Modellierung einer persistierenden Pseudomonas aeruginosa-Infektion bei verwundeten Zebrafischlarven

Zusammenfassung

Derzeit fehlt es an in vivo-Modellen , die sich für ein Wirkstoffscreening gegen chronische bakterielle Infektionen eignen. In dieser Arbeit beschreiben wir ein Protokoll für die Wundinfektion mit einem klinischen Isolat von Pseudomonas aeruginosa , um eine persistierende Infektion bei Zebrafischlarven zu erzeugen.

Zusammenfassung

Pseudomonas aeruginosa ist ein wichtiger Krankheitserreger des Menschen, insbesondere bei chronischen Wundinfektionen und chronischen Lungeninfektionen (insbesondere bei Patienten mit Mukoviszidose (CF)). Chronische bakterielle Infektionen sind refraktär gegenüber Antibiotikabehandlungen, und es besteht ein dringender Bedarf an In-vivo-Modellen für chronische Infektionen, die für ein Wirkstoffscreening geeignet sind, um effiziente Therapien zu entwickeln. In dieser Arbeit beschreiben wir ein Infektionsprotokoll mit einem klinischen Isolat von P. aeruginosa von einem CF-Patienten, das konstitutiv das Green Fluorescent Protein (GFP) exprimiert, zur Erzeugung einer persistierenden Wundinfektion in Zebrafischlarven. Embryonen, die durch die Schwanzflosse verletzt wurden, werden 1,5 Stunden lang in eine Bakteriensuspension getaucht, gewaschen und 3 Tage lang auf Bakterienbelastung überwacht. Die bakterielle Belastung wurde täglich quantifiziert, indem fluoreszierende koloniebildende Einheiten (KBE) von lysierten infizierten Larven gezählt wurden, was eine persistierende Infektion ermöglichte. Darüber hinaus waren persistente P. aeruginosa-Bakterien refraktär gegenüber einer Antibiotikabehandlung. Dieses neuartige in vivo-Modell der persistierenden P. aeruginosa-Infektion bietet die Möglichkeit, die Wirksamkeit innovativer Behandlungen gegen chronische Infektionen zu bewerten.

Einleitung

Pseudomonas aeruginosa ist ein gramnegatives pathogenes Bakterium, das für die chronische Besiedlung von Patienten mit Mukoviszidose (CF) und Wunden verantwortlich ist ^1,2. P. aeruginosa gehört zur Gruppe der ESKAPEE-Erreger und wird von der Weltgesundheitsorganisation als kritische Priorität für neue Therapeutika anerkannt³. Chronische bakterielle Infektionen sind aufgrund der adaptiven Arzneimittelresistenz schwer mit Antibiotika zu behandeln, die mit mehreren Faktoren zusammenhängt, darunter der Lebensstil des Biofilms, das verminderte Wachstum, die geringe Stoffwechselaktivität⁴ sowie der intrazelluläre Lebenszyklus⁵. In-vivo-Modelle sind unerlässlich, um die chronische Infektion von P. aeruginosa besser zu verstehen und zu behandeln.

Während mehrere In-vivo-Modelle zur Beurteilung der Virulenz von P. aeruginosa verwendet wurden, erlaubten es nur sehr wenige Modelle, eine persistierende Besiedlung nachzuahmen und die Wirksamkeit von Behandlungen bei chronischen Infektionen zu testen⁶. Tiermodelle zur Untersuchung der chronischen Pathogenese von P. aeruginosa beruhen hauptsächlich auf der Verabreichung der in Agarkügelchen eingebetteten Bakterien in die Lunge⁷. Es wurde auch ein Modell für chronische kutane Infektionen der Maus entwickelt⁸. Der Zebrafisch (Danio rerio), der zahlreiche Vorteile mit sich bringt (moderate ethische Fragen, niedrige Kosten, hohe Eiproduktion), ist ein attraktives in vivo Wirbeltiermodell für Wirkstofftests, das dank der Embryonentransparenz auch eine hochauflösende Echtzeit-Visualisierung von P. aeruginosa und Wirtszellen ermöglicht⁹.

Wie in einer Übersichtsarbeit berichtet, wurden in früheren Studien hauptsächlich P. aeruginosa-Laborstämme (PAO1, PA14 und PAK) im Zebrafisch-Infektionsmodell verwendet, wo sie eine akute Infektion verursachten⁹. Wir haben kürzlich ein Wundinfektionsprotokoll entwickelt, das auf dem Eintauchen von schwanzflossenamputierten Embryonen mit dem PAO1-Stamm von P. aeruginosa basiert, der eine akute Infektion verursachte¹⁰. Die Infektion durch Eintauchen verletzter Embryonen, die eine natürliche Infektionsweise von P. aeruginosa widerspiegelt, ist eine Infektionsart, die reproduzierbar und einfacher ist als die Mikroinjektion.

Unser Ziel war es, ein Protokoll für persistierende P. aeruginosa-Infektionen im Zebrafisch zu etablieren. Zu diesem Zweck bestand unsere Strategie darin, klinische Stämme von P. aeruginosa, die im Zebrafischmodell^11,12 selten berücksichtigt wurden, in Kombination mit dem Wundinfektionsweg zu verwenden. Hier beschreiben wir das Protokoll, das wir entwickelt haben, um die persistente Besiedlung von Zebrafischembryonen auf der Grundlage einer Wundinfektion durch klinische Isolate von P. aeruginosa CF zu modellieren. Dieses neuartige in vivo-Modell entspricht unseren Erwartungen und bietet neue Möglichkeiten, die Wirksamkeit von Therapeutika im Kontext persistenter Besiedlung zu bewerten, wie hier und in einem begleitenden Artikel¹³ beschrieben.

Protokoll

Alle in der vorliegenden Studie beschriebenen Zebrafischversuche wurden an der Universität Montpellier nach den 3R-Prinzipien (Replacement, Reduction and Refinement) gemäß den Leitlinien der Europäischen Union für den Umgang mit Versuchstieren durchgeführt und von der Direction Sanitaire et Vétérinaire de l'Hérault und dem Comité d'Ethique pour l'utilisation d'animaux à des fins scientifiques unter der Referenz CEEA-LR-B4-172-37 genehmigt. Alle Infektionsexperimente wurden an Embryonen bis zu 5 Tage nach der Befruchtung durchgeführt. Die Zucht von adulten Zebrafischen (Danio rerio) aus den Fischen AB oder Golden Lines erfolgte nach den internationalen Richtlinien der EU-Tierschutzrichtlinie 2010/63/EU. Zebrafischanlage der Universität Montpellier mit Standardbedingungen wie einem 12 h:12 h Light: Dark Cycle, einem 3,5-Liter-Polycarbonat-Tank (maximal 22 Fische pro Tank), der an ein Umlaufsystem mit 4 % Salzgehalt/400 μS Leitfähigkeit und einer Wassertemperatur von 28 °C angeschlossen ist. Die Fische wurden 2x pro Tag mit Fischfutter gefüttert.

1. Herstellung von Lösungen

1. Bereiten Sie eine 1x Arbeitslösung für Fischwasser mit oder ohne Methylenblau für die Züchtung von Zebrafischembryonen vor (siehe Tabelle 1).
2. Bereiten Sie 20x Stamm (0,4%) und 1x funktionierende Tricain-Anästhesielösung vor, wie in Tabelle 1 beschrieben. Um ein wiederholtes Einfrieren und Auftauen der Stammlösung zu vermeiden, 10 ml Aliquots von 20x Tricain vorbereiten und bei -20 °C lagern.
3. Bereiten Sie 2%ige Triton-Lösung vor, verdünnt in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS; Tabelle 1).

2. Herstellung eines Inokulums aus fluoreszierendem  P. aeruginosa , das GFP konstitutiv exprimiert

HINWEIS: Alle Arbeiten mit P. aeruginosa werden unter Beachtung von BSL-2-Vorsichtsmaßnahmen in einer Biosicherheitswerkbank durchgeführt. P. aeruginosa-Stämme sollten genetisch so verändert werden, dass sie konstitutiv einen fluoreszierenden Reporter exprimieren, wie z. B. GFP (wie hier verwendet und in¹³ beschrieben). Die Verwendung von Stämmen mit einem chromosomal kodierten Fluoreszenzreporter wird dringend empfohlen, um den Verlust von Plasmid im Falle eines Plasmidkodierten Fluoreszenzreporters zu vermeiden.

1. 2 Tage vor der Infektion wird bei -80 °C ein Bestand an genetisch veränderten P. aeruginosa , die GFP exprimieren, auf LB-Agarplatten ausgezogen (Tabelle 1) und über Nacht bei 37 °C inkubiert.
2. Überprüfen Sie die Fluoreszenz der Kolonien mit einem Fluoreszenzmikroskop (Vergrößerung 6x), um eine GFP⁺P. aeruginosa-Kolonie in 1 mL LB-Bouillon zu impfen (Tabelle 1) und wachsen Sie über Nacht bei 37 °C unter Schütteln (180 U/min).
3. Am Tag der Infektion verdünnen Sie die obige Übernachtkultur von P. aeruginosa um 1:20 Uhr in 5 ml frische LB-Brühe. Züchten Sie die Bakterien bei 37 °C unter Schütteln (180 U/min), bis die Kultur einen OD₆₀₀ = 0,8 erreicht. Dies sollte ca. 2-3 h dauern.
4. Zentrifugieren Sie die Bakterienkultur 10 min lang bei Raumtemperatur (RT) bei 3584 x g. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 4 mL Fischwasser ohne Methylenblau.
5. Passen Sie das Kulturvolumen mit Fischwasser so an, dass es 7 x 10⁷ bis 1 x 10⁸ KBE/ml hat. Dies entspricht einem OD₆₀₀ von ca. 0,15 (für jeden Stamm anzupassen).
6. Um das Inokulum zu quantifizieren, führen Sie eine serielle Verdünnung der Bakteriensuspension durch, plattieren Sie 20 μl der ^{10-4-Verdünnung auf einer LB-Agarplatte} und inkubieren Sie sie über Nacht bei 37 °C.
7. Zählen Sie GFP⁺ -Kolonien unter einem Fluoreszenzmikroskop, um die KBE des Inokulums zu bestimmen.

3. Entnahme und Aufbereitung von Zebrafischembryonen

1. 3 Tage vor dem bakteriellen Immersionsexperiment Bilden Sie Zebrafisch-Brutpaare. Setze ein Zuchtmännchen und ein weibliches Zuchttier in ein Kreuzungsbecken.
2. Am nächsten Morgen sammeln Sie die Eizellen nach der Befruchtung mit einem feinmaschigen Sieb. Legen Sie die gesammelten Eier in eine Petrischale, in der sich Fischwasser mit Methylenblau befindet.
3. Um eine Kontamination zu vermeiden, geben Sie 1 Tropfen Bleichmittel in die Petrischale. Wechseln Sie nach 5 Minuten das Fischwasser durch Methylenblau, um das Bleiche zu entfernen.
4. Eizellen mit abnormaler Embryonalentwicklung (unbefruchtete Eizellen ähneln einem 1-Zell-Eistadium) oder toten Eizellen (weißes Aussehen) entsorgen.
5. Am Morgen der Infektion (bei 2 dpf) dechorionieren Sie die Embryonen mit zwei sehr dünnen Pinzetten unter dem Stereomikroskop (11-fache Vergrößerung). Reißen Sie das Chorion mit einer Pinzette ab, ohne den Embryo zu kneifen, um ihn freizusetzen.
6. Legen Sie die dechorionierten Embryonen in eine Petrischale, in der sich Fische mit Methylenblau befinden. Inkubieren Sie die Schalen bei 28 °C bis zur Infektion.

4. Verletzung des Embryos

1. Betäuben Sie Zebrafischembryonen in Fischwasser ohne Methylenblau, das 0,02 % Tricain enthält, ca. 5 min vor der Verletzung in einer Zellkulturschale (35 mm x 10 mm). Die Embryonen bewegen sich nicht mehr und reagieren nicht mehr auf Reize.
2. Legen Sie 25G-Nadeln auf die Oberseite von zwei Essstäbchen, um die Handhabung der Nadeln zu erleichtern.
3. Beseitigen Sie unter einem Stereomikroskop Embryonen mit abnormaler Entwicklung oder tote Embryonen. Sammeln Sie mit einer kreisenden Bewegung der Schale alle Embryonen in der Mitte.
4. Isolieren Sie die Embryonen nacheinander mit zwei Nadeln in vertikaler Position (Kopf nach unten - Schwanz nach oben) und platzieren Sie die linke Nadel am Schwanz, um sie gerade zu halten. Schneide die Flosse am Rand des Notochords mit der rechten Nadel ein. Machen Sie den Schnitt in einem Zug. Überschreiten Sie nicht 10 Minuten zwischen dem Schneiden und dem Eintauchen in die Bakterienlösung.

5. Infektion verwundeter Embryonen

1. Unter der biologischen Sicherheitswerkbank Typ II die P. aeruginosa-Lösung in einer Menge von ca. 1 x 10⁷ KBE/ml vortexen und in eine 6-Well-Platte geben.
2. Entnehmen Sie die verletzten Embryonen mit einer Einweg-Pasteur-Glaspipette und geben Sie sie in die Bakterienlösung unter dem mikrobiologischen Sicherheitsstift. Die Platte bei 28 °C 1,5 h inkubieren.
   HINWEIS: Wenn eine große Anzahl infizierter Larven benötigt wird, bilden Sie Gruppen von etwa 50 Larven, machen Sie die Wunde, tauchen Sie sie ein und wiederholen Sie den Vorgang für die folgende Gruppe.
3. Waschen Sie die Embryonen nach der Infektion unter dem mikrobiologischen Sicherheitspfosten wie unten beschrieben.
   1. Übertragen Sie die Embryonen mit einer Glaspipette zum Waschen in 10 ml Fischwasser ohne Methylenblau und fügen Sie so wenig Flüssigkeit wie möglich hinzu, für 30 Minuten bei Raumtemperatur.
   2. Übertragen Sie die infizierten Embryonen erneut mit einer Glaspipette für eine zweite Wäsche für einige Minuten in 4 ml Fischwasser ohne Methylenblau.
   3. Übertragen Sie 24 infizierte Embryonen einzeln in eine Multi-Well-Platte mit 1 ml Fischwasser ohne Methylenblau.
4. Legen Sie die Platten in eine Kunststoffbox bei 28 °C in den Inkubator. Befeuchten Sie die Box (z. B. mit feuchten Papiertüchern), um die Verdunstung zu begrenzen.

6. Überleben infizierter Embryonen

1. Bei Studien zum Überleben von Embryonen ist die Lebensfähigkeit unter einem Stereomikroskop 18 h, 24 h und 48 h nach der Infektion (hpi) zu überprüfen. Ein Embryo gilt als tot, wenn das Herz und die Blutzirkulation aufhören.
2. Darstellen Sie die Sterblichkeits-/Überlebensraten mit Hilfe von Kaplan-Meier-Treppengrafiken (GraphPad Prism 8.3.0) und analysieren Sie die Daten mit einem Log-Rank oder anderen geeigneten statistischen Tests.

7. Zählung der bakteriellen Belastung in infizierten Embryonen (Abbildung 1)

1. Führen Sie die KBE-Bestimmung von infizierten Embryonen zu vier verschiedenen Zeitpunkten durch: 1,5 hpi, d. h. direkt nach der Infektion, und nach jeder Wäsche bei 24, 48 und 72 hpi mit 5 Embryonen/Zeitpunkt. Führen Sie alle Schritte unter dem mikrobiologischen Sicherheitspfosten durch.
2. Bereiten Sie für jede infizierte Larve 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit 95 μl 1x PBS vor. Das Volumen der Larven beträgt etwa 5 μL.
3. Übertragen Sie die Larven auf eine 6-Well-Platte mit 4 ml Fischwasser ohne Methylenblau, um eine Wäsche durchzuführen und Planktonbakterien zu beseitigen.
4. Legen Sie jeden Embryo in ein Mikrozentrifugenröhrchen, das PBS enthält, und fügen Sie so wenig Flüssigkeit wie möglich hinzu. Berühren Sie einfach die Glaspipette mit den Larven auf der Oberfläche des PBS, damit die Larven ohne Zugabe von Flüssigkeit in das Mikrozentrifugenröhrchen einsinken können.
5. Zerkleinern Sie die Embryonen einzeln mit einem Stößel an der Seite des Mikrozentrifugenröhrchens. Bewahren Sie den Stößel in der Tube auf. Bestimmen Sie den Endpunkt, wenn kein intakter Embryo mehr vorhanden ist.
6. Heben Sie den Stößel an und fügen Sie 100 μl PBS-Triton 2 % hinzu, um alle verbleibenden Bakterien aus dem Stößel zu spülen (die Endkonzentration beträgt 1 %). Vortex und 10 min warten. Verarbeiten Sie nicht mehr als fünf Embryonen gleichzeitig.
7. Für jeden Embryo werden 3x 10 μl unverdünnte Lysate auf LB-Agarplatten getropft. Führen Sie mit einer Mehrkanalpipette eine serielle Verdünnung der Lysate in einer 96-Well-Platte durch, bis eine 10^{:3-Verdünnung} erreicht ist. 3x 10 μl Verdünnung ^10-1, ^10-2 und ^10-3 neben die unverdünnten Verdünnungen auf LB-Agarplatten geben und die Platten über Nacht bei 37 °C inkubieren.
8. Zählen Sie die fluoreszierenden Kolonien jeder Verdünnung unter dem Mikroskop und berechnen Sie die KBE pro infiziertem Embryo.

Abbildung 1: Experimenteller Zeitplan zur Beurteilung der bakteriellen Virulenz und Persistenz im Zebrafischembryo. Abkürzungen: CFU = Koloniebildende Einheiten, hpi = Stunden nach der Infektion. Die Zeichnung wurde mit BioRender.com erstellt. Die Zahl wurde von¹³ geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

8. Erprobung der Behandlung gegen persistierende Infektionen (Abbildung 2)

1. Bereiten Sie Antibiotikalösungen mit dem 40-fachen der minimalen Hemmkonzentration (MIC) für den Stamm P. aeruginosa vor. Überprüfen Sie vor dem Versuch, ob die gewählte Konzentration des Antibiotikums für den Embryo nicht toxisch ist.
2. Führen Sie die Schritte 7.1 und 7.2 aus. Geben Sie 1 ml Fischwasser mit Antibiotika in eine 24-Well-Platte und führen Sie eine Kontrolle ohne Antibiotika durch.
3. Übertragen Sie fünf Embryonen pro Behandlung aus dem Waschschritt in die 24-Well-Platte und fügen Sie so wenig Flüssigkeit wie möglich hinzu.
4. Mit den Antibiotika 30 min bei Raumtemperatur inkubieren. Kehren Sie zu Schritt 7.3 zurück. zur Quantifizierung der bakteriellen Belastung nach der Behandlung.

Abbildung 2: Experimentelles Verfahren zur Beurteilung der Wirksamkeit von Antibiotikabehandlungen bei infizierten Embryonen. Abkürzungen: ATB 30' = Antibiotikabehandlung für 30 min, KBE = Koloniebildende Einheiten, hpi = Stunden nach der Infektion. Die Zeichnung wurde mit BioRender.com erstellt. Die Zahl wurde von¹³ geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergebnisse

Der Zebrafischembryo ist ein geeignetes Modell zur Überwachung einer persistierenden Infektion mit P. aeruginosa CF-Isolaten
Wir nutzten den Immersionsmodus verletzter Embryonen, um in vivo die Virulenz von drei CF-Isolaten (A6520, B6513 und C6490)⁹ zu bewerten. Wir untersuchten auch das Verhalten eines gut charakterisierten späten CF-Isolats, RP73, das für seine Langzeitbesiedlung in den Atemwegen von Mäusen bekannt ist

Diskussion

Die Modellierung bakterieller chronischer Infektionen in vivo ist unerlässlich, um die Pathogenese zu verstehen und die Wirksamkeit der Behandlung zu bewerten. Hier haben wir ein persistentes Wundinfektionsmodell im Zebrafisch etabliert, das sich für die Testung von Medikamenten gegen P. aeruginosa eignet. Dies füllt die Lücke der derzeitigen Methodik mit einem Mangel an In-vivo-Modellen , die für das Wirkstoffscreening gegen chronische bakterielle Infektionen ...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Ethyl-3-aminobenzoat-Methansulfonat	Sigma	Nr. E50521
Kolben-Pellet	Eppendorf, Dutscher	33522
Meersalz	Instant Ocean, Aquariensysteme	218035
Triton	Euromedex	2000-B