Methodenartikel

Schnelle Dissektion und Dissoziation des olfaktorischen Epithels der Maus für Einzelkernsuspensionen

DOI:

10.3791/68472

⸱

1. August 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Genetics and Genomics Graduate Program, Baylor College of Medicine, 2Department of Molecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine, 3Jan and Dan Duncan Neurological Research Institute, Texas Children's Hospital, 4Medical Scientist Training Program, Baylor College of Medicine, 5Cytometry and Cell Sorting Core, Baylor College of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieser Artikel bietet ein optimiertes Protokoll für die Dissektion und Dissoziation von murinem Geruchsepithel zum Zwecke der Einzelkern-RNA-Sequenzierung.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das murine Geruchsepithel ist der erste Eintrittspunkt in das olfaktorische System und beherbergt verschiedene Zelltypen, zu denen olfaktorische sensorische Neuronen, ihre regenerierenden Vorläuferzellen und Stützzellen gehören. Geruchssinnige Neuronen wandeln chemische Geruchsstoffe in neuronale Signale um, doch die Mechanismen, die diesen Zellen zugrunde liegen, wie sie sich entwickeln und umwandeln, Synapsen mit dem Riechkolben bilden und ihre Geruchsrezeptoren regulieren, bleiben Bereiche intensiver Forschung. Das olfaktorische Epithel befindet sich auf der dorsalen Seite der Nasenhöhle und haftet an komplizierten knöchernen Strukturen, die als Nasenmuscheln bekannt sind. Diese Anatomie stellt einzigartige Herausforderungen an die Extraktion und Dissoziation, insbesondere im Zusammenhang mit der Herstellung lebensfähiger Einzelzellsuspensionen. Da Einzelzellsuspensionsprotokolle oft vorbereitende Schritte (z. B. Papain-Dissoziation, FACS) beinhalten, die die Lebensfähigkeit der Zellen belasten und/oder die Vorbereitung der Bibliothek verzögern können, ist die Minimierung der Gewebeextraktionszeit von entscheidender Bedeutung. In diesem Artikel wird eine optimierte Methode zur schnellen Dissektion des olfaktorischen Epithels und ein Protokoll zur Erzeugung hochwertiger Einzelkernsuspensionen vorgestellt.

Einleitung

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Das murine Riechepithel (OE) ist ein wesentlicher Bestandteil des olfaktorischen Systems und für die Erkennung und Weiterleitung von Odorantensignalen in das zentrale Nervensystem verantwortlich. Seine oberflächlichste Schicht enthält die geruchserkennenden Flimmerhärchen der olfaktorischen sensorischen Neuronen, die mit einer Schleimschicht bedeckt und von den unterstützenden Stütz- und Mikrovillarzellen umgebensind 1,2. OSNs sind bipolar und dehnen ihre Zilien apikal aus, um ein Gitter innerhalb der Schleimschicht zu bilden, und ihre Axone basal durch die knöcherne cribriforme Platte, um innerhalb des Riechkolbens zu Glomeruli zu verschmelzen. Diese Glomeruli sind der Ort der Synapsen zwischen OSNs und nachgeschalteten Neuronen. Die zugrunde liegenden OSNs, neuronale Vorläuferzellen, die als globose Basalzellen bezeichnet werden, füllen die OSNs ständig auf, wennsie nach direkter Exposition gegenüber Umwelteinflüssen wie Toxinen in der Luft, Krankheitserregern und physischen Traumata sterben. Globose Basalzellen stammen aus einem Reservepool multipotenter horizontaler Basalzellen 4,5, die am basalsten lokalisiert sind und an der basalen Lamina von knöchernen Vorsprüngen, den nasalen Nasenmuscheln, haften. Die Nasenmuscheln sind gewunden, so dass die OE schwer zu trennen und zu homogenisieren ist. Darüber hinaus ist das OE von Knochen des Schädels umgeben, was den Zugang zu diesem Bereich erschwert und traditionell einen zeitintensiven Eingriff erfordert.

Frühere Studien stützten sich auf eine verlängerte Papain-Inkubation, um das olfaktorische Epithel aus dem Knochenfreizusetzen 6,7,8,9,10, was die nachgelagerte Verarbeitung der Einzelzellsuspension weiter verzögern kann. Da das Scheren von OSN-Axonen die Apoptose11 auslöst, ist es unerlässlich, die Zeit von der Gewebeextraktion bis zur Vorbereitung der cDNA-Bibliothek zu minimieren. Darüber hinaus erschweren die Architektur des OE und seine Projektionen zum Riechkolben die Extraktion intakter Zellen für eine erfolgreiche Einzelzell-RNA-Sequenzierung. Glücklicherweise hat sich die Einzelkern-RNA-Sequenzierung (snRNA-seq) als leistungsfähiges Werkzeug für die Profilierung von Zellen bei gleichzeitiger Beibehaltung der Zelltypverteilung erwiesen, insbesondere in Geweben, in denen die Einzelzelldissoziation schwierig oder unpraktisch ist12,13.

Während eine Reihe von Studien 6,7,8,10,14,15 eine Einzelzellsequenzierung der Maus-OE durchgeführt haben, bietet keine ein detailliertes Dissektionsverfahren, das für eine konsistente und zweckmäßige Gewebeentnahme optimiert ist, was angesichts der Fragilität der OE und der Umhüllung durch verschiedene Knochen des Schädels notwendig ist. Darüber hinaus konzentrieren sich die bestehenden Präparierschablonen16 eher auf die Erhaltung der anatomischen Struktur als auf die Geschwindigkeit, was zu potenziell langen Präparierzeiten führt. Da eine zweckmäßige Gewebepräparation wesentlich ist, um den RNA-Abbau zu minimieren und die Qualität der präparierten Zellkernezu maximieren 17,18, ist ein optimiertes Protokoll für die schnelle Dissektion und Homogenisierung von muriner OE in eine Einzelkernsuspension für den Einsatz in verschiedenen nachgeschalteten Anwendungen gerechtfertigt.

Dieses Protokoll (Abbildung 1) stellt eine schlanke Methode dar, die entwickelt wurde, um diese Herausforderungen zu meistern und die schnelle Dissektion der murinen OE und eine effiziente Dissoziation des Gewebes zum Zwecke der Isolierung von Zellkernen zu ermöglichen. Dieser Ansatz ermöglicht eine qualitativ hochwertige Einzelkern-Sequenzierung19 und bietet eine zuverlässige Technik zur Untersuchung der molekularen Grundlagen der olfaktorischen Biologie.

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Abbildung 1: Anatomie der relevanten Nähte und Knochen des Schädels von C57BL/6 aus der Maus und repräsentativer Querschnitt durch das Riechepithel. (A) Die Nähte des Schädels sind farbcodiert. Die Nähte sind auf einer Seite des Schädels farbcodiert, während die andere Seite als Referenz unmarkiert bleibt (links). Die Namen der Nähte sind entsprechend farblich gekennzeichnet (rechts). (B) Knochen des Schädels farbcodiert. Die Knochen sind auf einer Seite des Schädels farbcodiert, während die andere Seite als Referenz unmarkiert bleibt (links). Die Namen der Knochen sind entsprechend farblich gekennzeichnet (rechts). (C) Querschnitt durch den zentralen Teil der OE (präpariert mit der in diesem Artikel beschriebenen Methode) mit Nasenmuscheln, die auf einer Seite farbcodiert sind, und links oben ohne Markierung als Referenz (links). Namen der visualisierten Nasenmuscheln (rechts). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Protokoll

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Alle Tierversuche in dieser Studie wurden vom Baylor College of Medicine IACUC genehmigt und in Übereinstimmung mit diesem durchgeführt. Es wurden weibliche C57BL/6J (JAX:000664)-Mäuse verwendet. Einzelheiten zu den Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Dissektion des olfaktorischen Epithels

  1. Beginnen Sie mit der Tiefenbetäubung der Maus mit einer beliebigen Methode (gemäß institutionell anerkannten Protokollen). Bestätigen Sie die chirurgische Anästhesieebene durch festes Zusammenkneifen der Zehen und fahren Sie mit der transkardialen Perfusion von mindestens 10 ml eiskaltem 1x PBS fort. Entfernen Sie die Haut, um den Schädel freizulegen (Abbildung 2A).
    HINWEIS: Das Entfernen des Kopfes vom Körper ist optional. Wenn man sich entscheidet, den Kopf zu entfernen, wird empfohlen, die Haut und andere Weichteile um den Schädel herum vor der Enthauptung zu entfernen.
  2. Nehmen Sie mit einer feinen, scharfen Schere zwei Schnitte vor, um die Jochbögen bilateral vom Plattenepithelknochen zu lösen, indem Sie eine Scherenspitze in die hintere Orbita und die andere neben den Gehörgang setzen (grüne Linien in Abbildung 2B).
  3. Machen Sie einen flachen Schnitt von Orbita zu Orbita entlang der vordersten Seite des Stirnbeins. Schneiden Sie nur die dorsale Oberfläche des Stirnbeins (~1-2 mm tief) und achten Sie darauf, keine darunter liegenden Strukturen oder Knochen zu schneiden, aus denen die Augenhöhle besteht (blaue Linie in Abbildung 2B).
    HINWEIS: Um einen flachen Schnitt zwischen den Augenhöhlen zu erreichen, halten Sie die Schere senkrecht zum Schädel und verwenden Sie zum Schneiden nur die scharfen Spitzen.
  4. Schneiden Sie entlang der Mittellinie des Schädels vom Foramen magnum durch die sagittalen und interfrontalen Nähte, bis der interorbitale Schnitt im Stirnbein in Schritt 1.3 erreicht ist (rote Linie in Abbildung 2B).
  5. Führen Sie eine Pinzette in den Schnitt entlang der Mittellinie des Schädels ein und ziehen Sie eine Halbkugel des Schädelgewölbes seitlich fest. Durch diese Aktion werden auch die Knochen der Augenhöhle (Stirn-, Oberkiefer- und Tränenknochen) entfernt, wodurch die lateralen Aspekte der Riechmuscheln freigelegt werden (Abbildung 2D).
    HINWEIS: Achten Sie darauf, die OE ab diesem Zeitpunkt nicht versehentlich zu beschädigen.
  6. Halten Sie das Nasenbein und die Schneidezähne fest und brechen Sie das kontralaterale Schädelgewölbe mit einer Pinzette auf. Lassen Sie das Gehirn (einschließlich der Riechkolben) mit der Knochenhälfte entfernen, wenn es weggerissen wird (Abbildung 1E). Die einzigen sichtbaren knöchernen Strukturen, die nach diesem Schritt verbleiben sollten, sind die Schädelbasis und die Knochen, die den OE umgeben (Abbildung 2F).
  7. Entfernen Sie mit einer Knochenzange oder einem Rongeurs das verbleibende Stirnbein und den prämaxillären (Schneide-)Knochen bis zur Basis der Schneidezähne (Abbildung 2G).
  8. Schneiden Sie mit einer Knochenzange entlang der frontonasalen Naht, um das Nasenbein von der cribriformen Platte zu lösen, und achten Sie dabei äußerst darauf, die darunter liegende freiliegende OE nicht zu beschädigen oder die cribriforme Platte zu brechen.
  9. Heben Sie das Nasenbein mit einer Pinzette von der cribriformen Platte ab, um das OE freizulegen (Abbildung 2H). Wenn der verbleibende Prämaxillarknochen die dorsale OE verdeckt, entfernen Sie ihn, bevor Sie fortfahren (schwarze Kreise in Abbildung 1I).
  10. Befestigen Sie mit einer Pinzette mit feiner Spitze vorsichtig die dorsale Seite des Nasenseptums an der Verbindung mit der cribriformen Platte und ziehen Sie nach hinten (Abbildung 2J,K). Bei minimalem Widerstand bricht das olfaktorische Hauptepithel als vollständig intakte Struktur frei (Abbildung 2L).
  11. Fahren Sie sofort mit der OE-Dissoziation fort oder frieren Sie das Gewebe für die spätere Verarbeitung ein.

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Abbildung 2: Technik zur schnellen Dissektion des Riechepithels. (A) Der Mauskopf nach der Entfernung des umgebenden Weichgewebes. (B) Farbcodierte Schablonen für Schnitte an Schädelgewölben. (C) Erscheinungsbild nach Schnitten am Schädelgewölbe. (D) Entfernung der ersten Hemisphäre des Schädelgewölbes zusammen mit dem an das Riechepithel angrenzenden Teil der Augenhöhle. (E) Entfernung des kontralateralen Teils des Schädelgewölbes zusammen mit dem Gehirn. (F) Der Kopf nach der Entfernung des Gehirns und des Schädelgewölbes. (G) Entfernung des vordersten Stirnknochens und des hinteren Prämaxillars nach dem Schnitt an der frontomaxillären Naht. (H) Entfernung der Nasenknochen. (I) Schwarze Kreise markieren Bereiche des verbleibenden Prämaxillarknochens, die optional entfernt werden können. (J) Platzierung einer Pinzette zur Entfernung des intakten Riechepithels. (K) Ziehen Sie nach hinten, um das olfaktorische Epithel freizusetzen. (L) Vollständige Freisetzung des Riechepithels. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

2. Dissoziation des olfaktorischen Epithels und Isolierung des Einzelkerns

  1. Legen Sie ein C-Röhrchen und zwei konische 15-ml-Röhrchen pro Probe auf Eis.
  2. Bereiten Sie den Lysepuffer vor, indem Sie einen RNAse-Inhibitor (bis zu einer Endkonzentration von 0,2 U/μl) zu einem vorgefertigten Kernextraktionspuffer hinzufügen.
  3. Geben Sie 4 ml 1 % BSA in jedes konische 15-ml-Röhrchen, wirbeln Sie es kurz vor und verwerfen Sie den Überschuss. Dadurch wird jedes der konischen 15-ml-Röhrchen mit BSA beschichtet, um die Adhäsion der Kerne an das Röhrchen zu minimieren.
  4. Für eine ganze OE geben Sie 2 ml eiskalten Lysepuffer in jedes C-Röhrchen.
  5. Geben Sie OE-Proben in die C-Rohre. Halten Sie jede Probe mit einer Pinzette #2 über das jeweilige C-Rohr und schneiden Sie sie mit einer Feinschere in kleine Stücke.
  6. Legen Sie die C-Röhrchen mit den einzelnen Proben kopfüber auf die automatisierten Gewebedissoziatorblöcke. Auf dem Dissoziator-Bildschirm ändert sich das Quadrat, das jedem Block entspricht, von Frei in Ausgewählt.
  7. Drücken Sie auf das Ordnersymbol, um in den Miltenyi-Ordner zu wechseln. Scrollen Sie mit den Pfeilen zum 4C_nuclei_1 Programm (ein vorinstalliertes Programm im Dissoziator). Drücken Sie OK , um das Programm auf jeden Block anzuwenden, und drücken Sie dann Start, um den Zyklus zu starten. Entfernen Sie die C-Röhrchen sofort nach Beendigung des Zyklus aus dem Dissoziator.
    HINWEIS: Wenn möglich, halten Sie die C-Röhrchen während des Dissoziationszyklus eiskalt. Es ist wichtig, die Proben unmittelbar nach Abschluss des Zyklus aus dem Dissoziator zu entfernen und mit den nächsten Schritten des Protokolls fortzufahren, um eine Überlyse der Zellkerne zu vermeiden.
  8. Mit einer Pipette wird die homogenisierte Suspension aus dem C-Röhrchen abgesaugt und durch ein 70 μm Sieb in das erste BSA-beschichtete konische Röhrchen filtriert. Vermeiden Sie es, die Knochenfragmente zu aspirieren, die sich am Boden des C-Rohrs angesammelt haben.
  9. Spülen Sie das Sieb mit 1 mL eiskaltem 1x PBS, um eine vollständige Filtration zu gewährleisten.
  10. Die filtrierte Suspension wird bei 500 × g 5 min lang bei 4 °C in einer Schwingschaufelzentrifuge zentrifugiert.
  11. Saugen Sie den Überstand vorsichtig an und entsorgen Sie ihn, wobei Sie darauf achten müssen, das Pellet nicht zu stören. Resuspendieren Sie das Kernpellet vollständig in 1 mL eiskaltem 1x PBS durch schonendes Pipettieren.
  12. Die resuspendierten Kerne werden durch ein 30 μm Sieb in das zweite BSA-beschichtete konische Röhrchen geleitet. Die Konzentration der Zellkerne kann mit einem Hämozytometer oder einem automatisierten Zellzähler quantifiziert werden.
  13. Fahren Sie sofort mit dem gewählten Downstream-Protokoll (mit oder ohne FACS) fort, um die Integrität der Probe zu erhalten und eine Verschlechterung zu verhindern (Abbildung 3).
    HINWEIS: Es wird dringend empfohlen, dass Benutzer Übungsläufe dieses gesamten Protokolls durchführen, um einen nahtlosen und rechtzeitigen Abschluss zu gewährleisten.

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Abbildung 3: Dissoziation des olfaktorischen Epithels und Arbeitsablauf bei der Einzelkernisolierung. Nach der Dissektion wird das olfaktorische Epithel mechanisch und chemisch dissoziiert. Anschließend wird das Lysat durch ein 70 μm Sieb filtriert, mit 1x PBS gespült und bei 500 × g für 5 min zentrifugiert. Das Pellet wird in 1x PBS resuspendiert, bevor es durch ein 30 μm Sieb filtriert wird. Die resultierende Kernsuspension steht für verschiedene Downstream-Sequenzierungsanwendungen zur Verfügung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Ergebnisse

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Um den anatomischen Kontext für die Dissektion und Analyse zu schaffen, wurden die Nähte und Knochen des Schädels der C57BL/6-Maus sowie der zentrale Teil des olfaktorischen Epithels (OE) sichtbar gemacht und farbcodiert (Abbildung 1). Eine Seite jedes Bildes wurde mit Anmerkungen versehen, um relevante Nähte, Knochen und Nasenmuscheln hervorzuheben, während die andere Seite als Referenz nicht markiert wurde. Der OE-Querschnitt wurde nach etablierten Protokollen20 ers...

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Diskussion

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Das hier beschriebene Verfahren ermöglicht die konsequente Entfernung einer intakten OE nach intrakardialer 1x PBS-Perfusion. Dies stellt eine bemerkenswerte Verbesserung der Geschwindigkeit im Vergleich zu früheren Methoden16 dar und ist von besonderer Bedeutung, da OSNs nach Axotomie2, was während der Hirnentfernung geschieht, zu degenerieren beginnen.

Die sorgfältige Entfernung des Stirn-, Prämaxillar- und Nas...

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären, dass diese Untersuchung in Abwesenheit von kommerziellen oder finanziellen Beziehungen durchgeführt wurde, die als potenzieller Interessenkonflikt ausgelegt werden könnten.

Danksagungen

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Die Autoren möchten den Single Cell Genomics Core des Baylor College of Medicine würdigen. Dieses Projekt wurde vom Cytometry and Cell Sorting Core am Baylor College of Medicine mit finanzieller Unterstützung des NIH (P30 AI036211, P30 CA125123 und SS10 RR024574) und der fachkundigen Unterstützung von Joel M. Sederstrom unterstützt. Dieses Projekt wurde teilweise von den NIH/NICHD [P50HD103555], den NIH/NINDS [5R01NS078294] und den NIH/NIA [5F30AG076265] finanziert. Abbildung 3 wird in BioRender erstellt. https://BioRender.com/5418352.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
15 mL ZentrifugenröhrchenCelltreat229411
Knochenzange Werkzeuge für die Feinwissenschaft16102-11
Bonn Miniatur Iris Schere Miltex 18-1392
Rinderserumalbumin-LösungSigma-AldrichNr. A1595
Dumont #3 Pinzette Werkzeuge für die Feinwissenschaft11231-30
Weibliche C57BL/6J-MäuseDas Jackson-LaborJAX:000664
schonende MACS C Röhren Miltenyi Biotec130-093-237
gentleMACS Octo Dissoziator Miltenyi Biotec130-096-427
MACS SmartSieb 30 um Miltenyi Biotec130-098-458
MACS SmartStrainers 70 um Miltenyi Biotec130-098-462
Mikro Friedman-Pearson RongeursWerkzeuge für die Feinwissenschaft16220-14
Puffer zur Extraktion von Kernen Miltenyi Biotec130-128-024
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), 1x ohne Calcium und Magnesium, PH 7,4 ± 0.1Corning21-040-CV
Protektor-RNAse-InhibitorMillipore Sigma3335402001
Sorvall Legend XTR KühlzentrifugeThermo Scientific50119927-5

Referenzen

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MausdissektionEinzelkern SuspensionEinzelzellsequenzierungolfaktorische SinnesneuronenGewebedissoziationDurchflusszytometrieMarkergenenNasenh hleProgenitorzellen

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