Methodenartikel

Ookluc: Eine Plasmodium berghei-Linie zur Identifizierung von transmissionsblockierenden Verbindungen

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DOI:

10.3791/68466

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11. Juli 2025

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1Department of Parasitology, Institute of Biomedical Sciences, University of São Paulo

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die sexuelle Entwicklung des Plasmodiums findet im Mitteldarm der Mücke statt. Die sexuellen Stadien des Parasiten ins Visier zu nehmen, ist eine vielversprechende Strategie, um die Übertragung zu blockieren. Wir haben Ookluc entwickelt, eine transgene P. berghei, die nach der Zygotenbildung Nanoluziferase exprimiert und ein Hochdurchsatz-Screening von transmissionsblockierenden Verbindungen ermöglicht. In diesem Artikel werden die Methoden für das Screening mit Ookluc beschrieben.

Zusammenfassung

Malaria bleibt eine Herausforderung für die Weltgesundheit; Im Jahr 2023 wurden weltweit 263 Millionen Fälle und 597.000 Todesfälle gemeldet. Der Lebenszyklus des Parasiten ist komplex, und es sind gezielte Eingriffe in kritischen Entwicklungsstadien erforderlich, um die Krankheit wirksam zu kontrollieren. Übertragungsblockierende (TB)-Strategien zielen darauf ab, die Übertragung von Plasmodium zu unterbrechen, indem sie entweder auf den Mückenvektor oder die Geschlechtsstadien des Parasiten durch Impfstoffe und Medikamente abzielen. TB-Interventionen können sich auf Gametozyten im menschlichen Wirt oder auf andere Formen im Mitteldarm der Mücke konzentrieren, wie z. B. Gameten, Zygoten, Ookineten und Oozysten.

Die Entwicklung neuer TB-Ansätze steht vor großen Herausforderungen. Die Untersuchung der Geschlechtsstadien des Parasiten ist von Natur aus schwierig, und das Hochdurchsatz-Screening (HTS) auf gametozytozide Verbindungen stützt sich hauptsächlich auf P . falciparum-Kulturen . Robuste In-vitro-Instrumente zur Bewertung von Interventionen gegen spätere Geschlechtsstadien sind jedoch nach wie vor begrenzt. Um die Entdeckung von TB-Verbindungen zu beschleunigen, entwickelte unsere Gruppe einen neuartigen HTS-Assay für die Aktivierung und Befruchtung von Gametozyten unter Verwendung von P. berghei, einem Mausmodell für Plasmodium-Infektionen . Der transgene Parasit Ookluc exprimiert Nanoluziferase ausschließlich nach der Zygotenbildung, mit maximaler Lumineszenz während der Ookinetenentwicklung. Dieser Lumineszenz-basierte Assay ermöglicht eine quantitative Auslesung der Differenzierung von Gameten zu Zygoten und von Zygoten zu Ookineten, wobei eine erhöhte Lumineszenz direkt mit der Ookinetenbildung korreliert. In diesem Videoartikel werden die Methoden zum Screening von Malaria-TB-Verbindungen mit Ookluc vorgestellt.

Einleitung

Malaria ist eine uralte Krankheit, die die Geschichte der Menschheit tiefgreifend geprägt hat. Allein im Jahr 2023 wurden 263 Millionen Fälle in 85 endemischen Ländern gemeldet, die zu 597.000 Todesfällen führten1. Die Krankheit wird durch Protozoen-Parasiten der Gattung Plasmodium verursacht, die zum Stamm der Apicomplexa gehören. Von den fünf Arten, die den Menschen infizieren – P. falciparum, P. vivax, P. knowlesi, P. ovale und P. malariae – machen P. falciparum und P. vivax die meisten Fälle aus. P. falciparum wird mit schwerer Malaria in Verbindung gebracht und ist in Afrika vorherrschend, während P. vivax mit Südamerika und Asien die größte geografische Verbreitung hat2.

Die Komplexität des Lebenszyklus von Plasmodium , der mehrere Entwicklungsstadien über zwei Wirte hinweg umfasst, erleichtert seine Übertragung und Persistenz in endemischen Regionen3. Ein kritischer Schritt in diesem Zyklus ist der Übergang vom Menschen zum Mückenvektor, was ihn zu einem wichtigen Ziel für Interventionen macht. Die Übertragung beginnt im menschlichen Wirt, wo sich die Sexualstadien von Plasmodium entwickeln, wenn sich die Merozoiten in männliche und weibliche Gametozyten differenzieren. Bei der Aufnahme durch eine Mücke lösen Umwelteinflüsse die Aktivierung der Gametozyten und die Bildung von Gameten aus, was zu einer Befruchtung im Mitteldarmlumen führt. Die resultierende Zygote differenziert sich zu einem beweglichen Ookineten, der aktiv in das Mitteldarmepithel eindringt und sich innerhalb der Basallamina zu einer Oozyste entwickelt. Im Inneren der Oozyste werden Tausende von Sporozoiten gebildet und anschließend in die Hämolymphe abgegeben, wodurch sie in die Speicheldrüsen wandern können. Dort dringen Sporozoiten in die Azinuszellen ein und wandern in das Drüsenlumen, wo sie verbleiben, bis die Mücke ihre nächste Blutmahlzeit zu sich nimmt, und den Parasiten auf die menschliche Haut übertragen4.

Die Suche nach neuen Strategien zur Blockierung der Übertragung (TB) ist angesichts der Einschränkungen der verfügbaren Medikamente und der zunehmenden Resistenz gegen Malariamittel von entscheidenderBedeutung 5. Herkömmliche Screening-Methoden wie Mückeninfektionen, manuelle mikroskopische Analysen oder der Einbau von radioaktivem Hypoxanthin sind arbeitsintensiv, schwer zu standardisieren und für Hochdurchsatzanwendungen ungeeignet 6,7. Neuere Ansätze mit fluoreszenzbasierter Detektion (z. B. DNA-Färbung oder GFP-Reporter) haben die Effizienz verbessert, dennoch bestehen nach wie vor erhebliche Herausforderungen bei der Bewertung von Verbindungen, die auf die Sexualstadien des Parasiten abzielen 6,7,8.

Um diesen Herausforderungen zu begegnen, wurde eine transgene P. berghei-Linie entwickelt, die Nanoluciferase (nLuc) exprimiert, genannt Ookluc 8. In diesem System wird das nLuc-Gen unter die Kontrolle des Ookineten-spezifischen P . berghei Circumsporozoite- und TRAP-related Protein (CTRP)- Promotors gestellt, der in Zygoten aktiviert wird, was dazu führt, dass die nLuc-Produktion etwa 6 Stunden nach der Gametenaktivierung beginnt und 24 Stunden nach dem Konversionsassay ihren Höhepunkterreicht 8. Dieses Design ermöglicht eine automatisierte, lumineszenzbasierte Quantifizierung der Lebensfähigkeit von Parasiten kurz nach der Befruchtung – wodurch eine direkte Vektormanipulation überflüssig wird – und erleichtert das Hochdurchsatz-Screening von Tausenden von Verbindungen8.

Obwohl die nLuc-Expression unabhängig von der Lebensfähigkeit der Ookineten auftritt und den Nachweis von Verbindungen, die spezifisch spätere Stadien wie die Ookineten-Morphogenese beeinflussen, einschränkt, bleibt Ookluc hochwirksam bei der Identifizierung von TB-Verbindungen, die auf die Gametogenese, die sexuelle Rekombination oder das Überleben von Parasiten in der Mücke abzielen, einschließlich Wirkstoffen, die die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies induzieren. Frühere Studien haben dieses System validiert, indem sie erfolgreich Verbindungen identifiziert haben, von denen bekannt ist, dass sie die Sexualstadien 9,10,11,12,13,14,15 von Plasmodium hemmen. Damit stellt Ookluc eine robuste und innovative Plattform für das Hochdurchsatz-Screening von Plasmodium-Sexualstadien dar, die die Entdeckung neuartiger TB-Wirkstoffe erleichtert und die Bemühungen zur Eliminierung von Malaria in den kommenden Jahren vorantreibt8. Dieses Protokoll beschreibt die Anwendung des Ookluc-Systems für das Wirkstoffscreening und die Bestimmung der Hemmkonzentration von 50 % (IC50).

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Protokoll

Alle Tierversuche wurden in strikter Übereinstimmung mit ethischen Richtlinien durchgeführt und von der Ethikkommission für die Verwendung von Tieren des Instituts für Biomedizinische Wissenschaften der Universität São Paulo (CEUA-ICB/USP) genehmigt. Die Tiere wurden in Übereinstimmung mit den von diesem Ausschuss festgelegten Standards untergebracht und gehalten. Die Experimente mit genetisch veränderten Plasmodium-Parasiten sowie deren kryokonservierte Lagerung bei -80 °C wurden in Übereinstimmung mit den Vorschriften des Institutionellen Ausschusses für biologische Sicherheit des Instituts für Biomedizinische Wissenschaften der Universität São Paulo (CIBio-ICB/USP) durchgeführt. In dieser Studie wurden insgesamt drei weibliche BALB/c-Mäuse im Alter von 3-5 Wochen verwendet - zwei infizierte und eine nicht infizierte.

1. Materialien und Reagenzien

  1. Bereiten Sie das Ookinetmedium vor, indem Sie RPMI 1640 mit 0,025 M HEPES, Penicillin-Streptomycin-Neomycin (PSN), 50 mg/l Hypoxanthin und 100 μM Xanthurensäure ergänzen. Stellen Sie den pH-Wert auf 8,3 8,16 ein.
  2. Bereiten Sie die Arbeitslösung für den Lumineszenz-Assay vor, indem Sie 1 Volumen des Substrats mit 50 Volumen des im Luciferase-Assay-System bereitgestellten Lysepuffers mischen.
  3. Stellen Sie einen Inkubator auf 21 °C ein.

2. Infektion und parasitierte Blutentnahme

  1. Infizieren Sie zwei weibliche BALB/c-Mäuse (4-6 Wochen alt) mit 150 μl kryokonserviertem Ookluc-Stamm durch intraperitoneale (IP) Injektion (Tag 0).
    HINWEIS: In diesem Protokoll empfehlen wir die Verwendung von BALB/c-Mäusen aufgrund ihrer leichten Verfügbarkeit und ihrer weit verbreiteten Verwendung in Tierhaltungen. Jeder Wildtyp-Mausstamm, der anfällig für eine P. berghei-Infektion ist und die Gametozytogenese unterstützt, sollte jedoch für den Einsatz geeignet sein.
  2. Ab Tag 3 ist die Parasitämie und Gametozytämie durch mikroskopische Untersuchung von Giemsa-gefärbten Blutausstrichen zu beurteilen.
  3. Wenn Parasitämie und Gametozytämie etwa 5 % bzw. 0,5 % erreichen (normalerweise an Tag 4), entnehmen Sie Blut durch Herzpunktion mit heparinisierten Spritzen und sammeln Sie das Blut von beiden infizierten Mäusen.
    HINWEIS: Obwohl es sich um eine transgene Linie von P. berghei handelt, ähneln ihr Wachstum und ihr Gametozytämieprofil denen, die beim ANKA-Stamm beobachtet wurden. In diesem Zusammenhang ist der Anteil der Gametozyten im Verhältnis zur Gesamtparasitämie etwa 10x geringer.
    HINWEIS: Idealerweise wird die Verbundplatte (siehe unten) vor der Entnahme von parasitiertem Blut vorbereitet, so dass das Blut sofort nach der Entnahme auf die Platte pipettiert wird. Wenn das Mausblut in einem anderen Raum entnommen werden muss oder aus anderen Gründen nicht sofort auf die Verbundplatte pipettiert werden kann, muss das entnommene Blut nicht länger als 30 Minuten bei 37 °C aufbewahrt werden.

3. Conversion Assay - Screening in 96-Well-Platten

HINWEIS: Um konsistente Ergebnisse zu gewährleisten, sollte der gesamte Versuch dreimal an verschiedenen Tagen wiederholt werden, um die Ergebnisse zu bestätigen.

  1. Bereiten Sie die Verbindungsproben mit Ookinetmedium als Verdünnungsmittel vor (eine Endkonzentration von 10 μM). Verdünnen Sie das Verbundmaterial auf 1 mM und bereiten Sie Arbeitsproben vor, indem Sie das 1 mM-Material 1:100 v:v in Ookinete Medium verdünnen. Bereiten Sie für einen Assay in doppelter Ausführung ein Endvolumen von 200 μl der Arbeitsprobe vor.
  2. Wird die Verbindung in einem anderen Lösungsmittel als Wasser verdünnt, so ist eine Kontrollprobe hinzuzufügen, die das in Ookinetmedium verdünnte Lösungsmittel im gleichen Verhältnis wie in der Prüfprobe enthält, um sicherzustellen, dass die beobachtete Hemmung auf die Verbindung und nicht auf das Lösungsmittel zurückzuführen ist.
    HINWEIS: Als Beispiel werden wir 90 Verbindungen untersuchen.
  3. Platzieren Sie unter Verwendung von zwei 96-Well-Platten 80 μl der Proben in jeder Vertiefung, wie folgt und in Abbildung 1 dargestellt, in doppelter Ausführung (zwei Platten): Positivkontrolle: 80 μl Ookinetmedium; Negativkontrolle: 80 μl Ookinetmedium; Lösungsmittelkontrolle: 80 μl Ookinetmedium mit 1 % DMSO; Proben: 80 μl von 10 μM jeder Verbindung in Ookinetmedium.

figure-protocol-1
Abbildung 1: Schematische Darstellung eines 96-Well-Plattenlayouts, das für das Screening von Verbindungen ausgelegt ist. Das Plattenlayout umfasst eine Positivkontrolle (C+), eine Negativkontrolle (C-), eine Kontrolle plus Verdünnungslösungsmittel (C+S) und 90 Testverbindungen (S1-S90). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

  1. 4 μl parasitiertes Mausblut werden in jede Vertiefung der 96-Well-Platte im Verhältnis 1:20 v:v gegeben, außer zur Negativkontrolle (C-). Schonend durch Pipettieren homogenisieren.
    HINWEIS: Unter Berücksichtigung der Verluste berechnen wir den Bedarf von ~400 μL parasitiertem Blut für jede Platte.
  2. Für die Negativkontrolle fügen Sie nicht infiziertes Mausblut im Verhältnis 1:20 hinzu (v:v, Blut:Probe). Schonend homogenisieren.
  3. Bei 21 °C für 6 h oder 24 h inkubieren.
    HINWEIS: Die nLuc-Aktivität ist nach 6 Stunden Inkubation nachweisbar und erreicht nach 24 Stunden des Assaysihren Höhepunkt 8. Der Assay ist nicht in der Lage, Verbindungen mit Aktivität nach der Zygotenbildung zu identifizieren, wie z. B. Verbindungen, die die Ookineten-Morphogenese hemmen, da gebildete Zygoten nLuc unabhängig von der abgeschlossenen Morphogenese akkumulieren. Daher ist eine 6-stündige Inkubation ausreichend, um alle Verbindungen nachzuweisen, die die nLuc-Aktivität blockieren, indem sie die Gametogenese oder die sexuelle Rekombination hemmen oder eine frühe Zytotoxizität aufweisen. Normalerweise bevorzugen wir jedoch Inkubationen von 24 Stunden, um stärkere Signale und ein besseres Signal-Rausch-Verhältnis zu erhalten.

4. Lumineszenz-Assay

  1. Nach der Inkubationszeit werden die Proben durch Auf- und Abpipettieren homogenisiert, um eine gründliche Durchmischung des Blut-Mediums zu gewährleisten.
  2. Bereiten Sie die Mischung aus Lysepuffer und Luciferase-Substrat unmittelbar vor der Verwendung im Verhältnis 1:50 vor (v:v, Substrat:Lysepuffer).
  3. Mischen Sie die Substratmischung mit den Proben im Verhältnis 1:1 (v:v) und achten Sie dabei auf ein schonendes Mischen, um Blasen zu vermeiden. Bei 37 °C 3-5 min inkubieren.
    HINWEIS: In diesem Beispiel haben wir 84 μl Substrat-Lyse-Puffer zu jeder Vertiefung hinzugefügt.
  4. Übertragen Sie die Proben auf eine weiße 96-Well-Platte mit flachem Boden. Messen Sie die Lumineszenz mit einem Plattenlesegerät. Verwenden Sie die folgende Parameterkonfiguration: Emissionsfilter: Objektiv; Messintervallzeit: 1 s pro Well.

5. Datenanalyse - Screening

  1. Notieren Sie sich nach dem Lumineszenz-Assay die Rohdaten, die angezeigt werden (Abbildung 2).
    HINWEIS: Die erhaltenen relativen Lichteinheiten (RLU) hängen vom verwendeten Luminometer ab. In unserem Fall lagen die RLU-Werte für die Positivkontrolle zwischen 10.000 und 500.000 in einem 24-Stunden-Inkubationsassay. Kürzere Inkubationszeiten (6 h) führen zu niedrigeren RLU-Werten.

figure-protocol-2
Abbildung 2: Ergebnisse einer simulierten Messung eines Umwandlungsassays für das Screening von Verbindungen. Das Bild zeigt simulierte Lumineszenzmesswerte aus einem Assay, der nach der Umwandlung von Ookineten in Gegenwart eines Panels von 90 Verbindungen durchgeführt wurde. Niedrigere Werte für die relative Lichteinheit weisen auf eine verringerte Ookinetenbildung hin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

  1. Berechnen Sie anhand einer Tabelle den Mittelwert jeder Messung mit der folgenden Formel. Ersetzen Sie XX durch die Adresse der ersten Messzelle und YY durch die Adresse der zweiten Messzelle. Wiederholen Sie die Formel für alle Proben.
    =(DURCHSCHNITT(XX:YY)
  2. Wandeln Sie die Daten in % Inhibition um, um die Ergebnisse besser analysieren zu können. Verwenden Sie in der Tabelle die folgende Formel. Ersetzen Sie A durch den RLU-Wert der Stichprobe und B durch den RLU-Wert der Kontrolle. Wiederholen Sie die Formel für alle getesteten Verbindungen:
    = 1 - (A/B) x 100
    HINWEIS: Die Daten werden wie in Abbildung 3 dargestellt angezeigt.

figure-protocol-3
Abbildung 3: Ergebnisse aus einer simulierten Messung eines Umwandlungsassays für das Screening von Verbindungen, dargestellt in % der Hemmung für jede Verbindung. Prozentsatz der Umwandlungshemmung für jede getestete Verbindung, berechnet wie oben beschrieben. Die hervorgehobenen Quadrate weisen auf Verbindungen hin, die eine Umwandlungshemmung von mehr als 95 % fördern. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

  1. Identifizieren Sie die Verbindungen, die eine Hemmung von mehr als 95 % aufweisen.
    HINWEIS: Diese Verbindungen zeigen eine hohe Aktivität gegen sexuelle Stadien bei einer Konzentration von 10 μM. In unserem Beispiel haben wir fünf Verbindungen mit hoher Aktivität gegen sexuelle Stadien gefunden.
  2. Für die identifizierten Verbindungen ist eine IC50-Bestimmung wie unten beschrieben durchzuführen.

6. Conversion Assay - Bestimmung von IC 50

  1. Infizieren Sie Mäuse mit Ookluc und sammeln Sie parasitiertes Blut, wie in Abschnitt 2 beschrieben.
  2. Bereiten Sie die Proben mit Ookinetmedium als Verdünnungsmittel vor. Es ist eine Anfangskonzentration zu verwenden, bei der eine 100%ige Hemmung der Umwandlung durch die Verbindung beobachtet wird.
    HINWEIS: Da die Wirkstoffe in einem Screening mit einer Konzentration von 10 μM identifiziert wurden, verwenden wir 20 μM als Anfangskonzentration für die erste Dosis-Wirkungs-Kurve. Für eine genaue Dosis-Wirkungs-Kurve ist es wichtig, dass Ihr Assay Anfangskonzentrationen enthält, die zu einer 100%igen Hemmung der Umwandlung führen, und Endkonzentrationen, die zu einer Hemmung von 0 % führen. Dieser Ansatz gewährleistet eine präzise IC50-Berechnung . Die erste Dosis-Wirkungs-Kurve gibt Aufschluss über die niedrigsten Konzentrationen der Verbindung mit ~100% Hemmung. In diesem Protokoll verwenden wir als Beispiel PyAz90, das kürzlich mit Ookluc13 identifiziert wurde.
  3. In einer 96-Well-Platte dreifach zugeben (siehe Abbildung 4): Positivkontrolle (C+): 80 μl Ookinetmedium; Negativkontrolle (C-): 80 μl Ookinetmedium; Erste Verdünnung der Probe (Cpd D1): 160 μl der Verbindung bei einer Anfangskonzentration im Ookinetmedium, die zu einer 100%igen Hemmung der Umwandlung führt; Vertiefungen D2 bis D12: 80 μl Ookinetmedium.
  4. Führen Sie zweifache serielle Verdünnungen durch, indem Sie 80 μl Vertiefung D1 in D2 pipettieren, homogenisieren und 80 μl Vertiefung D2 in D3 pipettieren und so weiter. Stellen Sie sicher, dass alle Vertiefungen ein Gesamtvolumen von 80 μl haben, also entsorgen Sie die letzten 80 μl, die aus der Vertiefung D12 entnommen wurden.
    HINWEIS: Führen Sie das Experiment mit mindestens drei Wiederholungen für alle Stichproben durch, wie in Abbildung 4 dargestellt. Um die Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit Ihrer Ergebnisse zu gewährleisten, sollte das gesamte Experiment an drei verschiedenen Tagen mit jeweils neu infizierten Tieren wiederholt werden.
    HINWEIS: Wenn die Ergebnisse im ersten Screening keinen Einfluss des Lösungsmittels auf die Umwandlung zeigen, ist es nicht erforderlich, diese Kontrollen in serielle Verdünnungen einzubeziehen. Andernfalls müssen auch serielle Verdünnungen des Lösungsmittels einbezogen werden.

figure-protocol-4
Abbildung 4: 96-Well-Plattenlayout, das für die Bestimmung von Compound IC50 ausgelegt ist. Das Plattenlayout umfasst Verdünnungen der Positivkontrolle (C+), der Negativkontrolle (C-) und der Verbindung (Cpd) (D1 bis D12). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

  1. Geben Sie parasitiertes Mausblut in die 96-Well-Platte bei einem Verhältnis von 1:20 v:v. Schonend durch Pipettieren homogenisieren.
    HINWEIS: In jede Vertiefung werden insgesamt 4 μl parasitiertes Blut gegeben, außer in die Negativkontrolle (C-). Unter Berücksichtigung der Verluste berechnen wir den Bedarf von ~200 μL parasitiertem Blut für jede zu testende Verbindung.
  2. In Negativkontrollvertiefungen wird nicht infiziertes Mausblut im Verhältnis 1:20 (v:v, Blut:Probe) zugegeben. Schonend homogenisieren.
  3. Bei 21 °C für 6 h oder 24 h inkubieren.
  4. Führen Sie den Lumineszenz-Assay durch, wie in Abschnitt 4 beschrieben.

7. Datenanalyse - IC 50 Bestimmung

HINWEIS: IC50 ist definiert als die Konzentration einer Verbindung, die erforderlich ist, um 50 % der biologischen Aktivität/Hemmung zu hemmen. In diesem Assay bezieht sich die Hemmung auf die Verringerung der Ookinetumwandlung. Die Daten werden als sigmoidale Dosis-Wirkungs-Kurve dargestellt, wobei die X-Achse die Verbindungskonzentration (logarithmisch transformiert) und die Y-Achse die prozentuale Hemmung darstellt.

  1. Die prozentuale Hemmung wird wie in Abschnitt 5, Schritt 5.3 beschrieben berechnet.
  2. Öffnen Sie die Software und erstellen Sie eine XY-Tabelle.
  3. Legen Sie die Optionen für die Y-Achse auf Geben Sie 3 Replikationswerte in nebeneinander liegenden Unterspalten ein.
  4. Pastendaten, wobei X für die Verbindungskonzentration und Y für die prozentuale Hemmung steht (Abbildung 5A).
  5. Klicken Sie in der Menüleiste auf Analysieren und wählen Sie Nichtlineare Regression (Kurvenanpassung) und dann Dosis-Wirkungs-Kurven - Hemmung und [Inhibitor] vs. normalisierte Reaktion -- variable Steigung; klicken Sie auf OK.
  6. Beobachten Sie im linken Bereich die Dosis-Wirkungs-Kurve der Daten. Wenden Sie die gewünschte Personalisierung an, z. B. Farbänderungen und Punktformate.
  7. Suchen Sie die Nonlin-Fit-Tabelle, um das berechnete IC50 und das 95 %-Konfidenzintervall (95 %-KI) zu ermitteln (Abbildung 5B).

figure-protocol-5
Abbildung 5: Dosis-Wirkungs-Kurve von PyAz90. Die %-Hemmung wurde in Abhängigkeit von der PyAz90-Konzentration (μM) auf einer logarithmischen Skala gemessen. Die sigmoidale Kurve stellt die angepassten Daten dar, die zur Bestimmung des IC50 verwendet wurden, der 0,013 μM betrug (95 % Konfidenzintervall: 0,012-0,014 μM). Datenpunkte stellen den Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts aus experimentellen Replikationen dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Ergebnisse

Die Erzeugung von Ookluc-Parasiten ermöglicht die Bewertung neuer TB-Wirkstoffkandidaten aus einer Perspektive, die von bestehenden Assays nicht geboten wird, insbesondere bei der Bewertung der Auswirkungen von Verbindungen auf die Gametenaktivierung, Befruchtung und Zygotenbildung8. Abbildung 2 und Abbildung 3 veranschaulichen die Fähigkeit der Methode, eine Reih...

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Diskussion

Die meisten HTS-Methoden, die zur Entwicklung neuer TB-Wirkstoffe verwendet werden, konzentrieren sich auf die Hemmung der Gametozytogenese oder die gametozytozide Aktivität. Bisher wurden nur zwei P. berghei-Modelle entwickelt, die es ermöglichen, die Gametozytenfunktion, die Gametogenese, die Zygotenbildung und die Ookineten-Morphogenesezu beurteilen 5.

Eines dieser Modelle ähnelt Ookluc, da es einen Fluoreszenzrepor...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Dieses Projekt wurde durch Zuschüsse der Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2021/06769-0) und des Instituto Serrapilheira (Stipendium G-1709-16618) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Dimethylsulfoxid (DMSO)Sigma-AldrichNr. D8418
GraphPad Prism Version 10.0.0 für WindowsGraphPad Software, Boston, Massachusetts, USA
Heparin-Natriumsalz aus der Darmschleimhaut von SchweinenSigma-AldrichNr. H3393
HEPES (1 M)Thermo Scientific15630106
HypoxanthinSigma-AldrichNr. H9636
Mäuse------Weibliche BALB/c-Mäuse im Alter von 3 bis 5 Wochen
Nano-Glo Luciferase Assay-SystemPromegaNr. N1110
Penicillin − Streptomycin − Neomycin-Lösung stabilisiertSigma-AldrichNr. P4083
POLARStar Omega Mikroplatten-Reader BMG Labtech----
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX ErgänzungThermo Scientific61870036
XanthurensäureSigma-AldrichD120804

Referenzen

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Schlagwörter

Hochdurchsatz Screeningsexuelle StadienGametozytenaktivierungLumineszenz AssayOokinetenentwicklungIC50 BestimmungDosis Wirkungs KurvePlattenleseger t

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