrogliazellen aus dem Kleinhirn während der frühen postnatalen Stadien (P3 bis P30). Diese Region und der altersspezifische Kontext stellen besondere Herausforderungen dar, darunter eine geringe Zellausbeute, ein geringer Myelingehalt und eine erhöhte Gewebefragilität. Um diesen Einschränkungen gerecht zu werden, integriert das Protokoll einen angepassten Dissoziations-Workflow, eine effiziente Entfernung von Ablagerungen und Myelin sowie sorgfältig abgestimmte Immunfärbebedingungen, die für kleinvolumiges Kleinhirngewebe geeignet sind. Trotz der zunehmenden Anerkennung von Kleinhirnmikroglia als funktionell und transkriptionell von denen in anderen Hirnregionen getrennt, bleiben detaillierte Protokolle für ihre Isolierung und Analyse begrenzt. Die derzeitige Methode bietet einen zuverlässigen und zugänglichen Arbeitsablauf, der insbesondere auf Entwicklungsstudien von Kleinhirnmikroglia zugeschnitten ist.

Das Hauptziel dieses Manuskripts ist es, einen reproduzierbaren und anpassungsfähigen methodischen Rahmen zu bieten, anstatt über spezifische biologische Entdeckungen zu berichten. Der Workflow eignet sich für die Anpassung an andere Entwicklungsstadien oder experimentelle Modelle, in denen transkriptionell unterschiedliche Mikrogliazustände stärker ausgeprägt sein können. In diesem Zusammenhang bleibt die Durchflusszytometrie ein wertvolles Instrument, insbesondere wenn sie mit komplementären Assays integriert wird.

Eine der wichtigsten Stärken dieses Protokolls ist seine Anpassungsfähigkeit über verschiedene Entwicklungsstadien hinweg, die vom postnatalen Tag 3 (P3) bis zum postnatalen Tag 30 (P30) reichen. Dies ermöglicht eine Längsschnittanalyse des Mikroglia-Phänotyps mit fortschreitender Gehirnreifung. Der kombinierte Einsatz von Durchflusszytometrie und scRNA-seq ermöglicht es, nicht nur Oberflächenmarker, sondern auch intrazelluläre Signalwege und Transkriptionsfaktoren zu untersuchen, die an Mikrogliazellen beteiligt sind.

Nichtsdestotrotz kann der enzymatische Aufschluss die Expression einiger Oberflächenmarker beeinflussen, was eine sorgfältige Optimierung der Verdauungsbedingungen für spezifische experimentelle Ziele erforderlich macht^17,18. Darüber hinaus liefern weder die Durchflusszytometrie noch die Einzelzellsequenzierung Daten auf Populationsebene, die die räumlichen und funktionellen Nuancen der Interaktionen von Mikrogliazellen in ihrer natürlichen Umgebung möglicherweise nicht vollständig erfassen. Die Einbeziehung von Einzelzell-Raumtechniken könnte dazu beitragen, diese Einschränkung zu überwinden, indem der räumliche Kontext von Mikrogliazellen erhalten bleibt. Zukünftige Studien, die dieses Protokoll mit bildgebenden Verfahren wie Immunhistochemie, In-vivo-Bildgebung, Western Blot oder räumlicher Einzelzell-Transkriptomik kombinieren, könnten ergänzende Einblicke in die Dynamik von Mikrogliazellen bieten.

Diese Methode eröffnet neue Wege, um zu untersuchen, wie frühe Beleidigungen wie Entzündungen, Hypoxie oder Umweltstressoren die Phänotypen von Mikrogliazellen beeinflussen und zu langfristigen neurologischen Entwicklungsergebnissen beitragen. Durch die präzise und zuverlässige Charakterisierung von Aktivierungszuständen von Mikrogliazellen erleichtert es die Identifizierung therapeutischer Ziele zur Modulation von Mikrogliareaktionen im frühen Leben, mit dem Ziel, neurologische Entwicklungsstörungen zu verhindern oder zu mildern.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Protokoll einen robusten und zugänglichen Rahmen für die Untersuchung der Zelldiversität von Mikroglia während der frühen Gehirnentwicklung bietet. Die Kombination von Durchflusszytometrie und Einzelzell-RNA-Sequenzierung ermöglicht eine flexible Anwendung in verschiedenen Entwicklungsstadien und experimentellen Modellen und ermöglicht eine tiefere Erforschung der Mikroglia-Biologie sowohl in physiologischen als auch in pathologischen Kontexten.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
140 &Mikro; M Metallgitter-Filter	Sigma-Aldrich	Nr. S3895
15 mL Röhrchen	Sarstedt	62.554.205
5 mL Röhrchen	Sarstedt	55.526.006
96-Well-Platte mit konischem Boden	Sarstedt	82.1583.001
Arginase 1 - Konjugat Pecy7 - Klon : A1exF5	Thermo Fisher Scientific	25-3697-82
Tischstabile fluoreszierende Reagenzien	Invitrogen	Nr. A49905
CD11b - Konjugat Fitc - Klon : M1/70	BD Pharmingen	553310
CD163 - Konjugat SB600 - Klon : TNKUPJ	Thermo Fisher Scientific	63-1631-82
CD206 - Konjugierter APC - Klon : C068C2	BioLegende	141708
CD45 - Konjugat A700 - Klon : 30-F11	BD Pharmingen	560510
CD64 - Konjugat  PerCP-eF710 - Klon : X54-5/7.1	Thermo Fisher Scientific	46-0641-82
CD80 - Konjugat SB436 - Klon : 16-10A1	Thermo Fisher Scientific	62-0801-82
CD86 - Konjugiertes Pe - Klon : GL-1	BioLegende	105008
Kollagenase D	Sigma– Aldrich	11088866001
DNase I	Sigma– Aldrich	10104159001
Fötales Rinderserum (FBS)	Sigma– Aldrich	Nr. F1051
HBSS (Hank'sche ausgewogene Salzlösung) 10x	Wisent Bioproducts	Artikel-Nr.: 311506CL
Hämozytometer	VWR International	82030-470
HEPES	Wisent Bioproducts	330.050.EL
iNOS - Konjugat PE- eF610 - Klon : CXNFT	Thermo Fisher Scientific	61-5920-82
Kcl	Thermo Fisher Scientific	Nr. BP366-500
KH2PO4	Thermo Fisher Scientific	Nr. BP362-500
Lebende/tote Amcyan	Thermo Fisher Scientific	Nr. L34957
Mikroglia-Zellkulturmedien	Lebenstechnologien	Nr. A12475-01
Na2HPO4	Thermo Fisher Scientific	Nr. BP332-500
NaCl	Thermo Fisher Scientific	Nr. BP358-212
Paraformaldehyd	Sigma– Aldrich	Nr. P6148
Anti-Maus für Ratte CD16/CD32	BD Biowissenschaften	553142
Saponin	Sigma– Aldrich	Nr. S7900
scRNAseq-Bibliotheken	10-fache Genomik	1000121
Kolloidales Medium auf Siliziumdioxidbasis	Thermo Fisher Scientific	45001747
Natriumazid	Thermo Fisher Scientific	Nr. BP922I-500
Trypan-Blau	Gibco	1525006