Schnelle Diagnose von Mycobacterium tuberculosis-Infektionen und Arzneimittelresistenzen auf der Grundlage von Echtzeit-Fluoreszenz-PCR

Zusammenfassung

Hier wird ein Protokoll zum Nachweis von Mycobacterium tuberculosis und seiner Arzneimittelresistenz mittels der quantitativen Echtzeit-Fluoreszenz-PCR (qPCR)-Technologie vorgestellt.

Zusammenfassung

Tuberkulose (TB) ist ein großes Gesundheitsproblem, von dem gefährdete Bevölkerungsgruppen unverhältnismäßig stark betroffen sind. Das Auftreten und die Ausbreitung arzneimittelresistenter Tuberkulose stellen eine ernsthafte Bedrohung für die globale öffentliche Gesundheit dar. Traditionelle Diagnosemethoden für Mycobacterium tuberculosis (MTB), wie z. B. Abstrichmikroskopie und Kultur, haben erhebliche Einschränkungen und führen oft zu einer verzögerten klinischen Behandlung. Um dieser Herausforderung zu begegnen, wurde ein effizientes diagnostisches Verfahren entwickelt, das auf Echtzeit-Fluoreszenz-PCR basiert. Aus Testproben können hochwertige MTB-Nukleinsäuren extrahiert werden, und der Resistenzstatus kann an wichtigen Resistenzstellen identifiziert werden. Im Vergleich zu herkömmlichen Methoden reduziert dieser Ansatz die Nachweiszeit erheblich auf nur wenige Stunden, so dass der Infektions- und Resistenzstatus kurz nach dem ersten Besuch eines Patienten bestimmt werden kann. Die Nachweissensitivität liegt bei über 85 % und die Spezifität bei 95 %. Diese nicht-invasive Technologie minimiert nicht nur die Beschwerden der Patienten, sondern unterstützt aufgrund ihrer geringen Kosten und hohen Effizienz auch eine genaue Diagnose in medizinischen Einrichtungen an der Basis. Insgesamt stellt der Ansatz eine deutliche Verbesserung der TB-Diagnostik dar.

Einleitung

Tuberkulose (TB), eine chronische Infektionskrankheit, die durch Mycobacterium tuberculosis (MTB) verursacht wird, gehört zu den zehn häufigsten Todesursachen weltweit¹. Arzneimittelresistente Tuberkulose (DR-TB) stellt eine große Herausforderung für die Bemühungen zur Bekämpfung der Tuberkulose dar. Der Aktionsplan für den Aufbau TB-freier Gemeinschaften (2022-2027), der vom chinesischen Zentrum für die Kontrolle und Prävention von Krankheiten (China CDC) herausgegeben wurde, betont die Notwendigkeit eines frühzeitigen Screenings auf Arzneimittelresistenzen bei allen bakteriologisch bestätigten Lungentuberkulose-Patienten². Sie befürwortet die Einführung neuartiger molekulardiagnostischer Technologien, um die Erkennungsmöglichkeiten von DR-TB zu verbessern, die Diagnosezeiten zu verkürzen, die Identifizierung von DR-TB-Fällen zu maximieren, eine standardisierte Behandlung und Behandlung zu gewährleisten und die notwendigen Maßnahmen zur Infektionskontrolle^{umzusetzen 3}. Darüber hinaus wird in der Notice on Strengthening DR-TB Prevention and Control (Nr. 4, 2023) die landesweite Förderung fortschrittlicher Diagnosetechniken vorgeschrieben. Sie fordert ein rechtzeitiges Resistenzscreening für alle bakteriologisch bestätigten TB-Patienten, um ein universelles Screening zu erreichen, die diagnostische Standardisierung zu verbessern und die Zugänglichkeit der Gesundheitsversorgung zu verbessern⁴.

DR-TB bezieht sich auf TB-Fälle, die gegen mindestens ein Anti-TB-Medikament resistent sind. Zu den aktuellen Klassifizierungen gehören Rifampicin-resistente (RR), monoresistente, polyresistente, multiresistente (MDR), präextensiv arzneimittelresistente (prä-XDR) und extensiv arzneimittelresistente (XDR) TB. Eine globale Metaanalyse der DR-TB-Epidemiologie zeigt alarmierende Resistenzraten: MDR-TB bei 11,6 %, Isoniazid-Resistenz bei 15,7 %, Rifampicin-Resistenz bei 9,4 % und Monoresistenz bei 11,8 %. Diese Daten unterstreichen die Schwerkraft und Komplexität von DR-TB⁵.

Rifampicin und Isoniazid sind Eckpfeiler der Medikamente für die Behandlung von TB. Die Weltgesundheitsorganisation (WHO) stellt jedoch fest, dass zwar schnelle Diagnosetechnologien für Rifampicin-Resistenz verfügbar sind, es jedoch an analogen Instrumenten für die Isoniazid-Resistenz mangelt. Diese Lücke erschwert die rechtzeitige Diagnose von multiresistenter TB (MDR-TB). Die vorläufige Definition von "Rifampicin-resistenter TB" spiegelt diese diagnostische Einschränkung wider und unterstreicht die unzureichende Fähigkeit, Resistenzen gegen andere Arzneimittel schnell zu erkennen ^6,7. Die WHO schätzt, dass Isoniazid-resistente TB-Fälle doppelt so häufig sind wie Rifampicin-resistente Fälle. Wenn man sich ausschließlich auf das Rifampicin-Resistenz-Screening verlässt, besteht die Gefahr, dass die Isoniazid-monoresistente TB (Hr-TB)⁸ übersehen wird. Unentdeckte Hr-TB-Patienten, die mit Standardtherapien behandelt werden, haben ein erhöhtes Risiko für Behandlungsversagen, Rückfall und Progression zu MDR-TB⁹. Die Ethambutol-Resistenz ist ebenfalls besorgniserregend. Als wichtiges Medikament für die Behandlung von TB und MDR-TB ergab die chinesische DR-TB-Basisumfrage 2017 eine Ethambutol-Resistenzrate von 4,9 % bei neuen Fällen und 17,2 % bei erneuten Behandlungen¹⁰.

Gegenwärtig ist die künstliche Kultur für den Nachweis der Arzneimittelresistenz von Resttuberkulose in einigen Labors noch die bevorzugte Methode, aber die Echtzeit-Fluoreszenz-PCR-Technologie ist herkömmlichen Methoden beim Nachweis der Arzneimittelresistenz der Tuberkulose überlegen: Nachweis und Quantifizierung: Die Echtzeit-Fluoreszenz-PCR bietet eine genaue quantitative Analyse durch Echtzeitüberwachung von Fluoreszenzsignalen, während herkömmlichen Methoden diese Genauigkeit fehlt. Traditionelle Versuchsmethoden sind zeit- und arbeitsintensiv, erfordern geschultes Personal und sind sehr subjektiv. Im Gegenteil, bei der Real-Time-PCR werden Fluoreszenzsonden und -signale per Computer erfasst, wodurch menschliche Fehler minimiert werden. Herkömmliche Datenanalysemethoden sind subjektiver, während die Echtzeit-PCR eine genaue und objektive Analyse durch Amplifikationskurven, Standardkurven und andere Analysemethoden ermöglicht. Diese Fortschritte machen die Echtzeit-Fluoreszenz-PCR zur bevorzugten Methode zum Nachweis von Arzneimittelresistenzen bei Tuberkulose¹¹.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass sich die arzneimittelresistente Tuberkulose (DR-TB) zu einer globalen Krise entwickelt hat. Die Resistenz gegen wichtige Medikamente - Isoniazid, Rifampicin und Ethambutol - erschwert die Bemühungen zur Kontrolle der Tuberkulose zusätzlich. Die rechtzeitige und genaue Erkennung von Arzneimittelresistenzen ist entscheidend für maßgeschneiderte Behandlungsschemata, die Verbesserung des Therapieerfolgs und die Eindämmung der DR-TB-Bedrohung.

Um die diagnostische Herausforderung anzugehen, wurde in dieser Studie ein Kit verwendet, das Mycobacterium tuberculosis identifizieren und arzneimittelresistente Mutationen innerhalb von 3,5 Stunden anhand von Sputumproben nachweisen kann. Dies wurde mit Unterstützung der real-time Fluoreszenz-qPCR erreicht. Die Methode ist einfach, kostengünstig und genau, was sie zu einem wertvollen Werkzeug im Kampf gegen DR-TB macht.

Protokoll

Diese Forschung wurde von der Ethikkommission des Fünften Divisionskrankenhauses des Produktions- und Baukorps von Xinjiang genehmigt. Die Ethikzahl ist LLWYH2025001, und es gibt keinen ethischen Konflikt. Die verwendeten Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Probenentnahme

1. Verwenden Sie international standardisierte Sputumflaschen mit Schraubverschluss, die von der Weltgesundheitsorganisation (WHO) empfohlen werden, oder versiegelte Plastikboxen und Wachspapierboxen, um Sputumproben zu entnehmen.
2. Beschriften Sie die Sputumbehälter mit dem Namen des Patienten, der Nummer (die ambulante Sequenznummer für neue Patienten oder die Registrierungsnummer für Nachsorgepatienten), den Untersuchungsgegenständen und den Behältersequenznummern 1, 2, 3 (1 = sofortiger Sputum am selben Tag, 2 = Nachtauswurf, 3 = morgendlicher Sputum am nächsten Tag). Bei Patienten ohne Sputum ist die Entnahme von Proben durch aerosolinduzierte Sputumentnahme zu entnehmen.
   HINWEIS: Das Personal sollte die Qualität der gesammelten Sputumproben bewerten. Das Probenvolumen sollte im Allgemeinen bei 3-5 ml gehalten werden. Zu den qualifizierten Proben gehören trockener Sputum, brauner blutbefleckter Sputum, Sputum mit einer geringen Menge frischem Blut oder schleimiger Sputum. Nicht qualifizierte Proben, wie z. B. Speichel, sollten nach weiteren Leitlinien erneut zur Untersuchung eingereicht werden.

2. Sputum-Vorverarbeitung

1. Geben Sie das 1-2-fache des Volumens von 4% NaOH-Lösung in den Sputumbehälter, basierend auf dem Volumen des gesammelten Auswurfs. Schütteln und den Inhalt 2 Minuten lang mischen.
2. Stellen Sie den Behälter für 15 Minuten bei Raumtemperatur in eine Biosicherheitswerkbank und schütteln Sie ihn während dieser Zeit mehrmals, um eine vollständige Verflüssigung des Auswurfs zu gewährleisten.
   HINWEIS: Behandeln Sie NaOH aufgrund seiner korrosiven Natur mit Vorsicht. Wenn der Auswurf nicht vollständig verflüssigt ist, verlängern Sie die Schüttelzeit. Dieser Schritt ist während des gesamten Experiments besonders wichtig.

3. Reagenzienvorbereitung (Prä-PCR-Bereich)

1. Vorbereitung der Reagenzien: Bereiten Sie die Reagenzien im dafür vorgesehenen Prä-PCR-Bereich vor. Tauen Sie gefrorene Reagenzien auf Raumtemperatur auf. Vortex für 5-10 s. Bei 3000 × g 5-10 s bei Raumtemperatur zentrifugieren.
   HINWEIS: Dieses Reagenz ist ein Dual-System (A/B) und muss separat hergestellt werden.
2. PCR-Mastermix-Vorbereitung
   1. Mix A: Kombinieren Sie in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen (n + 3) × 19,6 μl RIF PCR Mix A und (n + 3) × 0,4 μl TB-Enzym. Vortex für 5-10 s. Zentrifugieren Sie bei 3000 × g für 5-10 s bei Raumtemperatur (PCR Mix A: 60 μL).
   2. Mix B: Kombinieren Sie in einem weiteren 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen (n + 3) × 19,6 μl RIF PCR Mix B und (n + 3) × 0,4 μl TB-Enzym. Vortex und Zentrifuge wie oben (PCR Mix B: 60 μL).
3. Lagerung und Verwendung: Lagern Sie die vorbereiteten Mastermixe bei ≤−18 °C. Bei unverzüglicher Anwendung innerhalb von 4 h aufbrauchen.
   HINWEIS: Das gleiche Protokoll gilt für EMB- und INH-Reagenzien.
4. Aliquotierender PCR-Mastermix: Dispensieren Sie 20 μl PCR-Mix A und Mix B in separate dünnwandige PCR-Reaktionsröhrchen. Aliquotierte Röhrchen in versiegelten Beuteln in den Extraktionsbereich überführen.

4. Nukleinsäureextraktion und Probenbeladung (Extraktionsbereich)

1. Zentrifugieren Sie 1,2 mL vollständig verflüssigten Auswurf bei 15.058 × g für 5 min bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie den Überstand und behalten Sie das Pellet. Optional: Zentrifugieren Sie die gesamte aufgeschlossene Probe, wenn die Ausrüstung dies zulässt.
2. Das Pellet in 1,2 mL Kochsalzlösung resuspendieren, vortexen und bei 15.058 × g für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren. Wiederholen Sie diesen Waschschritt dreimal.
3. Geben Sie 250 μl TB-Extraktionspuffer zum Pellet. Vortex und thermische Lyse bei 99 °C für 10 min. Auf Raumtemperatur abkühlen lassen. Bei 15.058 × g für 1 min bei Raumtemperatur zentrifugieren und den Überstand (extrahierte Probe) entnehmen.
   HINWEIS: Bei viskosen Proben ist das Volumen des Verflüssigungspuffers zu erhöhen oder die Vortexzeit zu verlängern. Wenn die Proben ausschließlich für die DNA-Extraktion bestimmt sind, verlängern Sie die Verflüssigungszeit, um einen vollständigen Aufschluss zu gewährleisten.
4. Geben Sie mit einer Mikropipette 5 μl extrahierte Probe oder Negativ-/Positivkontrollen in jedes dünnwandige PCR-Reaktionsröhrchen. Tuben sofort verschließen und entsprechend etikettieren.
5. Vortex-beladene PCR-Röhrchen für 5-10 s und kurz zentrifugieren (5-10 s). Übertragen Sie die Röhrchen in den PCR-Amplifikationsbereich.

5. PCR-Amplifikation (Amplifikationsbereich)

HINWEIS: Programme zur Erkennung von Rifampicin-, Ethambutol- und Isoniazid-Resistenzen wurden auf einem Hongshi-Thermocycler eingestellt (Tabelle 1, Tabelle 2 und Tabelle 3). Die Bedingungen für das Radfahren sind inbegriffen.

1. Legen Sie die beladenen dünnwandigen PCR-Reaktionsgefäße zur Amplifikation in den Thermocycler.
2. Greifen Sie auf die Cycler-Schnittstelle zu. Klicken Sie auf Experiment Wizard und wählen Sie den Versuchstyp als Standard-Schmelzekurve aus (wie in Abbildung 1 gezeigt).
3. Klicken Sie auf Platteneditor, wählen Sie horizontal zwei benachbarte leere Vertiefungen aus und weisen Sie die entsprechende Wirkstoffvorlage aus dem rechten Bereich zu, um eine Probe zu definieren (wie in Abbildung 2 gezeigt).
4. Konfigurieren Sie Negativ-/Positivkontrollen und Probeninformationen. Klicken Sie auf Start , um das Programm zu starten. Die Laufzeit beträgt 2 h und 22 min.
5. Nach Abschluss werden die dünnwandigen PCR-Reaktionsgefäße (versiegelt) in einen versiegelten Beutel überführt. Sichern Sie den Verschluss und den Griff als biologisch gefährlichen Abfall.
6. Klicken Sie auf dem Thermocycler auf Analysieren , um die Daten zu verarbeiten.
   HINWEIS: Die Nachweisgrenzen dieser Methode sind wie folgt: Zusammengesetzte Gruppe: 10 Bakterien/ml; Rifampicin: 20.000 Bakterien/ml; Isoniazid: 10.000 Bakterien/ml; Ethambutol: 10.000 Bakterien/ml. (Die Nachweisgrenze (Limit of Detection (LoD)-Daten stammen aus der statistischen Analyse von 765 klinischen Fällen, die in der Bedienungsanleitung für Reagenzien angegeben sind.)

6. Interpretation des Ergebnisses

1. Bestimmen Sie Mutationen, indem Sie die Unterschiede der Schmelztemperatur (Tm) zwischen Testproben und Positivkontrollen vergleichen.
   HINWEIS: Wildtyp (arzneimittelsensitiv): Die Tm-Werte der Probe stimmen in allen vier Kanälen mit der Positivkontrolle überein (Abweichung ≤1 °C). Mutante (arzneimittelresistent): Der Tm-Wert in jedem Kanal ist ≥2 °C niedriger als der der Positivkontrolle (ΔTm ≥2 °C).

Ergebnisse

In dieser Studie wurden Echtzeit-Fluoreszenz-PCR und Schmelzkurvenanalyse verwendet, um Sputumproben von 17 Tuberkulosepatienten zu testen. Darüber hinaus wurden 30 Patienten auf Rifampicin-Resistenztests getestet und 20 auf Resistenz gegen Isoniazid und Ethambutol getestet. Die real-time Fluoreszenz-PCR-Methode zeigte eine positive Nachweisrate von 88,2 % für den Mycobacterium tuberculosis-Komplex .

Diskussion

Das Auftreten von arzneimittelresistenten Mycobacterium tuberculosis-Komplex-Stämmen (MTBC) auf globaler Ebene hat die Behandlung von Tuberkulose-Patienten (TB) erheblich erschwert. Insbesondere die multiresistente (MDR) und extensiv resistente (XDR) Tuberkulose stellt die Tuberkulosebekämpfung vor gewaltige Herausforderungen¹². Der schnelle Nachweis von Arzneimittelresistenzen ist entscheidend für die Entwicklung geeigneter Behandlungsschemata, die Verhi...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Hochgeschwindigkeitszentrifuge
Lysepuffer	Xiamen Zhishan Biotechnology Co., Ltd.
Mycobacterium tuberculosis Ethambutol Resistance Mutation Detection Kit	Xiamen Zhishan Biotechnology Co., Ltd.
Mycobacterium tuberculosis Isoniazid-Resistenz-Mutationsnachweis-Kit	Xiamen Zhishan Biotechnology Co., Ltd.
Mycobacterium tuberculosis Nachweis von Rifampicin-Resistenzmutationen Ki	Xiamen Zhishan Biotechnology Co., Ltd.
SLAN-96P Real-Time-PCR-System	Shanghai Hongshi Medical Technology Co., Ltd.	SLAN-96P
Lösung zur Sputumverarbeitung	Xiamen Zhishan Biotechnology Co., Ltd.
TopPette Pipettierer

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