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Methodenartikel

Durch Elektroschock induzierte Anfallsaktivität bei Drosophila-Larven

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DOI:

10.3791/68431

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6. Juni 2025

 ,  , 
1Division of Neuroscience, School of Biological Sciences, Faculty of Biology, Medicine and Health, University of Manchester, Manchester Academic Health Science Centre

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Drosophila-Larven zur Identifizierung einzigartiger Antiepileptika zur Behandlung von Epilepsie.

Zusammenfassung

Epilepsie stellt eine erhebliche gesundheitliche Belastung dar, die durch eine hohe Anzahl von Personen, die medikamentenrefraktär sind, noch verschärft wird. Während einige medikamentenrefraktäre Patienten auf nicht-medikamentöse Behandlungen ansprechen (z. B. Vagusnervstimulation, ketogene Diät usw.), ist der letzte Ausweg für viele eine schwierige und teure Operation zur Linderung von Anfällen. Es ist zwar allgemein anerkannt, dass Medikamente gegen Krampfanfälle mit einem breiteren Spektrum an Zielmolekülen erforderlich sind, aber die Hürde auf dem Weg dorthin ist die Identifizierung neuartiger Wirkstoffziele. Genetisch manipulierbare Modelltiere sind in dieser Hinsicht vielversprechend. Die Fruchtfliege, Drosophila melanogaster, ist zu einem leistungsfähigen Modell geworden, um die mechanistischen Grundlagen von Anfällen zu untersuchen und sie besser behandeln zu können. Viele identifizierte Fliegenmutationen führen dazu, dass Larven und adulte Tiere als Reaktion auf starke Stimulation (elektrisch, mechanisch und/oder thermisch) eine anfallsähnliche Aktivität zeigen. Viele dieser Mutationen befinden sich in Genen, die homolog zu denen sind, die zu genetischen Epilepsien beim Menschen beitragen (z. B. der spannungsgesteuerte Na+ -Kanal). Es ist nun auch möglich, ein Fliegen-Gen durch ein humanes Äquivalent zu ersetzen, das zusätzlich eine krankheitsbedingte Mutation trägt. So ist die bescheidene Fliege zu einem Avatar geworden, um menschliche Krankheiten zu modellieren. Diese Studie beschreibt eine geeignete Methode, um Drosophila-Larven für Wirkstoff-Screenings mit niedrigem bis mittlerem Durchsatz zu verwenden, um einzigartige Verbindungen und ihre Ziele zu identifizieren, die ein Antiepileptikum haben.

Einleitung

Epilepsie ist nach wie vor eine erhebliche gesundheitliche Belastung, von der weltweit etwa 1 % der Bevölkerung betroffen ist. Obwohl es mittlerweile über 30 Antiepileptika (ASMs) für die klinische Behandlung gibt, bleibt etwa ein Drittel der Menschen mit Epilepsie medikamentenrefraktär, was bedeutet, dass sie nicht gut auf eine medikamentöse Behandlung ansprechen 1,2. Die verfügbaren Medikamente sind ebenfalls nur palliativ und verhindern als solche weder die Epileptogenese noch bieten sie eine Heilung3. Daher besteht ein dringender Bedarf, bessere Epilepsiebehandlungen zu identifizieren. Ein Hindernis auf dem Weg zur Entwicklung wirksamerer Behandlungen ist die Identifizierung neuartiger Wirkstoffziele. In der Tat wirken sich fast alle aktuellen ASMs auf ähnliche Ziele aus: Ionenkanäle, einschließlich des spannungsgesteuerten Natriumkanals (Nav), und inhibitorische Neurotransmission, die durch γ-Aminobuttersäure (GABA) vermittelt wird4,5. Es ist allgemein anerkannt, dass die weitere Anwendung traditioneller Methoden der Arzneimittelentwicklung dieses Szenario wahrscheinlich nicht radikal ändern wird.

Labormodelltiere, einschließlich, aber nicht beschränkt auf die Fruchtfliege Drosophila melanogaster und der Zebrafisch Danio rerio, sind nützlich für die Identifizierung neuartiger ASMs 6,7,8. Tatsächlich liefert eine PubMed-Suche nach "Drosophila + Anfall" 342 Ergebnisse, während die gleiche Suche nach Zebrafischen 578 Ergebnisse liefert (beide Suchen wurden am 29. Januar 2025 durchgeführt). Obwohl die Anzahl ähnlicher Studien an Mäusen (~15.000) in den Schatten gestellt wird, wächst die Zahl der Studien mit Modellsystemen weiter. Diese Studien sind aufgrund der mechanistischen Konservierung der ZNS-Funktion über Stämme hinweg möglich. Darüber hinaus werden induzierte Anfälle bei Fliegen und Fischen effektiv mit klinisch eingesetzten ASMs behandelt, was zeigt, dass die Nuancen des Anfallsverhaltens zwar äußerlich unterschiedlich erscheinen mögen, die zugrunde liegenden Mechanismen jedoch viel gemeinsam haben 7,9,10.

Die Fruchtfliege, Drosophila, hat viele bahnbrechende Beiträge zum Verständnis der menschlichen Biologie geleistet. In Bezug auf Epilepsie bietet dieses Modellsystem einen beispiellosen genetischen Werkzeugkasten in Kombination mit identifizierbaren und experimentell zugänglichen Neuronen7. Darüber hinaus wurden nun die Konnektome sowohl für das larvale als auch für das adulte ZNS veröffentlicht und zahlreiche zellspezifische genetische Treiberlinien identifiziert 11,12. Bezeichnenderweise wurde eine Klasse von Mutationen identifiziert, bei der erwachsene Fliegen auf starke mechanische Stimulation mit einem Verlust der Haltung und anfallsähnlicher Aktivität (z. B. Flügelsummen, Zittern der Beine usw.) reagieren. Diese Klasse von Mutationen wurde als "bang-sensitiv" bezeichnet13,14,15,16. Seitdem wurde eine zweite Klasse von Anfallsmutationen identifiziert, die auf erhöhte Temperatur reagiert und die Fieberkrämpfe beim Menschen widerspiegelt17,18. Allerdings ist die experimentelle Lenkbarkeit adulter Fliegen im Vergleich zum Larvenstadium desselben Insektenmodells etwas reduziert. Zum Beispiel kann es schwierig sein, erwachsene Fliegen mit Medikamenten zu füttern, und invasivere Techniken wie Elektrophysiologie und Optogenetik können eine größere Herausforderung darstellen. Im Gegensatz dazu frisst die Drosophila-Larve ständig, um ihr Körpervolumen in nur 5 Tagen um das ~100-fache zu vergrößern und so die Verpuppung zu ermöglichen. Daher können wir uns auf eine adäquate Medikamentenfütterung im Larvenstadium verlassen. Die Embryogenese ist gut dokumentiert und kann genau inszeniert werden, was wiederum wichtige Meilensteine in der ZNS-Entwicklung identifiziert hat, einschließlich der ersten Erfassung neuronaler elektrischer Eigenschaften bis hin zur Schaltkreisbildung19. Nach dem Schlüpfen durchläuft eine Larve 3 Häutungen (oder Instars), bis sie am 5. Tag zum "Wandern" wird, woraufhin sie das Futter verlässt, um einen sicheren Ort zum Verpuppen zu finden. Nach ~100 h Verpuppung schlüpft eine adulte Fliege mit einem neuen Körper und ZNS (Abbildung 1).

Techniken zur Induktion von Anfällen bei Erwachsenen sind für Larvenstadien nicht gut geeignet. Den Larven fehlen sensorische Haare, deren synchronisierte Aktivierung bei mechanischer Stimulation zu einem Anfall führen kann. Um diese Schwierigkeiten zu überwinden, wurde daher eine Elektroschocktechnik entwickelt, um Anfälle im Wanderlarvenstadium auszulösen. Die anschließende vergleichende Analyse von Anfallsinduktionstechniken sowohl bei Larven als auch bei Erwachsenen zeigt, dass der Elektroschock der Larven weitaus weniger vom Mutationstyp abhängt (z. B. bang-sensitiv vs. Temperatur). Daher schlagen wir vor, dass diese Technik die bevorzugte Methode zum Testen neuartiger Mutationen sein sollte, bei denen die optimale Methode zur Anfallsinduktion unbekannt ist20. Die Elektroschocktechnik der Larven ist einfach, schnell und erfordert nur minimale Ausrüstung. Diese Technik bietet ein effizientes Mittel, um neuartige Verbindungen oder genetische Therapien auf die Wirksamkeit von Krampfanfällen bei einer Reihe von Mutationen zu untersuchen, die die genetische Vielfalt der menschlichen Epilepsie widerspiegeln.

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Protokoll

Die Fruchtfliege, Drosophila melanogaster, wird in dieser Studie verwendet (siehe Abschnitt "Ergebnisse" für Details). Diese Technik eignet sich am besten für wandernde Larven des dritten Stadiums (L3). Das Versuchsprotokoll ist relativ einfach, erfordert aber Übung, um es zu perfektionieren. Unserer Erfahrung nach benötigen neue Studenten etwa 2 Wochen, um den Assay zu beherrschen, und profitieren stark davon, andere, erfahrenere Untersucher zu beobachten, die den Assay in Echtzeit mit einem kameragestützten Dissektionsmikroskop oder ähnlichem durchführen. Die in dieser Studie verwendeten Reagenzien und Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Auswahl der Larven

  1. Entnehmen Sie die Larven von den Seiten von Fliegenfläschchen/-flaschen, die Standardfutter enthalten (5 l Wasser, 390 g Glukose, 360 g Mais, 250 g Hefe, 40 g Agar, 135 ml Nipagin, 15 ml Propionsäure).
  2. Verwenden Sie nur Larven, die sich aktiv bewegen und das Futter an den Seiten des Behälters hochgekrochen sind (wanderndes drittes Stadium, L3). Wählen Sie keine Vorpuppen, die eine stark verminderte Fortbewegung aufweisen.

2. Elektroschock-Verfahren

  1. Entfernen Sie eine einzelne wandernde L3 und geben Sie sie in eine kleine Petrischale aus Kunststoff (die Größe spielt keine Rolle) und waschen Sie sie vorsichtig mit ddH2O, um Speisereste zu entfernen. Hierfür eignet sich ein kleiner (000) Pinsel.
  2. Übertragen Sie die einzeln gewaschene Larve mit einem Pinsel in eine leere Plastikschale (auch hier spielt die Größe keine Rolle). Trocknen Sie die Larve mit einem kleinen Stück Papiertuch, das mit einer Pinzette gehalten wird. Entfernen Sie überschüssiges ddH2O, trocknen Sie die Larven jedoch nicht vollständig ab, um ein Anhaften an der Kunststoffschale zu vermeiden.
  3. Lassen Sie die Larve 30 s lang sich erholen. Dies erleichtert das Platzieren der Elektroschocksonde (siehe unten).
  4. Betrachten Sie die Larven unter einem Dissektionsmikroskop mit geringer Leistung (15-20x), und sobald das normale Krabbelverhalten wieder aufgenommen wird, platzieren Sie die Elektroschocksonde (siehe Schritt 3 für Details und Abbildung 2A) vorsichtig auf der vorderen dorsalen Oberfläche der Larve über der ungefähren Position des ZNS (siehe Abbildung 2C).
    HINWEIS: Dieser Schritt ist kritisch, es muss genügend Druck ausgeübt werden, um eine gute Leitfähigkeit zwischen Sondendraht und Nagelhaut zu gewährleisten, aber achten Sie darauf, die Larven nicht zu beschädigen. Zerquetschen Sie die Larve also um etwa ein Drittel bis die Hälfte ihrer Tiefe.
  5. Legen Sie einen 2 s langen Impuls mit konstanter Spannung an, dessen Stärke über eine Titrationskurve vorbestimmt wurde (Abbildung 3). Hier eignet sich jeder isolierte Spannungsstimulator. Die hier verwendete ist in Abbildung 2B dargestellt.
  6. Starten Sie nach dem Stromschlag einen Timer. Als Reaktion auf den Schock beginnen die Larven eine vorübergehende Lähmung, gefolgt von gelegentlichen Krämpfen der Körperwandmuskelaktivität und des Rollverhaltens, die das normale Krabbelverhalten zum Erliegen bringen.
  7. Stoppen Sie den Timer, wenn sich die Larve deutlich von ihrer ursprünglichen Position auf der Schale entfernt hat. Die Anfallsdauer oder Erholungszeit (RT) ist definiert als der Zeitraum zwischen dem Einsetzen des Stimulus und der Wiederaufnahme des normalen Krabbelverhaltens (z. B. eine vollständige peristaltische Vorwärtswelle, die zu einer Vorwärtsbewegung führt).
  8. Reinigen Sie die Sondendrähte am Ende eines jeden Tages sorgfältig, indem Sie sie zuerst mit 100 % Ethanol und dann mit ddH2O abspülen. Untersuchen Sie die Drähte sorgfältig unter Vergrößerung und kratzen Sie bei Bedarf mit einer Pinzette vorsichtig Rückstände von den Drähten ab. Achten Sie dabei sehr darauf, den Abstand zwischen den beiden Drähten nicht zu verändern.

3. Bau der Elektroschocksonde

  1. Es werden 2 x 1 m lange elektrische Drähte benötigt (sollte dünn und flexibel sein, d.h. für ~3 A ausgelegt) sind erforderlich. Lötzen Sie an das Ende jedes Drahtes einen 5 cm langen Wolframdraht (um den Kontakt zu maximieren, wickeln Sie den Wolframdraht vor dem Löten um ein freiliegendes Ende des elektrischen Drahtes). Löten Sie Steckverbindungen (z. B. Bananenstecker) an das andere Ende der Drähte, die für den einfachen Anschluss an den Spannungsstimulator geeignet sind.
  2. Befestigen Sie beide Wolframdrähte so an einem Elektrodenhalter, dass die Drähte parallel zueinander sind (Abbildung 2). Kleine Abschnitte von Glaskapillaren (~2 cm lang) werden verwendet, um die Drähte unter der Sondenverriegelungsschraube an Ort und Stelle zu halten.
  3. Biegen Sie die Drähte mit einer Pinzette so, dass sie bis auf 1-2 mm an der Stelle, an der sie aus dem Drahthalter austreten, herankommen. Das Biegen von Wolframdrähten ist nicht einfach, da die Drähte ein "Gedächtnis" behalten - daher ist Ausdauer erforderlich. Zu den Tipps, die diesen Prozess unterstützen, gehört die Verwendung von elektrischem Isolierband und/oder Blu-Tack (oder ähnlichem Modellierkitt), um die Drähte in der richtigen Ausrichtung/Entfernung zu halten.

4. Kalibrierung der Sonde

  1. Es ist sicherzustellen, dass Bestände an wanderndem L3 eines geeigneten Wildtyps (Negativkontrolle) und einer Anfallsmutante (Positivkontrolle) vorhanden sind. ~100 von jedem werden benötigt.
  2. Bereiten Sie die Larven einzeln vor, wie oben beschrieben.
  3. Verwenden Sie die Sonde, um für jede getestete Spannung eine Reihe von Spannungen an eine ausreichende Anzahl von Larven jedes Genotyps anzulegen. Es wird empfohlen, 0 V, 2 V, 4 V, 6 V, 8 V, 10 V und 12 V für 2 s zwischen 10 und 15 Larven pro Spannung anzulegen. Schocken Sie jede Larve nur einmal.
  4. Messen Sie die Erholungszeit für jede Larve und berechnen Sie den Durchschnitt für jeden Spannungsschritt, der für beide Genotypen angewendet wird.
  5. Zeichnen Sie die Durchschnittswerte in einem Diagramm und passen Sie die Daten mit einer geraden Linie an.
  6. Wählen Sie eine Spannung mit einem deutlichen und signifikanten Unterschied zwischen der Kontroll- und der Anfallsmutante. Achten Sie darauf, keine Spannung zu wählen, die eine zu lange Wiederherstellungszeit erzeugt. Andernfalls leidet die Produktivität aufgrund der langen Wartezeit auf die Wiederherstellung.
    HINWEIS: In dieser Studie wurde häufig eine Stimulationsspannung verwendet, die zu einer Erholungszeit von 50-100 s für Wildtyp und 200-300 s für parabss führt. Beispiele für Kalibrierungskurven sind in Abbildung 3 dargestellt. Es ist wichtig, 0 V zu verwenden, um den Akt des Drückens der Sonde auf die Rückenfläche einer Larve zu berücksichtigen. Dies führt zu einer gewissen Lähmung, die wahrscheinlich ein Abwehrmechanismus der Larve ist.

5. Durchführung von Versuchen

  1. Elektroschocklarve des/der gewünschten Genotyp(en) oder Arzneimittelexposition und Messung der Genesungszeit der Anfälle.
    HINWEIS: Für Testlarven ist ein n = 20 in der Regel ausreichend, aber eine Leistungsberechnung auf der Grundlage einer Pilotanalyse liefert eine genauere n-Zahl.
  2. Führen Sie während jedes Experiments immer eine negative (z. B. einen Wildtyp) und eine positive (z. B. parabss) Kontrolle durch. Die n Zahlen müssen nicht hoch sein; n = 5 ist ausreichend. Dies gibt die Gewissheit, dass der Assay wie erwartet funktioniert hat (z. B. keine Probleme mit der Sonde oder dem Stimulator).
  3. Wenden Sie einen Cut-off (z. B. 300 s) an, um zu lange Erholungszeiten zu vermeiden, und berücksichtigen Sie nur quantifizierbare Anfälle mit Erholungszeiten über 30 s.

6. Drogenscreening

  1. Geben Sie die in einem geeigneten Lösungsmittel gelösten Arzneimittel direkt auf die Lebensmitteloberfläche und lassen Sie sie einwirken (und bei Verwendung von Ethanol Zeit für die Verdunstung des Lösungsmittels). Alternativ kann man ein Medikament (in einem geeigneten Lösungsmittel) zu geschmolzenem Fliegenfutter hinzufügen. Weitere Informationen finden Sie im Abschnitt Ergebnisse.
  2. Um das Arzneimittel zu den geschmolzenen Lebensmitteln hinzuzufügen, schöpfen Sie Lebensmittel aus den Fläschchen, schmelzen Sie sie erneut und fügen Sie beim Abkühlen auf 40 °C das Arzneimittel hinzu, mischen Sie mit einem Vortex-Mixer und geben Sie dann 5 ml geschmolzene Lebensmittel zurück in die Fläschchen und lassen Sie sie vor der Verwendung abkühlen.
  3. Führen Sie einen Konzentrationsgradienten durch, um die optimale Wirkstoffkonzentration zu ermitteln.
    HINWEIS: Ein guter Ausgangspunkt ist die Zugabe von 3 mM Arzneimittellösung entweder direkt auf die Lebensmitteloberfläche (200 μl pro Standard-Drosophila-Fläschchen ) oder die Herstellung einer Konzentration von 3 mM in geschmolzenen Lebensmitteln. Ausgewachsene Weibchen können direkt in dieses Futter Eier legen, oder es können bei Bedarf in ausgewählten Stadien Larven hinzugefügt werden. Das (die) verwendete(n) Lösungsmittel muss (müssen) allein in ausgewählte Durchstechflaschen als Vehikelkontrolle gegeben werden.

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Ergebnisse

Zahlreiche Drosophila-Mutationen zeigen ein verstärktes anfallsähnliches Verhalten 7,20. Die genetische Basis dieser Mutationen ist vielfältig, was die ähnlich unterschiedlichen genetischen Ursachen der menschlichen Epilepsie günstig nachahmt. Drei der am besten untersuchten Drosophila-Mutationen sind parabangsenseless (parabss), julius seizure (jus) und easy-shocked (eas

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Diskussion

Die Elektroschockmethode zur Induktion von Anfällen bei Drosophila-Larven bietet ein einfaches, aber effizientes Screening zur Identifizierung neuartiger Antiepileptika oder genetischer Manipulationen. Da es sich jedoch um einen qualitativen Assay handelt, besteht die Haupteinschränkung darin, dass die Methode kleine Effektgrößen nicht ohne weiteres identifizieren kann. Nichtsdestotrotz bietet der mittlere Durchsatz, der sich für das Screening von bis zu ~5 Verbindungen pro Woch...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden Interessen bestehen.

Danksagungen

Wir danken den vielen Mitarbeitern des Baines-Labors, die diese Technik über viele Jahre hinweg gemeinsam entwickelt haben, und insbesondere Richard Marley, der sich sehr bemüht hat, diese Technik robust und zuverlässig zu machen. Wir danken Anna Munro für das Zeichnen der Larven, das in Abbildung 2 zu sehen ist. Die Arbeit im Baines-Labor, die zur Entwicklung dieser Technik beigetragen hat, wurde großzügig von BBSRC, MRC und dem Wellcome Trust unterstützt. Diese Arbeit wird derzeit durch eine Finanzierung durch einen Wellcome Trust Investigator Award an R.A.B. (Grant 217099/Z/19/Z) unterstützt. Die Entwicklung dieser Technik profitierte auch von der Manchester Fly Facility, die mit Mitteln der Universität und des Wellcome Trust (Grant 087742/Z/08/Z) eingerichtet wurde.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
ElektrodenhalterWorld Precision Instruments Nr. M3301
Kapillaren aus GlasHarvard-InstrumenteGC100F-10
Wolframdraht (99,95 %)Goodfellow Cambridge, Vereinigtes Königreich0,1 mm Durchmesser
SpannungsstimulatorDigitimer Ltd, GroßbritannienDS2A mkII Isolierter Stimulator mit konstanter Spannung

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