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Methodenartikel

Entnahme von Nasenspülflüssigkeit an der Maus ohne Blutkontamination

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DOI:

10.3791/68451

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11. Juli 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Kindai University Faculty of Medicine, 2Department of Arts and Sciences, Kindai University Faculty of Medicine

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine neuartige Methode zur Vermeidung von Blutkontaminationen in der murinen Nasenspülflüssigkeit (NLF). Da diese Methode die NLF-Entnahme ohne Blutkontamination gewährleistet, ermöglicht sie einen genaueren Nachweis von immunologischen Komponenten und verschiedenen Atemwegserregern.

Zusammenfassung

Proben der oberen Atemwege, einschließlich Nasenspülflüssigkeit (NLF) und Nasenabstriche, sind nützlich zum Nachweis von Krankheitserregern, einschließlich Viren und Bakterien, die Atemwegserkrankungen verursachen können. NLF wurde verwendet, um zelluläre und humorale Komponenten im Atmungssystem zu untersuchen, z. B. bei der Bewertung der Induktion von Immunglobulin (Ig) A nach Schleimhautimpfungen. Bei experimentellen Nagetieren können die NLF-Proben entweder auf transpharyngealem oder transtrachealem Weg entnommen werden. Obwohl berichtet wurde, dass der transpharyngeale Weg bei der Entnahme der NLF-Proben effizienter ist als der transtracheale Weg, waren die auf dem transpharyngealen Weg entnommenen NLF-Proben oft mit Blut kontaminiert, was sich auf den Gehalt an zellulären und humoralen Inhalten in den ursprünglichen NLF-Proben auswirkte. Daher zielte diese Studie darauf ab, eine neuartige NLF-Entnahmemethode bei Versuchsmäusen zu etablieren, um die Blutkontamination zu minimieren. Kurz bevor der Unterkiefer der Maus abgetrennt wurde, wurden Wattebällchen in den Mund gelegt, um Blut aufzunehmen. Wenn die Blutung gestoppt wurde, wurden die NLF-Proben entnommen, indem eine Mikropipette in die Choana eingeführt und zweimal mit 200 μl phosphatgepufferter Kochsalzlösung gespült wurde (Endvolumen: 400 μl/Maus). Um Blutkontaminationen nachzuweisen, wurde ein einfacher und empfindlicher forensischer Luminol-Test verwendet, der Hämoglobin nachweist. Der Luminol-Test zeigte, dass eine Blutkontamination in den NLF-Proben nachweisbar war, die nach der herkömmlichen Methode (ohne Wattebällchen) entnommen wurden, nicht jedoch in denen, die mit der neuartigen Methode (mit Wattebällchen) entnommen wurden. Aufgrund der Kontamination des Blutes waren die Gesamt-IgA- und IgG-Konzentrationen in den NLF-Proben bei der konventionellen Methode höher als bei der neuartigen Methode; Es ist bekannt, dass Blut viel höhere Spiegel an IgA und IgG enthält als NLF. Daher kann diese einzigartige Methode als einfache und empfindliche Methode zur Entnahme von NLF-Proben von Versuchsmäusen verwendet werden, um eine Blutkontamination zu verhindern.

Einleitung

Sowohl in der klinischen als auch in der Grundlagenforschung sind geeignete Methoden der Probenentnahme für die Bewertung der Ergebnisse von entscheidender Bedeutung. Die Nasenspülung ist eine Spültechnik, die zur Analyse der zellulären und humoralen Komponenten in den Atemwegen verwendet wird 1,2,3. Klinisch wurde die Nasenspülflüssigkeit (NLF) als wirksame nichtinvasive Probe für die Entdeckung von Biomarkern verwendet, wobei mehrere Studien ihre Verwendung bei verschiedenen Atemwegserkrankungen unterstützen, einschließlich Sinusitis, Mukoviszidose und allgemeinen Atemwegserkrankungen 4,5,6,7. Bei Versuchstieren wurde NLF auch zur Untersuchung von Modellen für Atemwegserkrankungen verwendet, einschließlich Influenza, Coronavirus-Krankheit-2019 (COVID-19) und allergischer Erkrankung 3,8,9. Diese Methode wird häufig verwendet, um wichtige inflammatorische Biomarker wie polymorphkernige Zellen und Zytokine zu bestimmen, die häufig als Indikatoren für Reaktionen auf Allergene, Asthma und Atemwegsinfektionen untersucht werden 10,11,12. In jüngerer Zeit wurden zur Untersuchung der Wirksamkeit und Sicherheit potenzieller intranasaler Impfstoffkandidaten häufig NLF-Proben von Versuchstieren entnommen, und die Konzentrationen von Krankheitserregern und Immunglobulin (Ig) in NLF-Proben wurden als Indikatorenquantifiziert 13.

Bei Versuchsmäusen kann NLF mit der transpharyngealen oder transtrachealen Methode entnommen werden. Bei der transpharyngealen Methode wurde der Mauskopf einschließlich der palatopharyngealen Region vom Kehlkopf getrennt, und dann wurde ein Katheter durch die Rachenöffnung in die Choana eingeführt, um phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) zu injizieren und NLF aus dem Nasenlochzu sammeln 14. Die transtracheale Methode verschaffte sich durch die Luftröhre Zugang zu den Atemwegen, ohne den Kopf abzutrennen, und NLF wurde aus dem Nasenloch entnommen, wodurch das Risiko einer Blutkontamination minimiert wurde. Obwohl diese beiden primären Methoden für die NLF-Sammlung bei Versuchsmäusen eingesetzt wurden, haben beide konventionellen Methoden ihre eigenen Grenzen. Es wurde gezeigt, dass die transtracheale Methode aufgrund des Austretens von transtrachealer Spülflüssigkeit in die Mundhöhle geringere Mengen an NLF liefert als die transpharyngeale Methode. Die vorherige Studie zeigte, dass nach der Injektion von PBS die zurückgewonnenen Flüssigkeitsvolumina in NLF 70%-80% bzw. 90%-100% bei der transtrachealen bzw. transpharyngealen Methode betrugen14. Obwohl die transpharyngeale Methode mit größeren Mengen an NLF als besser angesehen werden kann als die transtracheale Methode, war eine Blutkontamination während des Eingriffs bis zu einem gewissen Grad unvermeidlich14,15. In ähnlicher Weise haben mehrere Studien berichtet, dass NLF-Proben häufig mit hohen Konzentrationen von Blutserumproteinen kontaminiert waren 16,17,18. Dies kann den Nachweis und die Quantifizierung von NLF-spezifischen Biomarkern für Atemwegserkrankungen beeinträchtigen19. Dies kann sich auch auf die Ig-Konzentrationen, insbesondere IgA und IgG, in NLF-Proben auswirken, da Blut größere Mengen an IgA und IgG enthält als NLF.

Um diese Herausforderungen anzugehen, zielte diese Studie darauf ab, eine einzigartige, einfache und zuverlässige transpharyngeale Methode zur Entnahme von NLF-Proben von Versuchsmäusen zu etablieren, die Probenausbeute zu maximieren und die Blutkontamination zu minimieren. Während der experimentellen Prozesse wurden Wattebällchen in den Mund der Maus gelegt, um die Blutkontamination zu verhindern, und dann wurde PBS injiziert, um NLF-Proben aus dem Nasenloch zu sammeln. Die Blutkontaminationsgrade in NLF wurden mit einer forensischen Technik, der Luminol-basierten Chemilumineszenz, bestimmt, die eine Semi-Quantifizierung der Hämoglobin (Hb)-Spiegel in NLF-Proben ermöglicht. Die Luminol-Reaktion in NLF, die mit der neuartigen Methode gesammelt wurde, war negativ. So kann die aktuelle neuartige Methode die NLF-Probenqualität für verschiedene biologische Experimente verbessern, wie z. B. Antikörper-Enzyme-linked Immunosorbent Assays (ELISAs), Zytokinprofile, immunologische und medizinische Biomarkerbestimmungen und Modelle für Atemwegserkrankungen bei Mäusen.

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Protokoll

Alle experimentellen Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Medizinischen Fakultät der Kindai University genehmigt und nach den von den National Institutes of Health (NIH) festgelegten Kriterien durchgeführt20. In dieser Studie wurden 4 Monate alte männliche C57BL/6-Mäuse verwendet. Informationen zu den in dieser Studie verwendeten Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. NLF-Sammlung

  1. Eine Maus mit 5 % Isofluran21 nach institutionell anerkannten Protokollen einschläfern.
  2. Legen Sie die Maus auf den Rücken auf eine chirurgische Platte und fixieren Sie sie, indem Sie alle vier Gliedmaßen festnageln.
  3. Entnehmen Sie Blut aus dem Herzen mit einer 1-ml-Spritze.
  4. Öffnen Sie die Bauchhöhle mit einer Schere, um die viszeralen Organe und das Zwerchfell freizulegen.
  5. Schneiden Sie das Zwerchfell und die Rippen mit einer Schere ein, um den rechten Vorhof sichtbar zu machen.
  6. Punktion des rechten Vorhofs mit einer Schere, um das Blut weiter zu entfernen.
  7. Legen Sie drei Wattebäusche in das Maul des Tieres, während Sie an der Zunge ziehen.
  8. Trennen Sie den Unterkiefer mit einer Schere, während Sie den Kopf anheben (Nase nach oben), um eine Blutkontamination im NLF zu verhindern.
  9. Ersetzen Sie die Wattebällchen durch neue, um eine Blutkontamination zu vermeiden.
  10. Nachdem die Blutung aufgehört hat, injizieren Sie 200 μl steriles PBS in die Choana und sammeln Sie das aus den Nasenlöchern ausgestoßene NLF in einem 1,5-ml-Röhrchen.
  11. Wiederholen Sie Schritt 1.10 noch einmal.

2. Nachweis einer Blutkontamination durch Luminol-Chemilumineszenz

  1. 1 mg Luminol und 5 mg Natriumperoxid (Na2O2) mit 1 ml sterilem Wasser mit einem 1,5 ml-Röhrchen auflösen, um die Stammlösung herzustellen.
    HINWEIS: Die Endkonzentration beträgt 1 mg/ml Luminol und 5 mg/ml Na2O2.
  2. Decken Sie die Tube mit Alufolie ab und lagern Sie sie bis zur Verwendung bei 4 °C.
  3. Verdünnen Sie die Stammlösung 10-fach mit entionisiertem Wasser, um eine Arbeitslösung herzustellen.
    HINWEIS: Die Endkonzentration beträgt 0,1 mg/ml Luminol und 0,5 mg/ml Na2O2.
  4. Pipettieren Sie 2 μl der NLF-Proben in die Vertiefungen einer 96-Well-Platte.
  5. Geben Sie 100 μl der verdünnten Luminollösung in jede Vertiefung.
  6. Schütteln Sie die 96-Well-Platte kurz, um die Proben mit der Luminollösung zu mischen.
  7. Beobachten Sie die Luminol-Chemilumineszenz direkt im Dunkeln.
  8. Quantifizieren Sie die Hb-Konzentration bei Bedarf mit einem Luminometer.

3. Quantifizierung von IgA und IgG durch ELISAs

  1. Beschichten Sie Vertiefungen von 96-Well-Platten mit 100 μl/Vertiefung eines Gesamt-Anti-Maus-IgA- (20 ng/Well; 200 ng/ml) oder IgG-Antikörpers (10 ng/Well; 100 ng/ml) (siehe Materialtabelle).
  2. Verschließen Sie die Platten und inkubieren Sie sie über Nacht bei 4 °C.
  3. Waschen Sie die Platten dreimal mit 300 μl/Vertiefung eines Waschpuffers, der jeweils 0,05 % Tween 20 in PBS enthält, und tupfen Sie die Platten dann auf Küchenpapier ab.
  4. In jede Vertiefung werden 200 μl eines Assay-Verdünnungsmittels mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) und 0,2 % Tween 20 PBS gegeben.
  5. Inkubieren Sie die Platten bei Raumtemperatur (RT) für 60 min.
  6. Aspirieren Sie das Assay-Verdünnungsmittel und tupfen Sie dann die Platten auf Küchenpapier ab.
  7. Bereiten Sie 100 ng/ml eines Maus-IgA- oder IgG-Standards mit dem Assay-Verdünnungsmittel vor und führen Sie zweifache serielle Verdünnungen durch: 50 ng/ml, 25 ng/ml, 12,5 ng/ml, 6,25 ng/ml, 3,13 ng/ml, 1,56 ng/ml und 0,78 ng/ml.
    HINWEIS: Das erforderliche Volumen jedes Standards beträgt 100 μl pro Well.
  8. Verdünnen Sie die Proben mit dem Assay-Verdünnungsmittel in den entsprechenden Verdünnungen: Serum (104 bis 106), NLF (10, 50, 200 und 500) und BALF (101 bis 104).
    HINWEIS: Das erforderliche Volumen jeder Probe beträgt 100 μl pro Well.
  9. Geben Sie 100 μl IgA- oder IgG-Standards und Proben in die entsprechenden Vertiefungen.
  10. Inkubieren Sie die Platten 75 Minuten lang bei RT.
  11. Waschen Sie die Platten jedes Mal dreimal mit 300 μl/Vertiefung des Waschpuffers und tupfen Sie die Platten dann auf Küchenpapier ab.
  12. Ein Peroxidase-konjugierter Anti-Maus-Antikörper F(ab')2 (siehe Materialtabelle) wird mit dem Assay-Verdünnungsmittel in der entsprechenden Verdünnung verdünnt: 104-fache Verdünnung.
    HINWEIS: Das erforderliche Volumen beträgt 100 μl pro Well.
  13. 100 μl des verdünnten Peroxidase-konjugierten Anti-Maus-Antikörpers F(ab')2 in jede Vertiefung geben.
  14. Inkubieren Sie die Platten 75 Minuten lang bei RT.
  15. Waschen Sie die Platten jedes Mal fünfmal mit 300 μl/Vertiefung des Waschpuffers und tupfen Sie die Platten dann auf Papiertürme ab.
  16. Geben Sie 100 μl einer Substratlösung, die Tetramethylbenzidin (TMB) und Wasserstoffperoxid enthält, in jede Vertiefung.
  17. Inkubieren Sie die Platten 5 Minuten lang bei RT.
  18. 50 μl einer Stopplösung, 2 N Schwefelsäure (2N H2SO4), in jede Vertiefung geben.
  19. Messen Sie die Extinktion bei 450 nm mit einem Mikroplatten-Reader.
  20. Bestimmen Sie die Konzentrationen von IgA und IgG in jeder Probe unter Verwendung der Standardkurven.

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Ergebnisse

Unter Verwendung der konventionellen oder neuartigen Methode wurden NLF-Proben von C57BL/6-Mäusen über den transpharyngealen Weg entnommen. Wie in Abbildung 1 gezeigt, waren die NLF-Proben, die mit der herkömmlichen Methode entnommen wurden, leicht rosafarben gefärbt (Abbildung 1A); die NLF-Proben, die mit der neuartigen Methode entnommen wurden, waren eindeutig (Abbildung 1B). Da die Differenz auf die Blutkontamination in den NLF-P...

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Diskussion

Die Nasenspülung ist eine wertvolle Technik zur Gewinnung biochemischer, zytologischer und biologischer Informationen bei Atemwegserkrankungen wie Influenza und COVID-1923. Neben der Identifizierung verschiedener infiltrierender Zellen kann die nicht-zelluläre Zusammensetzung der Atemwege aus den NLF-Proben mit verschiedenen Methoden wie ELISAs, Immunoblot und quantitativer Polymerase-Kettenreaktion untersucht werden

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Wir danken Seiichi Omura, Ph.D., Cong Thanh Nguyen, M.D., Ph.D., Kota Moriguchi, M.D., Ph.D., Reona Shiro, M.D., und Sandesh Rimal, M.S., Abteilung für Mikrobiologie, Medizinische Fakultät der Kindai University, und Hirotaka Ebina, Ph.D., Shinya Okamura, Ph.D., und Yasuo Yoshioka, Ph.D., Virus Vaccine Group, BIKEN Innovative Vaccine Research Alliance Laboratories, Forschungsinstitut für mikrobielle Krankheiten, Osaka University, für hilfreiche Diskussionen. Wir danken auch den Mitgliedern des Life Science Research Institute der Kindai University für ihre hervorragende technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde vom japanischen Ministerium für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie durch das Monbukagakusho (MEXT, 2021-2025) Stipendium (I.A.), das Grant-in-Aid for Scientific Research KAKENHI der Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) JP23K06493 (F.S.), JP21K07287/JP24K10500 (A.-M. P.) und JP22K18378/JP24K10163 (I.T.) sowie das Kindai University Research Enhancement Grant KD2406 (F.S.) und KD2506 (I.T.) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Fixiernadel für TiereNatsume Seisakusho Co., Ltd., Tokio, JapanKN-358-AWir haben eine Maus mit Fixiernadeln für Tiere fixiert. Edelstahl; Gesamtlänge, 23 mm; und Nadelspitze, 15 mm.
BD OptEIATM  TMB Substrat-Reagenzien-SetBD Biosciences, San Diego, CA, USA555214Wir haben 100 μm hinzugefügt. L TMB-Substratlösung pro Vertiefung.
GlockeNANA Wirhaben eine Glocke für die Anästhesie verwendet.
Durchsichtige, unsterile 96-Well-Immuno-Platten mit flachem Boden ThermoFisher Scientific, Rochester, NY, USA442404Wir haben durchsichtige, unsterile 96-Well-Platten mit flachem Boden und MaxiSorp-Oberflächenbehandlung für enzymgebundene Immunsorbent-Assays verwendet.
WattebauschSansho Co., Ltd., Tokio, Japan94-1951Wir verwendeten Wattebällchen, um eine Blutkontamination zu vermeiden. Der Durchmesser der Wattebällchen betrug 7 mm.
Fötales RinderserumSigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA172012-500 MLWir fügten dem Assay-Verdünnungsmittel 10 % fötales Rinderserum hinzu.
Pinzetten (Mikropinzette für Forschungsexperimente, gebogene Spitze)Sansho Co., Ltd., Tokio, Japan91-1506Wir haben eine Pinzette zum Sezieren verwendet. Modell, HSC 551-10; und über die gesamte Länge, 105 mm.
Pinzette (Präzisionspinzette)Sansho Co., Ltd., Tokio, Japan91-2772Wir haben eine Pinzette zum Dissektionieren verwendet. Modell, HSC 607-12; über alle Längen, 120 mm; und Spitzendurchmesser 0,3 mm.
Anti-Maus-IgA-UNLB für ZiegenSouthernBiotech, Birmingham, AL, USA1040-01Wir haben durchsichtige, unsterile 96-Well-Platten mit flachem Boden und Immuno mit 100 μm beschichtet. L/Well (20 ng/Well) Gesamtimmunglobulin A.
Isofluran Viatris Inc., Canonsburg, PA, USANA Wirverwendeten Isofluran für die Anästhesie.
Luminol ReagenziensetFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation, Osaka, Japan124-06511Wir haben ein Luminol-Reaktionsreagenzienset verwendet, um Hämoglobin in NLF-Proben nachzuweisen.
MikroröhrchenWatson Co., Ltd., Tokio, Japan131-7155CWir verwenden Mikroröhrchen zum Sammeln von NLF und BALF (1,5-ml-Mikroröhrchen mit Lockining-Kappe, rundem Boden, Soft-Touch-Kappe).
Milli-Q WasserMerck KGaA, Darmstadt, DeutschlandMilli-Q Direct 8Wir haben MilliQ Wasser verwendet, um eine Luminol-Rektionslösung herzustellen.
Mini-Shaker PSU-2TBiosan Ltd., Riga, LettlandPSU-2TWir haben 96-Well-Platten mit dem Mini-Shaler PSU-2T geschüttelt.
MausstammCLEA Japan, Inc., Tokio, JapanNAWir verwendeten 4 Monate alte männliche C57BL/6-Mäuse.
Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon deltabehandelte Mikroplatte mit flachem BodenThermo Fisher Scientific Nunc A/S . Kamstrupvej, Roskilde, Dänemark136101Für den Luminol-Test haben wir die NuncTM MicroWellTM 96-Well, Nunclon Delta-behandelte Mikroplatte mit flachem Boden verwendet.
Peroxidase-konjugiertes AffiniPure F(ab')2 Fragment Ziege Anti-Maus IgG, F(ab')2 Fragmentspezifisch (minimale Kreuzreaktion mit Serumproteinen von Menschen, Rindern und Pferden)Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA, USA115-036-072Wir haben 100 μm hinzugefügt L von Peroxidase-konjugiertem AffiniPure F(ab')2-Fragment Ziegen-Anti-Maus-IgG, F(ab')2 Fragment spezifisch, als Nachweisantikörper (10.000-fache Verdünnung) zu jeder Vertiefung.
Phosphatgepufferte KochsalzlösungSigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USAD8537-500MLWir haben die phosphatgepufferte Kochsalzlösung von Dulbecco (modifiziert ohne Calciumchlorid und Magnesiumchlorid, flüssig, sterilfiltriert, geeignet für die Zellkultur) für die NLF- und BALF-Entnahme verwendet.
Pipette Watson Co., Ltd., Tokio, JapanNAWir haben eine 200-μ L-Pipette für die Nasenspülung.
PipettenspitzeWatson Co., Ltd., Tokio, JapanNAWir haben einen 200-μ; L Multifit-Pipettenspitze für die Nasenspülung.
Polyoxyethylen(20)-Sorbitan-Monolaurat (Tween 20)FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation, Osaka, Japan167-11515Wir fügten 0,05 % Tween 20 zum Waschpuffer und 0,2 % Tween 20 zum Assay-Verdünnungsmittel hinzu.
Gereinigter Ziegen-Anti-Maus-IgG-Antikörper (minimale x-Reaktivität)BioLegend, San Diego, CA, USA405301Wir beschichteten durchsichtigen, unsterilen 96-Well-Immunoplatten mit flachem Boden mit 100 μ; L/Well (10 ng/Well) Gesamtimmunglobulin G.
Kleine Schere, doppelzackigSansho Co., Ltd., Tokio, Japan91-7005Wir haben eine Schere zum Disektionieren verwendet. Modell, S-4A; und über die gesamte Länge, 115 mm.
SchwefelsäureWako Pure Chemical Industries, Ltd, Tokio, Japan192-04755Wir haben 50 μm hinzugefügt. L von 2 N Schwefelsäure in jede Vertiefung, um die Reaktion zu stoppen.
Surflo intravenöser Katheter Terumo Corporation, Tokio, Japan SR-FS2032Wir verwendeten einen intravenösen Surflo-Katheter und injizierten PBS in die Luftröhre für die bronchoalveoläre Lavage. Katheter, 20G; Katheterlänge, 32 mm; Innendurchmesser des Katheters, 0,80 mm; Außendurchmesser des Katheters, 1,1 mm; und inneres Nadel, 22G.
Chirurgische gerade SchereSansho Co., Ltd., Tokio, Japan91-7004Wir haben eine Schere zum Dissektionieren verwendet. Modell, S-3B; und über die gesamte Länge, 120 mm.
Surgilcal PlatteNatsume Seisakusho Co., Ltd., Tokio, JapanKN-321-BZum Sezieren haben wir eine Korkplatte verwendet. Tiefe, 20 cm; Breite, 15 cm; und Höhe 3 cm.
Synergy H1 Hybrid Multi-Mode Mikroplatten-Reader Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA, USANA Wirhaben die Absorption von Proben bei 450 nm mit dem Synergy H1 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader gemessen.
SpritzeTerumo Corporation, Tokio, Japan SS-01TWir haben eine 1-ml-Spritze für die Blutentnahme aus dem Herzen verwendet.
Thema  Niccho Kogyo Co., Ltd. Tokyo JapanNAWir haben einen Katheter mit Faden gebunden, um die richtige Positionierung während des Eingriffs zu gewährleisten.

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