Methodenartikel

Bildgestützte In-vivo-Verfolgung von transplantierten distalen Lungenepithel-Vorläuferzellen für Lungenfibrose mittels Magnetpulver-Bildgebung

761 Ansichten

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DOI:

10.3791/68477

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27. Juni 2025

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1Precision Health Program, Michigan State University, 2Department of Radiology, College of Human Medicine, Michigan State University, 3Department of Pediatrics and Human Development, Michigan State University, 4Lyman Briggs College, Michigan State University, 5College of Social Science, Michigan State University, 6Department of Chemistry, Hunter College, 7Corewell Health Medical Group, 8Institute for Quantitative Health Science and Engineering (IQ), Michigan State University, 9Department of Biomedical Engineering, College of Engineering, Michigan State University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die Zelltherapie bietet eine vielversprechende Intervention bei Lungenfibrose, indem Vorläuferzellen verwendet werden, um geschädigtes Gewebe zu reparieren und die Lungenfunktion zu verbessern. Da die Bildgebung eine zentrale Rolle bei der Verfolgung der Zellintegration spielt, beschreiben wir hier die durch Magnetpartikelbildgebung gesteuerte in vivo-Verfolgung der Zelltherapie bei Lungenfibrose in einem Mausmodell.

Zusammenfassung

Lungenfibrose (PF) ist eine fortschreitende und chronische Lungenerkrankung, die durch eine wiederholte Schädigung des Alveolarepithels gekennzeichnet ist, die zu einer übermäßigen Ablagerung der extrazellulären Matrix führt, was zu Gewebeverdickung, Narbenbildung und einem gestörten Gasaustausch führt, was zu respiratorischen Funktionsstörungen führt. In den Vereinigten Staaten werden jährlich rund 50.000 neue Fälle gemeldet, wobei die Patienten mit schwerwiegenden Komplikationen wie Pneumothorax, pulmonaler Hypertonie, Atemversagen und einem erhöhten Risiko für Lungenkrebs konfrontiert sind. Die derzeitigen Therapieoptionen sind in ihrer Wirksamkeit begrenzt und zielen in erster Linie darauf ab, das Fortschreiten der Erkrankung zu verlangsamen. Die Zelltherapie hat sich als vielversprechender Eingriff erwiesen, der das Potenzial bietet, geschädigtes Lungengewebe zu regenerieren, Entzündungen zu modulieren und die Lungenfunktion zu verbessern. Die Wirksamkeit dieser Therapien hängt jedoch maßgeblich von der Fähigkeit ab, die Verteilung, das Überleben und die Integration transplantierter Zellen in der Wirtslunge zu überwachen.

Die Magnetpartikelbildgebung (MPI) ist eine neuartige, nicht-invasive, präklinische Bildgebungsmodalität, bei der superparamagnetische Eisenoxid-Nanopartikel (SPIONs) als Tracer verwendet werden. MPI bietet eine hohe Sensitivität, Spezifität und kein Hintergrundsignal, was eine Echtzeit- und quantitative Verfolgung von markierten Zellen in vivo ermöglicht. In dieser Studie untersuchten wir den Einsatz von MPI zur Überwachung von humanen distalen Lungenepithel-Vorläuferzellen, die in die Lunge immungeschwächter Mäuse transplantiert wurden. Die Zellen wurden mit unterschiedlichen SPION-Konzentrationen markiert, um das Signal zu optimieren, was durch Immunfärbung und Eisenquantifizierung bestätigt wurde. Nach der intratrachealen Instillation wurden 2D-MPI-Scans angefertigt, um die räumliche Verteilung der transplantierten Zellen zu verfolgen. Die longitudinale Bildgebung über 2 Wochen ermöglichte die Visualisierung der Zellintegration und -retention im Lungengewebe. Eine erfolgreiche Instillation zeigte MPI-Signale sowohl in der linken als auch in der rechten Lunge, die im Laufe der Zeit abnahmen (~65%). Mäuse wurden anschließend für die histologische Validierung getötet. Diese Studie zeigt den Nutzen von MPI für die nicht-invasive, longitudinale Nachverfolgung der Zelltherapie bei Lungenfibrose und dreht sich um die komplizierten Techniken, die während der Eingriffe eingesetzt werden.

Einleitung

Die Zelltherapie 1,2 bietet regeneratives Potenzial, fördert die Gewebereparatur, reduziert Entzündungen und verbessert die Ergebnisse bei chronischen Krankheiten wie Leukämie und Lymphom 3,4 (hämatopoetische Stammzellen), Osteoarthritis 5,6 (mesenchymale Stammzellen), Typ-1-Diabetes7 (Inselzelltransplantation), Rückenmarksverletzungen 8,9, neurodegenerative Erkrankungen10,11,12 (neurale Stammzellen) und Lungenfibrose 13,14,15,16 (pulmonale Vorläuferzellen). Diese Therapien bieten ein erhebliches Potenzial, obwohl Herausforderungen wie Immunabstoßung und langfristige Wirksamkeit noch bestehen 17,18. Die Lungenfibrose (PF) ist eine chronische und fortschreitende Lungenerkrankung, die durch eine übermäßige Vernarbung des Lungengewebes gekennzeichnet ist, die zu einer Beeinträchtigung der Lungenfunktion führt19. Die Zelltherapie für PF zielt darauf ab, geschädigtes Lungengewebe zu regenerieren und die Fibrose zu reduzieren, indem regenerative Zellen wie mesenchymale Stammzellen oder distale Lungenvorläuferzellen in die betroffene Lunge eingeführtwerden 20. Distale Lungenvorläuferzellen, zu denen Populationen wie Basalzellen, alveoläre Typ-II-Zellen, bronchioalveoläre Stammzellen und andere multipotente Vorläuferzellen gehören, haben die Fähigkeit, die Gewebereparatur zu fördern, Entzündungen zu reduzieren, geschädigtes Lungengewebe möglicherweise zu regenerieren und einen Teil der Lungenschäden rückgängig zu machen, während die normale Lungenfunktion wiederhergestelltwird 21. Mehrere präklinische und klinische Studien im Frühstadium haben gezeigt, dass die Transplantation von Lungenvorläuferzellen in fibrotische Lungen dazu beitragen kann, Alveolarstrukturen zu regenerieren, den Gewebeumbau zu fördern und Entzündungen zu reduzieren 13,22,23. Darüber hinaus können diese Zellen verschiedene Wachstumsfaktoren und Zytokine sezernieren, die das fibrotische Milieu modulieren und die Reparatur weiter fördern. Trotz der ermutigenden Ergebnisse bei der Verbesserung der Lungenfunktion bestehen nach wie vor Herausforderungen bei der Optimierung der Zellabgabe, einschließlich der effizienten Isolierung, Expansion und Integration dieser Zellen in das geschädigte Lungengewebe, der Gewährleistung der langfristigen Sicherheit und der Vermeidung unerwünschter Nebenwirkungen. Weitere Forschung ist erforderlich, um die Protokolle zu verfeinern und die langfristige Sicherheit und Wirksamkeit von Vorläuferzelltherapien bei Lungenfibrose zu bewerten.

Die Transplantation von Zellen in die Lunge bei Lungenfibrose umfasst mehrere Techniken, die jeweils darauf abzielen, die Zellabgabe, das Überleben und die Integration in das geschädigte Lungengewebe zu verbessern. Zu den gängigen Methoden gehören die intravenöse Injektion24,25, die endobronchiale Verabreichung26,27 und die intratracheale Instillation 28,29,30,31, jeweils mit spezifischen Vorteilen und Herausforderungen. Die intravenöse Verabreichung von Stammzellen wird durch suboptimales pulmonales Homing, Sequestrierung in Off-Target-Organen, eingeschränkte Lebensfähigkeit nach der Infusion und das Risiko immunogener Reaktionen behindert. Die endobronchiale Verabreichung ist zwar eher lokalisiert, wird aber durch heterogene Zellverteilung, mögliche Atemwegsverschlüsse, Entzündungsreaktionen und verfahrenstechnische Herausforderungen innerhalb der fibrotischen Lungenarchitektur eingeschränkt. In ähnlicher Weise kann die intratracheale Instillation, obwohl sie eine direkte pulmonale Deposition ermöglicht, zu einer inkonsistenten Zelldispersion, einer unzureichenden distalen Lungenpenetration, einer lokalisierten Reizung und einer Variabilität der Dosisuniformität über die Lungenkompartimente hinweg führen. Obwohl alle diese Techniken darauf abzielen, das Überleben, die Integration und die Wirksamkeit der Zellen bei der Regeneration von Lungengewebe zu verbessern, hängt die Wahl der optimalen Technik von Faktoren wie der Art der zu transplantierenden Zellen, dem Stadium der Fibrose und dem allgemeinen Gesundheitszustand des Patienten ab.

Trotz ihrer Herausforderungen bleibt die intratracheale Instillation eine der am häufigsten verwendeten Methoden, um Zellen direkt in die Lunge zu bringen, insbesondere im Zusammenhang mit Lungenfibrose. Bei dieser Technik werden Zellen über einen Katheter, der in die Luftröhre eingeführt wird, in die Lunge eingeführt32. Die Zellen werden dann im Alveolarraum abgelagert, wo sie möglicherweise das geschädigte Lungengewebe reparieren können. Diese Methode ist minimalinvasiv und im Vergleich zu anderen Verabreichungsansätzen wie der ex vivo Lungenperfusion relativ einfach durchzuführen. Da die Zellen direkt in der Lunge abgelagert werden, können die Chancen auf eine effektive Integration und Reparatur verbessert werden. Im Gegensatz zur intravenösen Injektion vermeidet die intratracheale Instillation die systemische Durchblutung und verringert das Risiko, dass Zellen in anderen Organen wie der Leber oder der Milz eingeschlossen werden, was zu einer gezielteren therapeutischen Wirkung in der Lunge führt. Trotz dieser Vorteile steht die Methode immer noch vor Herausforderungen in Bezug auf die suboptimale Zellverteilung und -retention sowie das Überleben in der Lunge, was die therapeutische Wirksamkeit einschränken kann. Die laufende Forschung arbeitet daran, diesen Ansatz für effektivere klinische Ergebnisse zu verfeinern. Forscher können feststellen, ob die intratracheale Instillation für ihre Anwendungen geeignet ist, indem sie mehrere Faktoren bewerten. Dazu gehören die Art der Zellen, die abgegeben werden, ihre Fähigkeit, zu überleben und sich in das Lungengewebe zu integrieren, sowie die Schwere des Krankheitsmodells (d. h. Lungenfibrose).

Die Bildgebung ist ein unverzichtbares Instrument zur Verfolgung von Zellen, zur Bewertung ihrer Lebensfähigkeit, Verteilung und Wirkung, zur Verbesserung der Zelltherapieüberwachung und zur Optimierung von Behandlungsstrategien33. Die Forscher haben die Verabreichungseffizienz durch Bildgebung und Analysen nach der Entbindung bewertet, um die Zellverteilung und -retention zu verfolgen. Verschiedene Techniken wie Fluoreszenz, Magnetresonanztomographie (MRT), Computertomographie (CT), Positronen-Emissions-Tomographie (PET), Einzelphotonen-Emissions-Computertomographie (SPECT) und Ultraschall wurden verwendet, um markierte Stammzellen für Lungenfibrose zu verfolgen. Sie sind jedoch mit Einschränkungen wie geringer Tiefeneindringtiefe (Fluoreszenz), schlechter Empfindlichkeit (MRT), Strahlenbelastung (CT, PET, SPECT) und geringer Auflösung (Ultraschall) konfrontiert34. Obwohl die Optimierung des Kontrasts, der Auflösung und der Biokompatibilität der Bildgebung bis zu einem gewissen Grad dazu beitragen kann, diese Herausforderungen zu meistern, kann sich die Erforschung neuerer Bildgebungsverfahren auch als unerlässlich für eine genaue Stammzellverfolgung in der Lunge erweisen. In den letzten Jahren hat sich das Magnetic Particle Imaging (MPI) zu einer vielversprechenden, strahlungsfreien Bildgebungsmodalität entwickelt, die eine hochempfindliche, quantitative Echtzeit-Bildgebung mit hohem Kontrast ohne Hintergrundinterferenzen bietet.

Das MPI verwendet superparamagnetische Eisenoxid-Nanopartikel (SPIONs) zur direkten Visualisierung, und sein Funktionsprinzip basiert auf der nichtlinearen Magnetisierungsreaktion dieser SPIONs, wenn sie einem zeitlich veränderlichen Magnetfeld ausgesetzt werden35,36. Elektromagnete werden verwendet, um einen feldfreien Bereich (FFR) zu erzeugen, in dem nur Teilchen innerhalb dieses Bereichs eine nichtlineare Magnetisierung aufweisen und ein Signal erzeugen, wenn sie durch ein oszillierendes Magnetfeld angeregt werden. Auf der anderen Seite ist die Magnetisierung von Teilchen außerhalb dieses FFR gesättigt und sie nehmen nicht an der Signalerzeugung teil. Durch die systematische Verschiebung des FFR über das gesamte Abbildungsvolumen erstellt das MPI räumliche Karten der Nanopartikelverteilung und der nachfolgenden Bilder. MPI bietet mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen Bildgebungsmodalitäten 37,38. Im Gegensatz zu MRT oder CT liefert MPI nur ein Signal vom Tracer, was zu keinem Hintergrundrauschen und außergewöhnlichem Kontrast führt. Es bietet Echtzeit-Bildgebung mit hoher zeitlicher Auflösung und eignet sich daher ideal für die Verfolgung dynamischer Prozesse wie Zellmigration oder Perfusion. Darüber hinaus ist MPI hochempfindlich und ermöglicht die Detektion kleiner Mengen von SPIONs ohne ionisierende Strahlung, im Gegensatz zu PET oder CT. Darüber hinaus zeigt es eine hervorragende lineare Quantifizierung, die eine genaue Bestimmung der Tracerkonzentration ermöglicht. Insgesamt kombiniert MPI die Stärken der Sensitivität, Sicherheit und Quantifizierung, was es zu einem leistungsstarken Werkzeug für die biomedizinische Bildgebung macht. MPI ist vielversprechend für die Stammzellverfolgung in der Lunge und ermöglicht eine präzise Überwachung der Zellmigration, -retention und der therapeutischen Wirkung. Es bietet einen hervorragenden Kontrast ohne Interferenz mit Gewebesignalen und ermöglicht dadurch eine präzise Lokalisierung von markierten Stammzellen 39,40,41,42. In den folgenden Abschnitten werden die für diese Studien durchgeführten Protokolle beschrieben, die die Verwendung der intratrachealen Instillation zur Abgabe der markierten Zellen an die Lunge der Maus und die Bestätigung über MPI demonstrieren.

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Protokoll

Alle Verfahren mit tierischen Probanden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Michigan State University genehmigt und mit menschlichen Probanden wurden von Corewell Health IRB Nr. 2017-198 genehmigt. Alle Patienten gaben vor der Teilnahme an der Studie eine schriftliche Einverständniserklärung ab.

Explantatproben der menschlichen Lunge von Patienten mit idiopathischer Lungenfibrose (IPF), die sich einer Lungentransplantation unterzogen, wurden von Corewell Health gesammelt. Vor dem Transplantationsverfahren erfüllten alle Patienten die diagnostischen Kriterien für idiopathische Lungenfibrose (IPF), die durch Hypoxämie, Dyspnoe und reduziertes Lungenvolumen gekennzeichnet war43. Die pathologische Analyse von Gewebe, das aus dem distalen Ende des Lungenlappens entnommen wurde, bestätigte das Vorhandensein von Fibrose.

Männliche NOD/SCID-Mäuse wurden im Alter von 8 Wochen gekauft und 1 Woche lang akklimatisiert und dann bis 12 Wochen vor dem Eingriff gealtert.

1. Isolierung und Expansion menschlicher Epithelzellen der Atemwege

  1. Legen Sie die explantierte Lungenprobe auf Eis, um die Zellintegrität während der Dissektion zu erhalten. Identifizieren Sie den Bronchus/die großen Atemwege, die in der Probe vorhanden sind; Die kleinen Atemwege befinden sich in den distalen Teilen der Lungenprobe, die am weitesten von den großen Atemwegen entfernt sind. Schneiden Sie mit sterilisierten Instrumenten den distalen Teil der Lungenprobe heraus und verarbeiten Sie ihn in kleinere Portionen, um die Verdauung des Gewebes zu unterstützen. Spülen Sie die Probe in Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS), um überschüssiges Blut und Flüssigkeit zu entfernen, und verdauen Sie dann das explantierte Lungengewebe, das die kleinen Atemwege enthält, in einem Puffer, der aus Protease aus Streptomyces griseus, 1x Penicillin/Streptomycin, DNase I und 1x Gentamicin in einem 50-ml-Röhrchen besteht. Legen Sie das Gewebe in ein 37 °C heißes Wasserbad, um es ca. 4 h lang zu schaukeln, oder bis das Gewebe ausreichend verdaut ist.
  2. Den Inhalt des 50-ml-Röhrchens durch ein steriles 100-μm-Zellsieb leiten. Spülen Sie das Tuch 3x mit DPBS aus und geben Sie die Wäschen durch das Sieb. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 400 × g für 5 Minuten, entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml Kulturmedium, indem Sie die Zellsuspension 50x mit einer auf 500 μl eingestellten Pipette pipettieren.
  3. Die Zellsuspension wird in einen 75 cm2-Kulturkolben gegeben, der das Epithelwachstumsmedium der Atemwege enthält. Die Zellen werden ca. 2 Wochen lang bei 37 °C, 5 % CO2 kultiviert .

2. Markierung von Epithelzellen der Atemwege mit Nanopartikeln (Eisenoxid-Tracer)

  1. Wenn Epithelkulturen zu 80 % konfluent sind, markieren Sie die Zellen mit Eisenoxid-Tracer in einer Endkonzentration von 250 μg/ml. Das entsprechende Volumen Eisenoxid-Tracer wird in 10 ml Kulturmedium pro Flasche Epithelzellen gegeben und 48 Stunden lang inkubiert.
    HINWEIS: Unterschiedliche Konzentrationen von Eisenoxid-Tracer (50, 100, 200 und 250 μg/ml) wurden für die Zellmarkierung und anschließend für ihre 2D-MPI-Scans ausgewertet (Abbildung 1A). Die Konzentration von 250 μg/ml zusammen mit 50.000 Zellen für die Transplantation wurde für diese Studie festgelegt.
  2. Waschen Sie die Zellen nach 48 h 3x mit DPBS, um überschüssige Nanopartikel zu entfernen.
  3. Die Zellen werden mit einem Reagenz zur Zellablösung abgetrennt und 15 Minuten lang bei 37 °C inkubiert, oder bis sich die Zellen von der Oberfläche des Kolbens zu heben beginnen.
  4. Sammeln Sie die Zellen in einem 50-ml-Röhrchen mit 1 ml fötalem Rinderserum. Spülen Sie den Kolben 3x mit 5 mL DPBS und geben Sie die Waschmittel in das 50-ml-Röhrchen mit den Zellen.
  5. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 400 × g für 5 min. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml Kulturmedium, indem Sie die Zellsuspension 50x mit einer auf 500 μl eingestellten Pipette pipettieren.
  6. Verwenden Sie ein Hämozytometer, um die Zellkonzentration zu bestimmen und das Volumen der Zellsuspension zu bestimmen, das für die In-vivo-Transplantation erforderlich ist.
  7. Aliquotieren Sie 100 μl der Zellsuspension und fixieren Sie sie in 4 % Paraformaldehyd.

3. In-vitro-Immunfärbung und Mikroskopie

  1. Laden Sie das 100 μl aliquot der Zellsuspension in eine Cytospin-Kartusche mit einem Objektträger und einem Filter und schleudern Sie es 5 Minuten lang bei 1.000 U/min.
  2. Umreißen Sie die Zellen auf dem Objektträger mit einem hydrophoben Stift.
  3. Waschen Sie die Objektträger 2 x 15 min lang mit DPBS.
  4. Permeabilisieren Sie die Zellen auf dem Objektträger, indem Sie mit 0,1 % Triton X-100 in DPBS für 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
  5. Waschen Sie die Zellen 2 x 2 min mit DPBS.
  6. Blockieren Sie die Objektträger 2 Stunden lang mit 5 % Rinderserumalbumin (BSA)/1 % Ziegenserum in DPBS.
  7. Inkubieren Sie die Objektträger in Primärantikörpern (Anti-Dextran) in 2,5 % BSA/0,5 % Ziegenserum in DPBS über Nacht bei 4 °C.
  8. Entfernen Sie den primären Antikörper und waschen Sie die Objektträger 3 x 5 min in 1x Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit Tween 20 (TBST).
  9. Inkubieren Sie die Objektträger mit 1:1.000 Sekundärantikörpern in 2,5 % BSA/0,5 % Ziegenserum in DPBS für 1 h bei Raumtemperatur im Dunkeln.
  10. Waschen Sie die Objektträger 3 x 5 min mit 1x TBST.
  11. Geben Sie ein nukleares Färbemittel, 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI), in einer Konzentration von 1:1.000 DPBS in den Objektträger und lassen Sie ihn 5 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren.
  12. Waschen Sie die Objektträger 2 x 5 min mit 1x TBST. Entfernen Sie überschüssiges 1x TBST von der Folie.
  13. Fügen Sie Montagemedium mit DAPI hinzu und legen Sie ein Glasdeckglas über den Objektträger, wobei Sie darauf achten müssen, dass keine Luftblasen entstehen.
  14. Nachdem die Folie ausgehärtet ist, versiegeln Sie die Ränder des Deckglases mit einem klaren Nagellack.
  15. Bilden Sie die Objektträger auf einem konfokalen Mikroskop ab.

4. Zelltransplantation mittels intratrachealer Instillation

  1. Präparat
    1. Wiegen Sie die Maus, um die für jede Maus erforderliche Dosis von Bleomycin (BLM) zu berechnen.
    2. Bereiten Sie in einem 1,7-ml-Mikrozentrifugenröhrchen die gewünschte BLM-Lösung (verdünnt in sterilisierter Kochsalzlösung) in einem Volumen von nicht mehr als 50 μl vor.
      HINWEIS: Die Wirkstoffkonzentration variiert je nach den Versuchszielen. Für dieses Verfahren wurde BLM mit 0,6 U/kg verwendet.
    3. Laden Sie die BLM-Lösung in eine Pipette. Füllen Sie zusätzlich eine Spritze mit 200 μl Luft vor, um sicherzustellen, dass das gesamte Flüssigkeitsvolumen in die Luftröhre ausgestoßen wird.
      HINWEIS: Nach 72 Stunden BLM-Behandlung wird die markierte Zellsuspension auf ähnliche Weise verabreicht.
    4. Verwenden Sie die in Schritt 2.6 erhaltene Zellzahl, um das Volumen der Zellsuspension zu berechnen, die 50.000 Zellen enthält, die verabreicht werden soll.
    5. Betäuben Sie die Maus, indem Sie sie in eine Induktionsbox legen, die mit der Anästhesieeinheit verbunden ist und Isofluran (2,5-3%) liefert, bis sie sediert ist.
      HINWEIS: Die Mäuse werden während des gesamten Eingriffs zweimal anästhesiert: (1) am Tag der BLM-Verabreichung und (2) am Tag der intratrachealen Instillation der Zellen, der 72 Stunden nach der BLM-Dosis liegt.
    6. Richten Sie das Faserlicht-Intubationskit wie in Abbildung 2A gezeigt ein, wobei die optische Fasersonde durch das Laryngoskop und den Katheter geführt wird.
      HINWEIS: Das beleuchtete Ende der Faser sollte knapp außerhalb (1-2 mm) des Katheterschlauchs platziert werden.
  2. Intratracheale Instillation
    1. Bestätigen Sie die Anästhesie, indem Sie den Pedalreflex überprüfen, indem Sie den Zeh in eines der Hinterbeine einklemmen. Sobald eine adäquate Anästhesie bestätigt ist, hängen Sie die Maus an ihren Schneidezähnen in Rückenlage auf einem abgewinkelten Nagetier-Intubationsständer auf (Abbildung 2B-D).
    2. Fassen Sie die Zunge vorsichtig mit einer stumpfen Pinzette und positionieren Sie sie in einer Aufwärts- und Linksbewegung, um eine angemessene Visualisierung des Kehlkopfes zu erhalten.
    3. Schalten Sie die faseroptische Sonde ein und dringen Sie in den Mund ein, um sich der Luftröhre zu nähern. Nutzen Sie die Lupe des Laryngoskops für eine verbesserte Visualisierung des Kehlkopfes und lokalisieren Sie die Stimmbänder an der Trachealöffnung.
    4. Führen Sie den Katheter in die Trachealöffnung ein und lösen Sie das Laryngoskop sehr vorsichtig und ziehen Sie es heraus. Geben Sie ein winziges Tröpfchen Kochsalzlösung (20 μl) an das obere Ende des Katheters.
      HINWEIS: Der Flüssigkeitsstand bewegt sich auf und ab, angepasst an die Atemfrequenz der Maus. Dies bestätigt die Platzierung des Katheters in der Luftröhre und nicht versehentlich in der Speiseröhre.
    5. Setzen Sie eine Spritze mit vorgeladenen 200 μl Luft auf und schieben Sie das Tröpfchen hinein. Legen Sie die Zellsuspension (≤50 μl) in den Katheter und träufeln Sie sie wie zuvor mit der luftgeladenen Spritze.
    6. Um zu verhindern, dass die eingeträufelte Flüssigkeit aus der Luftröhre entweicht, lassen Sie den Katheter 5-7 s lang an Ort und Stelle. Ziehen Sie dann den Katheter vorsichtig heraus.
    7. Halten Sie die Maus mindestens 30 s lang in der gleichen Position auf dem Intubationsständer.
    8. Entfernen Sie die Maus und legen Sie sie in einen Bergekäfig, der auf einem Heizkissen steht. Überwachen, bis Sie sich vollständig von der Narkose erholt haben.

5. Bildgebung von Magnetpartikeln

  1. Betäuben Sie die Maus, indem Sie sie in eine Induktionsbox legen, die mit der Anästhesieeinheit verbunden ist und Isofluran (2-2,5%) liefert, bis sie sediert ist.
  2. Richten Sie das Mausbett in einem MPI-Scanner ein, wobei die Anästhesieleitung durch entsprechende Anschlüsse unter dem Bett verläuft.
  3. Während die Maus sediert wird, bereiten Sie den MPI-Scanner für die Bildgebung vor. Starten Sie die verknüpfte Software und definieren Sie einen Ordnernamen im Projekt und den Scan in der Namensdomäne Prüfung zur Identifizierung und stellen Sie die Scanparameter entsprechend den Anforderungen ein. Um dieses Verfahren auszuführen, verwenden Sie die folgenden Scan-Parameter: Scan-Typ: 2D-Scan; Scan-Modus: Standard; Sendekanäle: Mehrkanal (isotrop); Durchschnitte pro Projektion: 2.
  4. Überprüfen Sie die Anästhesie, wie in Schritt 4.2.1 beschrieben. Platzieren Sie die Maus sicher auf dem MPI-Bett, wie in Abbildung 2E dargestellt.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Schnauze richtig mit dem eingebauten Nasenkonus des Bettes ausgerichtet ist, um die Anästhesie während des Scans ordnungsgemäß aufrechtzuerhalten.
    VORSICHT: Eine unzureichende Anästhesie während des Scans kann dazu führen, dass die Maus während des Scans aufwacht.
  5. Nachdem Sie die Maus in den Scanner eingesetzt haben, schieben Sie das Bett in die Bohrung und klicken Sie auf Scan starten.
  6. Nachdem der Scan abgeschlossen ist, nehmen Sie die Maus aus dem MPI-Bett und legen Sie sie in einen Auffangkäfig, der auf einem Heizkissen platziert ist. Überwachen, bis Sie sich vollständig von der Narkose erholt haben.
  7. Analysieren Sie die Bilder mit Hilfe einer Bildanalysesoftware.

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Ergebnisse

Die Pilotstudie wurde mit sechs Mäusen durchgeführt. Von diesen starb nur eine Maus vor Abschluss der Studie, am Tag 10. Die 2D-MPI-Signalintensitäten für verschiedene Markierungskonzentrationen wurden in Abhängigkeit von der Anzahl der Zellen bewertet (Abbildung 1A). Es wurde beobachtet, dass die Signalintensität direkt proportional zur Konzentration des Eisenoxid-Tracers war. Daher wurde die Konzentration von 250 μg/mL als optimale Markierungskonzentration...

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Diskussion

Die intratracheale Instillation bei Mäusen ist eine präzise Technik, um Substanzen direkt in die Lunge zu bringen. Während mehrerer kritischer Schritte während dieses Verfahrens ist besondere Aufmerksamkeit erforderlich. Beginnend mit der Sicherstellung der richtigen Anästhesietiefe, um Beschwerden und Bewegungen zu vermeiden, und der Positionierung der Maus in Rückenlage mit ausgefahrenem Hals, um die Atemwege für einen freien Zugang zur Trachealöffnung auszurichten. Die Verwendung eine...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Die Finanzierung dieser Studie erfolgte zum Teil durch den Zuschuss von R01HL153165-01A1 an X.P.L. und R21AI159928-01 an P.W.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1.7 mL MikrozentrifugenrohrDOT ScientificRN1700-GMTFür Zellsammlung und die Herstellung von BLM-Verdünnungen
Anti-Dextran-AntikörperSTEMCELL Technologies60026Primärantikörper
BD Luer-Lok SpritzeBecton, Dickinson309628Für Luftinjektionen während der intratrachealen Instillation
Cytospin 3Thermo Shandon74010121GB
DNase IMillipore-Sigma10104159001
Dulbecco's phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS +/-) Gibco14190250
Fetal Bovine Serum ThermoFisher ScientificA5670701
Gentamicin Gibco15750060
Ziegen-Anti-Maus-IgG (H+L) Cross-adsorbiertes Sekundärantikörper, Alexa Fluor™ 568ThermoFisher ScientificA-11004Sekundärantikörper
Ziegen-SerumMillipore-SigmaG9023
IsofluranCovetrus11695067772Gasanästhesie
Isofluran-VerdampferSOMNI ScientificVS6002Anästhesieapparat
MomentumMagnetic Insight IncPräklinischer Magnetischer Partikel-Bildgebungs- (MPI) Scanner
Maus-Intubations-KitOHANOhan-201Komplettes Intubations-Kit mit allen erforderlichen Zubehörteilen
NOD/SCID-MäuseJackson LaboratoryRRID:IMSR_JAX:001303Immungeschwächtes Mausmodell
Penicillin/Streptomycin Gibco15140122
PneumaCult-Ex Plus Medium STEMCELL Technologies5040
ProLong Diamond Antifade Mountant mit DAPI InvitrogenP36962Einbettungsmittel für immungefärbte Objektträger
Protease aus Streptomyces griseus Millipore-SigmaP5147
Chirurgisches KitBlutende Zange zur Fixierung der Zunge der Maus
Tris-gepufferte Kochsalzlösung mit Tween20 (TBST)ThermoFisher Scientific28360
TrypLE Express Enzym ThermoFisher Scientific12604021
VivoTrax PlusMagnetic InsightMIVTP01Eisenoxid-Tracer für die Zellmarkierung in vitro und nachfolgende MPI

Referenzen

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