Methodenartikel

Entwicklung eines innovativen LED-basierten Beleuchtungsgeräts für die in vitro Anwendung der photodynamischen Therapie mit Rose Bengal

DOI:

10.3791/68462

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12. September 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Inserm, CHU Lille, U1189-ONCO-THAI-Assisted Laser Therapy and Immunotherapy for Oncology, University of Lille, 2CNRS, Inserm, CHU Lille, UMR9020-U1277-CANTHER-Cancer Heterogeneity Plasticity and Resistance to Therapies, University of Lille

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Manuskript stellt ein neuartiges, innovatives 3D-gedrucktes Beleuchtungsgerät zur Untersuchung der durch Rose Bengal vermittelten photodynamischen Therapie in vitro vor.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In diesem Artikel wird ein neues Gerät zur photodynamischen Therapie (PDT) zur Bewertung der Wirksamkeit der Rose Bengal (RB)-vermittelten PDT in vitro beschrieben. Das Gerät mit der Bezeichnung CELL-LED-550/3 besteht aus zwei 3D-gedruckten Teilen, von denen eines ein grünes Licht von 550 nm von einer einzigen LED (dem Lichtquellenteil) erzeugt und das andere dieses Licht an eine 96-Well-Zellkulturplatte (den Lichtverteilerteil) verteilt. Der Lichtquellenteil wird von einem Treiber mit drei verschiedenen Modi gesteuert, so dass der Lichtverteilerteil drei verschiedene Bestrahlungsstärken an die untere Außenfläche der Vertiefungen abgeben kann: 0,02 mW/cm2, 0,23 mW/cm2 oder 0,62 mW/cm2. Das Teil des Lichtverteilers wurde so konzipiert, dass die Vertiefungen einzeln und gleichzeitig beleuchtet werden. Um die Relevanz des CELL-LED-550/3-Geräts zu demonstrieren, wurde seine Fähigkeit zur Induktion des Zelltods durch RB-vermittelte PDT auf hepatozellulären HepG2-Karzinomzellen untersucht. Zuerst wurden HepG2-Zellen 2 Stunden lang mit steigenden Konzentrationen von Rose Bengal behandelt, einem Photosensibilisator mit einem Absorptionspeak (dem höchsten) bei etwa 550 nm. Die behandelten Zellen wurden dann mit dem Gerät CELL-LED-550/3 beleuchtet, das bei Lichtdosen von 0,3 J/cm2, 0,6 J/cm2 und 1,2 J/cm2 (jeweils mit Beleuchtungszeiten von 8 min und 4 s, 16 min und 8 s bzw. 32 min und 16 s) auf seine maximale Bestrahlungsstärke eingestellt war. Schließlich wurde die Viabilität mit Hilfe von Cell-Titer Glo 24 h nach der PDT gemessen. Die experimentellen Ergebnisse zeigen, dass die RB-vermittelte PDT mit dem CELL-LED-550/3-Gerät in der Lage ist, eine Abnahme der Lebensfähigkeit von HepG2-Zellen zu induzieren, und zwar in einer Weise, die sowohl von der Konzentration von Rose Bengal als auch von der verabreichten Lichtdosis abhängt. Basierend auf dem in diesem Artikel vorgestellten Proof of Concept erweitert das CELL-LED-550/3 die Untersuchung der RB-vermittelten PDT um ein weiteres Werkzeug.

Einleitung

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Mit mehr als 905.000 neuen Fällen und 830.000 Todesfällen im Jahr 2020 ist der primäre Leberkrebs die siebthäufigste Krebserkrankung und die zweithäufigste krebsbedingte Todesursache weltweit1. Unter den primären Leberkarzinomen ist das hepatozelluläre Karzinom (HCC) mit etwa 90 %der Fälle die häufigste Form 2. Aufgrund der unentdeckten chronischen Lebererkrankung und der schlechten Einhaltung der Überwachungsbedingungen werden nur 25 % der Patienten mit HCC im Frühstadium der Erkrankung diagnostiziert3. Diese früh diagnostizierten Patienten werden in der Regel durch Leberresektion, Lebertransplantation oder lokale ablative Therapien mit kurativer Absicht behandelt und zeigen eine gute Prognose mit einer Fünf-Jahres-Überlebensrate von über 70 %4,5. Für die anderen 75 % der Patienten (Patienten mit intermediär oder spät diagnostiziertem HCC) bringen innovative Behandlungsmodalitäten wie zielgerichtete Therapien, Immuntherapien und Kombinationstherapienzwar einen Überlebensvorteil 6, die Prognose bleibt jedoch sehr schlecht: Die Fünf-Jahres-Überlebensrate liegt bei dieser Patientengruppe nicht über 30 % und sinkt bei der Untergruppe der metastasierten Patienten auf 2 %6. Die Erforschung alternativer Behandlungsoptionen ist daher von entscheidender Bedeutung, um die Behandlungsergebnisse zu verbessern und das Überleben von Patienten mit HCC im mittleren oder fortgeschrittenen Stadium zu verlängern. Die Photodynamische Therapie (PDT), eine in der Dermatologie weit verbreitete Krebstherapie7, könnte ein geeigneter Alternativkandidat sein.

Die PDT ist eine photochemische Behandlung, die die Verwendung eines photosensibilisierenden Mittels (PS), einer geeigneten Wellenlänge des sichtbaren Lichts und molekularen Sauerstoff kombiniert, um zytotoxische reaktive Sauerstoffspezies (ROS) zu erzeugen8. Die krebshemmende Wirkung der PDT leitet sich von drei ROS-induzierten Mechanismen ab9: zunächst direkte zytotoxische Wirkungen auf bösartige Zellen10, dann Schädigung des Tumorgefäßsystems, die Hypoxie des Tumorgewebes induziert, Nährstoffentzug und Regression11 und schließlich Induktion einer Entzündungsreaktion durch die Freisetzung von Gefahrensignalen und Tumorantigenen aus geschädigten oder absterbenden Tumorzellen12. Seit mehr als drei Jahrzehnten ist die PDT Gegenstand intensiver Untersuchungen, um ihr Potenzial zur Behandlung verschiedener Krebsarten und -formen zu bewerten 13,14,15,16,17,18. Aufgrund ihrer durch diese Untersuchungen nachgewiesenen Wirksamkeit 19,20,21 wird die PDT heute in der Dermatologie zur Behandlung von nicht-melanozytärem Hautkrebs eingesetzt 7. Bei den anderen Indikationen hat die Zahl der klinischen Studien in den letzten Jahren zugenommen, was die erheblichen Bemühungen zeigt, die PDT allein oder in Kombination mit Standardbehandlungen in die klinische Praxis zu bringen 22,23,24.

Es gibt eine Vielzahl von Photosensibilisatoren, die für PDT25 verwendet werden. Unter ihnen hat sich gezeigt, dass Rose Bengal (RB) als wirksames photodynamisches Mittel gegen Kehlkopftumorzellen26, Melanomzellen27, Brustkrebszellen28 und Prostatakrebsgewebe29 wirkt. Die in diesem Artikel vorgestellte Arbeit basiert auf der Notwendigkeit, zu evaluieren, ob die RB-vermittelte PDT auch für HCC-Zellen effizient ist.

Eine solche Bewertung erforderte in der Tat die vorherige Entwicklung eines auf grünen LEDs basierenden Geräts für die 550-nm-Beleuchtung von 96-Well-Zellkulturplatten. Für diese Vorrichtung30 wurde ein Design in zwei Teilen umgesetzt: Ein Lichtquellenteil erzeugt ein grünes Licht von 550 nm aus einer einzigen LED, während ein Lichtverteilerteil dieses Licht durch die Verwendung eines optischen Faserbündels auf die 96 Vertiefungen einzeln und von der LED weg verteilt. Dieses zweiteilige Design schützt die Zellen erstens vor schädlichen thermischen Effekten, die durch die unkontrollierte Wärmeentwicklung innerhalb der LED entstehen können, und ermöglicht es zweitens, die Zellen in einem Zellkultur-Inkubator zu beleuchten, während der Lichtquellenteil mit seinen elektronischen Komponenten (einschließlich der LED) draußen bleibt. Diese innovativen Eigenschaften verschaffen dem sogenannten CELL-LED-550/3 Baustein große Vorteile gegenüber den bereits veröffentlichten LED-basierten Systemen, die speziell für die Multiwell-Plattenbeleuchtung konzipiert wurden 31,32,33,34,35.

In diesem Artikel wird zunächst das Gerät CELL-LED-550/3 ausführlich beschrieben. Als Proof of Concept demonstriert dann eine Zellviabilitätsstudie die Wirksamkeit der RB-vermittelten PDT unter Verwendung von CELL-LED-550/3 in einem 2D-HCC-Zellkulturmodell (HepG2)30. Abgesehen davon, dass es kostengünstig und tragbar ist, ist das CELL-LED-550/3-Gerät daher auch ein besonders relevantes Werkzeug für RB-vermittelte PDT-Experimente.

Protokoll

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Die Einzelheiten zu den Reagenzien und der Ausrüstung, die in dieser Studie verwendet wurden, sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Aufbau der Vorrichtung

HINWEIS: Die beiden Teile des Gerätes CELL-LED-550/3 werden separat gefertigt und erst im letzten Schritt miteinander verbunden.

  1. Aufbau des Lichtquellenteils
    1. Befestigen Sie eine richtig dimensionierte Lüfterkühlkörperbaugruppe an der Rückseite der Leiterplatte (PCB), auf der die 550 nm 3-W-LED montiert ist.
    2. Decken Sie die LED mit einer klaren PMMA-Kollimationslinse (Polymethylmethacrylat) ab, um erstens den Lichtstrahl zu homogenisieren und zweitens den Abstrahlwinkel von 120° auf 10° zu reduzieren. Eine solche Reduzierung ermöglicht es, die Lichtmenge, die an den Lichtverteilerteil abgegeben wird, zu erhöhen.
    3. Verbinden Sie die LED mit dem aktuellen Treiber mit Tri-Mode-Dimmung, wodurch unterschiedliche Bestrahlungsstärken abgegeben werden können.
    4. Bauen Sie das Gehäuse, die Gehäusefront und den Gehäuseverschluss separat im 3D-Druck auf (rote Kästchen in Abbildung 1).
    5. Installieren Sie den Treiber und die LED, die sowohl mit der Objektiv- als auch mit der Lüfterkühlkörperbaugruppe ausgestattet sind, an den dafür vorgesehenen Stellen im Gehäuse (blaue Felder in Abbildung 1).
    6. Installieren Sie die Netzbuchse und den Wippschalter an den dafür vorgesehenen Stellen in der Gehäuseschließung (blaue Kästchen in Abbildung 1).
    7. Verbinden Sie den Treiber und die Kühlkörperbaugruppe des Lüfters über den Wippschalter mit der Netzbuchse.
    8. Montieren Sie das Gehäuse, den Gehäuseverschluss und die Gehäusefront.
    9. Prüfen Sie, ob die LED zur Achse der zylindrischen Öffnung der Gehäusefront ausgerichtet ist.
      HINWEIS: Die zylindrische Öffnung der Gehäusefront ist für die optische Verbindung des Lichtquellenteils (Buchse) mit dem Lichtverteilerteil (Stecker) vorgesehen.

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Abbildung 1: Dreidimensionale Vorder- (A), Rückansicht (B) und Explosionszeichnung (C) des Lichtquellenteils. Adaptiert von Lefebvre, A. et al.30. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. 

  1. Aufbau des Lichtverteilerteils
    1. Bauen Sie den Gehäuseunterverschluss, das Gehäuse und den oberen Verschluss separat im 3D-Druck auf (zusammen bilden sie eine Hohlbox) (rote Kästen in Abbildung 2).
    2. Bauen Sie den 96-Well-Abstandhalter im weißen 3D-Druck (roter Kasten in Abbildung 2) so auf, dass er genau auf den in 1.2.1 erwähnten Hohlkasten passt. Die weiße Farbe zielt darauf ab, die Lichtreflexion zu maximieren und somit die Lichtverteilung zu optimieren.
      HINWEIS: Der Durchmesser und der Achsabstand der kreisförmigen Öffnungen im 96-Well-Spacer sollten dem Durchmesser und dem Mittenabstand der Wells der 96-Well-Platte entsprechen, die für biologische Assays verwendet wird.
    3. Bohren Sie 96 kleine Löcher in den oberen Verschluss der Hohlbox, so dass sie mit der Mitte der 96 kreisförmigen Öffnungen im 96-Well-Abstandhalter ausgerichtet sind, wenn dieser auf den oberen Verschluss aufgesetzt wird.
    4. Führen Sie eine optische Kunststofffaser mit einem Durchmesser von 0,5 mm von unten nach oben in jedes der 96 kleinen Löcher des oberen Verschlusses ein.
    5. Tragen Sie Polyesterharz auf die Unterseite des oberen Verschlusses auf, um die 96 optischen Fasern mit dem oberen Verschluss zu verbinden.
    6. Nachdem das Harz getrocknet ist, polieren Sie die distalen Enden der optischen Fasern, bis sie sich an der Oberseite des oberen Verschlusses anpassen.
    7. Sammeln Sie die optischen Fasern in der in Schritt 1.2.1 erwähnten Hohlbox zu einem einzigen Bündel, das durch einen Mantel geschützt ist und sich etwa zwei Meter aus der Box erstreckt.
      HINWEIS: Die Höhe der Box sollte ausreichend sein, um ein Verbiegen der optischen Fasern und eine optische Dämpfung zu verhindern, die verursacht werden kann.
    8. Montieren Sie die Hohlbox so, dass das Faserbündel durch die dafür vorgesehene Öffnung des Gehäuses gelangt.
    9. Setzen Sie die proximalen Enden der optischen Fasern zusammen in einen 3D-gedruckten Stecker, der die Verbindung zum Lichtquellenteil (Buchse) ermöglicht.
      HINWEIS: Für diesen Steckverbinder sollte kein Klebstoff erforderlich sein, um eine Lichtdämpfung zu verhindern, die dieser Kleber verursachen kann.
    10. Setzen Sie den 96-Well-Spacer auf die Hohlbox.
    11. Erstellen Sie ein Sieb, indem Sie ein Transparentpapier zwischen eine transparente PMMA-Platte (untere Fläche) und eine kratzfeste Mylar-Folie (obere Fläche) einführen, um den schmalen Strahl, der an jedem distalen Ende der optischen Faser abgegeben wird, in einen Strahl zu diffundieren, der so groß ist wie der Well-Durchmesser der 96-Well-Platte, die für biologische Assays verwendet wird.
    12. Bauen Sie den Siebrahmen im 3D-Druck (roter Kasten in Abbildung 2) so auf, dass seine mittlere Öffnung genau der Größe der 96-Well-Platte entspricht, die für biologische Assays verwendet wird, und die Wells dadurch perfekt mit den kreisförmigen Öffnungen des 96-Well-Abstandhalters übereinstimmen.
    13. Befestigen Sie das Sieb mit dem Siebrahmen an der Oberseite des 96-Well-Abstandshalters.

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Abbildung 2: Dreidimensionale Ansichten des Lichtverteilerteils. Adaptiert von Lefebvre, A. et al.30. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. 

  1. Montage des Lichtquellenteils mit dem Lichtverteilerteil
    1. Stecken Sie den Stecker des Lichtverteilerteils in die Buchse des Lichtquellenteils.
      HINWEIS: Sobald der Stecker in die Buchse eingesteckt ist, sollte der vom Lichtquellenteil abgegebene Lichtstrahl etwas mehr als die Oberfläche des Lichtempfangselements des Lichtverteilerteils abdecken, wodurch die Lichtversorgung der 96 optischen Fasern sichergestellt wird.

2. Biologische Assays

  1. Prozess der Zellkultur
    1. Kultivieren Sie die Hepatokarzinom-Zelllinie HepG2 in RPMI 1640 Medium, ergänzt mit 10 % hitzeinaktiviertem Rinderserum und 1 % Streptomycin und Penicillin.
    2. Die Kulturflaschen mit HepG2-Zellen werden in einem 5 % CO2 -Zellkulturinkubator bei 37 °C aufbewahrt.
    3. Das Kulturmedium wird alle 3 Tage gewechselt, indem das Kulturmedium aus den Kolben abgesaugt und durch das zuvor auf 37 °C erhitzte Kulturmedium RPMI 1640 ersetzt wird.
    4. Verwenden Sie ein Mikroskop, um die Konfluenz der Zellen in den Kulturflaschen zu überprüfen, bis sie eine Konfluenz von 80 % bis 90 % erreichen.
  2. Aussaatverfahren
    1. Nehmen Sie die Zellen aus dem Inkubator und legen Sie sie unter die vorgereinigte mikrobiologische Sicherheitsstation.
    2. Entfernen Sie das Nährmedium aus den Kulturflaschen.
    3. Die Kulturkolben werden mit Phosphatpufferlösung gewaschen.
    4. Geben Sie 3 ml Trypsin (0,25 %, 0,53 mM) auf die Zellen und legen Sie die Kulturflaschen für 5 Minuten bei 37 °C in den Inkubator, um die Zellen zu lösen.
    5. Nach 5 Minuten wird das Trypsin mit 7 ml Kulturmedium aus den Kulturflaschen gewonnen und die gesamte Lösung aus Medium + Trypsin + Zellen in einem 15-ml-Röhrchen zurückgewonnen.
    6. Zählen Sie die Zellen mit einem Zellzähler. Nehmen Sie dazu 20 μl der Lösung, die die Zellen enthält, und geben Sie sie in ein Röhrchen. Fügen Sie 20 μl Trypanblau-Lösung hinzu und geben Sie die Zelle + Trypanblau-Lösung auf den Zählobjektträger und setzen Sie sie in den Zellzähler ein.
    7. Nachdem die Zellen gezählt wurden, verdünnen Sie sie in Kulturmedium, um eine Lösung von 150.000 Zellen/ml zu erhalten, und säen Sie die Zellen in einer weißen 96-Well-Platte mit klarem, flachem Boden mit einer Geschwindigkeit von 1,5 x 104 Zellen/Well. Die weiße Farbe zielt darauf ab, die Lichtreflexion und -verteilung in den Vertiefungen zu maximieren.
      HINWEIS: Die Anzahl der Zellen pro Well muss entsprechend der verwendeten Zelllinie angepasst werden. Möglicherweise ist ein vorheriger Dichtetest erforderlich, um die richtige Anzahl von Zellen für die Aussaat zu finden.
    8. Bereiten Sie zwei Platten für jede Viabilitätsablesezeit vor. Eine Platte wird beleuchtet und eine bleibt dunkel.
    9. Inkubieren Sie die Platten vor der Behandlung 24 Stunden lang, um die Zelladhäsion zu ermöglichen.
  3. Rose Bengal Behandlung
    1. Bereiten Sie eine Stammlösung von Rose Bengal vor, indem Sie Rose Bengal Pulver in 10% iger Kochsalzlösung rekonstituieren. Diese Lösung muss kurz vor der Zellbehandlung hergestellt werden, um eine Verschlechterung der Rose Bengal aufgrund ihrer Stabilität zu vermeiden.
    2. Bereiten Sie Rose Bengal Lösungen in steigenden Konzentrationen (0 μM, 5 μM, 10 μM, 25 μM, 50 μM, 75 μM, 100 μM) vor, indem Sie die zuvor hergestellte Rose Bengal Stammlösung im Zellkulturmedium verdünnen.
    3. Sobald die Lösungen hergestellt sind, entfernen Sie das Kulturmedium von den Platten, die die Zellen enthalten, und fügen Sie 100 μl Rose Bengal Behandlungslösungen hinzu.
    4. Inkubieren Sie die Zellen 2 Stunden lang mit Rose Bengal, um die Internalisierung von Rose Bengal zu ermöglichen.
      HINWEIS: Die Inkubationszeit für die Rose Bengal Lösung kann je nach verwendeter Zelllinie unterschiedlich sein. Die Kinetik des Einbaus von Rose Bengal muss möglicherweise durch Fluoreszenzmessung fein abgestimmt werden, um die richtige Inkubationszeit für jede untersuchte Zelllinie zu finden.
    5. Entfernen Sie nach 2 Stunden die Rose Bengal-Lösungen, waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS und fügen Sie 100 μl/Vertiefung Rose Bengal-freies Kulturmedium hinzu.
      HINWEIS: Bei höheren Konzentrationen von Rose Bengal können zusätzliche Waschungen mit PBS erforderlich sein. Es kann eine Sichtkontrolle durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass die Zellen korrekt gewaschen wurden. Nach ausreichender Spülung sollte das PBS aufgrund des außerhalb der Zellen vorhandenen Rosenbengalen keine rosa Farbe annehmen.
    6. Decken Sie die Mikroplatten mit Alufolie ab, um sie vor Lichteinwirkung zu schützen. Beleuchten Sie die Hälfte der Platten für den PDT-Assay (siehe Schritt 2.4). Die unbeleuchteten Platten liefern Kontrolldaten für die PDT-Ergebnisse (Dunkelzustand). Sie werden auch Daten über den Einfluss von nicht photoaktivierter Rose Bengal auf die Lebensfähigkeit der Zellen liefern. Die anderen Mikroplatten werden für die Belichtung mit Licht im Gerät verwendet (PDT-Zustand).
  4. Bedienungsverfahren für das Gerät CELL-LED-550/3
    1. Verbinden Sie den Stecker am Lichtverteiler mit der Buchse der Lichtquelle. Stecken Sie dann die Lichtquelle in eine Steckdose.
    2. Entfernen Sie zwei Mikrotiterplatten (PDT + Dunkel) aus dem Inkubator, entfernen Sie das Aluminium für den PDT-Zustand und setzen Sie diese Platte auf den Lichtverteiler.
    3. Stellen Sie den Dimmer des Treibers auf den maximalen Pegel ein, um die von der LED gelieferte Leistung zu maximieren und eine durchschnittliche Bestrahlungsstärke von 0,62 mW/cm2 über die 96 Vertiefungen zu erhalten.
      HINWEIS: Der Dimmer des Treibers sollte auf den für die biologischen Assays am besten geeigneten Wert eingestellt werden (unter den drei verfügbaren). Unabhängig davon, wie der Dimmer des Treibers eingestellt ist, erfordert die geringe Bestrahlungsstärke keine Schutzbrille.
    4. Beleuchten Sie die Platte, bis die gewünschte Lichtdosis auf die Zellen erreicht ist. Um die gewünschte Lichtdosis zu erhalten, können zwei Parameter eingestellt werden, Zeit und Bestrahlungsstärke, die sich auf die folgende Gleichung beziehen:
      Lichtdosis (J /cm 2 ) = Bestrahlungsstärke (W /cm 2) × Zeit (s) (Gleichung 1).
      Die Bestrahlungsstärke kann durch Einstellen des Treiberdimmers auf 0,02 mW/cm2, 0,23 mW/cm2 bzw. 0,62 mW/cm2 moduliert werden. Aus der gewählten Bestrahlungsstärke kann Gleichung 1 verwendet werden, um die Beleuchtungszeit zu berechnen, die erforderlich ist, um die gewünschte Lichtdosis zu erreichen.
    5. Sobald die gewünschte Lichtdosis erreicht ist, schalten Sie das Gerät aus. Setzen Sie die PDT-Mikroplatte aus Aluminium wieder aus und stellen Sie sie mit der Kontrollplatte wieder in den Inkubator, bis der Viabilitätstest durchgeführt wird.
    6. OPTIONAL: Beleuchten Sie bei Bedarf die anderen Platten mit dem gleichen Verfahren wie oben beschrieben.
  5. Assay zur Zellviabilität
    1. Lassen Sie die beleuchtete Platte nach dem PDT-Assay 24 Stunden lang im Inkubator, bevor Sie die Auswirkungen der PDT auf die beleuchteten Zellen messen, indem Sie deren Lebensfähigkeit messen. Die Inkubationszeit kann variiert werden, um die mehr oder weniger langfristigen Auswirkungen der PDT auf die Zellen zu untersuchen. Für jede Inkubationszeit nach der PDT sollte eine unbeleuchtete Platte (dunkler Zustand) für den gleichen Zeitraum inkubiert werden.
    2. Nach der Inkubationszeit nehmen Sie eine beleuchtete und eine unbeleuchtete Platte und fügen Sie 100 μl Reagenz aus dem Zellviabilitäts-Assay-Kit in jede Vertiefung hinzu, um die Zellviabilität basierend auf dem mitochondrialen Stoffwechsel und der ATP-Produktion durch die Zellen zu messen.
    3. Inkubieren Sie die Multiplatte 10 Minuten lang im Dunkeln, bevor Sie die Zellviabilität messen.
    4. Nach einer 10-minütigen Inkubation wird die in jeder Vertiefung emittierte Lumineszenz mit einem multimodalen Lesegerät abgelesen. Die emittierte Lumineszenz ist proportional zur Produktion von ATP durch die lebenden Zellen zum Zeitpunkt der Zugabe der Zellviabilitäts-Assay-Lösung.
    5. Betrachten Sie den Lumineszenzwert des unbehandelten (NT) Zustands als 100 % Lebensfähigkeit und normalisieren Sie die Lumineszenzwerte der behandelten Bedingungen auf den NT-Zustand, um den Prozentsatz der Lebensfähigkeit zu erhalten, der durch jede Behandlung induziert wird.
    6. Wiederholen Sie das gleiche Zellviabilitäts-Messprotokoll für jede Lesezeit nach der PDT-Behandlung (z. B. 24 h, 48 h und 72 h nach der Behandlung).

Ergebnisse

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Wie in Abbildung 3 gezeigt, ermöglicht der Baustein CELL-LED-550/3 die homogene Beleuchtung einer 96-Well-Platte von unten mit 550 nm grünem Licht.

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Abbildung 3: Bilder des Bausteins CELL-LED-550/3 während einer illustrativen Beleuchtung einer 96-Well-Platte, wenn das Raumlicht ein- (A) oder ausgeschaltet (B) ist. Adaptiert von Lefebvre, A. et al.30. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. 

Jede Vertiefung wird einzeln und von der einzelnen LED weg (bis zu zwei Meter) durch die Verwendung eines Bündels optischer Fasern beleuchtet (Abbildung 4).

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Abbildung 4: Das faseroptische Bündel, das die individuelle Beleuchtung der Vertiefungen einer 96-Well-Platte weg von der einzelnen LED ermöglicht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. 

Um die Wirksamkeit des CELL-LED-550/3-Geräts zu ermitteln, wurde seine Fähigkeit zur Induktion einer RB-vermittelten PDT auf der HepG2-Hepatokarzinom-Zelllinie untersucht. Die Zellen wurden 2 h vor der Beleuchtung mit steigenden Konzentrationen von Rose Bengal im Bereich von 0-100 μM behandelt. Die Verwendung eines solchen Konzentrationsbereichs zielt darauf ab, die wirksame Dosis (EC50) von Rose Bengal zu bestimmen, die HepG2-Zellen abtöten würde, wenn sie grünem Licht ausgesetzt wird. Der Einfluss der Lichtdosis, die von der CELL-LED-550/3-Komponente abgegeben wird, auf die Induktion des Zelltods in HepG2-Zellen wurde ebenfalls untersucht. Zu diesem Zweck wurden die Zellen für 8 min 9 s, 16 min 18 s oder 32 min 36 s bei einer Intensität von 0,62 mW/cm2 Licht ausgesetzt, um Lichtdosen von 0,30 J/cm2, 0,60 J/cm2 bzw. 1,22 J/cm2 zu erhalten.

Zunächst wurde beobachtet, dass die Beleuchtung allein in Abwesenheit von Rose Bengal (Lichtbedingungen, Abbildung 5) keinen Einfluss auf die Lebensfähigkeit von HepG2-Zellen hatte, unabhängig von der empfangenen Lichtdosis. Es wurde auch beobachtet, dass Bengal Rose allein in Abwesenheit von Licht (RB-Bedingungen, Abbildung 5) unter keiner der getesteten Bedingungen eine Veränderung der Zellviabilität induzierte. Im Gegensatz dazu zeigen die Ergebnisse, dass die RB-vermittelte PDT mit CELL-LED-550/3 in der Lage ist, HepG2-Zellen abzutöten. Darüber hinaus wurde eine erhöhte Wirksamkeit in Korrelation mit einer erhöhten Lichtdosis beobachtet, mit einer maximalen effektiven Konzentration (EC50) von 34,3 μM für eine leichte Dosis von 0,30 J/cm2, 26,6 μM für eine Dosis von 0,60 J/cm2 und 6,8 μM für eine Dosis von 1,2 J/cm2.

Diese Ergebnisse bestätigten die Wirksamkeit dieses neuen PDT-Geräts für die RB-vermittelte PDT (Abbildung 5).

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Abbildung 5: Wirksamkeit des Geräts in Bezug auf die Lebensfähigkeit der HepG2-Zelllinie. Prozentsatz der Lebensfähigkeit 24 Stunden nach Behandlung mit HepG2. NT, unbehandelt; RB, nur Photosensibilisator (0 μM, 5 μM, 10 μM, 25 μM, 50 μM, 75 μM und 100 μM); Licht, Beleuchtung für 0,30 J/cm2, 0,60 J/cm2 und 1,22 J/cm2; PDT, Beleuchtung mit RB-Behandlung. Die Ergebnisse werden als Mittelwerte ± SEM von drei unabhängigen Experimenten dargestellt, ausgedrückt als Prozentsatz des NT. Es wurde ein bidirektionaler ANOVA-Test mit p ≤ 0,01 (**) durchgeführt. p ≤ 0,0001 (****) wird als statistisch signifikant angesehen, und p ≥ 0,05 wird als nicht signifikant (NS) angesehen. Adaptiert von Lefebvre, A. et al.30. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. 

Diskussion

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Dieser Artikel beschreibt sowohl das Protokoll zur Entwicklung eines innovativen Beleuchtungsgeräts für die RB-vermittelte PDT in vitro als auch das Protokoll zur Implementierung eines Proof of Concept für das so entwickelte CELL-LED-550/3-Gerät30.

Die CELL-LED-550/3 besteht aus zwei Teilen, die jeweils eine bestimmte Funktion haben. Das Ziel des ersten Teils, der als Lichtquellenteil bezeichnet wird, besteht darin, aus einer einzigen LED einen homogenen grünen Lichtstrahl mit einem Durchmesser zu erzeugen, der größer ist als der des optischen Faserbündels des zweiten Teils. Letzteres, das als Lichtverteilerteil bezeichnet wird, zielt darauf ab, durch das optische Faserbündel das von dem Lichtquellenteil zugeführte Licht einzeln und von der LED weg auf die Vertiefungen einer 96-Well-Platte zu verteilen. Bei einem Abstand von bis zu 2,5 m zur LED können die Zellen so lange wie nötig beleuchtet werden, ohne dass das Risiko schädlicher thermischer Effekte besteht, die durch die unkontrollierte Wärmeentwicklung innerhalb der LED entstehen können.

Diese Eigenschaft bietet einen ersten signifikanten Vorteil von CELL-LED-550/3 gegenüber den anderen LED-basierten Systemen, die speziell für die 96-Well-Plattenbeleuchtung 31,32,33,34,35,36 entwickelt wurden. Bei allen anderen Systemen werden die LED(s) nur wenige Zentimeter unter den Zellen (in der Regel unter 5 cm) positioniert, was nicht ausreicht, um das Risiko von LED-bedingten schädlichen thermischen Effekten für die Zellen auszuschließen. Um dieses Risiko zu begrenzen, enthalten die meisten dieser anderen Systeme (einige leider nicht) ein LED-Kühlsystem32, 34, 35, das manchmal sehr (zu) nahe an den Zellen positioniert ist und dann durch die daraus resultierenden thermischen Schwankungen kontraproduktiv beeinflusst werden kann. Der zweiteilige Aufbau des CELL-LED-550/3 Bausteins bietet einen weiteren wesentlichen Vorteil gegenüber den meisten anderen bestehenden LED-basierten Systemen 31,32,33,35,36: Dies ermöglicht die Beleuchtung der Zellen in einem Zellkultur-Inkubator ohne jegliches Risiko für das Gerät. Der Teil des Lichtverteilers, der keine elektronischen Komponenten enthält, kann in der Tat im Inkubator platziert werden, während der Teil der Lichtquelle, der elektronische Komponenten enthält, die empfindlich auf feuchte Umgebungen reagieren, außerhalb aufbewahrt wird, um das Risiko von Korrosion oder Ausfall zu vermeiden. Einige bestehende LED-basierte Systeme, einschließlich elektronischer Komponenten, ermöglichen eine Beleuchtung innerhalb eines Inkubators, aber eine solche Verwendung wird erstens von den Designern/Herstellern nicht empfohlen und zweitens erfordert eine "ausreichende" Trocknung nach Gebrauch33,34. Die Fähigkeit, die Zellen in einem Inkubator zu beleuchten und somit die Zellen während des Protokolls unter den gleichen physiologischen Bedingungen (Temperatur, Luftfeuchtigkeit und CO2 -Konzentration) zu halten, ist entscheidend, um potenzielle Verzerrungen bei der Beurteilung der Zellviabilität nach der PDT zu vermeiden, insbesondere bei Protokollen, die lange Beleuchtungszeiten erfordern. Hervorzuheben ist auch, dass das Gerät CELL-LED-550/3 mit einer einzigen LED alle 96 Wells einzeln und gleichzeitig beleuchtet. Diese originelle und innovative Funktion ist bei keinem der anderen oben genannten LED-basierten Systeme 31,32,33,34,35,36 verfügbar. Die meisten dieser Systeme umfassen 96 LEDs, wobei eine LED unter jeder Vertiefung platziert ist, und liefern daher 96 einzelne Strahlen 31,33,34,36, während die übrigen Systeme von 6 bis 25 LEDs, die einige Zentimeter von der Vertiefungsplatte entfernt positioniert sind, einen globalen Strahl liefern, der alle oder einen Teil der Vertiefungen abdeckt 31,32,35 . Basierend auf der Literatur wurde noch nie zuvor vorgeschlagen, 96 einzelne Strahlen aus einer einzigen LED zu erzeugen, wie es die CELL-LED-550/3 durch die Verwendung eines optischen Faserbündels tut.

Der Teil der Lichtquelle besteht aus einer 550 nm 3 W LED, die nach zwei Hauptkriterien ausgewählt wurde. Zunächst sollte das Emissionsspektrum der LED (und damit ihre zentrale Wellenlänge) das Absorptionsspektrum des RB-Photosensibilisators überlappen. Eine solche Überlappung, die mit der gewählten LED (zentrale Wellenlänge: 554,4 nm; Halbwert: 106,4 nm; beide nach der in Lefebvre et al.30) beschriebenen Methodik (Abbildung 6) geschätzt werden, ist essentiell für die RB-Photoaktivierung und damit für die Induktion einer RB-vermittelten PDT. Zweitens sollte die optische Leistung der LED weniger als 5 W betragen. Diese Leistungsbegrenzung wird durch die zulässige Leistung der Kollimationslinse, die im Lichtquellenteil enthalten ist, und durch die Leistung des optischen Faserbündels, das im Lichtverteilerteil enthalten ist, auferlegt.

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Abbildung 6: Absorptionsspektrum von Rose Bengal in Wasser. Das max-normierte Absorptionsspektrum von Rose Bengal in Wasser wird entsprechend der linken Achse aufgetragen, und die mittlere spektrale Bestrahlungsstärke von CELL-LED-550/3 wird entsprechend der rechten Achse skaliert. Das Profil der mittleren spektralen Bestrahlungsstärke stimmt mit dem der LED überein, das auf der Website des Herstellers verfügbar ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. 

Die optische Kopplung zwischen den beiden Teilen des Gerätes ist ein kritischer Faktor. Diese Kopplung zielt zum einen darauf ab, das Maximum des von der 3 W LED abgegebenen Lichts in einem schmalen Strahl zu sammeln und zum anderen diesen Strahl in das optische Faserbündel zu injizieren. Was das erste Ziel betrifft, so ermöglicht eine asphärische Kollimationslinse mit kurzer Brennweite, die speziell für PCB (Printed Circuit Board)-montierte LEDs entwickelt wurde, die Konzentration des 120-Grad-LED-Strahls in einen 10-Grad-Schmalstrahl mit räumlich gleichmäßiger Verteilung. Der resultierende Strahl projiziert darüber hinaus Bilder des quadratischen LED-Chips, die im Vergleich zu denen, die mit dem ersten Strahl erhalten wurden, eine verbesserte Klarheit und geringere optische Aberrationen aufweisen. Bei der Einspeisung dieses schmalen Strahls in das optische Faserbündel sind vier wichtige Punkte zu beachten. Zunächst werden die proximalen Enden der optischen Fasern aus PMMA (Polymethylmethacrylat) mit einem Durchmesser von 96 mm (Polymethylmethacrylat) (numerische Apertur: 0,2) zu einem hausgemachten Verbinder zusammengefasst, so dass sie an den Seiten eine quadratische lichtaufnahmende Oberfläche von 5 mm bilden (Abbildung 7). Eine quadratische Form, die den quadratischen Projektionen des LED-Chips durch den Strahl entspricht, wurde der üblichen runden Form für den Steckverbinder vorgezogen, um den Lichtverlust zu begrenzen. Zweitens wurde der selbstgemachte Steckverbinder sowohl so konzipiert, dass er keinen Klebstoff benötigt, als auch mit einem kristallklaren Harz 3D-gedruckt, um die Lichtabsorption zu begrenzen und somit eine Überhitzung/Karbonisierung des Materials zu verhindern. Drittens wurden die lichtaufnahmefähige Oberfläche sowie die endgültige Oberfläche des Steckverbinders mit einer Polierscheibe so poliert, dass das maximale Licht durch sie hindurchfällt. Viertens und letztens wurde der Abstand zwischen der Linse und der quadratischen lichtempfänglichen Fläche theoretisch bestimmt und dann auf einer optischen Bank so eingestellt, dass der homogenste zentrale Teil der quadratischen LED-Projektion etwas stärker überlappt als die lichtempfängliche Fläche.

Mit einer solchen Kopplung wird eine Leistung von 1,25 W für den 10-Grad-Engstrahl erreicht, während die Gesamtleistung, die von dem Bündel aus 96 optischen Fasern übertragen wird, 0,12 W beträgt (es wurde ein für LED-Licht geeigneter Fotodiodensensor (OPHIR) verwendet).

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Abbildung 7: Quadratische lichtempfängliche Oberfläche, die durch Zusammenführen der 96 optischen Fasern zu einem hausgemachten Steckverbinder erhalten wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. 

CELL-LED-550/3 liefert eine mittlere Bestrahlungsstärke von 0,62 mW/cm2 (Standardabweichung: 0,09 mW/cm2) (Abbildung 8) an der unteren Außenfläche der Wells. Dieser Mittelwert, der die oben erwähnte Kopplungseffizienz berücksichtigt, wurde nach den in Lefebvre und al.30 ausführlich beschriebenen Methoden geschätzt und erwies sich als über die Zeit stabil (Variationskoeffizient unter 0,6 %). Bei einer so niedrigen Bestrahlungsstärke (niedriger als bei den oben beschriebenen anderen LED-basierten Systemen, die speziell für die 96-Well-Plattenbeleuchtung entwickelt wurden) hat sich gezeigt, dass die Beleuchtung allein keinen Einfluss auf die Lebensfähigkeit der HepG2-Zellen hat, während für die RB-vermittelte PDT ein sehr hoher Wirkungsgrad erreicht wurde. Für PDT-Protokolle, die höhere Bestrahlungsstärken erfordern, um den Wirkungsgrad zu gewährleisten, könnten mehrere LEDs verwendet werden, und daher könnten mehrere Lichtquellenteile implementiert werden, vorausgesetzt, dass die Lichtleistung, die in jede optische Faser eingespeist wird, die zulässige Leistung von einigen Dutzend Milliwatt nicht überschreitet.

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Abbildung 8: Histogramm, das die Verteilung der Bestrahlungsstärken darstellt, die an die 96 Vertiefungen einer Platte abgegeben werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. 

Wenn man nur die LED im Teil der Lichtquelle durch eine andere geeignete ersetzt, ist es möglich, ein anderes CELL-LED-Gerät zu erhalten. Eine LED gilt als geeignet, wenn sie (aus den oben genannten Gründen) im sichtbaren Bereich (gemäß den Spezifikationen des Glasfaserbündels) eine optische Leistung von weniger als 5 W abgibt. Da es eine beträchtliche Anzahl solcher LEDs gibt, könnte eine Vielzahl von CELL-LED-Bauelementen entwickelt und dadurch viele PDT-Protokolle in vitro evaluiert werden. Bei einem PDT-Protokoll sollte offensichtlich diejenige LED mit der besten Überlappung mit dem Absorptionsspektrum des betrachteten Photosensibilisators unter allen geeigneten LEDs bevorzugt werden. Bei einem LED-Wechsel sollte besonders auf die Lüfter-Kühlkörper-Baugruppe geachtet werden. Tatsächlich sollte diese Baugruppe angemessen dimensioniert sein, um eine Überhitzung und eine anschließende Verschlechterung sowohl der LED als auch des Treibers zu verhindern. Darüber hinaus ist für jeden LED-Wechsel eine neue optische und thermische Charakterisierung erforderlich.

Sowohl die Möglichkeit, die meisten Photosensibilisatoren durch einfachen Austausch einer einzigen LED zu photoaktivieren, als auch die Möglichkeit, die Zellen in einem Inkubator zu beleuchten, stellen einen echten Mehrwert für dieses Gerät im Vergleich zu den bestehenden Geräten dar.

Offenlegungen

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Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Danksagungen

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Die Autoren danken dem Zentralkrankenhaus von Lille, Frankreich, und dem INSERM für die Unterstützung unserer Studie.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
550  NM 3  W LED auf einer Leiterplatte montiert OSRAM GmbHOSTAR KP CSLPM1. F1
75 cm2 KulturzellkolbenSarstedt3911002
Bündel aus 100 Kunststoff-Lichtwellenleitern (0,5 mm Durchmesser)ARCENCIEL LEDfaser05egmGlühende PMMA 0,5 Durchmesser - Lng  200 m        http://arcenciel-led.fr/accueil/193-fibre-optique-end-glow-05mm-prix-au-m.html
Zähler für ZellenThermoFisherAMQAF2000Optional können Sie unter micrcoscope zählen
Inkubator für ZellkulturenPHCI (Dutscher)MCO-170AICUVD-PE
Zelltiter GloPromegaNr. G7571
Klare PMMA-KollimationslinseGlecc Store14mm Objektiv 10°;Aliexpress - DEL Kollimationslinse mit 14 mm Unterstützung
Colorfab Ngen SchwarzFarbfabrik  SKU-020014FDA-Konformität mit Lebensmittelkontakt
Colorfab Ngen WeißFarbfabrik  SKU-020013FDA-Konformität mit Lebensmittelkontakt
Stromtreiber mit Tri-Mode-Dimmung (CDM-Treiber)CDM-TreiberBD392200 mA
Epoxidharz Clé OpaktKristall'DiamantCristal Diamant 150 mL
Lüfter-Kühlkörper-BaugruppeBOYD
HepG2-ZellenATCCNr. HB-8065
Multimodales Lesegerät (CLARIOstar Plus)BMG Labtech430-2927
Phosphat-Puffer-LösungThermoFisher20012-068
PMMA (Polymethylmethacrylat) optische Fasern (numerische Apertur: 0,2)Guangzhou Mayki Beleuchtung Begrenzt
StromanschlussRSpro907-5680
RMPI 1640ThermoFisher21875-091
Wippschalter RSpro419-744
Rose BengaleThermoFisher / MerckNr. A17053.14 / 330000-1G
Kratzfestes Mylar-BlattRSproTel.: 785-0802
ScheideAUPROTECTØ 8,5 mm / Ø Außen 11 mmPP Polypropyl è ne UV-beständiger schwarzer Wellmantel nicht gespalten
SVFEurobioCVF SVF00-01
PauspapierCanson79368730
Transparente PMMA-PlatteRSproTel.: 284-6269
Trypan-BlauThermoFisher15250061
TrypsinThermoFisher25200-072
Ultimaker 2+Ultimaker
weiße 96-Well-Platte mit klarem BodenDutscher655098

Referenzen

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