Entnahme von Nasenspülflüssigkeit an der Maus ohne Blutkontamination

Sowohl in der klinischen als auch in der Grundlagenforschung sind geeignete Methoden der Probenentnahme für die Bewertung der Ergebnisse von entscheidender Bedeutung. Die Nasenspülung ist eine Spültechnik, die zur Analyse der zellulären und humoralen Komponenten in den Atemwegen verwendet wird ^1,2,3. Klinisch wurde die Nasenspülflüssigkeit (NLF) als wirksame nichtinvasive Probe für die Entdeckung von Biomarkern verwendet, wobei mehrere Studien ihre Verwendung bei verschiedenen Atemwegserkrankungen unterstützen, einschließlich Sinusitis, Mukoviszidose und allgemeinen Atemwegserkrankungen 4,5,6,7. Bei Versuchstieren wurde NLF auch zur Untersuchung von Modellen für Atemwegserkrankungen verwendet, einschließlich Influenza, Coronavirus-Krankheit-2019 (COVID-19) und allergischer Erkrankung ^3,8,9. Diese Methode wird häufig verwendet, um wichtige inflammatorische Biomarker wie polymorphkernige Zellen und Zytokine zu bestimmen, die häufig als Indikatoren für Reaktionen auf Allergene, Asthma und Atemwegsinfektionen untersucht werden 10,11,12. In jüngerer Zeit wurden zur Untersuchung der Wirksamkeit und Sicherheit potenzieller intranasaler Impfstoffkandidaten häufig NLF-Proben von Versuchstieren entnommen, und die Konzentrationen von Krankheitserregern und Immunglobulin (Ig) in NLF-Proben wurden als Indikatoren^{quantifiziert 13}.

Bei Versuchsmäusen kann NLF mit der transpharyngealen oder transtrachealen Methode entnommen werden. Bei der transpharyngealen Methode wurde der Mauskopf einschließlich der palatopharyngealen Region vom Kehlkopf getrennt, und dann wurde ein Katheter durch die Rachenöffnung in die Choana eingeführt, um phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) zu injizieren und NLF aus dem Nasenloch^{zu sammeln 14}. Die transtracheale Methode verschaffte sich durch die Luftröhre Zugang zu den Atemwegen, ohne den Kopf abzutrennen, und NLF wurde aus dem Nasenloch entnommen, wodurch das Risiko einer Blutkontamination minimiert wurde. Obwohl diese beiden primären Methoden für die NLF-Sammlung bei Versuchsmäusen eingesetzt wurden, haben beide konventionellen Methoden ihre eigenen Grenzen. Es wurde gezeigt, dass die transtracheale Methode aufgrund des Austretens von transtrachealer Spülflüssigkeit in die Mundhöhle geringere Mengen an NLF liefert als die transpharyngeale Methode. Die vorherige Studie zeigte, dass nach der Injektion von PBS die zurückgewonnenen Flüssigkeitsvolumina in NLF 70%-80% bzw. 90%-100% bei der transtrachealen bzw. transpharyngealen Methode betrugen¹⁴. Obwohl die transpharyngeale Methode mit größeren Mengen an NLF als besser angesehen werden kann als die transtracheale Methode, war eine Blutkontamination während des Eingriffs bis zu einem gewissen Grad unvermeidlich^14,15. In ähnlicher Weise haben mehrere Studien berichtet, dass NLF-Proben häufig mit hohen Konzentrationen von Blutserumproteinen kontaminiert waren 16,17,18. Dies kann den Nachweis und die Quantifizierung von NLF-spezifischen Biomarkern für Atemwegserkrankungen beeinträchtigen¹⁹. Dies kann sich auch auf die Ig-Konzentrationen, insbesondere IgA und IgG, in NLF-Proben auswirken, da Blut größere Mengen an IgA und IgG enthält als NLF.

Um diese Herausforderungen anzugehen, zielte diese Studie darauf ab, eine einzigartige, einfache und zuverlässige transpharyngeale Methode zur Entnahme von NLF-Proben von Versuchsmäusen zu etablieren, die Probenausbeute zu maximieren und die Blutkontamination zu minimieren. Während der experimentellen Prozesse wurden Wattebällchen in den Mund der Maus gelegt, um die Blutkontamination zu verhindern, und dann wurde PBS injiziert, um NLF-Proben aus dem Nasenloch zu sammeln. Die Blutkontaminationsgrade in NLF wurden mit einer forensischen Technik, der Luminol-basierten Chemilumineszenz, bestimmt, die eine Semi-Quantifizierung der Hämoglobin (Hb)-Spiegel in NLF-Proben ermöglicht. Die Luminol-Reaktion in NLF, die mit der neuartigen Methode gesammelt wurde, war negativ. So kann die aktuelle neuartige Methode die NLF-Probenqualität für verschiedene biologische Experimente verbessern, wie z. B. Antikörper-Enzyme-linked Immunosorbent Assays (ELISAs), Zytokinprofile, immunologische und medizinische Biomarkerbestimmungen und Modelle für Atemwegserkrankungen bei Mäusen.

Alle experimentellen Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Medizinischen Fakultät der Kindai University genehmigt und nach den von den National Institutes of Health (NIH) festgelegten Kriterien ^{durchgeführt20}. In dieser Studie wurden 4 Monate alte männliche C57BL/6-Mäuse verwendet. Informationen zu den in dieser Studie verwendeten Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. NLF-Sammlung

1. Eine Maus mit 5 % Isofluran²¹ nach institutionell anerkannten Protokollen einschläfern.
2. Legen Sie die Maus auf den Rücken auf eine chirurgische Platte und fixieren Sie sie, indem Sie alle vier Gliedmaßen festnageln.
3. Entnehmen Sie Blut aus dem Herzen mit einer 1-ml-Spritze.
4. Öffnen Sie die Bauchhöhle mit einer Schere, um die viszeralen Organe und das Zwerchfell freizulegen.
5. Schneiden Sie das Zwerchfell und die Rippen mit einer Schere ein, um den rechten Vorhof sichtbar zu machen.
6. Punktion des rechten Vorhofs mit einer Schere, um das Blut weiter zu entfernen.
7. Legen Sie drei Wattebäusche in das Maul des Tieres, während Sie an der Zunge ziehen.
8. Trennen Sie den Unterkiefer mit einer Schere, während Sie den Kopf anheben (Nase nach oben), um eine Blutkontamination im NLF zu verhindern.
9. Ersetzen Sie die Wattebällchen durch neue, um eine Blutkontamination zu vermeiden.
10. Nachdem die Blutung aufgehört hat, injizieren Sie 200 μl steriles PBS in die Choana und sammeln Sie das aus den Nasenlöchern ausgestoßene NLF in einem 1,5-ml-Röhrchen.
11. Wiederholen Sie Schritt 1.10 noch einmal.

2. Nachweis einer Blutkontamination durch Luminol-Chemilumineszenz

1. 1 mg Luminol und 5 mg Natriumperoxid (Na₂O₂) mit 1 ml sterilem Wasser mit einem 1,5 ml-Röhrchen auflösen, um die Stammlösung herzustellen.
   HINWEIS: Die Endkonzentration beträgt 1 mg/ml Luminol und 5 mg/ml Na₂O₂.
2. Decken Sie die Tube mit Alufolie ab und lagern Sie sie bis zur Verwendung bei 4 °C.
3. Verdünnen Sie die Stammlösung 10-fach mit entionisiertem Wasser, um eine Arbeitslösung herzustellen.
   HINWEIS: Die Endkonzentration beträgt 0,1 mg/ml Luminol und 0,5 mg/ml Na₂O₂.
4. Pipettieren Sie 2 μl der NLF-Proben in die Vertiefungen einer 96-Well-Platte.
5. Geben Sie 100 μl der verdünnten Luminollösung in jede Vertiefung.
6. Schütteln Sie die 96-Well-Platte kurz, um die Proben mit der Luminollösung zu mischen.
7. Beobachten Sie die Luminol-Chemilumineszenz direkt im Dunkeln.
8. Quantifizieren Sie die Hb-Konzentration bei Bedarf mit einem Luminometer.

3. Quantifizierung von IgA und IgG durch ELISAs

1. Beschichten Sie Vertiefungen von 96-Well-Platten mit 100 μl/Vertiefung eines Gesamt-Anti-Maus-IgA- (20 ng/Well; 200 ng/ml) oder IgG-Antikörpers (10 ng/Well; 100 ng/ml) (siehe Materialtabelle).
2. Verschließen Sie die Platten und inkubieren Sie sie über Nacht bei 4 °C.
3. Waschen Sie die Platten dreimal mit 300 μl/Vertiefung eines Waschpuffers, der jeweils 0,05 % Tween 20 in PBS enthält, und tupfen Sie die Platten dann auf Küchenpapier ab.
4. In jede Vertiefung werden 200 μl eines Assay-Verdünnungsmittels mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) und 0,2 % Tween 20 PBS gegeben.
5. Inkubieren Sie die Platten bei Raumtemperatur (RT) für 60 min.
6. Aspirieren Sie das Assay-Verdünnungsmittel und tupfen Sie dann die Platten auf Küchenpapier ab.
7. Bereiten Sie 100 ng/ml eines Maus-IgA- oder IgG-Standards mit dem Assay-Verdünnungsmittel vor und führen Sie zweifache serielle Verdünnungen durch: 50 ng/ml, 25 ng/ml, 12,5 ng/ml, 6,25 ng/ml, 3,13 ng/ml, 1,56 ng/ml und 0,78 ng/ml.
   HINWEIS: Das erforderliche Volumen jedes Standards beträgt 100 μl pro Well.
8. Verdünnen Sie die Proben mit dem Assay-Verdünnungsmittel in den entsprechenden Verdünnungen: Serum (10⁴ bis 10⁶), NLF (10, 50, 200 und 500) und BALF (10¹ bis 10⁴).
   HINWEIS: Das erforderliche Volumen jeder Probe beträgt 100 μl pro Well.
9. Geben Sie 100 μl IgA- oder IgG-Standards und Proben in die entsprechenden Vertiefungen.
10. Inkubieren Sie die Platten 75 Minuten lang bei RT.
11. Waschen Sie die Platten jedes Mal dreimal mit 300 μl/Vertiefung des Waschpuffers und tupfen Sie die Platten dann auf Küchenpapier ab.
12. Ein Peroxidase-konjugierter Anti-Maus-Antikörper F(ab')₂ (siehe Materialtabelle) wird mit dem Assay-Verdünnungsmittel in der entsprechenden Verdünnung verdünnt: 10^4-fache Verdünnung.
    HINWEIS: Das erforderliche Volumen beträgt 100 μl pro Well.
13. 100 μl des verdünnten Peroxidase-konjugierten Anti-Maus-Antikörpers F(ab')₂ in jede Vertiefung geben.
14. Inkubieren Sie die Platten 75 Minuten lang bei RT.
15. Waschen Sie die Platten jedes Mal fünfmal mit 300 μl/Vertiefung des Waschpuffers und tupfen Sie die Platten dann auf Papiertürme ab.
16. Geben Sie 100 μl einer Substratlösung, die Tetramethylbenzidin (TMB) und Wasserstoffperoxid enthält, in jede Vertiefung.
17. Inkubieren Sie die Platten 5 Minuten lang bei RT.
18. 50 μl einer Stopplösung, 2 N Schwefelsäure (2N H₂SO₄), in jede Vertiefung geben.
19. Messen Sie die Extinktion bei 450 nm mit einem Mikroplatten-Reader.
20. Bestimmen Sie die Konzentrationen von IgA und IgG in jeder Probe unter Verwendung der Standardkurven.

Unter Verwendung der konventionellen oder neuartigen Methode wurden NLF-Proben von C57BL/6-Mäusen über den transpharyngealen Weg entnommen. Wie in Abbildung 1 gezeigt, waren die NLF-Proben, die mit der herkömmlichen Methode entnommen wurden, leicht rosafarben gefärbt (Abbildung 1A); die NLF-Proben, die mit der neuartigen Methode entnommen wurden, waren eindeutig (Abbildung 1B). Da die Differenz auf die Blutkontamination in den NLF-Proben mit der konventionellen Methode zurückzuführen zu sein schien, wurde die Blutkontamination in den NLF-Proben mittels einer Luminol-Reaktion untersucht. Wie in Abbildung 2 gezeigt, war die Chemilumineszenz in den NLF-Proben, die mit der konventionellen Methode entnommen wurden, positiv, was auf eine Blutkontamination hinweist (Abbildung 2A). Auf der anderen Seite war die Chemilumineszenz in den NLF-Proben, die mit der neuartigen Methode entnommen wurden, negativ (Abbildung 2B). Um plausible Blutungsneigungen bei Mäusen zu leugnen, wurde auch bronchoalveoläre Lavageflüssigkeit (BALF) mit der Standardmethode der transtrachealen Methode gesammelt; die BALF-Probe wies keine Blutkontamination auf. Diese Ergebnisse zeigten, dass die neuartige NLF-Entnahmemethode der konventionellen überlegen war.

Um festzustellen, ob die Blutkontamination in den NLF-Proben die Konzentrationen von IgA und IgG beeinflussen könnte, wurden die IgA- und IgG-Spiegel in Seren und NLF mittels ELISAs quantifiziert. Wie in Abbildung 3 gezeigt, waren die Serum-IgA- und IgG-Spiegel zwischen den beiden Methoden ähnlich; die Konzentrationen sowohl von IgA (Abbildung 3A) als auch von IgG (Abbildung 3B) waren in Seren viel höher als in NLF. Die IgA-Spiegel in den NLF-Proben waren bei der neuartigen Methode tendenziell niedriger als bei der konventionellen Methode (P < 0,1, Student's t-Test); die IgG-Konzentrationen in den NLF-Proben waren bei der neuartigen Methode signifikant niedriger als bei der konventionellen Methode (P < 0,05, Student's t-Test). So schien die Blutkontamination mit der herkömmlichen Methode zu ungenauen IgA- und IgG-Antikörperkonzentrationen in den NLF-Proben zu führen; Die neuartige Methode war präziser als die herkömmliche Methode.

Abbildung 1: Entnahme von Nasenspülflüssigkeit (NLF) nach konventioneller oder neuartiger Methode. (A) Bei der konventionellen Methode war NLF mit Blut kontaminiert, und die Farbe der NLF-Probe wurde blassrosa. (B) Bei der neuartigen Methode gab es keine Blutkontamination in NLF. (A,B) In beiden Gruppen war die bronchoalveoläre Lavageflüssigkeit (BALF), die über den transtrachealen Weg gesammelt wurde, klar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Blutkontamination, die durch die Luminol-Reaktion nachgewiesen wurde. (A,B) Zwei μl NLF- und BALF-Proben wurden in eine 96-Well-Platte gegeben und mit 100 μl einer verdünnten Luminollösung gemischt. Das blau-weiße Chemilumineszenzsignal wurde in der kontaminierten NLF-Probe nachgewiesen, die mit der konventionellen Methode (A) entnommen wurde, war jedoch in der NLF-Probe, die mit der neuartigen Methode (B) entnommen wurde, nicht nachweisbar. Blut- und BALF-Proben wurden als Positiv- bzw. Negativkontrollen verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Quantifizierung der IgA- und IgG-Konzentrationen in Serum-, NLF- und BALF-Proben mittels Enzyme-linked Immunosorbent Assays (ELISAs). (A,B) NLF wurde von Mäusen mit der konventionellen (offener Balken) und neuartigen Methode (geschlossener Riegel) gesammelt; Seren und BALF wurden ebenfalls von denselben Mäusen geerntet. Die Konzentrationen von IgA und IgG wurden durch ELISAs quantifiziert. Die Serumproben wiesen viel höhere IgA- und IgG-Spiegel auf als die NLF- und BALF-Proben. Bei NLF waren die IgA-Konzentrationen tendenziell niedriger, und die IgG-Konzentrationen waren bei der neuartigen Methode signifikant niedriger als bei der konventionellen Methode (IgA, P < 0,1; IgG, P < 0,05, Studentischer t-Test). Die Ergebnisse sind der Mittelwert + Standardfehler des Mittelwerts von sechs Mäusen pro Gruppe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die Autoren haben nichts offenzulegen.