MALDI-ToF MS-Methode zur Charakterisierung von synthetischen Polymeren mit unterschiedlicher Dispersität und Endgruppen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll enthält detaillierte Anweisungen und Beispiele für die Probenvorbereitung, Datenerfassung und Datenanalyse zur Charakterisierung synthetischer Polymere mit unterschiedlicher Dispersion und Endgruppen unter Verwendung der matrixgestützten Laserdesorption/Ionisations-Flugzeit-Massenspektrometrie.

Zusammenfassung

Die matrixgestützte Laserdesorptions-/Ionisationslaufzeit-Massenspektrometrie (MALDI-ToF MS) ist ein effektives Analysewerkzeug zur Charakterisierung synthetischer Polymere und bietet eine präzise Bestimmung des Molekulargewichts und strukturelle Einblicke wie sich wiederholende Einheitsmassen und die Identifizierung von Endgruppen. Dieses Protokoll beschreibt die Schritte für die Polymeranalyse, einschließlich der Probenvorbereitung mit geeigneter Matrix- und Kationenauswahl, der Datenerfassung und einer Kalibrierungsmethode, um genaue Massenmessungen zu gewährleisten. Es unterstreicht die Vielseitigkeit der MALDI-ToF-MS bei der Analyse von Polymeren, von monodispersen bis hin zu hochdispersen Materialien, wobei Einschränkungen bei der Auflösung hochdisperser Proben zu beachten sind. Durch den Vergleich theoretischer und beobachteter Massen, einschließlich Isotopenmustern, ermöglicht die Methode eine sichere Bestätigung von Wiederholungseinheiten und Endgruppen. Das Protokoll unterstützt neue Anwender, indem es repräsentative Daten zur Matrixauswahl, zur spektralen Interpretation über Dispersitätsbereiche und zur Charakterisierung von Polymeren mit einzigartigen Isotopenmerkmalen oder metastabilen Ionenbildungen präsentiert. Zu den Strategien zur Fehlerbehebung gehört die Behebung von Problemen wie Matrixinterferenzen und Proben, die während der Probenvorbereitung ohne zusätzliches Kation ionisieren. Insgesamt dient dieser Leitfaden als Grundlage für den Einsatz von MALDI-ToF MS als schnelle und zuverlässige Technik für die Polymeranalyse.

Einleitung

Die matrixgestützte Laserdesorptions-/Ionisations-Flugzeit-Massenspektrometrie (MALDI-ToF MS) ist eine hocheffektive Analysetechnik zur Charakterisierung synthetischer Polymere 1,2,3,4. Viele Polymere können durch Kernspinresonanz (NMR) charakterisiert werden, um die Struktur der Wiederholungseinheit zu bestätigen. Die meisten Endgruppen sind jedoch nur ein Bruchteil der Repeat-Unit-Peaks, selbst bei Polymeren mit niedrigem Molekulargewicht, und mit zunehmendem Molekulargewicht eines Polymers scheinen die Endgruppensignale in der NMR⁵ schwer zu quantifizieren. Die MALDI-ToF-MS-Daten bestätigen jedoch, dass dies die Endgruppen sind, auch bei höheren Molekulargewichten. Diese Massenspektrometrie-Technik ist für ihre weiche Ionisationsfähigkeit bekannt und erzeugt meist einfach geladene Polymerionen mit sehr geringer Fragmentierung². Dies ermöglicht eine präzise Bestimmung des Molekulargewichts und eine detaillierte Strukturanalyse, die schnelle und genaue Ergebnisse liefert und wertvolle Informationen liefert, wie z. B. sich wiederholende Einheitsmassen, Endgruppenidentifikationen und bei Polymeren mit geringer Dispersität die Bestimmung des zahlengemittelten Molekulargewichts (M_n), des gewichtsdurchschnittlichen Molekulargewichts (M_w) und der Dispersität (Đ)⁶.

MALDI-ToF MS kann Polymere mit unterschiedlicher Dispersität analysieren, hat aber Einschränkungen bei höherer Dispersität. Für monodisperse Polymere wie Dendrimere ist diese Methode ideal, um ihre Masse zu bestätigen und Endgruppen zu identifizieren⁷. Für Polymere mit geringer Dispersität (1,01-1,09) und einigen Polymeren mit moderater Dispersität (Đ = 1,1-1,3) kann MALDI-ToF MS auch zur Bestimmung der Polymer-Wiederholungseinheitsmasse, der Endgruppenmasse, Đ, M_n und M_w⁸ verwendet werden. Bei hochdispersen Polymeren (Đ = 1,3-10) wird dies jedoch zu einer Herausforderung. Bei breit dispergierten Polymeren weisen die niedrigeren Fraktionen eine viel höhere Intensität auf als ihre Gegenstücke mit höherem Molekulargewicht, was zu einer künstlich geringeren Dispersität führt als bei anderen Charakterisierungstechniken wie der Größenausschlusschromatographie (SEC). Dies wird als "Low Mass Bias" bezeichnet. Die durchschnittliche Wiederholungsmasse und die Endgruppen können aus den Ergebnissen mit niedrigerem Molekulargewicht bestätigt werden, aber es ist unmöglich, die wahren M_n, M_w und Đ für Polymere mit hoher Dispersität aus MALDI-ToF MS⁹ zu bestimmen. Daher muss SEC als Charakterisierungstechnik für breit dispergierte Polymere hinzugefügt werden, um die wahren M_n, M_w und Đ zu bestimmen.

Die Optimierung der Probenvorbereitung ist für eine qualitativ hochwertige Peakauflösung auf einem MALDI-ToF-Massenspektrum^{von 2,10} unerlässlich. Im ersten Schritt wird eine geeignete Matrix auf Basis der Polymerpolarität ausgewählt. Für unpolare Polymere werden häufig Matrizen wie trans-2-[3-tert-butylphenyl)-2-methyl-2-propenyliden] (DCTB), Galvinoxyl free radical (GFR) und 9-Nitroanthracen (9-NA) verwendet¹¹. Polare Polymere eignen sich besser für Matrizen wie α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure (CHCA), Dithranol, 2-(4-hydroxyphenylazo)benzoesäure (HABA) und 2,5-Dihydroxybenzoesäure (DHB)12,13,14. Für dieses Protokoll wurde DCTB aufgrund seiner Wirksamkeit mit unpolaren Polymeren als primäre Matrix ausgewählt, und CHCA wurde für polare Polymere verwendet. Die Kationenauswahl spielt ebenfalls eine wichtige Rolle, da Alkalimetalle wie Natrium und Kalium sauerstoffhaltige Polymere effektiv ionisieren, während Übergangsmetalle wie Silber besser für ungesättigte Kohlenwasserstoffe geeignet sind^10,14.

Sobald die Matrix und der Analyt ausgewählt sind, werden die optimalen Kationen:Analyt:Matrix-Verhältnisse für die Probenlösungsgemische bestimmt. Diese Probenlösungsmischung wird in einer Menge von 1 μl auf die Zielplatte gegeben. Wenn eines oder mehrere der korrekten Verhältnisse der Kationen:Analyt:Matrix-Auswahl nicht vorhanden sind, kann dies die Empfindlichkeit der MALDI-ToF MS-Datenerfassung beeinträchtigen. Für die unten aufgeführten repräsentativen Daten wurde die Probenvorbereitung für die beste Auflösung ^2,15 optimiert.

Nach der Vorbereitung der Probenlösung und deren Zugabe zur MALDI-ToF MS-Zielplatte wird diese Probe in das MALDI-TOF MS-Instrument eingeführt, um mit der Datenerfassung zu beginnen. Für diese Studie wurden die Daten ausschließlich im positiven Ionenmodus gesammelt, und es wurde ein neueres MALDI-ToF-Massenspektrometer verwendet, das auf früheren Arbeiten von Payne et al. ^aufbaute.16. Wichtige MALDI-ToF-MS-Parameter, wie z. B. Laserleistung, Laserstrahldurchmesser, Detektorverstärkung und gepulste Extraktionsverzögerungszeit, können angepasst werden, um die Auflösung während der Erfassung zu verbessern. Für die MALDI-ToF MS-Datenerfassung stehen zwei Modi zur Verfügung: linear und Reflectron¹⁷. Der Reflektron-Modus wird bevorzugt, um eine höhere Signalauflösung im Vergleich zum linearen Modus^18,19 zu erreichen. Im linearen Modus wandern beschleunigte Ionen direkt durch das Flugrohr zum Detektor. Im Gegensatz dazu geht es beim Reflectron-Modus darum, einmal durch das Flugrohr zu gehen und dann die Ionen ein zweites Mal durch das Flugrohr zurück zu reflektieren, bevor sie den zweiten Detektor erreichen, der ihre Flugbahn ungefähr verdoppelt. Dieser Ansatz ermöglicht die Differenzierung von Ionen mit ähnlichen Massen, aber unterschiedlichen Geschwindigkeiten^20,21. Die Laserleistung kann auch ein Faktor bei der Erhöhung des Signal-Rausch-Verhältnisses oder der Verringerung der Fragmentierung eines Polymers^{sein 22}. Die geringstmögliche Laserleistung zum Abtragen einer Probe verbessert das Signal-Rausch-Verhältnis und verringert auch die Möglichkeit einer Fragmentierung²². Nach der Optimierung der Signalauflösung und der Maximierung des Signal-Rausch-Verhältnisses kann die Erfassung qualitativ hochwertige Daten für den ausgewählten Polymeranalyten liefern.

Die Kalibrierung ist für eine genaue Massenmessung in MALDI-ToF MS unerlässlich. Es werden zwei Hauptmethoden verwendet: die interne und die externe Kalibrierung, die sich beide auf Kalibranten mit bekannten Massen stützen, die den erwarteten Bereich des Analyten abdecken⁶. Für die in den repräsentativen Daten analysierten Polymere wurden monodisperse Dendrimerkalibranten für die Kalibrierung über weite Massenbereiche^{ausgewählt 23}. Die interne Kalibrierung, bei der das Kalibrant mit dem Kationen, dem Analyten und der Matrix gemischt wird, verbessert die Massengenauigkeit, da sowohl das Kalibrant als auch der Analyt den gleichen Bedingungen ausgesetzt sind und jede Verschiebung der Kalibriermasse sie gleichermaßen beeinflusst. Dieses Verfahren kann jedoch zu einer Peaküberlappung mit den resultierenden Polymersignalen führen, was die Analyse^{erschwert 24}. Im Gegensatz dazu vermeidet die externe Kalibrierung, die in diesem Protokoll verwendet wird, eine Peaküberlappung, indem die Kationen:Kalibrant:Matrix getrennt von der Kationen:Analyt:Matrix auf der Zielplatte vorbereitet und aufgespottet wird. Geringfügige Massenungenauigkeiten können jedoch aufgrund geringfügiger Unterschiede in der Probenplatzierung und der lokalen Instrumentenreaktion auftreten, wie z. B. Schwankungen der Laserintensität oder der Ionisationseffizienz über das Target, so dass sich der Kalibrant und der Analyt in unmittelbarer Nähe zueinander befinden sollten²⁴. In den repräsentativen Daten betrug die beobachtete Massendifferenz mit der externen Kalibriermethode weniger als 0,100 Da vom theoretischen Wert.

Schließlich können für alle Polymere die MALDI-ToF MS-Daten analysiert werden, um die Wiederholungseinheitsmasse zu bestimmen und eine Endgruppenanalyse der Polymere durchzuführen. Die Wiederholungseinheitsmasse kann bestätigt werden, indem die theoretische Wiederholungseinheitsmasse mit Hilfe von Softwaretools mit der beobachteten Wiederholungseinheitsmasse in den MALDI-ToF-Massenspektren verglichen wird. Wenn sie übereinstimmen, hat das Polymer wahrscheinlich die erwartete Wiederholungseinheitsstruktur (oder ein Isomer). Die MALDI-ToF MS-Endgruppenanalyse für Polymere beginnt mit der Berechnung der theoretischen Masse des Analyten. Dazu gehören die kombinierte Masse der Rapporteinheit, der Endgruppen und des ausgewählten Kations aus der Probenvorbereitung. Im Falle von monodispersen Makromolekülen umfasst die Berechnung die Gesamtmasse eines Analyten zusammen mit der Masse des ausgewählten Kationen. Softwaretools zum Zeichnen chemischer Strukturen können bei diesen Berechnungen helfen. Die theoretische Masse aus der Software wird dann mit der beobachteten Masse aus den MALDI-ToF-Massenspektren verglichen, um zu überprüfen, ob das Polymer der erwarteten Molekülstruktur entspricht. Wenn jedoch die beobachtete Wiederholungseinheitsmasse ungefähr mit dem theoretischen Wert übereinstimmt, die Gesamtmasse eines angegebenen n-mers, einschließlich der Endgruppen und des Kationen, jedoch nicht, kann die Diskrepanz auf das Vorhandensein unerwarteter Endgruppen hindeuten. Um unbekannte Endgruppen zu identifizieren, werden die Reaktionsbedingungen überprüft, um alternative Moleküle oder Reagenzien zu bestimmen, die reagiert haben könnten, um die beobachteten Endgruppen zu bilden. Dieser Schritt ist entscheidend für die genaue Charakterisierung der gesamten Struktur des Polymers.

Dieses Protokoll bietet eine Schritt-für-Schritt-Methode für die MALDI-ToF-MS-Analyse von synthetischen Polymeren, die Anwender, insbesondere Anfänger, bei der Probenvorbereitung, der Optimierung der Instrumentenmethode, der Datenerfassung und der Datenanalyse unterstützen soll. Repräsentative Daten veranschaulichen die Matrixauswahl für ein gegebenes Polymer; Spektren und Analyse von Polymeren mit unterschiedlicher Dispersität, einschließlich monodisperser, mäßig disperser und hochdisperser Proben; die Endgruppenanalyse von Polymeren, die solche mit unterschiedlichen Isotopenauflösungsmustern (z. B. halogeniert) und solche, die zur Bildung metastabiler Ionen neigen (z. B. azidterminiert); die Datenanalyse von Polymeren mittels MALDI-ToF MS, die einen Vergleich der beobachteten und theoretischen Massen umfasst, um die Wiederholungseinheitsmasse und die Gesamtmasse des Polymers, einschließlich Endgruppen und Kationenaddukten, zu bestätigen; und ein Beispiel für die Fehlerbehebung bei Matrixinterferenzen von Polymeren mit geringer Masse und selbstionisierenden Polymeren.

Dieses Protokoll bietet nicht nur eine Grundlage für die Charakterisierung von MALDI-ToF-MS-Polymeren, sondern auch eine Anleitung zur Probenvorbereitung, zur schrittweisen Optimierung der Instrumentenmethode (Abbildung 1) und zur Interpretation von Spektren sowohl für neu synthetisierte als auch für kommerzielle synthetische Polymere.

Protokoll

ACHTUNG: Lesen Sie vor der Verwendung die Sicherheitsdatenblätter (SDB) für alle Chemikalien. Führen Sie alle Probenvorbereitungen und MALDI-ToF-MS-Plattenvorbereitungen in einem Abzug durch und tragen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung (PSA), einschließlich Schutzbrille, Laborkittel und Handschuhe.

1. Vorbereitung der Probe

1. Herstellung von Matrix-, Kationen-, Kalibrierungs- und Analyt-Stammlösung
   1. Bereiten Sie die alkalische Kationen-Stammlösung vor, indem Sie 2 mg des gewünschten Kations in 1 ml eines Lösungsmittels lösen, das aufgrund seiner Verträglichkeit mit dem Analyten und dem Kation ausgewählt wurde. Für Probe 1 wurden 2 mg Natriumtrifluoracetat in 1 ml THF gelöst.
   2. Bereiten Sie die Matrixstammlösung vor, indem Sie 20 mg der gewünschten Matrix in 1 ml eines kompatiblen Lösungsmittels auflösen, basierend auf der Löslichkeit des Analyten. Beispiel: Für die repräsentativen Daten (Probe 1) lösen Sie 20 mg DCTB in 1 ml Tetrahydrofuran (THF).
   3. Bereiten Sie die kalibrierende Stammlösung vor, indem Sie die Anweisungen des Lieferanten befolgen.
   4. Bereiten Sie die Analytlösung vor, indem Sie 10 mg des Analyten in 1 ml eines geeigneten Lösungsmittels auflösen. Für Probe 1 werden 10 mg des Analyten in 1 ml THF gelöst.
2. Vorbereitung der MALDI-ToF MS Zielplatte
   1. Reinigen Sie die MALDI-ToF MS Zielplatte.
   2. Bereiten Sie die Analytaufnahmeprobe und die Kalibrierprobenlösung vor. Geben Sie die Kationen-, Analyt- und Matrixstammlösungen in einem Verhältnis von 1:5:20 μl in das Röhrchen A und den Vortex. Für die externe Kalibrierung: Geben Sie das Kationen-, Kalibrierungsmittel und die Matrixstammlösungen in einem Verhältnis von 1:5:20 μl in das Röhrchen B und den Vortex.
   3. Geben Sie das Gemisch aus Analyt und Kalibrant der Probenlösung auf die MALDI-ToF MS-Zielplatte. Pipettieren Sie 0,5 μl des Kationen:Analyt:Matrix-Probenlösungsgemisches (Röhrchen A) mit der Methode der getrockneten Tröpfchen auf die MALDI-ToF MS-Zielplatte. Pipettieren Sie 0,5 μl des Kationen:Kalibrant:Matrix-Gemisches (Röhrchen B) mit der Methode der getrockneten Tröpfchen auf eine Stelle neben dem Analyten auf der MALDI-ToF MS-Zielplatte. Notieren Sie die genaue Position jedes Spots (Zeilenbuchstabe und Spaltennummer), um die Probe und das Kalibrant während der Datenerfassung leicht zu lokalisieren.

2. Datenerfassung

1. Setzen Sie die MALDI-ToF MS-Zielplatte ein und wählen Sie eine Erfassungsmethode
   1. Setzen Sie die MALDI-ToF MS-Zielplatte in das Gerät ein. Setzen Sie die Zieltafel in der richtigen Ausrichtung auf die Halterung und schieben Sie die MALDI-ToF MS Zieltafel nicht zu weit hinein.
   2. Docken Sie die MALDI-ToF MS-Zielplatte mit der Gerätesteuerungssoftware an das Gerät an.
   3. Wählen Sie eine Methodendatei in der Gerätesteuerungssoftware aus und öffnen Sie sie. Wählen Sie eine reflektorpositive (RP) oder eine linear positive (LP) Methode innerhalb des Massenbereichs des Analyten.
   4. Überwachen Sie die Gerätesteuerungssoftware, um zu bestätigen, dass die Zielplatte eingesetzt wurde und die Einrichtung der Methode abgeschlossen ist.
      HINWEIS: Diese repräsentativen Polymere enthalten Sauerstoff; Daher wird der positive Modus gewählt (bei den meisten Verbindungen ist die Erfassung im positiven Modus abgeschlossen). Für die repräsentativen Daten wurde eine RP-Methode für den Reflektormodus an allen Proben gewählt.
2. Erste Datenerfassung
   1. Suchen Sie in der Gerätesteuerungssoftware die Kamera, die die MALDI-ToF MS-Zielplatte und ein Diagramm der Bohrlöcher mit den angezeigten Spaltenbuchstaben und Zeilennummern anzeigt. Klicken Sie auf die MALDI-ToF-MS-Vertiefung, die das Kationen-Analyt-Matrix-Gemisch enthält , um es für die Datenerfassung auszuwählen.
   2. Stellen Sie den Massenerfassungsbereich in der Gerätesteuerungssoftware auf einen breiten Bereich von 500-20000 Da ein, um sicherzustellen, dass die erwartete Masse des Analyten vollständig erfasst wird. Verwenden Sie den Cursor, um den Bereich etwa 2x unter und über der erwarteten Masse des Analyten nach einer ersten Erfassung einzustellen.
   3. Datenerfassung
      1. Drücken Sie die Start-Taste an der Gerätesteuerungssoftware, um die MALDI-ToF MS-Datenerfassung zu starten.
      2. Drücken Sie Stopp oder lassen Sie die MALDI-ToF MS-Erfassung automatisch abschließen.
      3. Klicken Sie auf Hinzufügen , um das MALDI-ToF-MS-Einzelspektrum als Summenspektrumpuffer hinzuzufügen.
         HINWEIS: Der MALDI-ToF MS-Einzelspektrumpuffer speichert ein individuelles MALDI-ToF-Massenspektrum, und der Summenspektrumpuffer sammelt Daten aus mehreren Erfassungen, wodurch die Signalintensität erhöht wird.
      4. Positionieren Sie den MALDI-ToF MS-Laser neu, indem Sie den Kamera-Feed anzeigen, und klicken Sie auf Eine beliebige Stelle innerhalb desselben ausgewählten Wells , um den Laser an eine neue Position zu bewegen.
      5. Wiederholen Sie die MALDI-ToF MS-Erfassungen, um dem Summenpuffer einzelne MALDI-ToF MS-Einzelspektren hinzuzufügen. Wiederholen Sie die Schritte 2.2.3.1 bis 2.2.3.4, bis die Ergebnisse der MALDI-ToF-MS zufriedenstellend sind.
      6. Bewerten Sie das MALDI-ToF-Massenspektrum auf Auflösung und Basisrauschen. Wenn das MALDI-ToF-MS-Spektrum eine hohe Auflösung und minimales Grundlinienrauschen aufweist, fahren Sie mit dem Kalibrierungsschritt fort. Wenn nicht, sollten Sie die Datenerfassungsmethode optimieren (z. B. durch Anpassen der Laserleistung, der Detektorverstärkung oder der Einstellungen für die Extraktion gepulster Ionen).
3. Optimierung der Datenerfassung (siehe Abbildung 1)
   1. Passen Sie die MALDI-ToF MS-Laserleistung, die Detektorverstärkung und die Extraktion gepulster Ionen nacheinander an, um die Auflösung zu verbessern und/oder das Hintergrundrauschen zu verringern
   2. Um die MALDI-ToF MS-Methode zu duplizieren, kopieren Sie die MALDI-ToF MS LP- oder RP-Methode, und fügen Sie sie unter einem neuen Namen ein. Öffnen Sie die eingefügte MALDI-ToF MS-Methodendatei, die erstellt wurde, und benennen Sie die Datei um.
   3. Erfassen Sie ein anfängliches MALDI-ToF-Massenspektrum, indem Sie alle Schritte in Abschnitt 2.2 für die erste Datenerfassung im Abschnitt Datenerfassung ausführen. Zoomen Sie in eine Reihe von Peaks des MALDI-ToF-MS mit der höchsten Intensität, um die Auflösung und das Basisrauschen in der Gerätesteuerungssoftware zu bewerten.
   4. Optimierung der Akquisition
      1. Passen Sie die Leistung des MALDI-ToF MS-Lasers an
         1. Beginnen Sie mit einer niedrigen MALDI-ToF MS-Laserleistung von ~ 4% und befolgen Sie die Schritte 2.2.3.1 und 2.2.3.2 für die erste Datenerfassung, um die Datenerfassung zu starten und zu stoppen.
         2. Beobachten und vergleichen Sie die Auflösung und das Basisrauschen des MALDI-ToF-MS-Einzelpuffers mit dem Anfangsspektrum im Summenpuffer.
         3. Erhöhen Sie die Leistung des MALDI-ToF MS-Lasers in Schritten von 2 % bis 10 %, um die Ionisation zu verbessern. Führen Sie die Schritte 2.2.3.1 und 2.2.3.2 für die erste Datenerfassung aus, um die Datenerfassung nach jedem Inkrement zu starten und zu stoppen.
         4. Wählen Sie die niedrigste Laserleistung, die hochintensive Spitzen mit minimalem Rauschen liefert.
            HINWEIS: Wenn die Leistung des MALDI-ToF MS-Lasers 50 % und mehr beträgt, besteht eine erhöhte Wahrscheinlichkeit einer Probenfragmentierung.
      2. Optimieren Sie den Durchmesser des MALDI-ToF MS-Lasers
         1. Passen Sie auf der Registerkarte "Detektor" den Durchmesser des MALDI-ToF MS-Lasers an, um die Einstellungen "Mittel", "Groß" und "Ultra" zu testen. Führen Sie die Schritte 2.2.3.1 und 2.2.3.2 für die erste Datenerfassung aus, um die Datenerfassung zu starten und zu stoppen.
         2. Beobachten und vergleichen Sie die Auflösung und das Basisrauschen des MALDI-ToF-MS-Einzelpuffers mit dem Anfangsspektrum im Summenpuffer.
         3. Wählen Sie den MALDI-ToF MS-Laserdurchmesser aus, der eine optimale Auflösung bei minimalem Grundlinienrauschen bietet.
            HINWEIS: Der MALDI-ToF MS-Laserdurchmesser steuert den Durchmesser des Laserstrahls.
      3. Passen Sie die Verstärkung des MALDI-ToF MS-Detektors an
         1. Erhöhen oder verringern Sie die Verstärkung des MALDI-ToF MS-Detektors in kleinen Schritten. Führen Sie die Schritte 2.2.3.1 und 2.2.3.2 für die anfängliche Datenerfassung aus, um die Datenerfassung bei jeder Erhöhung oder Abnahme der Verstärkung des MALDI-ToF-MS-Detektors zu starten und zu stoppen.
         2. Beobachten Sie die Signalintensität und -auflösung der MALDI-ToF-Massenspektren auf der Gerätesteuerungssoftware bei jeder Einstellung des MALDI-ToF MS-Einzelpuffers und des Anfangsspektrums im Summenpuffer.
         3. Behalten Sie die Verstärkung des MALDI-ToF MS-Detektors bei, die die beste Intensität und gute Signalauflösung bietet.
      4. Modifizieren Sie die MALDI-ToF MS-Extraktion mit gepulsten Ionen
         1. Stellen Sie die gepulste Ionenextraktion des MALDI-ToF MS in Schritten von 10 ns ein. Führen Sie die Schritte 2.2.3.1 und 2.2.3.2 für die Erstdatenerfassung aus, um die Datenerfassung für jede Erhöhung oder Verringerung der Detektorverstärkung zu starten und zu stoppen.
         2. Bewerten, wie die Änderungen der gepulsten Ionenextraktion die Auflösung des MALDI-ToF-MS-Signals verbessern.
            HINWEIS: Die gepulste Ionenextraktion MALDI-ToF MS ist definiert als Zeitverzögerung zwischen der Laserionisation. Durch Erhöhen oder Verringern der Pulsionenextraktion bleiben Ionen unterschiedlicher Energien entweder kürzer oder länger im elektrischen Feld. Die längere Zeit kann es Analyten gleicher Masse und positiv geladener Ionen, die zu leicht unterschiedlichen Zeiten abtragen, ermöglichen, vollständig auf die gleiche Geschwindigkeit zu beschleunigen wie Analytionen derselben Masse, wenn die Spannung angelegt wird. Dies kann verwendet werden, um die Auflösung zu erhöhen und das Hintergrundrauschen des Signals²⁵ zu verringern.
   5. Sobald die optimale Auflösung und das höchste Signal-Rausch-Verhältnis erreicht sind, speichern Sie die optimierte MALDI-ToF MS-Methodendatei für die aktuelle und zukünftige Verwendung.
4. MALDI-ToF MS-Kalibrierung
   1. Erfassen Sie das Kalibrierungs-MALDI-ToF-Massenspektrum, indem Sie die Kalibrierprobe auf der Zielplatte auswählen und alle Schritte in Abschnitt 2.2 für die erste Datenerfassung befolgen
      1. Greifen Sie auf die Kalibrierungsreferenzpunkte zu. Navigieren Sie zur Registerkarte "Kalibrierung" in der Gerätesteuerungssoftware. Öffnen Sie die entsprechende Massenkontrollliste, die dem verwendeten Kalibranten entspricht.
   2. Gleichen Sie die Kalibrierungsspitzen des MALDI-ToF-Massenspektrums mit den Referenzmassen in der Massenkontrollliste ab.
      1. Wählen Sie in der Massenkontrollliste die Masse aus, die dem ersten Kalibrierungspeak im MALDI-ToF-Massenspektrum entspricht. Das MALDI-ToF-Massenspektrum zoomt automatisch auf den ausgewählten Kalibrantpeak.
      2. Stellen Sie den Referenz-Peak ein, indem Sie links neben dem Calibrant-Signal klicken. Der Gipfel wird ausgewählt.
      3. Wählen Sie Anwenden , um das Kalibrantsignal als Referenzmasse in der Massenkontrollliste festzulegen.
      4. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle zusätzlichen Kalibrierungspeaks. Wählen Sie die nächste interessierende Masse aus der Massensteuerungsliste aus, richten Sie den entsprechenden Kalibranten-Peak aus und wenden Sie die Referenzeinstellung an.
5. Probenaufnahme für kalibrierte Polymeranalyten
   1. Suchen Sie die Vertiefung, die die Kation:Analyt:Matrix-Gemischvertiefung enthält, und wählen Sie sie in der Gerätesteuerungssoftware aus.
   2. Führen Sie die Datenerfassung durch, indem Sie alle Schritte in Abschnitt 2.2 bei geöffneter optimierter und kalibrierter Methode ausführen.
   3. Fügen Sie einen geeigneten Dateinamen hinzu und speichern Sie das kalibrierte MALDI-ToF-Massenspektrum des Analyten für die weitere Analyse.
6. Entfernen Sie die MALDI-ToF MS-Zielplatte mit der Gerätesteuerungssoftware. Reinigen Sie die MALDI-ToF MS Zielplatte

Abbildung 1: Entscheidungsbaum für die Optimierung der Instrumentenmethode. Dieser Leitfaden soll Anfängern helfen, die Parameter der Instrumentenmethode systematisch zu optimieren. Beginnen Sie mit den Standard- oder Anfangseinstellungen und passen Sie jeweils einen Parameter an, indem Sie ihn je nach beobachteten Verbesserungen entweder erhöhen oder verringern. Fahren Sie dann in der Richtung fort, die (1) die Spitzenintensität, (2) die Basisqualität (geringes Rauschen) und (3) eine schmale Peak- und Isotopenauflösung verbessert. Dieser Ansatz hilft dabei, optimale Bedingungen für zuverlässige und qualitativ hochwertige Spektren zu identifizieren. Wenn die Polymerprobe im Reflektormodus nicht ionisiert oder kein brauchbares Spektrum erzeugt, wechseln Sie in den linearen Modus und verwenden Sie denselben Entscheidungsbaum, um die Parameter zu optimieren. Beachten Sie, dass der lineare Modus oft zu breiteren Peaks und begrenzter oder keiner Isotopenauflösung führt, aber er kann für Polymere mit höherer Masse oder Polymere, die im Reflektormodus die Ionisation verlieren können, wirksam sein. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

3. Datenanalyse und -interpretation

1. Öffnen Sie die MALDI-ToF MS Datenanalysesoftware und laden Sie das MALDI-ToF MS Analyt-Probenspektrum.
2. Wählen Sie die richtige MALDI-ToF MS-Verarbeitungsmethode für die Analytproben. Hier wiesen alle Proben eine Isotopenauflösung auf, und der erste Peak wurde für alle Peaks mit der gewählten MALDI-ToF MS-Verarbeitungsmethode ausgewählt.
   HINWEIS: Die Verarbeitungsparameter von MALDI-ToF MS können für synthetische Polymerproben angepasst werden. So wurde beispielsweise im Rahmen einer technischen Schulung durch den Instrumententechniker von MALDI-ToF MS ein MALDI-ToF MS-Verarbeitungsverfahren für Polymere entwickelt. Ein MALDI-ToF-MS-Verfahren zur Verarbeitung der durchschnittlichen Massenmasse wurde von Payne et al. für spezifische Anwendungen entwickelt¹⁶. Wenden Sie sich an das polymertechnische Team des MALDI-ToF MS-Herstellers, um Informationen und Ratschläge zur Bearbeitung der MALDI-ToF MS-Verarbeitungsmethode zu erhalten.
3. Finden Sie Peaks mit der Analysesoftware MALDI-ToF MS.
4. Vergleichen Sie die theoretische und experimentelle Polymermasse
   1. Notieren Sie die theoretische Polymermasse. Zeichnen Sie die erwartete Makromolekülstruktur, einschließlich des Kationens, in einer chemischen Zeichensoftware. Öffnen Sie das Analysefenster in der chemischen Zeichensoftware und zeichnen Sie die theoretische Masse auf.
      1. Monodisperse Makromoleküle: Erfassen Sie die genaue Masse und das Molekulargewicht des Makromoleküls, indem Sie die Struktur und das Kation zusammen auswählen.
      2. Niedrige, mittlere und hochdisperse Polymere: Wählen Sie für die Wiederholungsmasse der Einheit nur das Polymer-Rückgrat aus, um die Masse der Wiederholungseinheit aufzuzeichnen. Für die Gesamtmasse eines angegebenen n-mers setzen Sie die Wiederholungseinheitsnummer auf eine Masse innerhalb des MALDI-ToF MS-Spektrumbereichs, der in der MALDI-ToF MS-Analysesoftware angezeigt wird. Wählen Sie die gesamte Polymerstruktur aus, einschließlich der Kationen- und Endgruppen, um die Masse eines angegebenen n-mers aufzuzeichnen.
   2. Vergleichen Sie die aufgezeichnete theoretische Masse mit der beobachteten Masse aus dem MALDI-ToF-MS-Spektrum.
      1. Für die Berechnung der Gesamtmasse monodisperser Makromoleküle befolgen Sie die unten beschriebenen Schritte.
         1. Vergrößern Sie den Peak mit der höchsten Intensität im MALDI-ToF-MS-Spektrum und stellen Sie sicher, dass die Ansicht einen Massenbereich von mindestens 2x unter und über der theoretischen Masse umfasst.
         2. Vergleichen Sie die theoretische Masse mit der beobachteten Masse im MALDI-ToF-Massenspektrum. Wenn die Differenz weniger als 0,100 Da beträgt, ist die erwartete monodisperse Makromolekülmasse wahrscheinlich genau.
         3. Untersuchen Sie das MALDI-ToF-MS-Spektrum auf zusätzliche Peaks, die auf das Vorhandensein unerwarteter Strukturen hinweisen könnten.
         4. Wenn Abweichungen festgestellt werden, bewerten Sie mögliche strukturelle Abweichungen. Überprüfen Sie das Reaktionsschema und berechnen Sie die Massen alternativer Strukturen zum Vergleich.
      2. Führen Sie für die wiederholte Berechnung der Masseneinheit von Polymeren mit niedriger, mittlerer und hoher Dispergierung die unten beschriebenen Schritte aus.
         1. Wählen Sie zwei Peaks aus, die durch die Masseneinheit der Wiederholungseinheit im MALDI-ToF-MS-Spektrum getrennt sind und die höchste Intensität aufweisen, und zoomen Sie hinein.
         2. Subtrahieren Sie für jedes Paar benachbarter Peaks die beobachtete Masse des Peaks mit der höheren Masse vom Peak mit der unteren Masse, um die Masseneinheit der Wiederholungseinheit zu berechnen. Wiederholen Sie diesen Vorgang für den nächsten Satz von Peaks, um die Konsistenz der Wiederholungseinheitsmasse zu bestätigen.
         3. Vergleichen Sie die berechnete Wiederholungseinheitsmasse mit der theoretischen Wiederholungseinheitsmasse. Wenn die beobachteten und theoretischen Werte übereinstimmen und konsistente Massenunterschiede aufweisen, ist die Wiederholungsmasse des Polymers wahrscheinlich korrekt.
      3. Führen Sie für die Gesamtmasse eines angegebenen n-mers von niedrig-, mittel- und hochdispersen Polymeren die unten beschriebenen Schritte aus.
         1. Vergrößern Sie den Peak auf dem MALDI-ToF-Massenspektrum, der der theoretischen Gesamtmasse entspricht, sowie Peaks, die eine Wiederholungseinheit darüber und darunter liegen.
         2. Vergleichen Sie die theoretische Masse mit der beobachteten Masse im MALDI-ToF-Massenspektrum. Wenn die Differenz weniger als 0,100 Da beträgt, sind die erwarteten Endgruppen wahrscheinlich genau.
         3. Untersuchen Sie das MALDI-ToF-Massenspektrum auf zusätzliche Peaks, die auf unerwartete Strukturen hindeuten könnten.
         4. Wenn Abweichungen festgestellt werden, bewerten Sie alternative Endgruppen oder strukturelle Abweichungen. Überprüfen Sie das Reaktionsschema und berechnen Sie die Massen für mögliche alternative Endgruppen oder zyklische Strukturen.

Ergebnisse

Probe 1: Monodisperses Tris[G1](OH)₆
Die Generation 1 eines monodispersen Dendrimers, bestehend aus einem 1,1,1-Tris(hydroxymethyl)propan-Kern mit drei Benzyliden-geschützten Bis(hydroxymethyl)propionsäure an der Peripherie (Tris[G1]Bnz₃), wurde mit Pd/C und_H2-Gas in 1:1 Methanol:Chloroform umgesetzt, um die Benzylidengruppen zu entfernen, und führte zu einem Dendrimer mit 6 Hydroxylgruppen zu Tris[G1](OH)₆ (Abbildung 2A).

Tris[G1](OH)₆ wurde unter Verwendung von NaTFA als Kationenmittel und CHCA als Matrix analysiert. CHCA wurde verwendet, weil es mit polaren Verbindungen hochwirksam ist und mit Hydroxylgruppen von Tris[G1](OH)₆ interagiert, um eine homogene Schicht auf der Zielplatte zu bilden. Die Vorbereitung der MALDI-ToF-MS-Probe begann mit der Herstellung von Stammlösungen aus NaTFA (1 mg/ml in THF), dem Analyten (5 mg/ml in THF) und CHCA (5 mg/ml in THF). Nachdem diese Lösungen hergestellt waren, wurden 1 μl der Na⁺ -Kationenlösung, 5 μl der Analytlösung und 20 μl der Matrixlösung in einem Mikrozentrifugenröhrchen kombiniert und verwirbelt (Verhältnis von 1:25:100 Kationen:Analyt:Matrix für insgesamt 26 mL). Anschließend wurde 1 μl dieser Mischung aus dem Mikrozentrifugenröhrchen entnommen und auf der MALDI-ToF MS-Zielplatte getrocknet. Diese Probe wurde im Reflektormodus analysiert, und der Peak wurde im MALDI-ToF MS-Spektrum durch den Vergleich der theoretischen und beobachteten Werte bestätigt (Abbildung 2B, rot).

Abbildung 2: (A) Reaktionsschema für die Modifikation von Probe 1 zu Tris[G1](OH)₆. Die Benzylidengruppen wurden mit einer Pd/C- und_H2-Reaktion entfernt, um Tris[G1](OH)₆ zu bilden. Zur Bestimmung des Abschlusses der Reaktion wurde die MALDI-ToF-MS verwendet. (B) MALDI-ToF-Massenspektren von Probe 1, Tris[G1](OH)₆ und ein überlagertes Blank-Matrix-Spektrum, das die Matrix und das Salz ([CHCA + Na]⁺) umfasste. Das vollständige MALDI-ToF MS-Spektrum und die Vergrößerung von Tris[G1](OH)₆ zeigen, dass der beobachtete Massenwert für [Tris[G1](OH)₆ + Na⁺]⁺ 505,239 Da beträgt und eine Differenz von +0,013 Da von der theoretischen Masse von 505,226 Da aufweist. Durch den Vergleich des leeren MALDI-ToF MS-Matrixspektrums (schwarz) mit dem Tris[G1](OH)₆ MALDI-ToF MS-Spektrum (rot) können alle Peaks außer 505,26 Da außer Acht gelassen werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Es wurde das Na⁺ -Addukt für Tris[G1](OH)₆ beobachtet. Der theoretische Massenwert von [Tris[G1](OH)₆ + Na]⁺ setzt sich zusammen aus der Masse des monoisotopischen Peaks von Tris[G1](OH)₆ (482,2362 Da) plus der Masse des Natriumkations (22,9892 Da), was eine Gesamtmasse von 505,226 Da ergibt. Der beobachtete Massenwert für [Tris[G1](OH)₆ + Na]⁺ beträgt 505,239 Da, was mit dem theoretischen Wert mit einer Differenz von +0,013 Da übereinstimmt.

Um eine vollständige Entfernung aller drei Benzylidengruppen zu gewährleisten, wurde das MALDI-ToF-MS-Spektrum zwischen 505 und 769 Da weiter analysiert. Dieser Massenbereich ermöglicht die Detektion von Peripheriegruppen, die nicht detektiert wurden. Es gäbe das Vorhandensein eines Peaks, [Tris[G1]Bnz₂(OH)₂ + Na]⁺, der darauf hindeuten würde, dass ein Benzyliden, das bei 681,289 Da ([Tris[G1]Bnz₃ + Na]⁺ 769,3194 Da - 88,0313 Da) und bei 593,257 Da ([Tris[G1]Bnz₃ + Na]⁺ 769,3194 Da -176,0626 Da) für [Tris[G1]Bnz₁(OH)₄ + Na]⁺ entfernt wurde, was darauf hindeuten würde, dass zwei Benzylidengruppen aus Tris[G1]Bnz₃ entfernt wurden (Abbildung 3). Diese Peaks und Tris[G1]Bnz₃ sind nicht vorhanden; daher ging die Reaktion zu Ende und Tris[G1](OH)₆ wurde synthetisiert.

Abbildung 3: Strukturen und theoretische Massen von Tris[G1]Bnz₃, den Zwischenprodukten von Tris[G1]Bnz₂(OH)₂, Tris[G1]Bnz₁(OH)₄ und Probe 1 Tris[G1](OH)_6. Der schwarze Punkt zeigt das Produkt an. Strukturen und theoretische Massen von einer und zwei Benzylidengruppen entfernt und das vollständig hydroxylierte Tris[G1](OH)₆ Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Im Bereich mit niedrigem Molekulargewicht unter 900 sind mehrere Peaks vorhanden, die nicht mit der monodispersen Masse von Tris[G1](OH)₆ übereinstimmen. Die meisten Matrizen weisen kleinere Rauschprobleme unter 1000 auf, daher ist ein leeres MALDI-ToF-MS-Spektrum enthalten, um zu bestätigen, dass Tris[G1](OH)₆ rein ist. Die Matrix-Blindprobe enthielt die Matrix- (CHCA) und Kationen- (Na⁺) Stammlösungen. Das gleiche Kation: Matrix-Konzentrationsverhältnis-Mengen aus dem Tris[G1]OH₆ (1:100 mg/ml) wurden für die Probenmischung der Analyse verwendet. Anschließend wurde 1 μl der Mischung auf die Probenplatte gegeben und zur Analyse getrocknet.

Die vorläufige Datenerfassung, die Kalibrierungserfassung und die Datenerfassung wurden abgeschlossen, um ein leeres MALDI-ToF-MS-Matrixspektrum zu erfassen. In Abbildung 2B (schwarz) wurden die MALDI-ToF MS-Blank-Matrix (schwarz) und das Tris[G1](OH)_6-Spektrum der Probe (rot) in der Flex-Analyse überlagert, um zu vergleichen und zu bestätigen, welche Peaks nicht mit dem Produkt assoziiert sind. Alle Peaks, die im leeren MALDI-ToF MS-Matrixspektrum und im Tris[G1](OH)₆ identifiziert wurden, können ignoriert werden, und daher beträgt der einzige Peak 505,226 Da, was Probe 2 entspricht. Zum Beispiel befinden sich die Peaks von 445,016 Da und 656,141 Da im Tris[G1](OH)₆ MALDI-ToF MS-Spektrum (Abbildung 2B rot) auch im leeren MALDI-ToF MS-Matrixspektrum (Abbildung 2B schwarz) bei 445,017 Da und 656,144 Da und weisen eine Differenz von +0,001 Da bzw. +0,003 Da auf. Diese Peaks werden nicht in die Analyse einbezogen, da sie mit der Blindmatrix und dem Tris[G1](OH)₆ MALDI-ToF MS-Spektrum übereinstimmen und ähnliche Unterschiede aufweisen. Daher wird die Masse von Tris[G1](OH)₆ durch MALDI-ToF MS bestätigt, aber andere Analysen wie SEC und NMR sind erforderlich, um die Reinheit der Probe zu bestätigen.

Probe 2: Poly(2,2-dimethylpropanoat) mit einer Chlorid- und einer Protonenendgruppe
3-Chlor-2,2-dimethylpropansäure wurde unter Verwendung von Kaliumcarbonat als Base polymerisiert (Abbildung 4A). Eine Probe aus Poly(2,2-dimethylpropanoat) (PDMP) mit Chlorid an einem Ende und einem Proton am anderen Ende (M_n = 980 Da) wurde mit MALDI-ToF MS ionisiert, um die während der Reaktion gebildeten polymeren Architekturen zu bestimmen und die verschiedenen Endgruppen zu analysieren. Die Probenvorbereitung für die MALDI-ToF-MS begann mit der Herstellung von Stammlösungen aus NaTFA (2 mg/ml in THF), dem Analyten (5-7 mg/ml in THF) und DCTB (20 mg/ml in THF). Nachdem diese Lösungen hergestellt waren, wurden 5 μl der Na⁺ -Kationenlösung, 5 μl der Analytlösung und 10 μl der Matrixlösung in einem Mikrozentrifugenröhrchen kombiniert und verwirbelt (Verhältnis von 10:25:200 Kationen:Analyt:Matrix für insgesamt 20 mL). Anschließend wurde 1 μl dieser Mischung aus dem Mikrozentrifugenröhrchen entnommen und auf der MALDI-ToF MS-Zielplatte getrocknet. Für die Matrix wurde DCTB ausgewählt, da es mit vielen anderen Polyestern funktioniert, aber auch andere Matrizen wie CHCA, HABA, GFR und DHB ausprobiert wurden. CHCA, HABA und GFR ionisierten die Probe gut, DHB erwies sich jedoch als erfolglos. NaTFA-Ionen wirkten im Vergleich zu Kaliumtrifluoracetat (KTFA), Cäsiumtrifluoracetat (CsTFA), Lithiumtrifluoracetat (LiTFA) und Silbertrifluoracetat (AgTFA) besser, da es besser mit den Sauerstoffn der Estergruppen interagiert.

Das MALDI-ToF-MS-Spektrum (Abbildung 4B) bestätigte die Molekulargewichtsverteilung von PDMP mit einer Chlorid-Endgruppe für Probe 3 im Bereich von 600 Da bis 1600 Da. Dies bedeutet, dass die Probe eine geringe Dispersität aufwies, was dazu führte, dass die M_n-, M_w- und Đ-Werte bei Verwendung der MALDI-Tof MS-Analysesoftware 980 Da, 1070 Da bzw. 1,09 betrugen. Der Monoisotopen-Peak war im Reflectron-Modus ausreichend aufgelöst, was die Verwendung einer exakten Massenidentifikation ermöglichte.

Abbildung 4: Reaktionsschema und MALDI-ToF MS Massenspektrum von Probe 2. (A). Reaktionsschema für die Synthese von PDMP unter Verwendung von 3-Chlor-2,2-dimethylpropansäure. (B) MALDI-ToF MS-Massenspektrum von Probe 2. Dieses vollständige MALDI-ToF-MS-Spektrum zeigt die Gesamtverteilung der PDMP-Probe mit einer Chlorid-Endgruppe (M_{, n} = 980 Da), die mit Na⁺ ionisiert wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Um die Masse der Polymer-Wiederholungseinheit zu bestätigen, wurde die Massendifferenz zwischen zwei benachbarten Peaks berechnet. Die Wiederholungseinheit des Polymers hat ein beobachtetes durchschnittliches Molekulargewicht von 100,056 Da, was bestätigt wurde, indem die durchschnittliche Masse von acht Peaks (Hauptverteilung) im Bereich von 600 Da bis 1300 Da genommen wurde, was nur +0,004 Da unter der theoretischen Wiederholungseinheit von PDMP (100,052 Da) liegt und zusätzlich eine Endgruppenmasse aufweist, die einem Wasserstoff (am vorderen Ende) und einem Chlorid (am hinteren Ende) entspricht Ende).

Das MALDI-ToF-MS-Spektrum zeigte drei unterschiedliche Verteilungen, die jeweils dem resultierenden Polymer mit unterschiedlichen Endgruppen entsprachen. Diese Endgruppen wurden identifiziert und bestätigt, indem ihre theoretischen Massen berechnet und mit den beobachteten Massen im MALDI-ToF MS-Spektrum verglichen wurden. Um die Endgruppen weiter zu identifizieren, wurde ein einzelnes n-mer für die Analyse ausgewählt (Abbildung 5).

Die Hauptverteilung von PDMP zeigte, dass das Polymer einen Wasserstoff (am vorderen Ende) und ein Chlorid (am hinteren Ende; blau) hatte. Der theoretische Massenwert des 8-Mer von PDMP (Abbildung 5) setzt sich zusammen aus der Masse der Wiederholungseinheiten (100,0524 Da x 8) plus der Masse der Cl-Endgruppe (+ 34,9689 Da) und der Masse der Wasserstoff-Endgruppe (+ 1,0078 Da) plus der Masse des Natriumkations (+ 22,9892 Da), was eine Gesamt-8-mer-Masse von 859,385 Da ergibt. Der beobachtete Massenwert für 8-mer [H-PDMP_8-Cl + Na]⁺ beträgt 859,426 Da, was nur +0,041 Da vom theoretischen Wert unterscheidet.

Die nächste Verteilung (orange) zeigte, dass das Polymer das Proton am vorderen Ende durch ein Natrium und ein Chlorid am hinteren Ende ersetzte. Der theoretische Massenwert des 8-Mer des deprotonierten PDMP setzt sich zusammen aus der Masse der Wiederholungseinheiten (100,0524 Da x 8) plus der Masse der Cl-Endgruppe (+ 34,9689 Da) und der Masse von zwei Natriumgruppen (+ (22,9892 Da x 2)), was eine Gesamtmasse von 881,367 Da ergibt. Der beobachtete Massenwert für 8-mer [Na-PDMP_8-Cl + Na]⁺ beträgt 881,413 Da, was nur +0,046 Da vom theoretischen Wert unterscheidet.

Schließlich bestätigte die dritte Verteilung (grün) von PDMP das Vorhandensein von zyklischen oligomeren Spezies. Der theoretische Massenwert des 8-Mer von zyklischem PDMP setzt sich zusammen aus der Masse der Wiederholungseinheiten (100,0524 Da × 8) plus der Masse einer Natriumgruppe (+ 22,9892 Da), was eine Gesamt-8-Mer-Masse von 823,409 Da ergibt. Der beobachtete Massenwert für das zyklische 8-mer [PDMP8 + Na]+ beträgt 823,448 Da, was nur +0,039 Da vom theoretischen Wert unterscheidet.

Das Vorhandensein von Halogenen auf dem Polymer kann durch MALDI-ToF MS identifiziert werden. Die Endgruppe auf dem linearen Polymer hat einen Cl, was durch das etwa 3:1-Verhältnis der Peaks [M⁺] und [M+2]⁺ angezeigt wird. Die Differenz zwischen den beobachteten und den theoretischen [M⁺] und [M+2]⁺ Peaks ist in Tabelle 1 dargestellt. Die theoretische und beobachtete prozentuale Häufigkeit für den zweiten Peak bei 761,3 Da [M+2]⁺ beträgt 42,3 % bzw. 42,2 % (wobei der erste Peak 100 % beträgt), was das Vorhandensein einer Cl-Gruppe auf der polymeren Endgruppe bestätigt. Es wurde festgestellt, dass die cyclische Spezies 36 Da unter der linearen sodierten Verbindung und 58 Da unter der disodierten Verbindung liegt. Darüber hinaus hatte diese zyklische Verbindung nicht das 3:1-Verhältnis, das eine monochlorierte Spezies hat. Dieses Chlorid könnte über einen S_N2-Angriff mit dem Carboxylat am gegenüberliegenden Ende entfernt worden sein, was zum Ringverschluss führte.

Abbildung 5: MALDI-ToF MS-Massenspektrum einer einzelnen Wiederholung von Probe 2. Dieses MALDI-ToF MS-Spektrum zeigt den Hauptpeak als PDMP mit Wasserstoff- und Chlorid-Endgruppen (M_{, n} = 980 Da), die mit Na⁺ ionisiert sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Vergleich zwischen der beobachteten und theoretischen prozentualen Peakhäufigkeit und der Peak-Isotopenintensität von [M⁺] und [M+2]⁺ Peaks (mit [M⁺] = 100 %) des linearen PDMP mit Wasserstoff- und Chlorid-Endgruppe (M_n = 980 Da) aus MALDI-ToF MS. Die Endgruppe auf dem linearen Polymer hat einen Cl, was durch das Verhältnis von [M⁺] und [M+2]⁺ Peaks von etwa 3:1 angezeigt wird. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Probe 3: Poly(2,2-dimethylpropanoat) mit quartären Ammonium- und Protonenendgruppen.
3-Brom-2,2-dimethylpropansäure wurde unter Verwendung von Triethylamin (TEA) als Base polymerisiert, es wurde jedoch festgestellt, dass TEA Br in der Endgruppe ersetzte (Abbildung 6A). Eine Probe von PDMP mit einem quartären Ammonium auf der einen Seite und einem Proton auf der anderen Seite (M_n = 1410 Da) wurde verwendet, um die Isotopenverteilung mit denen mit einer Cl-Endgruppe zu vergleichen. Die Vorbereitung der MALDI-ToF-MS-Probe begann mit der Herstellung von Stammlösungen aus KTFA (2 mg/ml in THF), dem Analyten (5-7 mg/ml in THF) und DCTB (20 mg/ml in THF). Nachdem diese Lösungen hergestellt waren, wurden 5 μl der K⁺ -Kationenlösung, 5 μl der Analytlösung und 10 μl der Matrixlösung in einem Mikrozentrifugenröhrchen kombiniert und verwirbelt (Verhältnis von 10:25:200 Kationen:Analyt:Matrix für insgesamt 20 mL). Anschließend wurde 1 μl dieser Mischung aus dem Mikrozentrifugenröhrchen entnommen und auf der MALDI-ToF MS-Zielplatte getrocknet. Für die Matrix wurde DCTB ausgewählt, da es mit vielen anderen Polyestern zusammenarbeitet. Das Kaliumkation wurde hinzugefügt, um zu bestätigen, ob die Probe selbstionisierend war.

Das Polymer enthält quartären Stickstoff (positiv geladen) an der Endgruppe, der sich selbst ionisieren kann. Dies wurde durch MALDI-ToF MS-Spektren bestätigt, da sich das Masse-Ladungs-Verhältnis (m/z) nicht änderte, unabhängig davon, ob K⁺ oder Na⁺ in der Probenvorbereitung verwendet wurde. Zusätzlich bestätigten die MALDI-ToF MS-Spektren das Vorhandensein von positiv geladenem quartärem Ammonium in der Endgruppe, da Br eine gute Abgangsgruppe ist.

Die MALDI-ToF-MS-Spektren bestätigten, dass die Molekulargewichtsverteilung von PDMP mit einer quartären Ammonium-Endgruppe im Bereich von 600 Da bis 2200 Da liegt (Abbildung 6B). Dies bedeutet, dass die Probe eine geringe Dispersität aufwies, was dazu führte, dass die M_n-, M_w- und Đ-Werte bei Verwendung der MALDI-Tof MS-Analysesoftware 1410 Da, 1540 Da bzw. 1,08 betrugen.

Abbildung 6: Reaktionsschema und MALDI-ToF MS-Massenspektrum von Probe 3. (A) Reaktionsschema für Probe 3. Reaktionsschema für die Synthese von PDMP unter Verwendung von 3-Brom-2,2-dimethylpropansäure mit Triethylamin als Base. (B) Dieses vollständige MALDI-ToF MS-Spektrum zeigt die Gesamtverteilung des linearen PDMP mit einer quartären Ammonium-Endgruppe (M_n = 1410 Da). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Um zu bestätigen, ob das Polymer die gleiche Wiederholungseinheit (Monomer) hatte, wurde die Differenz zwischen zwei benachbarten Peaks berechnet. Die Rapporteinheit des Polymers hat ein beobachtetes durchschnittliches Molekulargewicht von 100,0535 Da. Dies wurde durch die Betrachtung des Durchschnitts von zwölf Peaks (Hauptverteilung) im Bereich von 900 Da bis 2300 Da bestätigt, was nur +0,0011 Da über der theoretischen Wiederholungseinheit (100,0524 Da) liegt.

Das MALDI-ToF MS-Spektrum wies zwei unterschiedliche Verteilungen auf. Eine der Verteilungen zeigte, dass das Polymer eine Carbonsäure und ein positiv geladenes quartäres Ammonium als Endgruppen hat (schwarz), während die andere Verteilung (violett) den Verlust von Proton aus der Carbonsäure und eine Addition von Kaliumionen zeigte. Um die Endgruppen weiter zu identifizieren, wurde ein einzelner n-mer für die Analyse ausgewählt (Abbildung 7).

Der theoretische Massenwert des 12-Mer von PDMP mit quartärer Ammonium-Endgruppe setzt sich zusammen aus der Masse der Wiederholungseinheiten (100,0524 x 12) plus der Masse der quartären Ammonium-Endgruppe (+ 101,1199) und der Masse der Wasserstoff-Endgruppe (+ 1,0078), was eine Gesamt-12-mer-Masse von 1302,757 Da ergibt. Der beobachtete Massenwert für 12-mer [H-PDMP_12-TEA]⁺ liegt bei 1302,730 Da, was nur -0,027 Da unter dem theoretischen Wert liegt.

Der theoretische Massenwert des 12-Mer von PDMP mit quartärer Ammonium-Endgruppe auf einer Seite und dem Ersatz des Protons durch ein anderes Kalium-Ion setzt sich zusammen aus der Masse der Wiederholungseinheiten (100,0524 × 12) plus der Masse der quartären Ammonium-Endgruppe (+ 101,1199) und der Masse der Kalium-Endgruppe (+ 38,9637), was eine Gesamt-12-mer-Masse von 1340,713 Da ergibt. Der beobachtete Massenwert für 12-mer [K-PDMP_12-TEA]⁺ liegt bei 1340,700 Da, was nur -0,013 Da unter dem theoretischen Wert liegt.

Abbildung 7: MALDI-ToF MS-Massenspektrum einer einzelnen Wiederholung von Probe 3. Dieses MALDI-ToF MS-Spektrum zeigt die Primärverteilung des linearen PDMP mit einer quartären Ammonium-Endgruppe (M_n = 1410 Da). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Probe 4: Lineares Poly(ethylen-brassylat)
Die nächste Polymerprobe, die durch MALDI-ToF MS charakterisiert wird, ist lineares Poly(ethylenbrassylat) (l-PEB). Dieses wurde aus dem makrozyklischen Monomer Ethylenbrassylat synthetisiert, das einen siebzehnköpfigen Ring aufweist, der zwei Estergruppen enthält (Abbildung 8A). Um die funktionelle Gruppe und die architektonische Veränderung innerhalb der Polymerstruktur zu verstehen, wurden vier verschiedene Charakterisierungstechniken untersucht: MALDI-ToF MS, ¹H-NMR, SEC und Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie (FTIR). ¹H-NMR, SEC und FTIR bestätigen die Entfernung des zyklischen Diesters und die Bildung von α-Propargyl-ω-hydroxy-PEB. Bei diesen Techniken wurde jedoch keinerlei Bildung von Nebenprodukten festgestellt. Auf der anderen Seite weist das MALDI-ToF-MS-Spektrum (Abbildung 8B) von l-PEB drei verschiedene Massenverteilungen auf, die auf die Bildung von drei verschiedenen PEBs hinweisen: α-Hydroxy-ω-hydroxy-PEB (1), α-Propargyl-ω-propargyl-PEB (2) bzw. α-propargyl-ω-hydroxy-PEB (3) (Abbildung 8B).

Abbildung 8: MALDI-TOF-Spektrum von l-PEBs mit Na⁺. (A) Lineare Strukturen aus Poly(ethylenbrassylat). (1) α-Hydroxy-ω-hydroxy-PEB (2), α-propargyl-ω-propargyl-PEB (3) α-propargyl-ω-hydroxy-PEB. (B) Es wurden drei Verteilungen identifiziert, darunter α-Hydroxy-ω-hydroxy-PEB (1), α-Propargyl-ω-propargyl-PEB (2) und α-propargyl-ω-hydroxy-PEB (3). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die l-PEB-Probe wurde auf dem MALDI-ToF MS analysiert, wobei DCTB als Matrix für unpolare Polymere verwendet wurde. Die Vorbereitung der MALDI-ToF-MS-Probe begann mit der Herstellung von Stammlösungen aus NaTFA (1 mg/ml in THF), dem Analyten (5 mg/ml in THF) und DCTB (20 mg/ml in THF). Nachdem diese Lösungen hergestellt waren, wurden 1 μl der Na⁺ -Kationenlösung, 5 μl der Analytlösung und 20 μl (4) der Matrixlösung in einem Mikrozentrifugenröhrchen kombiniert und vortexed (Verhältnis 1:25:400 Kationen:Analyt:Matrix für insgesamt 26 mL). Anschließend wurde 1 μl dieser Mischung aus dem Mikrozentrifugenröhrchen entnommen und auf der MALDI-ToF MS-Zielplatte getrocknet. Die beobachteten MWs für jede Verteilung lagen innerhalb einer Abweichung von 0,03 Da von den genauen Molekulargewichten der [M + Na]⁺ Ionen.

Der theoretische Massenwert für das 6-mer von α-Hydroxy-ω-hydroxy-PEB (1) setzt sich zusammen aus der Masse der Wiederholungseinheiten (270,1831 Da x 6) plus der Masse der 2-Hydroxyethoxy-Endgruppe (+ 61,0290 Da) plus der Masse der Wasserstoff-Endgruppe (+ 1,008 Da) plus Natriumkation (+ 22,9892 Da), was insgesamt 1706,124 Da ergibt. Der beobachtete Massenwert für das 6-mer von α-Hydroxy-ω-hydroxy-PEB (1) beträgt 1706,133 Da, was nur +0,009 Da über dem theoretischen Wert liegt.

Der theoretische Massenwert für das 5-mer von α-Propargyl-ω-propargyl-PEB (2) setzt sich zusammen aus der Masse der Wiederholungseinheiten (270,1831 Da x 5) plus der Masse des Ethylenbrassylats minus OCH₂CH₂O (+ 210,1620 Da) plus der Masse von zwei Propargylether-Endgruppen (+ 55,0184 Da x 2) plus Natriumkation (+ 22,9892 Da), was insgesamt 1694,103 Da ergibt. Der beobachtete Massenwert für das 5-mer von α-Propargyl-ω-propargyl-PEB (2) beträgt 1694,127 Da, was nur +0,024 Da über dem theoretischen Wert lag.

Der theoretische Massenwert für das 6-mer von α-Propargyl-ω-hydroxy-PEB (3) setzt sich zusammen aus der Masse der Wiederholungseinheiten (270,1831 Da x 6) plus der Masse der Propargylether-Endgruppe (+ 55,0184 Da) plus der Masse der Wasserstoff-Endgruppe (+ 1,008 Da) plus Natriumkation (+ 22,9892 Da), was insgesamt 1700,113 Da ergibt. Der beobachtete Massenwert für 6-mer von α-Propargyl-ω-hydroxy-PEB (3) beträgt 1700,139 Da, was nur +0,026 über dem theoretischen Wert liegt.

Probe 5: Azidiertes lineares Poly(ethylen-Messing)
Des Weiteren wurde I-PEB (Probe 6) mit 6-Azidohexansäure durch Veresterung seiner Alkoholendgruppen funktionalisiert (Abbildung 9), wodurch azidifiziertes l-PEB (Probe 7) erhalten wurde. Das erhaltene Produkt wurde auch auf dem MALDI-ToF MS (Abbildung 10) analysiert, indem die Probenvorbereitungstechniken als Ausgangspolymer verwendet wurden (Probe 6). Die beobachteten MWs für jede Verteilung lagen innerhalb einer Abweichung von 0,04 Da von den exakten Molekulargewichten der [M + Na]⁺ Ionen. Nach der Veresterung zeigen die [M + Na]⁺ Ionen von l-PEBs mit zwei Hydroxy-Endgruppen (1) aufgrund ihrer Umwandlung von (1) in α-azido-ω-azido-PEB (4) eine Massenverschiebung. Zusätzlich wurden l-PEBs mit einer Hydroxyendgruppe und einer Propargyl-Endgruppe (3) in ein α-Propargyl-ω-azido-PEB umgewandelt (5). (2) bleibt jedoch aufgrund seiner beiden Alkin-Endgruppen unreagiert.

Abbildung 9: Veresterung von linearem Poly(ethylenbrassylat) mit der Alkoholendgruppe über das Reaktionsschema der 6-Azidohexansäure. α-Hydroxy-ω-hydroxy-PEB (1) wandelt sich in α-Azido-ω-azido-PEB (4) und α-propargyl-ω-hydroxy-PEB(3) in α-propargyl-ω-azido-PEB (5) um. α-propargyl-ω-propargyl-PEB (2) bleibt aufgrund der Alkin-Endgruppen, die keine Veresterungsreaktion durchlaufen, unumgesetzt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Der theoretische Massenwert für das 6-mer von α-Propargyl-ω-azido-PEB (5) setzt sich zusammen aus der Masse der Wiederholungseinheiten (270,1831 Da × 6) plus der Masse der Propargylether-Endgruppe (+ 55,0184 Da) plus der Masse der Azidohexanoat-Endgruppe (+ 140,0824 Da) plus Natriumkation (+ 22,9892 Da), was insgesamt 1839,188 Da ergibt. Der beobachtete Massenwert für 6-mer von α-Propargyl-ω-azido-PEB (5) beträgt 1839,184 Da, was nur -0,004 Da unter dem theoretischen Wert liegt. Darüber hinaus ist das Vorhandensein von metastabilen Ionenpeaks (5-N₂) für (5) ein weiterer Hinweis auf eine Azidfunktionalisierung, da sich metastabile Ionen nur bilden, wenn ein Azid im Molekül vorhanden ist.

Der theoretische Massenwert für das 6-mer des metastabilen Peaks (5-N₂ + Na⁺) beträgt 1815,126 Da, der mit Hilfe der Gleichung aus dem Diagramm der Massendifferenz des metastabilen Peaks und der α-Azido-ω-Hydroxy-PEG-Peaks bestimmt wurde (Abbildung 11). Der beobachtete Massenwert für 6-mer des metastabilen Peaks liegt bei 1815,089 Da, was nur -0,031 Da unter dem theoretischen Wert liegt. Das Diagramm zeigt, dass innerhalb des Massenbereichs von 1000 bis 2000 Da der theoretische Massenwert des metastabilen Peaks 24 bis 24,1 Da niedriger ist als der von (5).

Der theoretische Massenwert für das 6-mer von α-Azido-ω-azido-PEB (4) setzt sich zusammen aus der Masse der Wiederholungseinheiten (270,1831 Da × 6) plus der Masse der 6-Azidohexanoat-Endgruppe (+ 140,0824 Da) plus der Masse der 2-Oxyethyl-6-azidohexanoat-Endgruppe (+ 200,1035 Da) plus Natriumkation (+ 22,9892 Da), was insgesamt 1994,273 Da ergibt. Der beobachtete Massenwert für das 6-mer von α-Azido-ω-azido-PEB (4) beträgt 1994,296 Da, was +0,023 Da über dem theoretischen Wert liegt.

Abbildung 10: MALDI-ToF-Spektrum von azidifizierten l-PEBs mit Na⁺. Dazu gehören drei Distributionen von α-Propargyl-ω-propargyl-PEB (2), α-Azido-ω-azido-PEB (4) und α-propargyl-ω-azido-PEB (5). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 11: Grafische Darstellung der Massendifferenz zwischen α-Azido-ω-Hydroxy-PEG und seiner metastabilen Verbindung relativ zur Masse von α-Azido-ω-hydroxy-PEG (mittlere Masse 1700 Da). Dieses Diagramm wurde aus dem MALDI-ToF-Spektrum von α-Azido-ω-hydroxy-PEG abgeleitet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Probe 6: Ein breit dispergiertes Kammpolymer
Das endgültige Reaktionsschema ist ein Wabenpolymer, das Thioether-Wiederholungseinheiten mit Poly(ethylenglykol)-Seitenketten⁹ aufweist. Die Wabenpolymerprobe aus 400 M_n Methylether-PEG-propargyl und 1,6-Hexanedithiol (CP MeO-PEG-400 HDT; Abbildung 12A) wurde mittels NaTFA analysiert. Natrium wurde als Gegenion gewählt, da Ether und Thioether leichter mit Natrium, Lithium und Kalium ionisieren als mit höheren Erdalkalimetallen wie Cäsium. Diese Proben wurden mit einer unpolaren Matrix, DCTB, durchgeführt, obwohl auch zusätzliche Matrices (CHCA und DT) mit schlechten Ergebnissen getestet wurden. Die Vorbereitung der MALDI-ToF-MS-Probe begann mit der Herstellung von Stammlösungen aus NaTFA (1 mg/ml in THF), dem Analyten (5 mg/ml in THF) und DCTB (20 mg/ml in THF). Sobald diese Lösungen hergestellt waren, wurden 1 ml der Kationenlösung, 5 ml der Analytlösung und 20 ml der Matrixlösung in einem Mikrozentrifugenröhrchen kombiniert und vortexed (Verhältnis von 1:25:400 Kationen:Analyt:Matrix für insgesamt 26 mL). Anschließend wurde 1 mL dieser Mischung aus dem Mikrozentrifugenröhrchen entnommen und auf der MALDI-ToF MS-Zielplatte getrocknet. Da NaTFA der Probe als Gegenion zugesetzt wurde, wies das MALDI-ToF MS-Massenspektrum die erwarteten Na^+- Addukte der bekannten Probe auf. Darüber hinaus wurden auch Erhöhungen von etwa 16 Da, 32 Da und 48 Da über diesen Spitzenwerten beobachtet, die später in diesem Artikel diskutiert werden.

Abbildung 12: Reaktionsschema für Probe 6 und MALDI-ToF-Massenspektrum von Probe 6 (A) Chemische Struktur und Reaktionsbedingungen eines Dithiol-basierten Kammpolymers mit mehreren HDT-Spacern und 400 M_n PEG-Seitenketten. (B) MALDI-ToF-Massenspektrum von Probe 6, CP MeO-PEG-400 HDT. Dur-Rapporteinheit = 550,30 Da, Moll-Rapporteinheit = 44,02 Da Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

MALDI-ToF MS bestätigte die weite Verteilung (Dispersität durch SEC = 2,88; Abbildung 12B) von CP MeO-PEG-400 HDT. Der Monoisotopen-Peak (der ausschließlich die am häufigsten vorkommenden Elementarisotope umfasst, nämlich ¹²C, ¹H, ¹⁶O und ³²S) war ausreichend aufgelöst, was die Verwendung einer exakten Massenidentifikation ermöglichte. Alle theoretischen Massenberechnungen wurden mit Hilfe von Monoisotopenmassen für jedes Element bestimmt. Aufgrund der großen Dispersität der Probe (2,88 x SEC) konnte das MALDI-ToF-Massenspektrum nicht zur Berechnung von M_n,_{M w} oder Đ verwendet werden. MALDI-ToF MS zeichnet sich durch die Charakterisierung von schmal dispergierten Polymeren (Đ < 1,3) aus, kann aber mit der vollständigen Charakterisierung von breit dispergierten Polymeren Schwierigkeiten haben. Bei der Beschreibung von Polymeren mit breiter Dispersion ist nur das niedermolekulare Ende des Massenspektrums mit MALDI-ToF MS gut aufgelöst und sichtbar, wobei Spezies mit höherem Molekulargewicht ausgeschlossen werden. Dieses Phänomen wird als Low Mass Bias bezeichnet. Aufgrund dieses Auftretens ist eine vollständige Charakterisierung der Wabenpolymere durch MALDI-ToF MS allein nicht möglich. Aus diesem Grund wurde SEC zusammen mit MALDI-ToF MS verwendet, um genaue M_n-, M_w- und Đ-Werte zu erhalten.

Um das Vorhandensein des Wabenpolymers zu bestätigen, wurde ein ähnlicher Ansatz für ein lineares oder zyklisches Standardpolymer gewählt. Jede Wiederholungseinheit des Kammpolymers enthält eine enge Verteilung von M_n = 400 PEG-Seitenketten, so dass die Kammpolymer-Wiederholungseinheiten untersucht wurden, um das Vorhandensein des beabsichtigten Produkts in jeder zu bestimmen. Zusätzlich wurde eine kleine Menge Ausgangsmaterial aus der Polymerisation in der Reaktionslösung (300-700 Da) zurückgelassen, die ebenfalls charakterisiert wurde.

Im vollen MALDI-ToF MS-Spektrum sind die unteren und höheren MW für 6 bis 15 mer des MeO-PEG-OH zu sehen. Ursprünglich waren diese MeO-PEG-OH im MALDI-ToF MS-Spektrum des MeO-PEG-propargyl-Ausgangsmaterials nicht sichtbar (Abbildung 13; oberes Spektrum). Das Auftreten dieser Peaks ist auf die relative Konzentration des MeO-PEG-Propargyls zum MeO-PEG-OH zurückzuführen. Im Verlauf der Wabenpolymerreaktion wird das MeO-PEG-Propargyl in das Produkt eingebaut. Aus diesem Grund beginnt das Verhältnis des alkinischen Ausgangsmaterials zum MeO-PEG-OH zu sinken, was ein unfunktionalisiertes MeO-PEG-OH im MALDI-ToF MS-Spektrum zeigt (Abbildung 13; unteres Spektrum).

Was die Massenverteilung des Produkts anbelangt, so wurden für alle nachfolgenden Berechnungen exakte Massenwerte verwendet. Der theoretische Massenwert einer Wiederholungseinheit des Ausgangsmaterials [MeO-(PEG₁₀)-CH₂CCH + Na]⁺ beträgt 44,0262 Da. Diese Wiederholungseinheitsmasse multipliziert mit der Anzahl der Wiederholungseinheiten, die für jede Seitenkette 10 beträgt, (44,0262 Da x 10) plus die Masse der α-Methoxy-Endgruppe (+ 31,0183 Da) und die Masse der ω-Propargyl-Endgruppe (+ 39,0235 Da) plus die Masse des Natriumkations (+ 22,9892 Da), ergibt eine Gesamt-10-mer-Masse von 533,2932 Da. Der beobachtete Massenwert für das 10-mer PEG + Na⁺ beträgt 533,239 Da, was -0,054 Da unter dem theoretischen Wert liegt (Abbildung 13). In den vollständigen MALDI-ToF-MS-Spektren gibt es für diese Serie das 6- bis 9-mer unten und das 11- bis 15-mer oben. Die Abfolge kleinerer, versetzter Peaks im niedermolekularen Spektrum entspricht unfunktionalisiertem MeO-PEG-OH-Ausgangsmaterial, wobei sich der theoretische Massenwert des 11-mers aus der Masse der Repeateinheiten (44,0262 Da x 11) plus der Masse der α-Methoxy-Endgruppe (+ 31,0184 Da) und der Masse der ω-Wasserstoff-Endgruppe (+ 1,008 Da) und der Masse des Natriumkations (+ 22,9892 Da) zusammensetzt, was insgesamt ein 11-mer ergibt Masse von 539.304. Der beobachtete Massenwert für das 11-mer + Na⁺ liegt bei 539,252 Da, was nur -0,052 Da unter dem theoretischen Wert liegt.

Abbildung 13: MALDI-ToF-Massenspektren (vergrößert von 530-615 Da) des Ausgangsmaterials (oben) und der niedermolekularen Spezies von Probe 8 (unten), CP MeO-PEG-400 HDT. Das Verhältnis des Alkin-Ausgangsmaterials zum MeO-PEG-OH (oberes Spektrum und rot) beginnt abzusinken, was ein unfunktionalisiertes MeO-PEG-OH (unteres Spektrum und blau) im Massenspektrum von CP MeO-PEG-400 HDT MALDI-ToF (unteres Spektrum) zeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Was die cyclischen Wabenpolymere betrifft, so können ihre Massen mit unterschiedlichen Polymerisationsgraden mit den Einzelteilen des gewünschten n-mers multipliziert werden. Der theoretische Massenwert des 2-mers [CP-MeO-PEG₁₆ HDT + Na]⁺ setzt sich zusammen aus der Masse der Wiederholungseinheiten jeder PEG-Kette, von denen es etwa 8 pro Kette gibt (44,0262 Da x 16) plus die Masse der terminalen Methylendgruppen jeder PEG-Kette (+ 15,0235 Da x 2) plus die Masse der Kohlenstoffe, die einst die Propargylgruppe waren und nun mit den Thiolen reagiert haben (+ 41,0391 Da x 2) plus die Masse des HDT, das mit den Alkinen reagiert hat (+ 148,0380 Da x 2) und die Masse des Natriumkations (+ 22,9892 Da), was eine Gesamt-2-mer-Masse von 1167,599 Da ergibt. Der beobachtete Massenwert für das 2-mer [CP-MeO-PEG₁₆ HDT + Na]⁺ beträgt 1167,626 Da, was +0,027 Da über dem theoretischen Wert liegt (Abbildung 14). Obwohl die zyklischen Strukturen mit niedrigerem Molekulargewicht beobachtet wurden, konnten die linearen Verbindungen mit Thiolen an beiden Enden oder Doppelbindungen an beiden Enden nicht beobachtet werden.

Diese thioetherhaltigen Polymere können auch einer Oxidation unterzogen werden, wobei die Thioether in Sulfoxide umgewandelt^{werden 9}. Dies erklärt die Zugabe mehrerer Sauerstoffe (+ 15,9949 Da x n) in Abhängigkeit vom Oxidationsgrad; dies unterscheidet sich vom K+-Addukt, das eine Differenz von +15,9739 Da zum Na⁺-Addukt darstellt. Für die einfache Oxidation des 2-mers [CP-MeO-PEG₁₆ HDT + Na]^{+ beträgt der} theoretische Massenwert 1183,594 Da, während der beobachtete Massenwert 1183,620 Da betrug, mit einem Anstieg von nur +0,026 Da gegenüber dem theoretischen Wert. Für die Doppeloxidation des 2-mers [CP-MeO-PEG₁₆ HDT + Na]⁺ beträgt der theoretische Massenwert 1199,590 Da, während der beobachtete Massenwert 1199,613 Da betrug, mit einem Anstieg von nur +0,023 Da gegenüber dem theoretischen Wert. Für die dreifache Oxidation des 2-mers [CP-MeO-PEG16 HDT + Na]⁺ beträgt der theoretische Massenwert 1215,585 Da, während der beobachtete Massenwert 1215,617 Da betrug, mit einem Anstieg von nur +0,032 Da gegenüber dem theoretischen Wert.

Abbildung 14: MALDI-ToF-Massenspektrum von Probe 8, CP MeO-PEG-400 HDT. Vergrößern von 1165-1254 Da zeigt zyklische 2-Mer-Kammpolymerprodukte mit unterschiedlichen Mengen an PEG-Repeat-Einheiten und unterschiedlichen Graden der Thioetheroxidation. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die Oxidation kann durch eine Gegenionenstudie weiter bestätigt werden. Dazu wird ein anderes ionisierendes Kation, wie z. B. K⁺, verwendet und die Verschiebung der Peaks in den MALDI-ToF-MS-Spektren verglichen. Eine Probe von CP MeO-PEG-400 HDT wurde auf dem MALDI-ToF-MS unter Verwendung von KTFA anstelle von NaTFA ausgeführt (Abbildung 15). Dies verschiebt alle Massen der Peaks um +15,9739 Da nach oben, was auf die Massendifferenz zwischen Na⁺ und K⁺ zurückzuführen ist. Für die Analyse mit dem K⁺ -Addukt war kein unoxidiertes Polymer (1183.574 Da_Theo) in den MALDI-ToF MS-Spektren vorhanden. Für die einfache Oxidation des 2-mers [CP-MeO-PEG₁₆ HDT + K]⁺ beträgt der theoretische Massenwert 1199,569 Da, während der beobachtete Massenwert 1199,567 Da (nur -0,002 Da) betrug, für die doppelte Oxidation des 2-mers [CP-MeO-PEG₁₆ HDT + K]⁺ beträgt der theoretische Massenwert 1215,564 Da, während der beobachtete Massenwert 1215,572 Da betrug, was eine Differenz darstellt (nur +0,008 Da), Für die dreifache Oxidation des 2-mers [CP-MeO-PEG₁₆ HDT + K]⁺ beträgt der theoretische Massenwert 1231,558 Da, während der beobachtete Massenwert 1231,563 Da (nur +0,005 Da) betrug, und für die neu gebildete vierfache Oxidation des 2-mers [CP-MeO-PEG₁₆ HDT + K]⁺ beträgt der theoretische Massenwert 1247,553 Da, während der beobachtete Massenwert 1247,551 Da (nur -0,002 Da) betrug. Es ist zu beachten, dass die Polymere zwischen dem Laufen der Na⁺ - und K⁺ -Addukte weiter oxidierten, was zum Verlust des unoxidierten Produkts und zur Bildung der vierfachen Oxidation des CP MeO-PEG-400 HDT führte. Es kann auch festgestellt werden, dass das Polymer zwar sowohl mit Na⁺ - als auch mit K⁺ -Addukten fliegt, das Signal-Rausch-Verhältnis jedoch bei den Na⁺ -Addukten deutlich höher ist, was die Option unterstreicht, Na⁺ für die primäre Charakterisierung zu verwenden.

Abbildung 15: MALDI-ToF-Massenspektrum von Probe 8, CP MeO-PEG-400 HDT. Der Zoom von 1195-1254 Da zeigt zyklische 2-Mer-Kammpolymerprodukte mit unterschiedlichen Anteilen an PEG-Repeat-Einheiten und unterschiedlichen Graden der Thioetheroxidation. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

MALDI-ToF MS ist eine hocheffektive Technik zur Charakterisierung von synthetischen Polymeren, die aufgrund ihres weichen Ionisationsmechanismus präzise Messungen mit minimaler Fragmentierung ermöglicht. Bei diesem Verfahren absorbiert die Matrix Energie von einem Laser und überträgt sie auf den Analyten²⁶. Diese Energie bewirkt, dass das Polymer verdampft, durch Wechselwirkung mit einem Kationisierungsmittel ionisiert und in ein Vakuum desorbiert. Die ionisierten Analyten wandern durch das Flugrohr, wo sie anhand ihres Masse-Ladungs-Verhältnisses (m/z)^26,27 nachgewiesen werden. Dieses Verfahren eignet sich zur Bestimmung der Masse monodisperser Moleküle und ist gleichermaßen wirksam für mäßig disperse (Đ = 1,1-1,3) und hochdisperse Polymere, bei denen die Einheitsmasse und Endgruppen der Wiederholungseinheit bestimmt werden können. Für mäßig disperse Polymere bietet MALDI-ToF MS auch die Dispersität (Ð), das zahlengemittelte Molekulargewicht (M_n) und das gewichtsdurchschnittliche Molekulargewicht (M_w).

Es sollten jedoch einige Einschränkungen der Technik beachtet werden. Die MALDI-ToF-MS weist bei der Analyse von Polymeren mit hoher Dispersität (Đ > 1,3) eine Verzerrung der geringen Masse auf, was bedeutet, dass Polymere mit geringerer Masse in der Verteilung das Spektrum dominieren, während Spezies mit höherer Masse Peaks mit geringer Intensität aufweisen oder nicht vorhanden sind^28,29. Darüber hinaus nimmt die Auflösung bei Polymeren über 10.000 Da deutlich ab, und Polymere über 15.000 Da könnten im linearen Modus besser analysiert werden. Der lineare Modus opfert jedoch die Auflösung des Isotopenpeaks im Vergleich zum Reflektormodus. Darüber hinaus beruht MALDI-ToF MS auf der Fähigkeit des Polymers, effektiv zu ionisieren. Polymere mit konjugierten Systemen oder Heteroatomen ionisieren leichter als gesättigte Kohlenwasserstoffe wie Polyethylen oder Polypropylen, die häufig chemische Modifikationen erfordern, um zu ionisieren^30,31.

Die Probenvorbereitung ist ein entscheidender Schritt, um erfolgreiche Ergebnisse zu erzielen. Einer der wichtigsten Aspekte ist die Auswahl der geeigneten Matrix für den Polymeranalyten^11,32. Zum Beispiel eignen sich Matrizen wie DCTB und GFR gut für unpolare Polymere, während DHB und CHCA für polare Polymere verglichen werden können, um herauszufinden, welche Matrix die am besten aufgelösten Peaks liefert. Darüber hinaus gewährleistet die Wahl eines geeigneten Lösungsmittels zum Auflösen sowohl der Matrix als auch des Analyten eine ordnungsgemäße Cokristallisation, was die Laserablation verbessert und die Auflösung in den resultierenden MALDI-ToF-MS-Spektren verbessert 33,34,35. Ebenso ist die Wahl des geeigneten Kationisationsmittels unerlässlich, um die Ionisationseffizienz zu maximieren und klare, unterscheidbare Peaks zu erzeugen.

Sobald die Matrix und das Kationisierungsmittel ausgewählt sind, kann das Matrix:Analyt:Kationen-Verhältnis optimiert werden. Beginnen Sie mit der Herstellung von Stammlösungen des ausgewählten Kations (1 mg/ml in THF), des Analyten (5 mg/ml in THF) und der Matrix (20 mg/ml in THF). Es wird ein Ausgangsvolumenverhältnis von 1:5:20 μl (Kationen:Analyt:Matrix) empfohlen, was Konzentrationsverhältnissen von ca. 1:25:400 mg/ml bei einem Gesamtvolumen von 26 μl entspricht. Wenn diese anfängliche Mischung keine gut aufgelösten Spektren ergibt, kann eine systematische Optimierung mit einem gitterbasierten Ansatz durchgeführt werden (Tabelle 2)^10,16. In diesem Aufbau wird das Analytvolumen fixiert, während das Matrixvolumen in den Spalten inkrementell mit 4 multipliziert wird und das Kationenvolumen in den Zeilen mit 4 multipliziert wird. Dieses Raster ermöglicht es dem Benutzer, das optimale Verhältnis für Ionisation und Auflösung zu identifizieren. Wenn eine der äußeren Gitterbedingungen eine verbesserte Leistung bietet, kann ein neues Gitter erstellt werden, das auf diesem Verhältnis zentriert ist, wobei das Vielfache von 4 Anpassungen zur weiteren Verfeinerung fortgesetzt wird. Ein guter Ausgangspunkt ist die Beurteilung, ob das Spektrum Peaks mit hoher Intensität, geringes Grundlinienrauschen und eine gut aufgelöste Isotopenauflösung enthält. Dieser Prozess kann zeitaufwändig sein, insbesondere bei neuartigen oder komplexen Polymeren, bei denen möglicherweise mehrere Matrices und Kationen in einem 3 x 3-Präparationsgitter getestet werden müssen.

Tabelle 2: Ein systematisches Raster von experimentellen Verhältnissen kann erstellt und getestet werden. Ein Verhältnis von 1:5:20 μl von Kationen, Analyten und Matrix wird verwendet, um mit (1:25:400 mg/ml) Kationen:Analyt:Matrix für insgesamt 26 ml zu beginnen. Das Analytvolumen ist auf 5 μl (25 mg/ml) festgelegt. Die Matrix und das Kationenverhältnis werden inkrementell über die Spalten bzw. die Zeilen nach oben mit 4 multipliziert. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Nach der Probenapplikation auf die MALDI-ToF MS-Zielplatte mit der Methode der getrockneten Tröpfchen wird die MALDI-ToF MS-Platte in das MALDI-TOF MS-Gerät geladen. MALDI-ToF MS-Datenerfassungsparameter wie Laserleistung, Laserstrahldurchmesser, Detektorverstärkung und Pulsionenextraktion können fein abgestimmt werden, um eine höhere Auflösung und einen klareren Peakabstand zu erreichen. Diese können systematisch geändert werden, um die Spitzenintensität zu bestimmen, das Basisrauschen zu senken und die Spitzenauflösung zu verbessern (Abbildung 1).

Die Optimierung der instrumentellen Parameter und der Probenvorbereitungsverhältnisse folgt keinem streng linearen Arbeitsablauf. Der Bediener kann mit einer bevorzugten Probenvorbereitungsmethode beginnen und im linearen Modus screenen, um zu beurteilen, ob das Polymer ionisiert, oder er kann zunächst die Gerätemethode (z. B. Laserleistung, Pulsextraktion) feinabstimmen, bevor er die Probenmischungsverhältnisse mit dem 3 x 3-Vorbereitungsgitter modifiziert. Flexibilität im Arbeitsablauf ist oft erforderlich, insbesondere bei der Analyse neuer, unbekannter oder schlecht charakterisierter Materialien.

Sobald die Optimierung abgeschlossen ist, kann ein Probenvorbereitungsprotokoll wiederverwendet werden, obwohl immer noch geringfügige Schwankungen zwischen den Bedienern oder zwischen den Tagen auftreten können. Durch die Durchführung einer Kalibrierung für jeden Erfassungslauf werden Schwankungen minimiert, und Unterschiede in der Spitzenmasse bleiben in der Regel unter 0,1 Da, wenn konsistente Protokolle befolgt werden. Daher ist eine Reproduzierbarkeit über Benutzer und Tage hinweg erreichbar, wenn sowohl die Instrumentenmethode als auch die Probenvorbereitung gleich bleiben. Wenn die Probleme weiterhin bestehen, finden Sie in Tabelle 3 eine Tabelle mit häufig auftretenden Problemen, die bei einem Benutzer auftreten können, und Lösungen.

Tabelle 3: Häufige Probleme und Strategien zur Fehlerbehebung auf der Grundlage praktischer Erfahrungen. Die Tabelle hilft bei Problemen, die bei der Probenvorbereitung, der Datenerfassung und der Datenanalyse auftreten. Für gerätespezifische Fehlerbehebung konsultieren Sie bitte das MALDI-ToF MS-Herstellerhandbuch oder einen qualifizierten Techniker. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Die Kalibrierung ist ein kritischer Schritt, um die Genauigkeit von Massenmessungen sicherzustellen. Es können sowohl externe als auch interne Kalibrierungen verwendet werden, aber es ist wichtig, dass die verwendeten Kalibranten im Massenbereich des Polymeranalyten liegen. Die richtige Kalibrierung stellt sicher, dass die Masse des Analyten korrekt bestimmt wird.

Die Datenanalyse wird durchgeführt, wenn das MALDI-ToF MS-Massenspektrum geöffnet wird, und für die weitere Analyse kann Peak-Picking ausgewählt werden. Die Masse von monodispersen Makromolekülen sowie von niedrig-, mittel- und hochdispersen Polymeren eines spezifizierten n-mers kann durch den Vergleich der beobachteten Masse mit theoretischen Werten bestätigt werden, die mit chemischer Zeichensoftware berechnet wurden. Diese Vergleiche helfen bei der Verifizierung der Gesamtmasse eines monodispersen Makromoleküls oder, im Falle von niedrig-, mittel- und hochdispersen Polymeren eines bestimmten n-mers, werden die Endgruppen identifiziert und die wiederholte Masseneinheit bestätigt.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Optimierung der Matrix, der Kationisierungsbedingungen und der experimentellen Verhältnisse entscheidend ist, um hochauflösende MALDI-ToF-MS-Daten zu erhalten. Die Kalibrierung gewährleistet genaue Massenmessungen. Die Datenanalyse mittels Peak-Picking und theoretischem Massenvergleich ermöglicht eine gründliche Charakterisierung des Polymers, einschließlich der Identifizierung von Endgruppen und der Wiederholungseinheitsmasse. Diese Technik kann für monodisperse Makromoleküle sowie für niedrig disperse, mäßig disperse und hochdisperse synthetische Polymere verwendet werden. Zu den zukünftigen Richtungen gehört die Erweiterung der Charakterisierung komplexer Polymerarchitekturen wie Polymer-Dünnschichtmischungen, zyklische Polymere und hyperverzweigte Polymere durch lösungsmittelfreie Probenvorbereitungsmethoden und Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS)36,37,38. Gerätekombinationen, wie z. B. die Verwendung der Größenausschlusschromatographie (SEC) zur Fraktionierung einer Probe, gefolgt von MALDI-ToF MS für die Strukturanalyse, können zur Identifizierung von Strukturen mit geringer Masse, zur Bestimmung der fraktionierten Dispersität und zur Charakterisierung von Endgruppen in hochdispersen Polymerproben verwendet werden 39,40,41. Darüber hinaus ermöglichen neue Datenanalyseansätze, einschließlich manueller Eingabe oder softwaregestützter Generierung von Kendrick-Massendefektdiagrammen, die Umwandlung von Massenspektren in zweidimensionale Karten, was die Identifizierung mehrerer Endgruppen innerhalb einer Stichprobe erleichtert ^2,42.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidhydrochlorid	TCI-Chemikalien	Nr. D1601	https://www.tcichemicals.com/US/en/p/D1601
1,1,1-Tris(hydroxymethyl)propan	Millipore Sigma	148083	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/148083?srsltid=AfmBOoqaMzcy1xravp1h2QE 0myfY5gjuEBfOIv2o882Wb _xcB4Ol4CMW
1,5,7-Triazabicyclo[4.4.0]dec-5-en	Millipore Sigma	345571	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/345571?srsltid=AfmBOooLQXIhWaMnO63nE xu-Y5MJoJID6RJiby0NXyu DHOxXYjle_kMT
1,6-Hexanedithiol 98% (HDT)	TCI	Nr. H0334	https://www.tcichemicals.com/US/en/p/H0334
2-(4-hydroxyphenylazo)benzoesäure) (HABA)	Millipore Sigma	Nr. H5126	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/h5126
2,2-Bis(hydroxymethyl)propionsäure	Millipore Sigma	106615	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/106615?srsltid=AfmBOopCRoa1N_UiDK 56NKhDKdlAN8feUrMxVYhul Muz2en6NYEGIh4b
2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenon 99% (DMPA)	Sigma-Aldrich	196118	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/196118?srsltid=AfmBOoqVTif6KNwIr6A -bIgnXbkrvWKIUNH6qOsc RseQLNVKi0DMWPb-
2,5-Dihydroxybenzoesäure (DHB)	Millipore Sigma	149357	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/149357
4-(Dimethylamino)pyridin	Millipore Sigma	522821	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/search/522821?focus=products&page=1&perpage= 30& sortieren=Relevanz& Begriff=522821 & Typ=Produkt
6-Bromhexansäure	Millipore Sigma	150452	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/search/6-bromohexanoic-acid?focus=products&page=1 & pro Seite=30& sortieren=Relevanz& term= 6-Bromhexansäure%20säure& Typ=Produkt
Benzaldehyddimethylacetal	Millipore Sigma	226076	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/226076?srsltid= AfmBOorbjP7zD9MO3g5Xk LL3rNZ02PhfkXoRfe3EjRK7 TrqJ-kEOrTCN
Benzoesäure	Millipore Sigma	242381	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sial/242381?srsltid=AfmBOook_iIcMnwuB3e _j-KetQyyHJ6Qq86jSK8 ZVxC3BorQgkO8Xg5I
Bruker UltraFlextreme	Bruker Daltonics		https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/mass-spectrometry/maldi-tof/ultraflextreme.html
Chloroform	Fisher Scientific	AA32614K7	https://www.fishersci.com/shop/products/chloroform-acs-99-8-thermo-scientific/AA32614K7 ?searchHijack=wahr& searchTerm= chloroform-acs-99-8-thermo-scientific & searchType=Schnell& passendCatNo =AA32614M6
Dithranol, BP, 98,5-101% (DT)	Fisher Scientific	18-602-270	https://www.fishersci.com/shop/products/dithranol-bp-98-5-101-spectrum-chemical/18602270
Ethylen-Brassylat	Millipore Sigma	W354309	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/w354309?utm_source=google&utm_medium= CPC& utm_campaign=8692675663& utm _content=86098110623& gad_source= 1& gclid=CjwKCAiApY-7BhBjEiwAQMr rEdJTcKN5TEFkP1uHvRlVign3lwg2cj5 _spBUCrfi6exZ3Ur5sJkARxoCfWsQ AvD_BwE
Galvinoxyl, freies Radikal	Millipore Sigma	G307	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/g307?srsltid= AfmBOopoWGDMXtLk5Erf0rVyl 7j442uyg8rIWkfBjhHZ2z0dDktH3y8-
Methanol	Fisher Scientific	Nr. A456	https://www.fishersci.com/shop/products/methanol-optima-lc-ms-grade-thermo-scientific/A4564
Palladium, 10% auf Kohlenstoff, Typ 487, trocken	Fisher Scientific	AAA1201206	https://www.fishersci.com/shop/products/palladium-10-carbon-type-487-dry-thermo-scientific-1/AAA1201206#?keyword=palladium%20on%20carbon
Poly(ethylen  Glykol)monomethylether 350  Mn  (MeO-PEG-OH 360)	Fisher Scientific	AA4156022	https://www.fishersci.com/shop/products/polyethylene-glycol-monomethylether-350-thermo-scientific/AA4156022
Kaliumtrifluoracetat (KTFA)	Millipore Sigma	281883	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/281883
Propargylalkohol	Fisher Scientific	Nr. A10295.0F	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A10295.0F?SID=srch-hj-A10295.0F
Propargylbromid 97 % (80 Gew.-% in Toluol, stabilisiert mit MgO)	Fisher Scientific	AAL1059514	https://www.fishersci.com/shop/products/propargyl-bromide-97-80-w-w-toluene-stab-magnesium-oxide-thermo-scientific/AAL1059514#?keyword=Propargyl%20bromide%2097%%20(80%%20w/w%20in%20Toluol%20stabilisiert%20mit%20MgO)
Natriumazid	Millipore Sigma	Nr. 2002	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sial/s2002
Natriumhydrid 60%ige Dispersion in Mineralöl	Millipore Sigma	452912	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/452912?srsltid= AfmBOooZhbCm_qtgKU99922Y91zI qEOWONlEGxjZn0mdSJF2L5hW1uVn
Natriumtrifluoracetat (NaTFA)	Oakwood	MFCD00013217	https://www.oakwoodchemical.com/ProductsList.aspx?CategoryID=-2&txt Suche=1549& ExtHyperLink=1
SpheriCal Neat Low Range Kit (250 - 7.500 da)	Polymer-Fabrik	PFS-104	https://www.polymerfactory.com/product-page/spherical-low-range-kit-500-7-500-da
Tetrahydrofuran (THF)	Fisher Scientific	Nr. T427	https://www.fishersci.com/shop/products/tetrahydrofuran-optima-fisher-chemical-3/T4274#?keyword=tetrahydrofuran%20optima
trans-2-[3-(4-tert-Butylphenyl)-2-methyl-2-propenyliden]malononitril (DCTB)	TCI	Nr. B3635	https://www.tcichemicals.com/US/en/p/B3635
α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure (CHCA)	TCI	Um 1768	https://www.tcichemicals.com/US/en/p/C1768