Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

Hypoxie verändert miRNAs-Spiegel, die an der nicht-Mendelschen Vererbung der Autismus-Spektrum-Störung bei Mäusen beteiligt sind

41K Aufrufe

⸱

DOI:

10.3791/68435

⸱

11. Juli 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Gevher Nesibe Genome and Stem Cell Institute, Erciyes University, 2Betül Ziya Eren Genome and Stem Cell (GENKÖK) Center, Erciyes University, 3Department of Medical Biology, Erciyes University, 4Department of Histology and Embryology, Yozgat Bozok University, 5Department of Physiology, Erciyes University, 6Department of Obstetrics and Gynecology, Faculty of Medicine, Erciyes University, 7University of Nice Sophia Antipolis, 8Department of Medical Genetics, Erciyes University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um Hypoxie bei neugeborenen Mäusen zu induzieren, indem sie in kontrollierten Umgebungen mit unterschiedlichen Sauerstoffkonzentrationen verabreicht werden. Mausmodelle, die bei der Geburt Sauerstoffschwankungen ausgesetzt waren, haben die Expression von miRNAs, die an der Induktion von phänotypischen Verhaltensänderungen wie Autismus beteiligt sind, dauerhaft variiert.

Zusammenfassung

Hypoxie kann in unterschiedlichem Ausmaß aus verschiedenen Gründen während der perinatalen Periode auftreten und die Entwicklung beeinträchtigen. Unser Ziel ist es, die Folgen einer leichten bis schweren neonatalen Hypoxie bei Mäusen zu untersuchen, wobei wir uns auf ihren möglichen Zusammenhang mit neurodegenerativen fetalen Hirnfunktionsstörungen im Zusammenhang mit der Autismus-Spektrum-Störung (ASD) konzentrieren.

Wir induzierten Hypoxie bei neugeborenen Mäusen, indem wir sie in kontrollierten Umgebungen mit unterschiedlichen Sauerstoffkonzentrationen abgaben. Die Ergebnisse zeigten erhöhte HIF-1α-Spiegel (ein Marker für Hypoxie) in der Großhirnrinde und im Hippocampus sowie eine erhöhte Neurodegeneration in diesen Regionen. Darüber hinaus beobachteten wir eine veränderte Expression von ASD-verwandten miRNAs (miR-19a-3p, miR-361-5p, miR-150-5p, miR-126-3p und miR-499a-5p) in hypoxischen Gruppen, was mit früheren Ergebnissen in Human- und Tiermodellen von ASD übereinstimmt. Diese molekularen Veränderungen wurden von Verhaltensänderungen wie verminderter Bewegung, Geschwindigkeit, sozialer Interaktion und sich wiederholendem Verhalten begleitet, sowie von einer erhöhten Tendenz, bei Mäusen, die hypoxischen Bedingungen ausgesetzt waren, Eckensuchverhalten zu zeigen. Obwohl Verhaltens- und molekulare Veränderungen in der 12%-O2-Gruppe (leichte Hypoxie) nachweisbar waren, wurden die ausgeprägtesten Veränderungen in den schwereren Hypoxie-Gruppen mit 10%O2 und 8%O2 beobachtet.

Insgesamt deuten die Ergebnisse darauf hin, dass neonatale Hypoxie dauerhafte molekulare Veränderungen induzieren kann, die mit neurodegenerativen Erkrankungen verbunden sind, mit Verhaltensfolgen. Darüber hinaus kann selbst bei einer normalen Geburt die Exposition gegenüber Hypoxie während der frühen Entwicklung das Gedächtnis und das Lernen beeinträchtigen. Die Ergebnisse unterstreichen die Notwendigkeit einer Früherkennung und Intervention bei Neugeborenen, die Hypoxie ausgesetzt sind, um langfristige neurologische Probleme zu verhindern. Der miRNA-Spiegel wird während der Entwicklung reguliert, und ihre Veränderungen in Geweben, insbesondere in Keimzellen, stellen einen Risikofaktor für die nächste Generation dar. Die Analysen bilden eine Grundlage für die Untersuchung der Regulationswege, die funktionelle und Verhaltensänderungen unter Hypoxie beeinflussen.

Einleitung

Hypoxie, die als Zustand des Sauerstoffmangels definiert ist, kann einzigartige zelluläre und molekulare Reaktionen hervorrufen, die für das Verständnis ihrer Rolle bei verschiedenen Pathologien entscheidend sind. Es kann Entwicklungssequenzen stören, was zu molekularen, zellulären und neuronalen Veränderungen und Verletzungen führt. Darüber hinaus unterbricht eine frühe Exposition gegenüber Hypoxie die Entwicklung des Zentralnervensystems (ZNS), wodurch die axonale Konnektivität und die Synapsenentwicklung beeinträchtigtwerden 1.

Obwohl gezeigt wurde, dass Hypoxie nachteilige Auswirkungen auf die ZNS-Entwicklung hat, kann sie auch unter bestimmten Bedingungen, wie z. B. während der Embryogenese, eine entscheidende physiologische Rolle spielen. Normale physiologische Hypoxie bezieht sich auf eine Situation, in der der Sauerstoffgehalt während der Embryonalentwicklung von Natur aus günstig ist. Dieser Prozess ermöglicht es embryonalen Zellen, Energie zu produzieren, indem er den anaeroben Stoffwechsel fördert, unterstützt die Entwicklung des Kreislaufsystems durch Beschleunigung der Vaskularisierung, sorgt für eine ordnungsgemäße Entwicklung von Herz und Knochen und stimuliert die Wanderung von Neuralleistenzellen2. Umgekehrt kann eine Hypoxie, die außerhalb ihres physiologischen Kontextes auftritt, nachteilige Auswirkungen auf die Entwicklung und die allgemeine Gesundheit, einschließlich der Embryonalentwicklung, haben, was zu Frühgeburten oder sogar embryonaler Letalität führen kann1. Es handelt sich daher um ein großes Problem für die öffentliche Gesundheit, da viele Neugeborene während der normalen Entbindung unter hypoxischen Zuständen leiden, oft ohne sofortige Erkennung durch Betreuer oder medizinisches Personal3. Darüber hinaus sind Veränderungen in der neuronalen Konnektivität, die mit Hypoxie verbunden sind, mit neurologischen Entwicklungsstörungen verbunden, einschließlich Autismus-Spektrum-Störungen (ASS) und geistiger Behinderungen1.

Aus molekularer Sicht kann Hypoxie die neurologische Entwicklung beeinflussen, indem sie die Expression von Genen verändert, die synaptische Funktionen regulieren, wodurch die neuronale Konnektivität gestört und zur Entwicklung von neurologischen Entwicklungsstörungen beigetragenwird 4.

Klinisch beeinflusst die neonatale Hypoxie die ZNS-Entwicklung über hormonelle und metabolische Wege1. Als Reaktion auf akute Hypoxie setzt der Hypothalamus schnell das Corticotropin-Releasing-Hormon und das Arginin-Vasopressin frei, was dann die Freisetzung des adrenocorticotropen Hormons aus dem Hypophysenvorderlappen auslöst, gefolgt von der Glukokortikoidproduktion in der fetalen Nebennierenrinde, und der Grad dieser Reaktion korreliert mit der Intensität und Dauer der Hypoxie. Diese schnelle Reaktion der Hypothalamus-Hypophysen-Nebennieren-Achse (HPA) auf akuten Stress unterstreicht die entscheidende Rolle von Glukokortikoiden bei der Begrenzung der physiologischen Auswirkungen von Stress und der Aufrechterhaltung der fetalen Homöostase durch Beeinflussung der damit verbundenen Genexpression, der Proteinsynthese und des Zellstoffwechsels 5,6.

Ein verminderter normaler Sauerstoffgehalt aktiviert verschiedene Reaktionen auf Hypoxie, von denen die meisten durch Transkriptionsfaktoren, Hypoxie-induzierbare Faktoren (HIFs) und zelluläre Sauerstoffsensoren wie Prolylhydroxylasen (PHDs)1 reguliert werden. HIF-1, ein Regulator der O2-Homöostase, wie in in vitro-Studien gezeigt wurde 7, ist ein Heterodimer, das aus HIF-1α und HIF-1β 8 besteht. Unter hypoxischen Bedingungen wird der Ersatz des Wasserstoffatoms durch eine Hydroxylgruppe im Komplex reduziert, was zur Akkumulation von HIF-1α führt, das dann mit HIF-1β dimerisiert. Infolgedessen verlagert sich das HIF-1-Dimer in den Zellkern, wo es die Transkription von Hunderten von Genen aktiviert1.

Die sauerstoffabhängige Natur der Neuronen macht sie besonders anfällig für hypoxischen Stress. Daher kann Hypoxie einen signifikanten Einfluss auf die Physiologie des Gehirns haben, mit langfristigen Auswirkungen auf die neuronale Funktion, indem sie die axonale Wegfindung und die Synapsenentwicklung beeinträchtigt9. Diese Veränderungen in den neuronalen Verbindungen können für verschiedene neurologische Entwicklungsstörungen wie ASDs und geistige Behinderung prädisponieren 9,10.

Perinatale Asphyxie ist definiert als Sauerstoffmangel während der Wehen und kann als Folge von perinatalen Ereignissen wie mütterlich-fetalen Blutungen, Nabelschnurkompressionen, Plazentakomplikationen, Gebärmutterruptur, Schulterdystokie oder Versagen des Neugeborenen, seinen ersten Atemzug zu machen, auftreten. Dieses schwerwiegende Ereignis betrifft jedes Jahr weltweit etwa vier Millionen Neugeborene und führt zum Tod von einer Million Neugeborenen 11,12,13. Obwohl die meisten Säuglinge Episoden von Hypoxie überleben, entwickeln einige Patienten eine hypoxisch-ischämische Enzephalopathie, die zu dauerhaften neurologischen Problemen wie Anfallsleiden, Zerebralparese, kognitiven Verzögerungen und motorischen Defiziten führen kann. Darüber hinaus können Asphyxie und Ischämie zu Funktionsstörungen verschiedener Organe und Systeme wie des ZNS (28 %), des Herz-Kreislauf-Systems (25 %), der Nieren (50 %) und der Lunge (23 %) führen11.

Darüber hinaus sind die Unreife des zerebralen Gefäßsystems und eine schlechte Autoregulation Faktoren, die Neugeborene für ischämische Risiken prädisponieren. In solchen Prozessen sind Entzündungen und oxidativer Stress die Hauptmediatoren der hypoxisch-ischämischen Schädigung bei Neugeborenen und der damit verbundenen Zelltodmechanismen. Eine abnormale Apoptose kann das sich entwickelnde Gehirn dem Risiko motorischer und kognitiver Störungen aussetzen14.

Angesichts der Komplexität von ASD ist es wichtig, die zugrunde liegende Genetik zu verstehen, die eine polygene Struktur zu haben scheint, sowie die Umweltfaktoren, die ihre Entwicklung bestimmen. Insbesondere impliziert die polygene Basis der ASD eine multifaktorielle Ätiologie, in der genetische Veranlagungen mit externen Faktoren, einschließlich Hypoxie, interagieren. Die bei eineiigen Zwillingen beobachtete Konkordanz von 60 % bis 92 % unterstreicht die Bedeutung genetischer Einflüsse, während die Diskordanz darauf hindeutet, dass auch Umweltfaktoren eine Rolle spielen. Die Prävalenz von Autismus wird auf 13/10.000 geschätzt, und es wird angenommen, dass diese Rate in den letzten Jahren gestiegen ist15. Studien unterstützen die Hypothese, dass die Exposition gegenüber Umweltfaktoren während der Schwangerschaft das Risiko für Autismus erhöhen kann, aber die Ergebnisse dieser Studien sind aufgrund von Unterschieden in den diagnostischen Kriterien, Vergleichsgruppen, Stichprobengröße und Expositionsbewertungsmethoden oft widersprüchlich15,16.

Obwohl die spezifischen neuropathologischen Befunde unklar sind, zeigen Studien mikroskopische und funktionelle Anomalien des Gehirns. Diese Anomalien deuten darauf hin, dass die ätiologisch relevante Periode in utero liegen könnte und dass die Pathogenese während der pränatalen Periode beginnen kann15. Expositionen während der Schwangerschaft stehen im Mittelpunkt der epidemiologischen Forschung zu potenziellen Risikofaktoren für Autismus. Insbesondere die Hypothese, dass geburtshilfliche Komplikationen das Risiko für ASD erhöhen können, wird durch viele Studien gestützt, aber das Ausmaß und die Folgen dieser Effekte variieren von Studiezu Studie 17.

Neben genetischen Faktoren spielen epigenetische Mechanismen eine Schlüsselrolle bei der Regulation der Genexpression unter hypoxischen Bedingungen. Insbesondere stellen miRNAs einen wichtigen Regulationsmechanismus bei der zellulären Reaktion auf Hypoxie dar, wie z. B. ihren Einfluss auf HIF. In den frühen Stadien der Hypoxie können spezifische Veränderungen der miRNA-Spiegel zur Akkumulation von HIF-1 und zur Aufrechterhaltung stabiler HIF-2- und HIF-3-Spiegel beitragen18. Obwohl das Expressionsprofil vieler miRNAs unter hypoxischen und Ischämiebedingungen verändert ist, wurde gezeigt, dass eine begrenzte Anzahl von Hypoxie-assoziierten miRNAs eine funktionelle Rolle spielt und die HIF-Expression beeinflusst. Dies erklärt, warum sich verschiedene menschliche Gewebe aufgrund der gewebespezifischen miRNA-Expression in hypoxischen Reaktionen unterscheiden18.

Neue Daten deuten auch darauf hin, dass spezifische miRNAs an der ASD-Pathologie beteiligt sind. In unserer früheren Arbeit haben wir gezeigt, dass miR-19a-3p, miR-361-5p, miR-150-5p, miR-126-3p und miR-499a-5p, von denen bekannt ist, dass sie das Zellüberleben, die Differenzierung und die Stressreaktionen bei Krebs regulieren, bei ASD-Patienten eine aberrante Expression aufweisen, die möglicherweise die neurologischen Entwicklungsergebnisse beeinflusst. Wir bestätigten diese Befunde dann in Blut-, Hypothalamus- und Spermienproben aus Mausmodellen für ASD und zeigten einen konsistenten Zusammenhang zwischen genregulatorischen Veränderungen und der Krankheit19. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Herunterregulierung dieser miRNAs in entscheidenden Wachstums- und Entwicklungsstadien einen signifikanten Einfluss auf die Entwicklung von Krankheiten wie ASD haben kann. Dies zeigt einmal mehr, dass die neonatale Hypoxie einen tiefgreifenden Einfluss auf molekulare und verhaltensbezogene Eigenschaften hat.

In dieser Studie untersuchten wir den Einfluss einer leichten bis mittelschweren neonatalen Hypoxie auf das Risiko, im Erwachsenenalter an Autismus zu erkranken. Zu diesem Zweck wurden neugeborene Mäuse unterschiedlich stark von Hypoxie ausgesetzt. Tatsächlich zeigen Mäuse, die bei der Geburt Hypoxie erlebten, Verhaltensänderungen im Erwachsenenalter und, was noch wichtiger ist, auf molekularer Ebene Veränderungen, die mit ASS verbunden sind. Unsere Ergebnisse lieferten somit wertvolle Informationen über die Langzeitwirkungen von Hypoxie.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

Alle Versuchsprotokolle wurden von der Ethikkommission für lokale Tierversuche der Universität Erciyes (HAYDEK) genehmigt und unter der Lizenznummer 21/216 durchgeführt.

1. Tierische Probanden

HINWEIS: An dieser Studie nahmen Balb/c-Mäuse aus der transgenen Abteilung des Betül-Ziya EREN Genom- und Stammzellzentrums (GENKÖK) an der Universität Erciyes teil.

  1. Verwenden Sie 2 Monate alte Balb/c-Mäuse mit einem durchschnittlichen Gewicht von 18-25 g. Halten Sie die Mäuse bei einer Temperatur von 20 ± 2 °C und einer Luftfeuchtigkeit von 52 ± 3 % in einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus (6-18 h).
  2. Füttern Sie die Mäuse mit Standard-Mauspellets, mit wöchentlichem Einstreuwechsel, und ermöglichen Sie unbegrenzten Zugang zu Futter und Wasser.
    HINWEIS: Molekulare Studien wurden in den Genomik- und Hypoxielaboratorien der GENKÖK und im Labor für Histologie und Embryologie der Universität Bozok durchgeführt. Ein "STOP-Punkt" zeigt an, wo Sie Ihre Arbeit pausieren und bei der angegebenen Temperatur aufbewahren können.

2. Etablierung des Hypoxie-Modells

  1. Gestalten Sie das Experiment so, dass es 4 Gruppen umfasst, darunter 3 hypoxische und 1 Schein-Kontrollgruppe.
  2. Verpaaren Sie gesunde weibliche Mäuse mit gesunden männlichen Mäusen, um gesunde trächtige weibliche Mäuse zu bilden, die schließlich in die folgenden Gruppen eingeteilt werden: schwere Hypoxie (8% O2) (n = 4), mäßige Hypoxie (10% O2) (n = 4), leichte Hypoxie (12% O2) (n = 4) und Normoxie (21% O2) als Schein-Kontrollgruppe (n = 4).
  3. Um eine Hypoxie zu induzieren, überführen Sie die trächtigen Mäuse in das Hypoxielabor und beginnen Sie 72 Stunden vor Tag E21.5 mit der Überwachung.
  4. Erkennen Sie den Entbindungsort der trächtigen Mäuse in den hypoxischen Gruppen und platzieren Sie sie sofort in Hypoxiekammern. Der Sauerstoffgehalt wird für jede Kammer wie für jede Gruppe beschrieben angepasst (siehe Schritt 2.2).
  5. Halten Sie Neugeborene nur 5 Minuten lang unter hypoxischen Bedingungen und bringen Sie sie dann sofort in normale Haltungsbedingungen.
    HINWEIS: Wenn Probanden über einen längeren Zeitraum unter hypoxischen Bedingungen gehalten werden, kann dies zur Letalität führen.
  6. Verwenden Sie 2 Neugeborene (zufällig ausgewählt) aus jeder Gruppe, um die Hypoxie-induzierte Schädigung zu bestätigen und das Geschlecht zu bestimmen. Halten Sie die verbleibenden Jungtiere bis zum Ende der Laktationsperiode neben ihren Müttern unter normalen Haltungsbedingungen, um zusätzliche molekulare und Verhaltenstests für die Erwachsenenphase durchzuführen (siehe Versuchsdesign in der ergänzenden Abbildung 1).

3. Geschlechtsbestimmung zur Beurteilung potenzieller Unterschiede in hypoxischen Effekten zwischen den Geschlechtern im Neugeborenenstadium

  1. Wiegen Sie jede Maus (zufällig ausgewählt (x2/Gruppe)) einzeln, um die erforderliche Dosierung von Anästhetika zu berechnen. Verabreichen Sie Ketamin in einer Menge von 100 mg/kg und Xylazin in einer Menge von 10 mg/kg intraperitoneal.
  2. Sobald die Maus vollständig betäubt ist, fahren Sie mit der Euthanasie durch zervikale Dislokation fort und sammeln Sie sofort das Schwanzgewebe in steril markierten 1,5-ml-Röhrchen (ein STOP-Punkt, -80 °C)
  3. Sammeln Sie sofort das gesamte Gehirngewebe und überführen Sie es in Zentrifugenröhrchen mit 10 % Formaldehyd für die weitere Analyse (ein STOP-Punkt, 25 °C).
  4. Bereiten Sie Gewebe für die DNA-Extraktion vor.
    1. Schwanzproben vorbereiten und bei Bedarf bei 25 °C auftauen. Geben Sie 300 μl Lysepuffer mit 1 M Tris, 0,5 M EDTA, 4 % SDS, dH2O und Proteinase K in die Proben.
  5. Homogenisieren Sie die Proben.
    1. Die Proben werden gründlich durch Vortexen gemischt und über Nacht bei 55 °C inkubiert.
    2. Am nächsten Tag 100 μl Ammoniumacetat zugeben und durch Vortexen kurz mischen. Zentrifugieren bei 12.000 g für 20 min bei 25 °C
  6. Führen Sie die Phasentrennung durch.
    1. Übertragen Sie die klare wässrige Phase vorsichtig in neue, sterile, mit 1,5 mL beschriftete Röhrchen.
    2. 500 μl Isopropanol zugeben und 5 Minuten bei 25 °C inkubieren (ein STOP-Punkt, -20 °C). Zentrifugieren Sie bei 12.000 g für 10 min bei 25 °C
  7. Wasche das DNA-Kügelchen.
    1. Nachdem Sie das Pellet am Boden des Rohrs untersucht haben, entsorgen Sie den Überstand vorsichtig.
    2. Fügen Sie 1000 μl 70%iges Ethanol hinzu und klopfen Sie vorsichtig auf das Rohr, um das Pellet schwimmen zu lassen. Zentrifugieren bei 7500 g für 10 min bei 25 °C
  8. Reinigen Sie die DNA.
    1. Nachdem Sie das Pellet am Boden des Rohrs untersucht haben, entsorgen Sie den Überstand vorsichtig.
    2. Verwenden Sie eine 10-μl-Mikropipette, um Ethanolreste zu entfernen und vollständig trocknen zu lassen.
    3. Fügen Sie 100 μl nukleasefreies Wasser (NFW) hinzu, um das Pellet wieder zu suspendieren. Inkubieren Sie bei +4 °C für 10-15 min.
  9. Quantifizieren und speichern Sie die DNA.
    1. Messen Sie die DNA-Konzentration mit einem Spektralphotometer. Lagern Sie DNA-Proben bis zur weiteren Verwendung bei +4 °C. (ein STOP-Punkt).
  10. Führen Sie eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) durch.
    1. Ausführung SRY-F, SRY-R und indirekte PAX6-F, PAX6-R Zündhütchen (siehe Ergänzende Tabelle 1).
    2. Bereiten Sie eine PCR-Mischung wie folgt vor (pro Probe): 5 μl PCR-Puffer (10x), 4 μl MgCl2, 4 μl dNTPs, 0,5 μl jedes der vier Primer, 31 μl dH2O und 0,5 μl Taq-Polymerase.
      HINWEIS: Die Taq-Polymerase sollte zuletzt und kurz vor der Anwendung hinzugefügt werden, um eine optimale Amplifikation zu gewährleisten.
    3. Bereiten Sie die beschrifteten PCR-Röhrchen vor und stellen Sie sie auf ein +4 °C Kühlgestell. 45 μl der Mischung in die Röhrchen verteilen.
    4. Klopfen Sie vorsichtig auf den Block, um sicherzustellen, dass sich die Tröpfchen der PCR-Mischung am Boden des Röhrchens befinden.
    5. 5 μl DNA-Proben zugeben und kurz pipettieren. Kurz vortexen und dann die Röhrchen zentrifugieren.
    6. Legen Sie die Röhrchen in die PCR-Maschine und stellen Sie das Programm auf die folgenden Bedingungen ein: Zunächst Inkubation bei 95 °C für 5 Minuten, 40 Denaturierungszyklen bei 94 °C für 1 min, Glühen bei 57 °C für 45 s und Verlängerung bei 72 °C für 1 min. Nach den Zyklen eine abschließende Verlängerung bei 72 °C für 10 min, gefolgt von einem Halten bei 40 °C auf unbestimmte Zeit.
  11. Visualisieren Sie die Ergebnisproben mit einer 2%igen Agarose-Gelelektrophorese.
    HINWEIS: Stichproben, die zwei Banden zeigen, sind männlich, und diejenigen mit nur einer Bande sind weiblich.

4. Bestätigung der Hypoxieschädigung bei neugeborenen Mäusen

  1. Mikroskopische Auswertung von Hirngewebe von getöteten Mäusen, um hypoxische Schäden zu bestätigen, und immunhistochemisches Untersuchen, um HIF-1α zu testen.
    1. Fixieren und Paraffin betten das Gewebe ein.
      1. Bewahren Sie das Gewebe 12 h lang in Formaldehyd auf, waschen Sie es dann 6 h lang in Wasser.
      2. Fixieren Sie das Gewebe, indem Sie 1 Tag lang für jede Konzentration in Ethylalkohol-Serien dehydrieren: 70%, 80%, 90%, dann 3 Stunden in 100% Ethylalkohol. Legen Sie das Taschentuch 15 Minuten lang in Xylol, um es zu reinigen.
      3. Übertragen Sie das Gewebe für jeweils 1 Stunde auf die Paraffinserien I, II und III. Nach der dritten Stunde richten Sie die Gehirnproben richtig aus und betten sie in sauberes Paraffin ein.
      4. Schneiden Sie mit einem Rotationsmikrotom 5 μm dicke Abschnitte aus den Paraffinblöcken.
    2. Bereiten Sie Folien vor.
      1. Für Hämatoxylin- und Eosin (HE)-Färbungen legen Sie die Schnitte auf einfache Glasobjektträger.
      2. Für die Immunhistochemie legen Sie die Schnitte auf positiv geladene Objektträger.
        HINWEIS: (ein STOP-Punkt), Folien können zu diesem Zeitpunkt für weitere Auswertungen und Arbeiten archiviert werden.
    3. Führen Sie eine HE-Färbung durch.
      1. Tauchen Sie die Proben 10 Minuten lang in Xylol-I-Lösung.
      2. Tauchen Sie die Proben für weitere 10 Minuten in Xylol-II-Lösung.
      3. Übertragen Sie die Proben für jeweils 1 Minute in eine Reihe von abnehmenden Alkoholkonzentrationen: 100 %, 96 % und 80 %.
      4. Waschen Sie die Proben 2 Minuten lang mit destilliertem Wasser.
      5. Tauchen Sie die Proben 8 Minuten lang in Hämatoxylin und waschen Sie sie dann 2 Minuten lang in destilliertem Wasser.
      6. Behandeln Sie die Proben nach dem Waschen 1 s lang mit saurem Alkohol, gefolgt von einer 1-minütigen Wäsche.
      7. Legen Sie die Proben 10 s lang in Ammoniakwasser und wiederholen Sie dann die 1-minütige Wäsche.
      8. Legen Sie die Proben 30 s lang in 70%igen Alkohol.
      9. Tauchen Sie die Proben 10 Minuten lang in Eosin.
      10. Übertragen Sie die Proben nach und nach, indem Sie die Alkoholkonzentrationen jeweils 1 Minute lang erhöhen: 96 %, 96 % und 100 %.
      11. Tauchen Sie die Proben jeweils 1 Minute lang in Xylol-I-, Xylol-II- und Xylol-III-Lösungen.
      12. Abdeckung mit Deckglas.
    4. Mit einem Mikroskop untersuchen.
      1. Untersuchen Sie nach der HE-Färbung das gesamte Hirngewebe jeder Gruppe unter einem Lichtmikroskop.
      2. Untersuchen Sie hippokampale und kortikale Bereiche auf neuronale Degeneration und perizelluläre/perivaskuläre Ödeme.
  2. Führen Sie eine HIF-1α-Färbung durch.
    1. Inkubieren Sie die Proben auf positiv geladenen Objektträgern über Nacht bei 67 °C in einem Inkubator, um eine ausreichende Fixierung zu gewährleisten.
    2. Die Schnitte werden durch Xylol-I- und Xylol-II-Lösungen geleitet, um die Entparaffinierung abzuschließen.
    3. Rehydrieren Sie die Abschnitte, indem Sie sie nacheinander für jeweils 5 Minuten in 100 %, 96 %, 80 % und 70 % Ethanollösungen legen und anschließend 5 Minuten lang in destilliertem Wasser spülen.
    4. Demaskieren Sie Epitope durch Mikrowellenschnitte in 0,01 M Zitronensäure (pH 6,0) bei 665 W für zwei 5-Minuten-Zyklen.
    5. Kühlen Sie die Abschnitte 20 min lang bei Raumtemperatur (RT).
    6. Markieren Sie den Umfang der Abschnitte mit einem hydrophoben Stift und waschen Sie die Abschnitte dann 3 Mal für jeweils 5 Minuten in PBS.
    7. Inkubieren Sie Abschnitte in 3% Wasserstoffperoxid in Methanol für 10 Minuten, um die endogene Peroxidaseaktivität zu blockieren.
    8. Waschen Sie die Abschnitte erneut 3 Mal für jeweils 5 Minuten in PBS.
    9. Um eine unspezifische Immunglobulinbindung zu verhindern, inkubieren Sie Schnitte mit einem UV-blockierenden Reagenz für 7 Minuten.
    10. Inkubieren Sie die Schnitte über Nacht bei 4 °C mit dem Anti-HIF-1α-Primärantikörper (1:200 Verdünnung).
    11. Waschen Sie die Abschnitte 3 Mal für jeweils 5 Minuten in PBS.
    12. Biotinylierten Sekundärantikörper auf die Schnitte auftragen und 40 Minuten bei RT inkubieren.
    13. Waschen Sie die Abschnitte erneut 3 Mal für jeweils 5 Minuten in PBS.
    14. Tragen Sie Streptavidin-Lösung auf die Schnitte auf und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei RT.
    15. Waschen Sie die Abschnitte 3 Mal für jeweils 5 Minuten in PBS.
    16. Die Färbereaktion wird durch Auftragen von 3,3'-Diaminobenzidin (DAB) und Beobachtung unter einem Lichtmikroskop entwickelt.
    17. Die Schnitte werden mit modifizierter Gill II-Hämatoxylinlösung gegengefärbt, um die Zellkerne zu färben.
    18. Dehydrieren Sie die Abschnitte, indem Sie sie durch steigende Ethanolkonzentrationen (70 %, 80 %, 96 % und 100 % Ethanol) führen.
    19. Reinigen Sie die Abschnitte, indem Sie sie jeweils 10 Minuten lang in Xylol-I- und Xylol-II-Lösungen inkubieren.
    20. Montieren Sie die Abschnitte mit einem Eindeckmedium und einem Deckglas.
    21. Untersuchen Sie montierte Schnitte unter einem Lichtmikroskop und beurteilen Sie Bereiche des Hippocampus und des präfrontalen Kortex.
    22. Messen Sie die Immunreaktivität mit Open-Source-Bildverarbeitungssoftware.

5. Verhaltensexperimente

  1. Lassen Sie die verbleibenden Mäuse nach Bestätigung der Hypoxie die Laktationszeit mit ihren Müttern abschließen.
  2. Führen Sie die Geschlechtsbestimmung am 21. postnatalen Tag auf der Grundlage des anogenitalen Abstands durch und bringen Sie die Tiere je nach Geschlecht in verschiedenen Käfigen unter. Wenn die Mäuse in der hypoxischen und der scheinkontrollierten Gruppe ein Alter von 2 Monaten erreichen, unterziehen Sie sie Verhaltensexperimenten.
  3. Bevor Sie Verhaltenstests durchführen, gewöhnen Sie die Probanden 15-30 Minuten vor dem Test an die Testumgebung.
  4. Stellen Sie sicher, dass alle Geräte/Geräte zwischen den Probanden und den Versuchen mit 70 % Ethanol desinfiziert werden.
  5. Führen Sie einen neuartigen Objekterkennungstest (NOR) durch.
    1. Stellen Sie die Kamera in eine Position, in der Motive gut zu sehen und zu überwachen sind.
    2. Installieren Sie eine geeignete Video-Tracking-Software.
    3. Bereiten Sie die Testarena (eine 60 cm × 60 × cm × 40 cm große Box) mit zwei Gegenständen vor, die nicht größer als die Maus sind. Achten Sie darauf, dass die beiden Objekte eine ähnliche Größe und Form haben und leicht zugänglich sind (10 cm × 10 cm Abstand zu den Wänden und parallel).
    4. Tag 1: Eingewöhnungsphase:
      1. Platziere die Maus in der Arena mit den beiden identischen Objekten. Lassen Sie die Maus die Objekte für eine bestimmte Zeit (z. B. 10 Minuten) frei erkunden.
      2. Beobachten und notieren Sie während dieser Sitzung, wie viel Zeit die Maus mit jedem Objekt verbracht hat. Notieren Sie auch, wie oft sich die Maus auf jedes Objekt zubewegt oder mit ihm interagiert hat
    5. Tag 2: Einführung in ein neuartiges Objekt:
      1. Ersetzen Sie eines der bekannten Objekte aus Tag 1 durch ein neuartiges Objekt (das sich in Aussehen, Textur oder Form unterscheidet).
      2. Bring die Maus in die Arena zurück, damit sie wieder genauso lange wie in der ersten Sitzung frei erkunden kann.
    6. Notieren Sie die Gesamtzeit, die die Maus mit dem vertrauten Objekt (ab Tag 1) und dem neuen Objekt verbracht hat. Zeichnen Sie auf, wie oft sich die Maus auf jedes Objekt zubewegt oder mit ihm interagiert hat.
    7. Berechnen Sie den Disputationsindex (DI), um das Gedächtnis und das Lernen der Maus anhand der Formel zu bewerten:
      Diskriminierungsindex (DI) = {(Zeit, die mit einem neuen Objekt verbracht wurde − Zeit, die mit einem vertrauten Objekt verbracht wurde)/(Gesamtzeit, die mit beiden Objekten verbracht wurde)} × 100.
      HINWEIS: Ein höherer DI deutet auf ein größeres Interesse an dem neuartigen Objekt hin, was auf ein besseres Gedächtnis und bessere Lernfähigkeiten hindeutet. Ein DI nahe 0 deutet auf keine Präferenz hin, was entweder auf gleiches Interesse oder ein schlechtes Gedächtnis für das vertraute Objekt hindeutet.
    8. Verwenden Sie die DI, um die Lern- und Gedächtnisfähigkeiten der Maus objektiv zu beurteilen, basierend auf ihrer natürlichen Neugier und der Fähigkeit, bekannte und neuartige Objekte zu erkennen und zu unterscheiden.
  6. Heckfederungstest (TST) durchführen
    1. Installieren Sie die Kamera an einer Stelle, an der die Mäuse gut sichtbar sind und überwacht werden können. Installieren Sie eine geeignete Video-Tracking-Software.
    2. Bereiten Sie den Versuchsaufbau mit Platz für 3 Mäuse gleichzeitig vor.
    3. Verwenden Sie 25 cm hohe Pappplatten mit einem Abstand von 20 cm, um die Mäuse so zu isolieren, dass sie sich während des Tests nicht sehen können.
    4. Schneiden Sie 12 cm lange Klebebandstreifen ab und befestigen Sie diese vorsichtig am Schwanz jeder Maus, wobei Sie darauf achten, dass der Schwanz sicher befestigt ist, ohne Schäden zu verursachen. Positionieren Sie das Band am Ende des Schwanzes (2 cm), so dass die Maus aufgehängt werden kann, ohne sich zu verletzen.
    5. Nehmen Sie die Mäuse 6 Minuten lang auf, während sie aufgehängt sind.
    6. Stoppen Sie am Ende der Dauer die Aufzeichnung, entfernen Sie die Maus und setzen Sie sie wieder in den Gehäusekäfig ein. Analysieren Sie die Videos, um die Dauer der aktiven Bewegung und die Dauer der Immobilität zu bestimmen.
      HINWEIS: Dies gibt Aufschluss über die Stressreaktion, da Immobilität oft auf einen Zustand erlernter Hilflosigkeit oder Stress hinweist. Der Grad der Immobilität wird häufig verwendet, um Verhaltensverzweiflung oder Stressreaktion bei Mäusen zu messen, die mit den Auswirkungen von Stress oder depressiven Zuständen zusammenhängen können.
    7. Basierend auf den beobachteten Bewegungs- und Immobilitätsmustern beurteilen Sie den emotionalen Zustand und die Stressbewältigungsmechanismen von Mäusen als Reaktion auf die erzwungene Suspendierung.
  7. Führen Sie einen Marmorvergrabungstest durch
    1. Füllen Sie einen leeren Käfig (20 cm × 35 cm × 15 cm) mit 5 cm hohem Maiskolben. 20 Murmeln in 5 Reihen mit je 4 Murmeln anrichten. Stellen Sie sicher, dass die Murmeln gleichmäßig auf der Oberfläche verteilt sind.
    2. Platzieren Sie das Motiv in einer Ecke des Käfigs, um freien Zugang zum gesamten Käfig zu gewährleisten.
    3. Geben Sie der Maus 20 Minuten Zeit, um den Käfig zu erkunden. Während dieser Zeit kann die Maus ein gewisses Vergrabungsverhalten zeigen und versuchen, die Murmeln mit Maiskolben zu bedecken. Entfernen Sie die Maus nach 20 Minuten aus dem Käfig.
    4. Zähle die Gesamtzahl der Murmeln, die die Maus während des Zeitraums von 20 Minuten unter dem Maiskolben vergraben hat. Notieren Sie die Gesamtzahl der vergrabenen Murmeln, da dies das wichtigste Maß für das Verhalten ist.
      HINWEIS: Die Anzahl der vergrabenen Murmeln wird häufig als Indikator für Angstzustände, zwanghaftes Verhalten oder Neophobie bei Nagetieren verwendet. Eine höhere Anzahl vergrabener Murmeln ist oft mit einem höheren Maß an Angst oder zwanghaften Tendenzen verbunden.
    5. Basierend auf der Gesamtzahl der vergrabenen Murmeln werden angstbezogene Verhaltensweisen und zwanghafte Tendenzen bei Mäusen bewertet, die zur Beurteilung der Auswirkungen von Behandlungen oder experimentellen Bedingungen verwendet werden können.
  8. Führen Sie einen Test der sozialen Interaktion durch.
    1. Installieren Sie die Kamera an einer Stelle, an der die Mäuse gut sichtbar sind und überwacht werden können.
    2. Schließen Sie die Kamera an den Computer an und richten Sie eine entsprechende Video-Tracking-Software ein. Stellen Sie eine rechteckige Box (60 cm × 40 cm × 25 cm) mit zwei Wänden (40 cm × 25 cm) mit zwei Türen (8 cm) auf, um die drei Kammern zu trennen.
    3. Platzieren Sie einen Käfig (15 cm × 10 cm), in dem sich eine Maus befindet, die dem Versuchsobjekt bekannt ist, und einen weiteren Käfig (15 cm × 10 cm), in dem sich eine Maus befindet, die zuvor noch nicht mit dem Versuchsobjekt interagiert hat.
    4. Starten Sie die Aufnahme und platzieren Sie das Motiv im mittleren Fach.
      ANMERKUNG: Bei diesem Versuch verwendete Mäuse, bei denen es sich nicht um Versuchstiere handelt, müssen sie gleichgeschlechtlich und gesund sein.
    5. Überwachen Sie das Motiv 5 Minuten lang und nehmen Sie es mit der Videokamera auf. Stoppen Sie am Ende der Dauer die Aufnahme, entfernen Sie die Maus und legen Sie sie wieder in den Gehäusekäfig zurück.
    6. Analysieren Sie mit der SIT-Software die soziale Interaktionszeit und die sozialen Neuheitstendenzen der Mäuse und vergleichen Sie sie mit der Scheinkontrollgruppe.
      HINWEIS: Mehr Zeit, die mit sozialen Verhaltensweisen (z. B. Fellpflege oder Schnüffeln) verbracht wird, und weniger Zeit, die mit dem Vermeiden oder Zeigen von Aggressionen verbracht wird, können als Zeichen einer hohen Geselligkeit interpretiert werden. Das Vermeiden von Interaktion, das Verbringen von mehr Zeit in Isolation oder das Zeigen erhöhter Aggression können auf Angstzustände, sozialen Rückzug oder eine verminderte Fähigkeit zur sozialen Interaktion hindeuten.
  9. Führen Sie einen offenen Feldtest durch.
    1. Positionieren Sie die Kamera so, dass die Mäuse gut zu sehen und zu überwachen sind. Verbinden Sie die Kamera mit dem Computer und richten Sie eine geeignete Video-Tracking-Software ein.
    2. Stellen Sie die Testarena (eine 60 cm × 60 cm × 40 cm große Box) auf und teilen Sie die Box mit imaginären Linien, um 16 Quadrate zu bilden.
    3. Starte die Aufnahme und platziere die Maus vorsichtig in der Mitte der Arena. Beobachten und notieren Sie das Verhalten der Maus für 5 Minuten.
    4. Stoppen Sie am Ende der Dauer die Aufzeichnung, entfernen Sie die Maus und setzen Sie sie wieder in den Gehäusekäfig ein.
    5. Messen Sie mit der Tracking-Software das äußere und innere Verhalten beim Gehen, Klettern, Fliehen, Putzen, Immobilität, Totalüberquerungen, Stuhlgang und Wasserlassen, um das Ausmaß der Angstzustände, der Bewegungs-, Erkundungs- und emotionalen Aktivität der Probanden zu beurteilen.
  10. Führen Sie den Morris-Wasserlabyrinth-Test (MWM) durch.
    1. Bereiten Sie das 120 cm Durchmesser und 60 cm tiefe Wasserlabyrinth in stabiler Position in einem Verhaltenslabor bei 23 ± 1 °C vor.
    2. Teilen Sie das Labyrinth in vier imaginäre Quadranten auf und hängen Sie verschiedene visuelle Hinweise (in Form und Farbe) in der Mitte jedes Quadranten der Labyrinthwände etwa 20 cm von der Basis entfernt auf. Positionieren Sie eine 17 cm lange Plattform mit einem Durchmesser von 10 cm 20 cm von der Wand entfernt.
      HINWEIS: Das Labyrinth, die Hinweise und die Plattform sollten ihre Position nicht ändern, damit Mäuse ihr Gedächtnis genau trainieren können.
    3. Füllen Sie das Labyrinth mit 21-26 °C heißem Wasser bis 1 cm unter der Plattform und färben Sie es mit einem schwarzen Mehrflächen-Acrylfarbstoff an.
      HINWEIS: Bei Verwendung anderer Mäusestämme sollte das Wasser mit einer Kontrastfarbe der Mäuse gefärbt werden, um sie überwachen zu können.
    4. Platzieren Sie die Kamera an einer Position, die das gesamte Bild aufnimmt, und verbinden Sie sie mit der MWM Software auf dem Computer.
      HINWEIS: Der Plattformplatz sollte im Programm für den fünften Testtag zugewiesen werden.
    5. Der Test dauert 5 Tage mit jeweils vier Versuchen. Beginnen Sie in den ersten vier Tagen mit der Aufnahme und beginnen Sie den Versuch, indem Sie den Probanden jeden Tag vorsichtig in einen anderen Quadranten stellen, wobei das Gesicht zur Panzerwand gerichtet ist.
    6. Weisen Sie den Standort der Plattform im Testplan für Tag 5 zu.
      HINWEIS: Dadurch wird verhindert, dass die Probanden ein assoziatives Gedächtnis bilden. Eine sorgfältige Platzierung der Motive im Wasser und die Aufrechterhaltung der richtigen Temperatur sind unerlässlich, um zusätzliche äußere Belastungen zu vermeiden. Testversionen dauern 5 Minuten und enden automatisch, wenn (i) die Plattform erreicht ist (ii) das Zeitlimit von 5 Minuten abläuft. Im Laufe der Tage sollten die Probanden den Standort der Plattform kennenlernen und sie in kürzerer Zeit finden.
    7. Am fünften Tag entfernst du die Plattform und platzierst die Mäuse vorsichtig in einem Quadrat des Labyrinths, wie zuvor beschrieben.
      HINWEIS: Die Testversion endet automatisch, wenn (i) die Maus die Plattform findet und betritt, (ii) das Zeitlimit von 5 Minuten abläuft. Gesunde Probanden sollten den Standort der vorherigen Plattform finden. Die Software berechnet automatisch die Zeit, die die Maus benötigt hat, um die Plattform in jedem Versuch zu finden, und hilft dabei, das Kurz- und Langzeitgedächtnis sowie die Lernfähigkeiten der Probanden zu bewerten.

6. Bestätigung einer Hypoxieschädigung bei adulten Mäusen

  1. Nachdem die Verhaltenstests abgeschlossen sind, opfern Sie die Probanden durch Gebärmutterhalsluxation.
  2. Entnahme von Hippocampus-Gewebe und Blutproben von 6 Mäusen jeder Gruppe, einschließlich der Schein-Kontrollgruppe, für die molekulare Analyse (Abschnitt 7).
  3. Legen Sie die Gehirne der verbleibenden 4 Mäuse in 10%ige Formaldehydlösung, um die Auswirkungen der Hypoxie-Exposition während der Neugeborenenperiode auf die Gehirnmorphologie bei Erwachsenen zu untersuchen.
  4. Verwenden Sie die gleiche Technik wie zuvor in Abschnitt 4 beschrieben, um die histologische Analyse von adulten Mausgehirnen durchzuführen.

7. Gesamt-RNA-Isolierung aus Proben der adulten Phase

  1. Geben Sie 500 μl Trizol zu jeder Gewebeprobe und 500 μl Blut.
  2. Für Hirngewebe homogenisieren Sie die Proben mit einer Spritze.
  3. Die Mischung 5 min bei RT inkubieren.
  4. Geben Sie 200 μl Chloroform in jedes Röhrchen und inkubieren Sie weitere 5 Minuten bei RT.
  5. Zentrifugieren Sie bei 12.000 g für 20 min bei +4 °C.
  6. Übertragen Sie die wässrige Phase (RNA) vorsichtig in ein neues steriles Röhrchen.
  7. Fügen Sie Isopropanol (Verhältnis 1:1 zur wässrigen Phase) hinzu und inkubieren Sie die Mischung über Nacht. (ein STOP-Punkt/ -20 °C).
  8. Am nächsten Tag bei 12.000 g für 10 min bei +4 °C zentrifugieren.
  9. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig und geben Sie 1000 μl 75 % Ethanol in das Pellet.
  10. Zentrifugieren Sie bei 7.500 × g für 5 min bei +4 °C.
  11. Wiederholen Sie den Ethanol-Waschschritt zweimal.
    HINWEIS: Wenn das Pellet zu klein ist, reicht eine Wäsche aus.
  12. Entsorgen Sie den Überstand und lassen Sie das Pellet bei RT an der Luft trocknen.
  13. Sobald das Pellet vollständig getrocknet ist, resuspendieren Sie es mit 50 μl NFW und inkubieren Sie es 10-15 Minuten lang bei +4 °C.
  14. Messen Sie die RNA-Konzentration spektrophotometrisch.
  15. Lagern Sie RNA-Proben bis zur weiteren Analyse bei -80 °C.

8. Komplementäre DNA-Synthese (cDNA)

  1. Bereiten Sie auf einem kühlenden Gestell von +4 °C die RNA-Proben vor, die aus Blut und Hirngewebe isoliert wurden.
  2. Bereiten Sie die beschrifteten PCR-Röhrchen vor.
  3. Mischen Sie die Reagenzien des cDNA-Synthesekits gemäß den Anweisungen des Herstellers.
  4. Bereiten Sie für jede Probe insgesamt 14 μL des Reaktionsgemisches vor und verteilen Sie es auf die Röhrchen.
  5. Fügen Sie der Mischung 6 μl RNA-Probe hinzu.
  6. Führen Sie die cDNA-Synthese im PCR-Gerät unter den vom Hersteller angegebenen Temperatur- und Zeitbedingungen durch.
    HINWEIS: Die in diesem Stadium synthetisierte cDNA kann bis zur weiteren Verwendung bei -80 °C gelagert werden.
  7. Verdünnen Sie die synthetisierte cDNA im Verhältnis 1:5.
  8. Lagern Sie die verdünnte cDNA bei -80 °C für zukünftige qPCR-Analysen.

9. Quantitative real-time PCR für die Expression von miRNA (miR-19a-3p, miR-361-5p, miR-150-5p, miR-126-3p, miR-499a-5p und U6 small nuclear RNA als Normalisierungskontrolle)

  1. Entwerfen Sie die Primer für jede miRNA (siehe Ergänzende Tabelle 2 für Sequenzen).
  2. Bereiten Sie das PCR-Reaktionsgemisch gemäß den Anweisungen des Herstellers vor.
  3. Geben Sie 14 μl des Reaktionsgemisches in jede Vertiefung einer 96-Well-PCR-Platte.
  4. Geben Sie 6 μl der 1:5 verdünnten cDNA in jede Vertiefung, um ein Gesamtreaktionsvolumen von 20 μl zu erhalten.
  5. Führen Sie für jede Probe eine PCR in doppelter Ausführung durch, um Schwankungen zu minimieren, indem Sie dieses Programm befolgen: Anfängliche Denaturierung bei 95 °C für 120 s, 45 Denaturierungszyklen bei 95 °C für 10 s, Glühen und Amplifizieren bei 56 °C für 60 s und Analyse der Schmelzkurve bei 60 °C für 15 s, dann bei 95 °C.
  6. Analysieren Sie die Ergebnisse mit Ct-Werten (Zyklusschwellenwert) und normalisieren Sie die Daten mit der 2-ΔΔCt-Methode .

10. Statistische Auswertung

  1. . Beurteilen Sie die Normalität der Daten anhand von Histogrammen, Q-Q-Diagrammen und dem Shapiro-Wilk-Test zur Analyse von miRNA-Expressionsdaten.
    1. Wenn die Daten normalverteilt sind, verwenden Sie die unidirektionale ANOVA.
    2. Wenn die Daten nicht normalverteilt sind, wenden Sie den Kruskal-Walli-Test, den Student-t-Test oder den Mann-Whitney-U-Test an.
  2. Verwenden Sie bei der Bewertung der geschlechtsspezifischen Unterschiede innerhalb jeder Gruppe je nach Verteilung der Daten entweder den t-Test des Schülers oder den Mann-Whitney-U-Test. Die statistische Signifikanz wird durch einen p-Wert von <0,05 bestimmt.
    HINWEIS: Alle Analysen sollten mit einer geeigneten Statistiksoftware durchgeführt werden. Hier kommt GraphPad Prism 8 zum Einsatz.
  3. Beurteilen Sie die Normalität der Daten anhand von Histogrammen, Q-Q-Diagrammen und dem Shapiro-Wilk-Test, um die Ergebnisse von Verhaltensexperimenten zu analysieren.
    1. Wenn die Daten normalverteilt sind, verwenden Sie eine bidirektionale ANOVA.
    2. Führen Sie für Daten, die nicht normalverteilt sind, den Kruskal-Walli-Test, den Student-t-Test oder den Mann-Whitney-U-Test durch.
    3. Bewerten Sie die geschlechtsspezifischen Unterschiede innerhalb jeder Gruppe anhand des t-Tests oder des Mann-Whitney-U-Tests des Schülers, abhängig von der Verteilung der Daten. Auch hier gilt: Betrachten Sie die Ergebnisse als statistisch signifikant, wenn der p-Wert < 0,05 beträgt.
  4. Verwenden Sie für immunhistochemische Analysen die Zwei-Wege-ANOVA, gefolgt von Tukeys Post-hoc-Test, um weibliche und männliche Gruppen zu vergleichen.
  5. Um weibliche und männliche Gruppen innerhalb jeder Hypoxie-Bedingung zu vergleichen, verwenden Sie den Post-hoc-Test von Sidak. Die statistische Signifikanz wird bestimmt, wenn der p-Wert < 0,05 beträgt.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

In dieser Studie wurden trächtige Balb/c-Mäuse während der Entbindung hypoxischen Bedingungen von 8 % O2 (schwer), 10 % O2 (mäßig) und 12 % O2 (leicht) ausgesetzt, und die neugeborenen Mäuse wurden 5 Minuten lang unter diesen hypoxischen Bedingungen gehalten, um Modelle für leichte, mittelschwere und schwere neonatale Hypoxie zu erstellen. Die Gruppe, die als Scheinkontrollgruppe bezeichnet wurde, wurde normoxischen (21%O2) Geburtsbedi...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Perinatale Hypoxie, ein großes Gesundheitsproblem bei Neugeborenen, kann molekulare, zelluläre und neuronale Veränderungen verursachen, indem sie kritische Entwicklungsprozesse stört, und wurde mit verschiedenen neurologischen Entwicklungsstörungen in Verbindung gebracht, einschließlich der Autismus-Spektrum-Störung (ASS)1. Während schwere Hypoxie umfassend auf ihre unmittelbaren Auswirkungen untersucht wurde, sind die langfristigen Folgen einer leichten bis mitte...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.

Danksagungen

Diese Studie wurde vom Wissenschaftlichen und Technologischen Forschungsrat der Türkei (TÜBİTAK) finanziert, und die Autoren danken Celalettin Göktaş (Transgene Tiereinrichtung) und der Biologin Selda Taşdemir (Verhaltenslabor).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
(-20 & Grad; C) GefrierschrankSiemens KD86NAWE0N
(+4 ° C) BlockAntagen Biosciencehttps://antagen.net/product/384-well-pcr-plate-rack-cat-rkp384/
(+4 ° C) KühlschrankSiemens KD86NAWE0N
(-20 & Grad; C) BlockCleaver Sientifichttps://www.cleaverscientific.com/electrophoresis-products/coolcube-storage-rack/
Absolutes EthanolMerck1070172511
AmmoniumacetatSigma238074-500G
Analytisches Gleichgewicht  Adam EquipmentLAB214i
ChloroformMerck1024451000
Zitronensäure  Merck100241
ComputerHPhttps://www.hp.com/us-en/shop/pdp/hp-all-in-one-24-cr1000t-238-9p2v3av-1
EDTASigmaE9884-1KG
Entellan Merck107961
EosinMerck109844
Ependorf (1,5 mL)?solab078.03.021
Ethovision-SystemNoldushttps://noldus.com/ethovision-xt
EtuvNUVEEN 400/500 N/A
Falcon-Röhren (15 mL)Isolab078.02.001
FormaldehydMerck104002
Heat CameraSamsungSC2000
HämatoxylinMerck105175
HIF-1α AntikörperBiossBS-20398R 
Hypoxie-Kammern BiospherixA-Chamber
IsoproponalMerck1096342511
Light Cycler 480 IIRoche5015278001
Käfig von Marble Burying TestVishnu https://guide.labanimal.com/product/standard-housing-stainless-steel
Mikrozentrifugenröhren (1,5 mL)Greiner616201
Mikropipettenspitzen (100 & Micro; L)Greiner774353
Mikropipettenspitzen (1000 & Mikro; L)Greiner778353
Mikropipetten (10 & Mikro; L)GilsonFD10001
Mikropipetten (100 & Mikro; L)GilsonFD10004
Mikropipetten (1000 & Mikro; L)GilsonFD10003
Mikropipettenspitzen (10 & Mikro; L)Greiner772353
Mikropipetten(2 & Mikro; L)GilsonGFAM00064
MikroskopieOlympusBx53
miRCURY LNA RT Kit (cDNA-Synthesekit)Qiagen339340
miRCURY LNA SYBR Grünes PCR-SetQiagen339346
MehrfachbrunnenplattenRoche4729692001
NanospektrophotometerShimadzuC101-E112
Arena des Novel Object Recogniton TestGlobale Biotechnologie137
Arena des Open Field TestGlobale Biotechnologie117
Oxycycler BiospherixA42OC
Paraffin Leica 39602012
PBS TabletSigmaP4417-50TAB
PCR-GerätSensoquestT3-0140
PlattendrehungPeqlab91-PSPIN-P
PrismaGraphPadhttps://www.graphpad.com/
Proteinase KSigmaP6556-10MG
QIAzol Lysis Reagenz IsolationsreagenzQiagen79306
SDSSigma8170342500
Seconder Antibody AbcamA0545-1ML
Die drei Kammern des Social Interaction TestsGlobale Biotechnologie118
SpinGilsonPMC880
Spritze (2 ml)Baybihttps://beybi.com.tr/urunler/medikal-urunler/medikal-sarf-malzemeleri/parcali-enjektorler
Aufbau des HeckaufhängungstestsSelf Made findet man ähnliche Angebote bei Harvard ApparatusSelf Made, ähnliches findest du unter (https://www.harvardapparatus.com/tail-suspension-test.html)
ThermomixerEppendorf#5355
Trizma-BasisSigma1503-1KG
VortexHeidolph541-10000-00-1
Xylenes Isolab 9,90,01,92,501

Referenzen

  1. Bonkowsky, J. L., Son, J. -H. Hypoxia and connectivity in the developing vertebrate nervous system. Dis Model Mech. 11 (12), dmm037127(2018).
  2. Dunwoodie, S. L. The role of hypoxia in development of the mammalian embryo. Dev Cell. 17 (6), 755-773 (2009).
  3. Beck, S., et al. The worldwide incidence of preterm birth: a systematic review of maternal mortality and morbidity. Bull World Health Organ. 88 (1), 31-38 (2010).
  4. Milash, B., et al. Temporal dysynchrony in brain connectivity gene expression following hypoxia. BMC Genomics. 17 (1), 334(2016).
  5. Adachi, K., Umezaki, H., Kaushal, K. M., Ducsay, C. A. Long-term hypoxia alters ovine fetal endocrine and physiological responses to hypotension. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 287 (1), R209-R217 (2004).
  6. Imamura, T., Umezaki, H., Kaushal, K. M., Ducsay, C. A. Long-term hypoxia alters endocrine and physiologic responses to umbilical cord occlusion in the ovine fetus. J Soc Gynecol Investig. 11 (3), 131-140 (2004).
  7. Fajersztajn, L., Veras, M. M. Hypoxia: from placental development to fetal programming. Birth Defects Res. 109 (17), 1377-1385 (2017).
  8. Ruas, J. L., Poellinger, L. Hypoxia-dependent activation of HIF into a transcriptional regulator. Semin Cell Dev Biol. 16 (4-5), 514-522 (2005).
  9. Mukandala, G., Tynan, R., Lanigan, S., O'Connor, J. J. The effects of hypoxia and inflammation on synaptic signaling in the CNS. Brain Sci. 6 (1), 6(2016).
  10. Lee, S., et al. Gene networks associated with non-syndromic intellectual disability. J Neurogenet. 32 (1), 6-14 (2018).
  11. Fattuoni, C., Palmas, F., Noto, A., Fanos, V., Barberini, L. Perinatal asphyxia: a review from a metabolomics perspective. Molecules. 20 (4), 7000-7016 (2015).
  12. Locci, E., et al. Exploring perinatal asphyxia by metabolomics. Metabolites. 10 (4), 141(2020).
  13. De Haan, M., et al. Brain and cognitive-behavioural development after asphyxia at term birth. Dev Sci. 9 (4), 350-358 (2006).
  14. Armstrong-Wells, J., Bernard, T. J., Boada, R., Manco-Johnson, M. Neurocognitive outcomes following neonatal encephalopathy. NeuroRehabilitation. 26 (1), 27-33 (2010).
  15. Gardener, H., Spiegelman, D., Buka, S. L. Prenatal risk factors for autism: comprehensive meta-analysis. Br J Psychiatry. 195 (1), 7-14 (2009).
  16. Hicks, S. D., Middleton, F. A. A comparative review of microRNA expression patterns in autism spectrum disorder. Front Psychiatry. 7, 176(2016).
  17. Cassidy, F. C., Charalambous, M. Genomic imprinting, growth and maternal-fetal interactions. J Exp Biol. 221 (Suppl_1), jeb164517(2018).
  18. Serocki, M., et al. miRNAs regulate the HIF switch during hypoxia: a novel therapeutic target. Angiogenesis. 21 (2), 183-202 (2018).
  19. Ozkul, Y., et al. A heritable profile of six miRNAs in autistic patients and mouse models. Sci Rep. 10 (1), 9011(2020).
  20. Siniscalco, D., et al. Autism spectrum disorders: is mesenchymal stem cell personalized therapy the future. J Biomed Biotechnol. 2012, 480289(2012).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Weitere Artikel entdecken

Neonatale HypoxieMicroRNA-DysregulationVerhaltenstestsMorris-WasserlabyrinthObjekterkennungstestMarble-Burying-TestSozialinteraktionstestNeurodegenerationsmarkerFrühintervention
Hypoxie verändert miRNAs-Spiegel, die an der nicht-Mendelschen Vererbung der Autismus-Spektrum-Störung bei Mäusen beteiligt sind
Kontaktieren Sie uns
Der Bibliothek empfehlen

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Urheberrecht © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.