Messung von zyklischem Guanosinmonophosphat (cGMP) in festen Geweben mittels Competitive Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)

Zusammenfassung

Dieses Protokoll misst die Konzentrationen von zyklischem Guanosinmonophosphat (cGMP) in festen Geweben unter Verwendung eines kompetitiven Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Das Protokoll beschreibt, wie festes Gewebe verarbeitet wird, ein kompetitiver ELISA durchgeführt wird, Absorptionen in cGMP-Konzentrationen in Picomolen pro Milliliter umgerechnet werden und die Endkonzentrationen als Nanomol cGMP pro Gramm Gewebe berechnet werden.

Zusammenfassung

Ein wichtiger Weg, der zyklisches Guanosinmonophosphat (cGMP) produziert, ist der Stickstoffmonoxid (NO)-cGMP-Weg. Auf diesem Weg stimuliert NO die katalytische Aktivität der löslichen Guanylylcyclase (sGC), die Guanosintriphosphat in cGMP umwandelt. NO ist von Interesse, da es bei Säugetieren unter anderem als Hauptgefäßdilatator, Inhibitor der Thrombozytenaggregation, Mediator der Immunfunktion, Neurotransmitter und zur Verbesserung der Ausdauer bei körperlicher Aktivität wirkt. Die Messung der Häufigkeit von NO in verschiedenen Geweben könnte helfen, seine Funktionen aufzuklären. NO kann jedoch aufgrund seiner weniger als Sekunden langen Halbwertszeit nicht direkt gemessen werden. In der Regel werden die Metaboliten von NO, Nitrat und Nitrit, gemessen, um die Häufigkeit von NO abzuschätzen. Denn diese Moleküle können in vivo durch Redoxreaktionen miteinander umgetauscht werden. Eine weniger gebräuchliche Methode zur Abschätzung der NO-Häufigkeit erfordert die Messung der Konzentration von cGMP, einem Signalmolekül stromabwärts von NO. Dennoch wird die Messung von cGMP in Geweben selten durchgeführt, obwohl sie die Möglichkeit bietet, die Funktionen von NO in Organen besser zu verstehen. Daher besteht ein Bedarf an einem Protokoll zur Messung der cGMP-Konzentrationen in festen Organen und Geweben. In diesem Protokoll wurden gesammelte Schweinegewebe homogenisiert, ein kompetitiver ELISA an verarbeiteten Proben durchgeführt und die Absorptionen in Nanomol cGMP pro Gramm Originalgewebe umgewandelt. Kurz gesagt, dieses Protokoll beschreibt eine vereinfachte Methode zur Messung der cGMP-Konzentrationen in festen Geweben mit dem zyklischen GMP-ELISA-Kit.

Einleitung

Cyclisches Guanosinmonophosphat (cGMP) ist ein Signalmolekül, das in der Lage ist, physiologische Veränderungen über den Stickstoffmonoxid (NO)-cGMP-Signalweg zu induzieren. Im NO-cGMP-Signalweg bindet NO an lösliche Guanylylcyclase, ein zytosolisches Enzym, das Guanosintriphosphat in cGMP umwandelt und dessen katalytische Aktivität erhöht ^1,2. Der anschließende Anstieg der cGMP-Konzentrationen aktiviert Signalwege, die die Vasodilatation^{fördern 3}, was zu einer Senkung des Blutdrucks^{führt 4,5}, der wichtigsten physiologischen Reaktion, die für das Vorhandensein von NO in vivo charakteristisch ist. Darüber hinaus ist bekannt, dass NO die Immunfunktion beeinflusst⁶, die Ausdauer bei körperlicher Aktivität^{verbessert 4} und die Blutgerinnung verhindert, indem es die Blutplättchenaggregation hemmt⁷.

Die direkte Messung von NO wird durch seine weniger als Sekunden lange Halbwertszeit in vivo⁸ in den meisten biologischen Geweben erschwert. Folglich erfordert die Aufklärung der physiologischen Wirkungen von NO eine Methode zur Messung seiner Häufigkeit ex vivo. Daher wird durch brauchbare quantitative Methoden die direkte Messung von NO vermieden. Eine gängige Methode zur Abschätzung der NO-Konzentrationen in Geweben ist die Messung der stabileren Metaboliten von NO: Nitrit und Nitrat 4,5,9,10,11. Die Hauptkomplikation bei der Verwendung von Nitrit- und Nitratkonzentrationen als Maß für die Häufigkeit von NO besteht darin, dass beide Metaboliten auch als NO-Vorläufer bzw. als Speichermolekül dienen. Die Metaboliten von NO, insbesondere Nitrat, sind in bestimmten Lebensmitteln reichlich vorhanden. Daher sind Änderungen der cGMP-Konzentrationen, wobei cGMP dem NO nachgeschaltet ist, nützlich für die Abschätzung der Mengen an aktivem NO, und die Häufigkeit von NO kann ohne die Interferenz von zuvor vorhandenem Nitrit und Nitrat bestimmt werden.

Frühere Forschungen stützten sich auf die Messung der cGMP-Konzentrationen im Plasma¹² und in den Blutplättchen¹³, weniger häufig ist jedoch die Messung der cGMP-Konzentrationen in festen Geweben. Die Möglichkeit, cGMP-Konzentrationen in festen Geweben zu messen, würde die Charakterisierung der NO-Aktivität in bestimmten Organen ermöglichen. Ziel war es, eine vereinfachte Methode zur Messung von cGMP in festen Geweben mittels kompetitivem ELISA zu identifizieren. Ein Vorteil der Verwendung von kompetitivem ELISA besteht darin, dass für die Verwendung von Geräten erforderlich ist, die in den meisten Labors zu finden sind, die sich für NO interessieren, wie z. B. ein Mikroplatten-Reader, der häufig für andere Zwecke verwendet wird. Im Vergleich dazu erfordern einige andere Messverfahren Geräte, die bei Experimenten, die sich auf NO konzentrieren, selten verwendet werden, wie z. B. Mikroskope^{14, 15}, einen Szintillationszähler¹⁶ oder einen Laser¹⁷. Neben der Zugänglichkeit ist die Messung von cGMP mit kompetitivem ELISA auch von großer Bedeutung. cGMP-Konzentrationen können bis zu 0,1 Pikosol (pmol) von cGMP/^{mL 18} nachgewiesen werden. Mit geringfügigen Änderungen am cGMP-ELISA-Kit (Table of Materials) Protokoll¹⁸ wurde eine Methode zur Messung von cGMP in festen Geweben unter Verwendung von kompetitivem ELISA etabliert.

Protokoll

Alle tierexperimentellen Eingriffe wurden in Übereinstimmung mit dem vom NIDDK Animal Care and Use Committee genehmigten Tierstudienprotokoll der Molecular Medicine Branch (ASP K049-MMB-23) durchgeführt. Die Gewebeentnahme erfolgte nach den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee des MedStar Health Research Institute (Protokollnummer: 2006001373 2020-017). In der Studie wurden junge erwachsene Yorkshire-Kreuzungsschweine (zwei männliche und zwei weibliche Schweine) verwendet, die 3 Monate alt sind und zwischen 30 und 35 kg wiegen. Abbildung 1 zeigt ein Schema, das die Schritte des cGMP-ELISA-Kit-Protokolls zeigt. Die in der Studie verwendeten Reagenzien und Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

Abbildung 1: Schaltplan des Protokolls. Ein Schema, das die Schritte des cGMP-ELISA-Kit-Protokolls veranschaulicht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

1. Vorbereitung der Gewebeprobe

HINWEIS: Das Gewebe wurde vor der Entnahme mit einer Heparin-Natriumlösung perfundiert und dann vor der Verwendung bei -80 °C gelagert. Siehe Park et ^al.19 für Details zur Entnahme der Gewebeproben.

1. Verarbeitung von Gewebeproben
   1. Kühlen Sie ein Taschentuchpulverisierer, eine Pinzette und einen Löffel 10 Minuten lang auf Trockeneis, bevor Sie mit dem Eingriff beginnen.
   2. Wiegen Sie einen Überschuss an Gewebe ab, da ein Teil bei der Pulverisierung verloren gehen kann (Ausbeute ca. 90%).
      HINWEIS: Früher führte ein Überschuss von 170 mg zu erfolgreichen Ergebnissen. Die Masse kann auf Wunsch erhöht oder verringert werden. Stellen Sie sicher, dass die Gewebemasse ein ausreichendes Probenvolumen für die Schritte der Acetylierung der Gewebeprobe und der Verdünnung der Gewebeprobe ergibt.
   3. Geben Sie das Taschentuch auf Trockeneis in den Pulverisierer.
   4. Schockfrosten Sie das Gewebe mit flüssigem Stickstoff und lassen Sie den flüssigen Stickstoff vollständig verdampfen.
   5. Setze den Deckel des Pulverisierers wieder auf und schlage 15 Mal mit einem Hammer darauf.
      HINWEIS: Wenn der Pulverisierer nicht verfügbar ist oder nicht verwendet werden kann, muss die Probe mit einer Schere oder einem Skalpell in möglichst kleine Stücke geschnitten werden, während sie eingefroren oder zumindest auf Eis gekühlt aufbewahrt wird. Dieser Schritt gewährleistet eine gute Homogenisierung und ist insbesondere bei härteren Geweben von entscheidender Bedeutung.
   6. Tarieren Sie ein Perlhomogenisatorröhrchen und übertragen Sie das pulverisierte Gewebe mit dem gekühlten Löffel und der Pinzette in das Röhrchen.
   7. Notieren Sie die Masse des Gewebes, das dem Bead-Homogenisator-Röhrchen zugesetzt wurde, um die Konzentrationen später von der Molarität in Mol pro Masse umzurechnen. Bewahren Sie die Probe auf Eis auf.
   8. In das Homogenisierungsröhrchen wird ein Volumen in Mikrolitern 0,1 N Salzsäure gegeben, das einem Vielfachen der Gewebemasse in Milligramm entspricht.
      HINWEIS: Geeignete Verdünnungen führen dazu, dass die gemessenen Proben auf die Standardkurve fallen. Diese Verdünnungen werden für verschiedene Gewebetypen durch Versuch und Irrtum gefunden. In früheren Experimenten führte ein Verdünnungsverhältnis von 1:10 für Skelettmuskelgewebe und ein Verdünnungsverhältnis von 1:5 für Lebergewebe zu erfolgreichen Ergebnissen. Zum Vergleich: Bei einer Verdünnung von 100 mg Gewebe würde ein Verdünnungsverhältnis von 1:10 1.000 μl 0,1 N Salzsäure erfordern, und ein Verdünnungsverhältnis von 1:5 würde 500 μl erfordern.
   9. Homogenisieren Sie die Gewebeproben mit einem Kugelmühlen-Homogenisator oder einer vergleichbaren Technik.
      HINWEIS: Kühlen Sie die Probe gelegentlich während der Homogenisierung mit Eis. Wenn kein Kugelmühlen-Homogenisator verfügbar ist, können andere Homogenisierungsmethoden, die Zellen effektiv aufspalten und Gewebehomogenat erzeugen, ersetzt werden, einschließlich der Verwendung eines rotierenden Homogenisators oder eines Ultraschall-Homogenisators.
   10. Die Zentrifuge homogenisiert 30 Minuten lang bei einer Geschwindigkeit von 17.000 x g bei einer Probentemperatur von 4 °C.
       HINWEIS: Unzureichend verdünnte Homogenate des Skelettmuskelgewebes werden überviskos und gelartig. Dies ist am besten nach der Zentrifugation zu sehen.
   11. Der Überstand wird in ein Mikrozentrifugenröhrchen überführt und der Überstand wird 10 min lang bei 17.000 x g bei einer Temperatur von 4 °C zentrifugiert.
   12. Ein Aliquot des Überstands wird in ein Mikrozentrifugenröhrchen überführt und die Probe auf Eis gelegt.
       HINWEIS: Die Acetylierung von 250 μl Überstand führte zu erfolgreichen Ergebnissen. Um das Protokoll zu unterbrechen, frieren Sie diese Proben bei -80 °C ein und lagern Sie sie bis zu 48 Stunden lang. Es wird empfohlen, das Volumen des Überstands für den Acetylierungsprozess am Tag der Acetylierung zu messen.

2. Standard-Vorbereitung

HINWEIS: Bereiten Sie die Standards am Tag der Vorbereitung der ELISA-Mikroplatten vor.

1. Vorbereitung des ELISA-Puffers
   1. Geben Sie aufgetautes 10x ELISA-Pufferkonzentrat in eine Glasflasche mit 90 mL Reinstwasser.
      HINWEIS: Achten Sie darauf, das restliche 10x ELISA-Pufferkonzentrat mit dem vorbereiteten ELISA-Puffer zu spülen und den Puffer wieder in die Glasflasche zu geben. Bei 4 °C bis zu 2 Monate lagern.
2. Standard-Stoffaufbereitung
   1. Geben Sie 1 ml ELISA-Puffer in die Standarddurchstechflasche und schütteln Sie sie, um sie aufzulösen.
      HINWEIS: Bei 4 °C bis zu 6 Wochen lagern.
3. Standardmäßige serielle Verdünnung
   1. Beschriften Sie eine Tube Standard B und neun Tuben Standard 0 bis Standard 8.
   2. Geben Sie 9,9 ml ELISA-Puffer in das mit Standard B gekennzeichnete Röhrchen.
   3. 100 μl des Standardbestands (300 pmol/ml cGMP) in das Standard-B-Röhrchen überführen und gründlich vortexen.
   4. Übertragen Sie 1.000 μl der Lösung im Standard-B-Röhrchen in das Standard-1-Röhrchen.
   5. Geben Sie 500 μl ELISA-Puffer in das Röhrchen mit der Bezeichnung Standard 0 und die Röhrchen mit der Bezeichnung Standard 2 in Standard 8.
   6. Vortexen Sie Standard 1 und übertragen Sie dann 500 μl Lösung von Standard 1 in Standard 2.
   7. Vortex-Standard 2 und übertragen Sie dann 500 μl Lösung von Standard 2 in Standard 3.
   8. Übertragen Sie weiterhin 500 μl von Standard n-1 in Standard n und achten Sie darauf, die Standards nach jeder Zugabe gründlich zu wirbeln.
   9. 500 μl Lösung aus Standard 8 verwerfen.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Wirbelstandards für eine optimale Standardkurve angegeben sind. Die Standards 0 bis 8 liegen bei einem Volumen von 500 μL vor. Lagern Sie die Standards bis zur Verwendung bei 4 °C. Verwenden Sie Standards am Tag ihrer Verdünnung.

3. Acetylierung

HINWEIS: Während der Acetylierungsreaktion wird der 2'-Hydroxylgruppe des cGMP-Moleküls eine Acetylgruppe hinzugefügt, die die Struktur von cGMP verändert und zu einer Erhöhung der Bindungsaffinität der Antikörper führt, wodurch die Empfindlichkeit des Assays um das ~10-fache erhöht wird. In Proben, die mehr als 1,0 pmol/ml cGMP enthalten, können Messungen ohne Acetylierung durchgeführt werden, und dieser Schritt kann entfallen. Die Notwendigkeit einer Acetylierung ist experimentell von Fall zu Fall zu ermitteln.

1. Zubereitung von Kaliumhydroxid
   1. Geben Sie 10 ml Reinstwasser in die Kaliumhydroxidflasche, um eine 4-M-Lösung herzustellen.
      HINWEIS: Verschließen Sie die Flasche nicht, da sich das Kaliumhydroxid auflöst. Monatelang bei Raumtemperatur lagern.
2. Acetylierung von Gewebeproben
   1. Zu einem Aliquot von 250 μl der Probe werden 50 μl (5:1) 4 M Kaliumhydroxid hinzugefügt und kurz darauf 12,5 μl (20:1) Essigsäureanhydrid zugegeben.
   2. 15 s lang wirbeln.
   3. 12,5 μl 4 M Kaliumhydroxid in die Probe geben und kurz vortexen.
   4. Optional: Wenn sich Skelettmuskelproben nach den Acetylierungsschritten verfestigen, zentrifugieren Sie die Proben bei 17.000 x g für 10 min.
3. Acetylierung von Standards
   1. In das mit Standard 0 gekennzeichnete Röhrchen werden 100 μl 4 M Kaliumhydroxid gegeben, unmittelbar gefolgt von 25 μl Essigsäureanhydrid.
   2. Vortex der Standard für 15 s.
   3. 25 μl 4 M Kaliumhydroxid in die Norm geben und kurz vortexen.
   4. Wiederholen Sie diese Schritte für die verbleibenden nummerierten Normen.
      HINWEIS: Alle Proben und Standards für die gleiche Dauer vortexen, um konsistente Ergebnisse zu gewährleisten.

4. Verdünnung der Gewebeprobe

1. Geben Sie vorgegebene Verhältnisse von ELISA-Puffer und einem Aliquot der acetylierten Probe in ein Mikrozentrifugenröhrchen.
   HINWEIS: Für jede Probe sind zwei verschiedene Verdünnungen erforderlich. Verdünnungsverhältnisse, die dazu führen, dass die gemessenen cGMP-Konzentrationen auf die Standardkurve fallen, werden durch Versuch und Irrtum gefunden. Die Verdünnungen müssen für jede Gewebeart experimentell bestimmt werden, damit der Prozentsatz zwischen 20 % und 80 % liegt. In früheren Experimenten, in denen Lebergewebe gemessen wurde, führten Verdünnungsverhältnisse von 1:2 und 1:3 mit den entsprechenden Prozentwerten zu erfolgreichen Ergebnissen. Diese Verhältnisse haben auch zu erfolgreichen Ergebnissen für die Skelettmuskulatur geführt. Schwankungen im Skelettmuskelgewebe können jedoch mehr verdünnte Proben erfordern.
2. Optional: Wenn sich bei der Zugabe der Gewebeprobe zum ELISA-Puffer ein Niederschlag bildet, zentrifugieren Sie die Probe 10 min lang bei 17.000 x g.

5. Vorbereitung der ELISA-Mikroplatte

1. Acetylcholinesterase (AChE) Tracer-Zubereitung
   1. Geben Sie 6 ml ELISA-Puffer in das AChE-Tracer-Fläschchen und schütteln Sie es vorsichtig, bis es sich auflöst.
      HINWEIS: Lagern Sie die Probe bis zu 2 Wochen lang bei 4 °C. Nicht wirbeln.
2. Antiserum-Vorbereitung
   1. Geben Sie 6 ml ELISA-Puffer in die Durchstechflasche mit Antiserum und schütteln Sie es vorsichtig, bis es sich auflöst.
      HINWEIS: Mindestens 4 Wochen bei 4 °C lagern. Nicht wirbeln.
3. Proben- und Standardinkubation
   1. Vortex-Standard 0.
   2. Geben Sie in die ELISA-Mikroplatte 50 μl Aliquots von Standard 0 bis 5 Wells (NSB und B₀; Abbildung 2).
   3. Zu zwei der Bohrlöcher (NSB; Abbildung 2) mit Standard 0 sind 50 μl ELISA-Puffer zuzugeben.
   4. Verwenden Sie eine Pipettenspitze, um 50 μl Aliquots der Standards 1 bis 8 in doppelter Ausführung auf die ELISA-Mikroplatte zu geben. Beginnen Sie mit dem am stärksten verdünnten Standard (Standard 8) und fahren Sie dann mit dem nächst verdünnten Standard fort, bis alle Standards hinzugefügt wurden.
      HINWEIS: Aspirieren und dosieren Sie jeden Standard mehrmals, bevor Sie ihn in eine Vertiefung geben. Vortex-Standards, bevor sie zu Bohrlöchern hinzugefügt werden.
   5. Jede Probe wird vor der Zugabe von 50 μl Aliquoten in die Vertiefungen in doppelter oder dreifacher Ausfertigung vortexiert.
   6. Geben Sie 50 μl AChE-Tracer in jede NSB-, B₀-, Standard- und Probenvertiefung (Abbildung 2).
   7. Geben Sie 50 μl Antiserum in jede Vertiefung B₀, Standard und Probe (Abbildung 2).
   8. Decken Sie die ELISA-Mikroplatte ab und inkubieren Sie sie 18 Stunden lang bei 4 °C.
      HINWEIS: Achten Sie darauf, bei jeder Anweisung einen Vortex zu verwenden, um konsistente Ergebnisse zu erzielen.
4. Vorbereitung des Waschpuffers
   1. Geben Sie in eine Glasflasche 200 mL Reinstwasser und 500 μL 400x Waschpufferkonzentrat.
   2. Geben Sie mit einer Spritze 100 μl Polysorbat 20 in die Glasflasche.
   3. Schütteln Sie die Flasche vorsichtig, um sie zu vermischen.
      HINWEIS: Lagern Sie den Waschpuffer bis zu 2 Monate bei 4 °C. Verdoppeln Sie das Volumen von Reinstwasser, 400x Waschpufferkonzentrat und Polysorbat 20 für eine volle 96-Well-Mikroplatte mit Proben.
   4. Füllen Sie den Waschpuffer vor Gebrauch in eine Waschflasche um.
5. Ellmans Reagenzienvorbereitung
   HINWEIS: Bereiten Sie den Tag der Entwicklung von ELISA-Mikroplatten vor.
   1. Geben Sie in einen lichtgeschützten Behälter 20 mL Reinstwasser.
   2. Verwenden Sie ein Aliquot des Reinstwassers, um das Ellman-Reagenz aufzulösen.
   3. Übertragen Sie das Ellman-Reagenz in den lichtgeschützten Behälter.
   4. Verwenden Sie das Ellman-Reagenz, um die Flasche zu spülen, in der es geliefert wurde.
   5. Übertragen Sie die gesamte Lösung mit einer Pipette zurück in den lichtgeschützten Behälter.
6. ELISA Mikroplatten-Waschung
   1. Entsorgen Sie den Inhalt der ELISA-Mikroplatte, indem Sie sie umdrehen. Stellen Sie sicher, dass die Vertiefungen geleert sind, indem Sie die invertierte ELISA-Mikroplatte auf ein Papiertuch klopfen.
   2. Füllen Sie die Vertiefungen mit Waschpuffer mit der Waschflasche.
   3. Rühren Sie die ELISA-Mikroplatte 5 s lang vorsichtig und schütten Sie dann den Waschpuffer aus und klopfen Sie die restliche Flüssigkeit auf ein Papiertuch ab.
   4. Füllen Sie die ELISA-Mikroplatte mit Waschpuffer, rühren Sie die ELISA-Mikroplatte 30 s lang vorsichtig und entleeren Sie den Inhalt. Wiederholen Sie dies viermal und klopfen Sie die ELISA-Mikroplatte nach jedem Dump auf ein Papiertuch, um die restliche Flüssigkeit zu entfernen.
      HINWEIS: Verhindern Sie ungenaue Absorptionswerte, indem Sie die ELISA-Mikroplatte gründlich waschen.
7. Entwicklung und Ablesung von ELISA-Mikroplatten
   1. Ellmans Reagenz in ein Reservoir überführen.
   2. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 200 μl des Ellman-Reagenzes in die Blind-, NSB-, B₀-, TA-, Standard- und Probenvertiefungen zu aliquotieren.
   3. Geben Sie 5 μl AChE-Tracer in die TA-Vertiefung.
   4. Decken Sie die ELISA-Mikroplatte mit Parafilm ab, legen Sie sie in ein lichtgeschütztes Gefäß und inkubieren Sie sie 60-90 min lang bei Raumtemperatur unter Rühren.
      HINWEIS: Verwenden Sie die B 0-Wells als Indikatoren für die entsprechende Inkubationszeit. Ideale B_{0-Vertiefungen} erscheinen sichtbar gelb, aber nicht dunkel.
   5. Entfernen Sie den Paraffinfilm und lesen Sie die ELISA-Mikroplatte mit einer optischen Dichte von 412 nm ab.
      HINWEIS: B_{0-Vertiefungen} mit einer Extinktion zwischen 0,3 AE und 1,0 AE, wobei die Leerproben abgezogen wurden, zeigen an, dass die ELISA-Mikroplatte ausreichend entwickelt ist.
   6. Wahlfrei: Wenn die ELISA-Mikroplatte unterentwickelt ist, ersetzen Sie den Paraffinfilm und lassen Sie ihn in einem lichtgeschützten Behälter für eine weitere Zeit inkubieren. Wenn die ELISA-Mikroplatte überentwickelt ist, entleeren Sie das Ellman-Reagenz, spülen Sie es einmal mit Waschpuffer aus und entwickeln Sie die ELISA-Mikroplatte mit dem Ellman-Reagenz neu.

Abbildung 2: Mikroplatten-Layout. Ein Beispiel für ein Mikroplatten-Layout für den kompetitiven ELISA. NSB deutet auf eine unspezifische Bindungsvertiefung hin. B₀ gibt eine maximale Bindungsvertiefung an. TA zeigt eine Gesamtaktivität gut an. Std. zeigt eine Standardvertiefung mit der entsprechenden Nummer an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

6. Umwandlung in Konzentration

1. Berechnungen von gebundenen AChE-Tracern
   1. Mitteln Sie die Extinktionen der beiden Rohlinge und subtrahieren Sie den Durchschnitt von den Absorptionen aller Vertiefungen.
      HINWEIS: Verwenden Sie für den Rest der Berechnungen die leer-subtrahierten Absorptionen.
   2. Berechnen Sie die durchschnittlichen Absorptionen der Vertiefungen NSB, B₀ und Blindvertiefungen.
   3. Verwenden Sie die folgende Gleichung, um die korrigierte B₀ -Extinktion zu berechnen:
      
      HINWEIS: Corr. steht für korrigiert, Abs. steht für Absorption und Avg. steht für Durchschnitt. Wenn die durchschnittliche Absorption der Blank-Wells (wobei der Blank-Durchschnitt subtrahiert wird) eine negative Zahl ist, verwenden Sie Null für die Berechnung.
   4. Berechnen Sie das Verhältnis für jeden Standard und jede Stichprobe mit der folgenden Gleichung:
      
   5. Multiplizieren Sie das Verhältnis jeder Stichprobe mit 100, um den Prozentsatz zu berechnen.
      HINWEIS: Proben zwischen 20 % und 80 % fallen auf die Standardkurve.
2. Standard-Kurvenberechnungen
   1. Mittelwert des Verhältnisses der doppelten Vertiefungen jedes Standards (1 bis 8).
   2. Berechnen Sie den Logit des gemittelten Verhältnisses jeder Norm mit der folgenden Gleichung:
      
   3. Unter Verwendung der bekannten Konzentrationen jedes Standards (Tabelle 1) als X-Werte und des Logits jedes Standards als Y-Werte berechnen Sie die Steigung und den Y-Achsenabschnitt.
   4. Berechnen Sie den Bestimmungskoeffizienten, indem Sie den log₁₀ der bekannten cGMP-Standardkonzentrationen als X-Werte und den Logit jedes Standards als Y-Werte verwenden.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Bestimmungskoeffizient nahe 1 liegt.
3. cGMP-Konzentrationsberechnungen in pmol/ml
   1. Berechnen Sie den Logit jeder Probe mit der folgenden Gleichung:
      
   2. Um die cGMP-Konzentration in jeder Probe (in Picomolen cGMP pro Milliliter Probe) zu berechnen, verwenden Sie die folgende Gleichung:
      
      HINWEIS: D.R. steht für Verdünnungsverhältnis. Die Homogenat-D.R.-Summe für Leberproben, die mit einem Verdünnungsverhältnis von Salzsäure im Verhältnis 1:5 verdünnt sind, beträgt 6. Die Puffer-D.R.-Summe für Leberproben, verdünnt mit einem Verdünnungsverhältnis von 1:2 von ELISA-Puffer, beträgt 3. Daher werden die nach Klammern gruppierten Begriffe mit 18 multipliziert.
4. cGMP-Konzentrationsberechnungen in nmol/g
   1. Berechnen Sie die Nanomol cGMP pro Vertiefung mit der folgenden Gleichung:
      
   2. Berechnen Sie die Gramm Gewebe in jeder acetylierten Probe mit der folgenden Gleichung:
      
      HINWEIS: "mg Gewebe" ist die Masse des Gewebes, das dem Homogenisierungsröhrchen zugesetzt wird, in Milligramm. "verwendetes HCl-Volumen" ist das Volumen von 0,1 N Salzsäure, das zur Verdünnung der Proben für die Homogenisierung verwendet wird.
   3. Berechnen Sie die Gramm Gewebe in jeder mit ELISA-Puffer verdünnten Probe anhand der folgenden Gleichung:
      
      HINWEIS: "Volumen der verdünnten Probe" ist das Volumen der mit ELISA-Puffer verdünnten Probe. "250 μL" ist das Volumen der acetylierten Probe. Bei den genannten "Reagenzien" handelt es sich um die Acetylierungsreagenzien 4 M KOH und Essigsäureanhydrid.
   4. Berechnen Sie die Gramm Gewebe pro Vertiefung mit der folgenden Gleichung:
      
      HINWEIS: "Puffervolumen" ist das Volumen des ELISA-Puffers, das verwendet wird, um die Gewebeproben zu verdünnen, bevor die Proben in die Vertiefungen gegeben werden.
   5. Teilen Sie die Nanomol von cGMP pro Vertiefung durch die Gramm Gewebe pro Vertiefung, um die Konzentration von cGMP in nmol/g zu berechnen.

Normnummer	Konzentrationen von cGMP (pmol/ml)
Norm 1	3.0
Norm 2	1.5
Norm 3	0.75
Norm 4	0.375
Norm 5	0.1875
Norm 6	0.09375
Norm 7	0.046875
Norm 8	0.0234375

Tabelle 1: Standardkonzentrationen. Die bekannten Konzentrationen der Standards 1 bis 8.

Ergebnisse

Yorkshire-Hausschweine, die mit Natriumchlorid (0,15 mmol/kg) oder ¹⁵N-markiertem Nitrat (0,15 mmol/kg) behandelt wurden, das einmal täglich an fünf aufeinanderfolgenden Tagen als Bolus in der Nahrung verabreicht wurde, wurden vor der Gewebeentnahme mit einer Heparinnatriumlösung (0,9 % Natriumchlorid) perfundiert; Alle Details zur Sammlung wurden zuvor veröffentlicht¹⁹. Die cGMP-Konzentrationen in den Gesäßmuskeln und in der Leber von vier Yorkshire-Hausschweinen wurden gemäß dem beschriebenen ELISA-Protokoll gemessen. Das Lebergewebe wurde in einem Verdünnungsverhältnis von 1:5 und die Gesäßmuskulatur in einem Verdünnungsverhältnis von 1:10 mit 0,1 N Salzsäure (HCl) verdünnt, um Proteine auszufällen. Die HCl-verdünnten Homogenate wurden acetyliert und dann mit ELISA-Puffer in einem Verdünnungsverhältnis von 1:2 und 1:3 sowohl für Leber- als auch für Gesäßmuskelproben verdünnt. Die cGMP-Konzentrationen wurden wie oben beschrieben gemessen. Die Absorptionen wurden in Picomole cGMP pro Milliliter der vorbereiteten Probe und dann in Nanomol cGMP pro Gramm Gewebe (nmol/g Gewebe) umgewandelt, wie im obigen Protokoll angegeben.

Die in Lebergeweben gemessenen cGMP-Konzentrationen führten unter den oben genannten Bedingungen zu optimalen experimentellen Ergebnissen. Die cGMP-Konzentrationen in der Kontroll- und in der mit Nitrat behandelten Gruppe betragen in der Schweineleber 0,0202 nmol/g ± 0,003 nmol/g Gewebe bzw. 0,0364 nmol/g ± 0,011 nmol/g Gewebe (Abbildung 3). Mehrere Werte bestätigen die Zuverlässigkeit der Ergebnisse. Die Extinktionen der B_0-Wells mit abgezogenen Leerproben, die zwischen 0,466 und 0,475 liegen, liegen im Bereich von 0,3 AE bis 1,0 AE, was eine ausreichende Mikroplattenentwicklung mit dem Ellman-Reagenz bestätigt. Die hohe Qualität der Standardkurve zeigt sich sowohl in der inkrementellen Erhöhung der Extinktionen von Standard 1 auf Standard 8 als auch in der Linearität der Standardkurve, die durch einen Bestimmungskoeffizienten von 0,99 verifiziert wird. Der Prozentsatz für jede gemessene Vertiefung (31,5 %-71,2 %) liegt zwischen 20 % und 80 %, was bestätigt, dass alle Proben auf die Standardkurve fallen. Proben, die die angegebenen Eigenschaften aufweisen, sind für die Interpretation geeignet.

Die im Gesäßmuskelgewebe gemessenen cGMP-Konzentrationen führten zu suboptimalen experimentellen Ergebnissen. Die suboptimale Markierung wird den Ergebnissen des Gesäßmuskels zugewiesen, da die meisten Prozentwerte der Gesäßmuskelvertiefungen (3,69 %-27,3 %) unter 20 % fielen, was darauf hindeutet, dass mehr verdünnte Proben benötigt wurden, damit die Absorptionen auf die Standardkurve fielen. Die cGMP-Konzentrationen in der Kontrollgruppe und in der mit Nitrat behandelten Gruppe im Gesäßmuskel des Schweins betragen 1,22 nmol/g ± 0,49 nmol/g Gewebe bzw. 0,732 nmol/g ± 0,18 nmol/g Gewebe (Grafik nicht gezeigt). Die Proben des Gesäßmuskels teilen sich die Absorptionen der B_{0-Vertiefungen} und -Standards der Leberproben. Die Verwendung dieser suboptimalen Stichproben kann zu falschen Schlussfolgerungen führen. Daher ist die Aufbereitung von stärker verdünnten Proben und eine erneute Messung der cGMP-Konzentrationen erforderlich.

Abbildung 3: cGMP-Konzentration im Lebergewebe. Die durchschnittliche cGMP-Konzentration von Schweineleber, die mit Natriumchlorid (0,15 mmol/kg) oder ¹⁵N-markiertem Nitrat (0,15 mmol/kg) behandelt wurde, in nmol/g Gewebe. n = 4; Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung an. Die Daten wurden mit dem Welch-t-Test analysiert; NS steht für No Significance. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Das Protokoll enthält Anweisungen zu den Schritten, die zur Messung der cGMP-Konzentrationen in festen Geweben mit kompetitivem ELISA erforderlich sind. Schwankungen der cGMP-Konzentrationen können auf Unterschiede in der NO-Häufigkeit im Gewebe hinweisen. Durch die Untersuchung dieser Unterschiede in festen Geweben können Informationen über NO in verschiedenen Organen aufgeklärt werden.

Im Protokoll wurden zunächst Gewebeproben zur Vorbereitung auf den ELISA homogenisiert. Dies begann mit dem Schockfrosten einer Masse festen Gewebes und dem anschließenden Pulverisieren. Das Aufbrechen von Geweben vor dem Homogenisierungsschritt soll dem Bead-Homogenisator helfen, die Zellen zu lysieren. Gewebe wurden in 0,1 N Salzsäure homogenisiert, um Proteine auszufällen, eine Technik, die bei anderen Methoden verwendet wird^20,21. Abschließend wurden die Feststoffe und der Niederschlag durch Zentrifugation von den löslichen Bestandteilen getrennt. Um die Standardkurve zu erstellen, wurde ein Bestand an cGMP (300 pmol cGMP/ml) seriell verdünnt, um acht verschiedene Standards herzustellen. Standards und Proben wurden acetyliert, um die Sensitivität des Assays zu verbessern, indem Konzentrationen von bis zu 0,1 pmol cGMP/ml nachgewiesen wurden. Diese Erhöhung der Empfindlichkeit wird erreicht, wenn die Acetylgruppe eine Bindung mit cGMP eingeht, wodurch die Fähigkeit jedes Antikörpers (im Antiserum vorhanden) verbessert wird, an das acetylierte cGMP¹⁸ zu binden. Die Acetylierung sowohl der Standards als auch der Proben gewährleistet eine einheitliche cGMP-Bindung zwischen den Wells. Der Acetylierungsschritt kann sowohl für Standards als auch für Proben weggelassen werden, wenn erwartet wird, dass die cGMP-Konzentration in den Mikrotiterplatten-Wells 1,0 pmol/mL^{übersteigt 18}.

In Vorbereitung auf die Zugabe von Proben zu den Vertiefungen wurden die Proben weiter mit ELISA-Puffer verdünnt. Die zusätzliche Verdünnung ermöglichte es, dass die Proben auf die Standardkurve fielen und dem Inhalt der NSB-, B₀- und Standard-Wells näher kamen, was zu einer Gleichmäßigkeit führte. Neben den Proben und Standards werden in den Vertiefungen mehrere andere Lösungen gemischt. In den NSB-Vertiefungen wird ELISA-Puffer (mit und ohne Acetylierungsreagenzien) zugegeben, während das Antiserum zurückgehalten wird. Damit soll die Menge an AChE-Tracer (an cGMP gebundene Acetylcholinesterase) bestimmt werden, die an das Maus-IgG bindet, das an der Vertiefung haftet, wenn der spezifische Antikörper, aus dem das Antiserum besteht, vorhanden ist. B_0-Wells enthielten ELISA-Puffer (mit den Acetylierungsreagenzien), AChE-Tracer und Antiserum; daher weisen die B_0-Wells die Bindungsfähigkeit des AChE-Tracers ohne die Konkurrenz von cGMP auf. Nachdem alle Vertiefungen ordnungsgemäß gefüllt sind, wird die Mikroplatte inkubiert und dann gewaschen. Ellmans Reagenz wurde in die Vertiefungen gegeben. Schließlich wurde dem TA ein AChE-Tracer zugesetzt, nachdem Ellmans Reagenz hinzugefügt worden war. Diese Vertiefung stellt die katalytische Aktivität des AChE-Tracers dar, unabhängig davon, wie viel Tracer von den Antikörpern an die Mikroplatte gebunden wurde. Die Mikroplatte wurde bei Raumtemperatur entwickelt, so dass der AChE-Tracer eine kolorimetrische Reaktion katalysieren kann.

Mehrere Schritte im Protokoll können die Ergebnisse des Assays verändern. Bei der Durchführung der folgenden Schritte ist besondere Vorsicht geboten, um optimale Ergebnisse zu erzielen. Die Identifizierung geeigneter Verdünnungen für jeden Gewebetyp für den Homogenisierungsschritt und nach der Acetylierung ist erforderlich, um sicherzustellen, dass die Proben auf die Standardkurve fallen. Bei der Erstellung der Standards sollten die Lösungen vor der Entfernung eines Aliquots oder nach der Zugabe eines Aliquots gründlich vortexed oder gemischt werden. Dieser Schritt ist wichtig, um die erwarteten cGMP-Konzentrationen jedes Standards zu erreichen. Während der Acetylierungsschritte sollten jeder Standard und jede Probe für die gleiche Dauer vortexiert werden, um konsistente Absorptionswerte zu erreichen. Standards und Proben sollten auch unmittelbar vor der Zugabe eines Aliquots in die entsprechende Vertiefung vortext werden. Diese Praxis führt zu genaueren cGMP-Konzentrationen. Das gründliche Waschen der Mikroplatte verbessert auch die Genauigkeit der Absorptionswerte, da es alle ungebundenen AChE-Tracer aus der Vertiefung entfernt. Nach der Zugabe des Ellman-Reagenzes sollte ausreichend Zeit für die Entwicklung der Mikroplatte eingeräumt werden, wobei auf die Farbe und vor allem auf die Absorption der B 0-Vertiefungen geachtet werden sollte. Es ist wichtig zu erkennen, dass die cGMP-Konzentration zwischen Duplikaten oder Dreifachen in Proben mit niedrigeren cGMP-Werten im Vergleich zu Proben mit höheren Konzentrationen stärker variieren kann. Die Messung einer konzentrierteren Probe kann helfen, dieses Problem zu lösen. Um Schwankungen zwischen den Mikrotiterplatten Rechnung zu tragen, sollten Proben desselben Gewebetyps nach Möglichkeit auf derselben Platte gemessen werden. Es wird erwartet, dass die Befolgung dieser Richtlinien die Qualität der resultierenden Daten des Assays verbessert.

Das obige Protokoll kann auf andere weiche, feste Gewebe extrapoliert werden. Die Weiterentwicklung des Unterabschnitts der Gewebevorbereitung des obigen Protokolls kann zu einem Verfahren führen, das für die Verarbeitung von Hartgeweben, einschließlich Knochen, geeignet ist, die aufgrund ihrer Vaskularität von Interesse sein können. Die Weiterentwicklung dieser Technik kann zu einer Methode führen, die geeignet ist, die cGMP-Konzentrationen in einer Vielzahl von festen Geweben zu messen, was zu einer nützlichen Methode führt, um zusätzliche Informationen über die Häufigkeit von NO in praktisch jedem Gewebe zu sammeln. Das oben erwähnte kompetitive ELISA-Protokoll ist zwar eine nützliche Technik zur Messung von cGMP und zur Abschätzung der NO-Häufigkeit, weist jedoch zwei bemerkenswerte Einschränkungen auf: (1) Dieser Assay unterscheidet nicht zwischen cGMP, das durch lösliche Guanylylcyclase synthetisiert wird, und cGMP, das durch partikuläre Guanylylcyclase (pGC) synthetisiert wird. Natriuretische Peptide stimulieren die pGC-Aktivität²² und daher deuten Veränderungen des cGMP über diesen Weg nicht auf Veränderungen der NO-Häufigkeit hin; (2) Zusätzlich beeinflussen Phosphodiesterase-Enzyme (PDE) die Ergebnisse des ELISA-Assays. Mehrere PDEs hydrolysieren cGMP und verringern seine Konzentration nach der Stimulation von sGC durch NO²³. Daher kann die katalytische Aktivität von PDEs den Zusammenhang zwischen cGMP-Konzentrationen und der NO-Häufigkeit verschleiern. Die Zugabe eines PDE5-Hemmers wie Sildenafil zur Verhinderung des cGMP-Verlusts ist ratsam für Experimente, die sich in erster Linie auf die Ermittlung exakter cGMP-Konzentrationen konzentrieren, im Gegensatz zu Messungen zur Beobachtung von Trends bei den cGMP-Konzentrationen. PDE5-Hemmer können Tieren etwa 1 h vor der Probenentnahme als Sildenafil verabreicht werden (die Wirkung hält bis zu 4 h^{an 24}) oder, wenn eine solche Verabreichung nicht durchführbar ist, kann Sildenafil den entnommenen Proben zugesetzt werden. Bei der Hemmung von PDEs nach der Gewebeentnahme ist Sildenafil zu 0,1 N Salzsäure hinzuzufügen, so dass das Gewebe in Gegenwart von Sildenafil homogenisiert wird. Messungen mit und ohne Sildenafil müssen durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass es keine Wechselwirkungen zwischen der Tierbehandlung und Sildenafil gibt.

Trotz seiner Einschränkungen wird der Assay als informativer Einblick in die nachgeschaltete Übertragung des NO-Signals verwendet. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Kopplung der Messung der cGMP-Konzentrationen in festen Geweben mit anderen Methoden der NO-Messung ein besseres Verständnis der Auswirkungen von NO in Organen ermöglicht.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1 mL BD durchsichtige Spritze zum Einnehmen	Becton Dickinson	50382903052177
14 mL Reagenzglas mit rundem Boden	Falke	352059
2,0 ml Mikroröhrchen, sortiert	Olympus Kunststoffe	24-283A
30-300 & Mikro; L Mehrkanalpipette	Eppendorf	3125000052
Essigsäureanhydrid (im cGMP-Kit)	Cayman Chemieunternehmen	400031	98% pure Hazard: Entzündlich, Korrosiv: schwere Verbrennungen der Haut, Augenschäden, Akute Toxcitity Sichere Handhabung: Von Zündquellen fernhalten, in belüfteten Räumen arbeiten, Handschuhe tragen
cGMP Acetylcholinesterase Tracer (im cGMP-Kit)	Cayman Chemieunternehmen	481020	zweibasisches Kaliumphosphat, Natriumchlorid   Kaliumphosphat einbasisch, Rinderalbumin, Natriumazid, EDTA, cGMP AChE tracer Gefahr: Gesundheitsgefahr: Organtoxizität bei wiederholter Exposition, Ätzend: Augenschäden, Haut- und Atemwegsreizend Sichere Handhabung: Arbeiten in belüftetem Bereich, Tragen Sie Handschuhe
cGMP ELISA Antiserum (im cGMP-Kit)	Cayman Chemieunternehmen	481022	zweibasisches Kaliumphosphat, Natriumchlorid   Kaliumphosphat monobasisch, Rinderalbumin,   Natriumazid, EDTA, Kaninchen Anti-cGMP polyklonales Antiserum Hazard: Gesundheitsgefahr: Organtoxizität bei wiederholter Exposition, Ätzend: Augenschäden, Haut- und Atemwegsreizend, akute Toxizität Sichere Handhabung: Arbeiten Sie in belüfteten Bereichen, tragen Sie Handschuhe
cGMP ELISA-Standard (im cGMP-Kit)	Cayman Chemieunternehmen	481024	zweibasisches Kaliumphosphat, Natriumchlorid   Kaliumphosphat monobasisch, Rinderalbumin,   Natriumazid, EDTA, cGMP-Standard Hazard: Gesundheitsgefahr: Organtoxizität bei wiederholter Exposition, Ätzend: Augenschäden, Haut- und Atemwegsreizend Sichere Handhabung: Arbeiten Sie in belüfteten Bereichen, tragen Sie Handschuhe
Zyklisches GMP-ELISA-Kit	Cayman Chemieunternehmen	581021
ELISA-Puffer-Konzentrat 10X (im cGMP-Kit)	Cayman Chemieunternehmen	400060	1 M Phosphat, 1 % BSA, 4 M Natriumchlorid, 10 mM EDTA, 0,1 % Natriumazid Hazard: Gesundheitsgefahr: Organtoxizität bei wiederholter Exposition, Ätzend: Augenschäden, Haut- und Atemwegsreizend Sichere Handhabung: Arbeiten Sie in einem belüfteten Bereich, lagern Sie in einem Behälter mit verschließbarem Deckel, tragen Sie Handschuhe
ELISA-Reagenz-Reservoir	Pierce (jetzt Thermo Fisher Scientific)	15075
Ellman-Reagenz (im cGMP-Kit)	Cayman Chemieunternehmen	400050	Kaliumphosphat zweibasisch, Natriumchlorid, Kaliumphosphat monobasisch, Acetylthiocholin (iodid), 5,5'-dithiobis-(2-nitrobenzoesäure) Gefahr: Akute Toxizität, Gesundheitsgefahr: Organtoxizität, Ätzend: Augenschäden, Hautreizend, Reizstoff für die Atemwege Sichere Handhabung: Arbeiten Sie in einem belüfteten Bereich, tragen Sie Handschuhe
Salzsäure	Sigma-Aldrich	320331	Gefahr: Ätzend: korrodiert Metall, verbrennt schwer die Haut, Augenschäden, Reizstoff für die Atemwege Sichere Handhabung: Arbeiten Sie in einem belüfteten Bereich, tragen Sie Handschuhe
Flüssigstickstoff	Roberts Sauerstoff		Nitrogen Hazard: Compressed Gas: Gefahr von kryogenen Verbrennungen, Frosbite, Erstickungsgefahr Sichere Handhabung: Arbeiten Sie in einem belüfteten Bereich, tragen Sie Handschuhe
Maus Anti-Kaninchen IgG beschichtete Platte (im cGMP-Kit)	Cayman Chemieunternehmen	400006	Gefahr: Keine
Neue Classic MF Balance	Mettler Toledo
Orbitalschüttler	Stovall Life Science Inc. (jetzt IBI Scientific)	15-453-211 (abweichend)
Parafilm	Bemis Company, Inc.	3023-4526 (variiert)
Polysorbat 20 (im cGMP-Kit)	Cayman Chemieunternehmen	400035	Gefahr: Keine
Kaliumhydroxid (im cGMP-Kit)	Cayman Chemieunternehmen	400029	85% rein Gefahr: Ätzend: korrodiert Metalle und Haut, Augenschäden, akute Toxizität Sichere Handhabung: Arbeiten Sie in einem belüfteten Bereich, tragen Sie Handschuhe
Precellys Evolution Homogenisator	Bertin Technologies	PE000062-PEVO0-A
Precellys Lysing Kit Homogenisierung von Hartgewebe	Bertin Technologies	P000911-LYSK0-A
Sense Mikroplatten-Reader	HIDEX	425-301
Sorvall Legend Micro 17R Zentrifuge	Thermo Fisher Scientific	75002441
Gewebe-Pulverisierer	Zellenbrecher	Cellcrusher-Bausatz
Vortex Genie 2	Wissenschaftliche Industrie	SI-0246
Waschflasche	Sigma-Aldrich	Z423092
Waschpuffer Konzentrat 400X (im cGMP-Kit)	Cayman Chemieunternehmen	400062	Kaliumphosphat zweibasisch, Kaliumphosphat einbasisch, Wasser Gefahr: Ätzend: Augenschäden, akute Toxizität, hautreizend, Organtoxizität Sichere Handhabung: Arbeiten Sie in einem belüfteten Bereich, tragen Sie Handschuhe