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Methodenartikel

Ein ex vivo Explantatmodell zur Untersuchung von glialen Wechselwirkungen in der Netzhaut der Maus

1.9K Ansichten

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DOI:

10.3791/68482

⸱

15. Juli 2025

 ,  , 
1Department of Ophthalmology, Schepens Eye Research Institute of Massachusetts Eye and Ear, Harvard Medical School

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier stellen wir eine detaillierte Methodik zur Isolierung der Netzhaut vom Mausauge für erweiterte ex vivo-Experimente zur Verfügung. Dieses Protokoll unterstreicht die Zugänglichkeit dieses technisch anspruchsvollen Ansatzes für Forscher, die die Forschungsmöglichkeiten nutzen möchten, die sich durch die In-situ-Haltung von retinalen Gliazellen in lebendem Gewebe bieten.

Zusammenfassung

Die Rolle der Gliazellen beim Glaukom ist ein zunehmend prominentes Forschungsthema, aber es ist noch viel darüber unbekannt, wie Populationen dieser Stützzellen - nämlich Astrozyten und Mikroglia - das Überleben der retinalen Ganglienzellen beeinflussen. Während In-vivo - und In-vitro-Modelle ein gewisses Maß an Einsicht bieten, weisen beide Ansätze erhebliche Einschränkungen auf, wie z. B. den Einfluss der peripheren Immunantwort bei ersteren und Veränderungen der physiologischen Funktion, die durch Zellisolierung und -kultur induziert werden, bei letzteren. Um diese Störfaktoren zu minimieren, haben wir ein ex vivo retinales Explantatsystem entwickelt, in dem Astrozyten, Mikroglia und andere retinale Zelltypen für einen Zeitraum von mindestens 3 Tagen in situ gehalten werden können, was eine gezielte Untersuchung mit einem höheren Durchsatz ermöglicht, als dies mit in vivo Modellen typischerweise möglich ist. Entscheidend ist, dass dieser Ansatz sehr gut für Methoden geeignet ist, die bei einem lebenden Tier eine Herausforderung oder nicht durchführbar wären, aber dennoch mit gängigen nachgelagerten Assays von intaktem Nervengewebe kompatibel bleibt. Hier präsentieren wir ein Protokoll, das für die Isolierung und Kultivierung intakter retinaler Explantate geeignet ist, zusammen mit repräsentativen Ergebnissen der Immunfluoreszenzmikroskopie, die die Veränderungen von Gliazellen und retinalen Ganglienzellen in der ex vivo Netzhaut dokumentieren.

Einleitung

Die lichtempfindliche Netzhaut, eine Erweiterung des Zentralnervensystems (ZNS), die sich im hinteren Teil des Auges befindet, ist für das Sehvermögen unerlässlich, aber sowohl anfällig für akute Verletzungen als auch für chronische Krankheiten. Wie bei anderen ZNS-Regionen werden Neuronen in der adulten Netzhaut nicht ersetzt, wenn sie verloren gehen, und die retinalen Ganglienzellen (RGCs), die visuelle Informationen aggregieren und an das Gehirn weiterleiten, sind besonders anfällig für Funktionsstörungen und Tod beim Glaukom, was zu einem irreversiblen Sehverlust führt 1,2. Das Glaukom ist weltweit eine der Hauptursachen für Erblindung3, doch trotz der verheerenden Auswirkungen auf die Betroffenen und der Gesamtkosten für die Gesellschaft ist noch viel darüber unbekannt, wie die frühen Stadien der Krankheit zum RGC-Verlust beitragen4. Die Rolle der Gliazellen ist ein wichtiges Forschungsgebiet in der Pathophysiologie des Glaukoms, da diese nicht-neuronalen Stützzellen für das Überleben von RGCs unerlässlich sind5, aber phänotypische Veränderungen in der Krankheit erfahren, die das vorteilhafte Verhalten verringern können6 oder sogar die Annahme schädlicher Phänotypen vorantreibenkönnen 7. Obwohl der Begriff Glia eine Reihe von spezialisierten Zelltypen im gesamten ZNS umfasst8, können diese grob in zwei Kategorien unterteilt werden - solche, die eine Entwicklungslinie mit Neuronen teilen und trophische, energetische und strukturelle Unterstützung bieten9, und solche mit myeloischem Ursprung, die spezialisierte Immunüberwachungs- und Reaktionsaufgaben ausführen10. Vertreter beider Kategorien - Astrozyten und Müller-Zellen in ersterem, Mikroglia in letzterem - bevölkern die Netzhaut5 und durchlaufen beim Glaukom große Veränderungen, die erhebliche Fragen über ihre Rolle beim Fortschreiten der Krankheit und beim Überleben von RGCs aufwerfen11.

Die Bemühungen, diese Fragen zu beantworten, werden zum Teil durch intrinsische Eigenschaften der retinalen Gliazellen behindert, die sowohl für die In-vivo- als auch für die In-vitro-Untersuchung eine Herausforderung darstellen. Im Gegensatz zu Neuronen sind sie elektrisch relativ leise, so dass Ansätze wie ERG, die eine funktionelle Bewertung von RGCs und Photorezeptoren in vivo ermöglichen, ungeeignet sind, um Veränderungen der Gliafunktion und des Gliaverhaltens zu untersuchen. Und obwohl induzierbare12- und spontane13-Modelle des Glaukoms verfügbar sind, ist noch viel unbekannt über Veränderungen der Gliazellen zu den frühesten Zeitpunkten der Krankheit, die einem nachweisbaren RGC-Verlust vorausgehen können, ein Problem, das durch die unterschiedliche Penetranz des Krankheitszustands in vielen dieser Modelle noch verschärft wird. Darüber hinaus deuten Hinweise sowohl aus klinischen als auch aus experimentellen Glaukomen darauf hin, dass periphere Immunzellen Beiträge leisten, die schwer von denen der Mikroglia zu unterscheiden sind, trotz Indikatoren, dass sie in unterschiedliche "Richtungen" wirken können, um das Fortschreiten der Krankheit zu beeinflussen14,15.

Auch bei der Untersuchung von retinalen Gliazellen in vitro gibt es zahlreiche Herausforderungen. Obwohl die Isolierung und Kultur von Astrozyten16,17 und Mikroglia18 aus dem Gehirn gut etabliert ist, zeigen neuere Arbeiten eine umfangreiche gliale Heterogenität zwischen ZNS-Regionen, insbesondere bei Astrozyten19, und Phänotypen, die in einer Region vorhanden sind, sind möglicherweise nicht in Gliazellen aus einer anderen, wie z. B. der Netzhaut, vorhanden20,21. Die direkte Isolierung von retinalen Astrozyten und Mikroglia für die Studie ist jedoch eine besondere Herausforderung, da beide Zelltypen relativ selten sind - jeder macht weniger als 1% der geschätzten 6,5 Millionen Zellen in der Netzhaut der Maus aus 22,23,24. Darüber hinaus sind Gliazellen im Gegensatz zu Neuronen hochplastisch und passen sich schnell an dramatische Veränderungen in ihrer Umgebung an 16,18,25; Infolgedessen können Verhaltensweisen, die in diesen Zellen in vitro beobachtet werden, spezifische Anpassungen an ihre neue Umgebung darstellen und nicht phänotypische Muster, die typischerweise bei Gesundheit oder Krankheit zu beobachten sind. Angesichts der Einschränkungen sowohl bei In-vivo-Experimenten als auch bei der Primärkultur von retinalen Gliazellen haben wir nach einem Zwischenansatz gesucht - retinalen Explantaten -, bei dem Glia, RGCs und andere Elemente der Netzhaut in situ in einem ex vivo-Kontext konserviert werden. Im Vergleich zu In-vivo-Modellen bietet dieser Ansatz einen verkürzten experimentellen Zeitverlauf26, ermöglicht eine direkte experimentelle Manipulation von retinalen Gliazellen27 und vermeidet den potenziell verwirrenden Einfluss der peripheren Immunzellinfiltration14. Umgekehrt kommt es im Gegensatz zur primären Zellkultur zu einer minimalen Störung der extrazellulären Umgebung, und die Gliazellen bleiben intakt und morphologisch erkennbar, wodurch die Herausforderungen vermieden werden, die mit dem wesentlichen Nachwachsen und der Identifizierung dieser Zellen nach enzymatischer und mechanischer Zerstörung verbunden sind16,25.

Im Vergleich zu den zuvor beschriebenen Methoden der retinalen Explantation liegt der Schwerpunkt bei diesem Ansatz auf der technischen Zuverlässigkeit, der Reproduzierbarkeit und der Maximierung der "Benutzerfreundlichkeit" des Ansatzes, um die Zugänglichkeit zu verbessern26,28. In persönlichen Gesprächen mit anderen Forschern stellten wir fest, dass die technischen Herausforderungen, die mit der Handhabung der lebenden Netzhaut verbunden sind, eine große Hürde für viele darstellen, die Explantate verwenden möchten, während die Pflege der explantierten Netzhaut in Kultur für Gruppen mit geeigneten Zellkultureinrichtungen relativ einfach war. Daher enthält dieses Protokoll eine Reihe von Innovationen, die die mit der Netzhautisolierung verbundene Lernkurve verkürzen und es den Forschern ermöglichen sollen, schneller mit der Sammlung experimenteller Daten zu beginnen. Obwohl wir besonderen Wert auf das Potenzial dieses Explantatmodells für die Untersuchung des Verhaltens retinaler Gliazellen gelegt und es hauptsächlich mit Immunfluoreszenzmikroskopie charakterisiert haben, sind auch andere retinale Zelltypen und Strukturen weitgehend konserviert, und die explantierten Netzhäute bleiben für eine Vielzahl zusätzlicher Untersuchungstechniken zugänglich.

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Protokoll

Alle Verfahren mit Tieren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Schepens Eye Research Institute genehmigt (Protokoll # 2022N000030, genehmigt am 3.4.2025). Die Tiere wurden in Übereinstimmung mit der Erklärung der Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) für die Verwendung von Tieren in der Augen- und Sehforschung behandelt.

HINWEIS: Abbildung 1 zeigt die wichtigsten Schritte bei der Isolierung von lebender Netzhaut aus dem enukleierten Mausauge.

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Abbildung 1: Eine schematische Darstellung der wichtigsten Schritte bei der Isolierung von lebender Netzhaut aus dem enukleierten Mausauge. Die entsprechenden Schrittnummern der Schlüsselschritte sind in Kreisen angegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

1. Vorbereitung

  1. Desinfizieren Sie eine 1-ml-Pipette und eine abgewinkelte Pinzette und legen Sie sie in die Biosicherheitswerkbank. Diese werden in Abschnitt 3 des Protokolls benötigt.
  2. Modifizieren Sie eine Transferpipette, indem Sie senkrecht über den Schaft etwa 2 cm unterhalb des Reservoirs schneiden, wo die Bohrung am breitesten ist, um die Pipette zu verkürzen und die Öffnung zu verbreitern. Achten Sie auf einen sauberen Schnitt, an dem sich die Netzhaut nicht verfängt.
    HINWEIS: Dieses Werkzeug kann zur Wiederverwendung aufbewahrt werden, wenn es gereinigt und zwischen den Anwendungen mit sterilem Wasser gespült wird.
  3. Bereiten Sie 50 ml Explantatmedien aseptisch in einer Biosicherheitswerkbank vor, indem Sie 47,5 ml Neurobasalmedien mit 500 μl N-2-Supplement, 1 mL B-27-Supplement, 500 μl Glutamax und 500 μl Penicillin-Streptomycin-Mix ergänzen (Endkonzentration von 100 U/ml Penicillin und 100 mg/ml Streptomycin).
    HINWEIS: Bereiten Sie frische Explantatmedien für jede Serie von Isolierungen vor. Überschüssige Medien können bis zu 1 Woche bei 4 °C gehalten und bei Bedarf für den Medienwechsel verwendet werden. Nach dem Öffnen unbenutztes Neurobasalmedium nach 1 Monat ersetzen. N-2 und B-27 sollten als Einmal-Aliquote eingefroren aufbewahrt werden, um Gefrier-Tau-Zyklen zu vermeiden.
  4. Bereiten Sie in einer Biosicherheitswerkbank die Kulturplatte(n) aseptisch vor, indem Sie in jede zu verwendende Vertiefung einen Einsatz geben und dabei über die "Zinken" behandeln, die aus dem Einsatzrand austreten, um zu vermeiden, dass Oberflächen berührt werden, die mit Kulturmedien in Kontakt kommen.
    1. Geben Sie 1 ml Explantatmedium in den Einsatz, gefolgt von weiteren 3 mL, die in die Vertiefung selbst gegeben werden. Geben Sie 2-3 ml steriles Wasser in unbenutzte Vertiefungen, um die Verdunstung zu kontrollieren.
    2. Platte(n) bei 37 °C mit 5 % CO2 in den Inkubator überführen, um sie ca. 30 min vor der Gewebeisolierung auszugleichen.
  5. Bereiten Sie Filterquadrate vor, um ein Substrat für die Gewebestabilisierung und den Transfer zu schaffen. Entnehmen Sie den Filter aus einem Filtrationsset mit Flaschenaufsatz, indem Sie mit einem Rasiermesser oder Skalpell die Peripherie des Materials umschneiden. Achten Sie darauf, Verletzungen oder Beschädigungen des Filters durch Falten oder Reißen zu vermeiden.
    HINWEIS: Das Entfernen des durchsichtigen Kunststoffbehälters mit einem robusten Rasierer, um den formbareren, undurchsichtigen Kunststoff an der Stelle, an der der Gewindeadapter auf den Behälter trifft, zu schneiden, vereinfacht den Extraktionsvorgang, aber es ist zusätzliche Vorsicht geboten, um Verletzungen zu vermeiden.
    1. Nachdem sich der Filter durch Schneiden gelöst hat, verwenden Sie eine Pinzette, um ihn herauszuziehen. Beachten Sie die Ausrichtung des Filters während und nach der Extraktion; Die matte Seite (die dem Reservoir zugewandt ist) sollte aufrecht stehen, um die Netzhaut in Schritt 2.16 für den Transfer zu montieren.
    2. Schneiden Sie den Filter in kleine Quadrate von ca. 7 mm × 7 mm; Für jedes Netzhautexplantat wird ein Quadrat benötigt. Die Quadrate in sterilem Wasser in einer 100 mm Petrischale für mindestens 20 Minuten einweichen.
      HINWEIS: Filterquadrate können vor der Verwendung bis zu 1 Woche in sterilem Wasser eingetaucht bleiben. Aufgrund der Tendenz der Filterquadrate, vor dem Eintauchen eine hohe statische Aufladung zu entwickeln, sollten Sie nur so viele Quadrate wie nötig vorbereiten. Das restliche Trockenfiltermaterial kann für die spätere Verwendung auf unbestimmte Zeit in einer sterilen 100-mm-Petrischale aufbewahrt werden.

2. Isolierung und Montage

  1. Euthanasieren Sie die Maus mit einer zugelassenen Methode, bevor Sie sie mit einem sekundären Ansatz bestätigen. In dieser Studie wurde CO2-Erstickung gefolgt von einer Gebärmutterhalsluxation verwendet. Entkernen Sie beide Augen mit einer gebogenen, stumpfen Pinzette und legen Sie sie in steriles PBS.
  2. Bereiten Sie den Arbeitsbereich vor, indem Sie eine 100-mm-Petrischale mit sterilem PBS füllen und auf den Tisch des binokularen Dissektionszielfernrohrs stellen.
    1. Schneiden Sie einen 1 cm breiten Streifen Labortuch ab und tauchen Sie es in die Schale, um es als stabilisierendes Substrat zu verwenden.
    2. Übertragen Sie ein Auge in die Sezierschale, lassen Sie das andere in PBS und legen Sie es auf Eis oder in den Kühlschrank bei 4 °C.
      HINWEIS: Aufgrund der Empfindlichkeit der Netzhaut gegenüber einem verlängerten postmortalen Intervall wird empfohlen, jeweils eine Maus einzuschläfern.
  3. Positionieren und fixieren Sie das Auge. Verwenden Sie eine Pinzette, um das Auge auf das untergetauchte Labortuch zu manövrieren, um die Stabilisierung zu unterstützen.
    1. Identifizieren Sie einen geeigneten Haltepunkt, fassen Sie ihn mit einer abgewinkelten Pinzette und rollen Sie das Auge sanft, so dass es von der Seite oder idealerweise von unten gehalten wird. Achten Sie darauf, dass die anterior-hintere Achse (d. h. von der Hornhaut bis zum Sehnerv) horizontal verläuft. Diese Ausrichtung verbessert die Sichtbarkeit und minimiert den Druck auf das Auge während der Dissektion.
      HINWEIS: Wenn möglich, greifen Sie nach extraorbitalem Gewebe, um ein Durchstechen oder Quetschen des Auges zu vermeiden, und bevorzugen Sie Muskeln oder Bindehaut gegenüber Sehnerv oder Fett.
  4. Während Sie mit der abgewinkelten Pinzette einen Halt halten, stellen Sie sicher, dass das Auge vollständig untergetaucht und sicher immobilisiert ist. Machen Sie einen Schnitt mit der Spitze des Skalpells #11 parallel und etwa 0,5 mm hinter dem Limbus, wo die Hornhaut in die Sklera übergeht.
    HINWEIS: Dieser Schnitt sollte gerade groß genug sein, um die Spitze einer Klinge der Federschere aufzunehmen. Da die Schärfe der Skalpellspitze entscheidend ist, um den Globus sauber zu durchstechen, wechseln Sie die Klinge alle zwei Netzhauten.
    1. Führen Sie eine Klinge der Federschere in die Kugel ein und beginnen Sie, zirkumlimbal um das Auge herum zu schneiden, wobei Sie das Auge bei Bedarf mit einer Pinzette vorsichtig neu positionieren.
      HINWEIS: Dieser Schnitt sollte so gerade und parallel zum Limbus wie möglich sein; Die Neupositionierung des Auges kann erfordern, dass Sie die Schere ablegen und mit jeder Hand eine Pinzette verwenden. Lassen Sie die Netzhaut nach der Freilegung während der gesamten Dissektion unter Wasser.
  5. Sobald der Schnitt das Auge umschrieben hat, entfernen Sie vorsichtig den vorderen Augenabschnitt und die Linse und drehen Sie dann die Augenmuschel nach oben, um die visuelle Inspektion und Glaskörperentfernung zu erleichtern. Wenn ein verlängertes Stück Sehnerv befestigt bleibt, kürzen Sie es auf eine kürzere Länge (1-2 mm), um dies zu erleichtern.
  6. Untersuchen Sie die Netzhaut auf sichtbare Schäden und die Glaskörperkammer auf Ablagerungen, wie z. B. pigmentierte Zellen aus dem RPE oder der Aderhaut, die bei der Entfernung des vorderen Augenabschnitts eingedrungen sein könnten. Verwenden Sie eine abgewinkelte Pinzette, um die Augenmuschel in dieser Position ruhigzustellen.
    HINWEIS: Für ein optimales Ergebnis müssen Ablagerungen in der Glaskammer entfernt und verbleibende Glaskörper und anhaftende Reste des Ziliarkörpers an der Netzhautperipherie minimiert werden. Dies kann ein schwieriger Prozess sein, und zusätzliche Hinweise finden Sie in den Abschnitten "Erkennen und Beheben von mechanischen Verletzungen" und "Metabolische Verletzungen" in den repräsentativen Ergebnissen.
    1. Verwenden Sie die modifizierte Transferpipette, um die Glaskammer mit PBS zu spülen, um kleine Partikelrückstände zu entfernen, Luftblasen zu vermeiden, indem Sie die Pipettenspitze unter der Oberfläche der Flüssigkeit halten und eine ausreichende Menge PBS im Reservoirkolben halten.
    2. Entfernen Sie größere Ablagerungen mit einem feinen Aquarellpinsel und minimieren Sie so den Kontakt mit der Netzhautoberfläche. Entfernen Sie bei Bedarf hartnäckigere Ablagerungen mit einer Pinzette mit feiner Spitze; Vermeiden Sie jedoch den direkten Kontakt von Werkzeugspitzen aus Metall mit der Netzhaut, um Schäden zu vermeiden.
  7. Nachdem Sie sichtbare Ablagerungen entfernt haben, spülen Sie die Glaskammer wiederholt (3-5 Mal) mit PBS aus der Transferpipette, wie oben beschrieben. Dadurch wird lose anhaftender Glaskörper entfernt, der nach der Entfernung von Ablagerungen zurückbleiben kann. Verwenden Sie die feine Bürste, um die Kammer vorsichtig zu sondieren, insbesondere in der Nähe der Peripherie, wenn Elemente des Ziliarkörpers übrig geblieben sind. Während der Glaskörper optisch transparent ist, wirkt er als Bremser auf die Bürstenfasern und kann auf diese Weise erkannt werden.
    HINWEIS: Eine dünne Restschicht des Glaskörpers auf der Netzhaut scheint sich nicht negativ auf die Isolierung oder die Haltbarkeit der Netzhaut ex vivo auszuwirken, aber das Vorhandensein signifikanter Mengen an der Netzhautperipherie, die oft mit Reststrukturen aus dem Ziliarkörper verbunden sind, kann zu Netzhautfalten und Probenverlust führen, wenn sie nicht entfernt werden.
    1. Wenn signifikante Glaskörpertaschen zurückbleiben, verwenden Sie die Bürste, um diese zu entfernen, indem Sie vorsichtig nach außen zur Peripherie streichen und darauf achten, dass die Fasern der Bürste, wenn sie die Netzhaut berühren, dies aus einem flachen Winkel tun und die Bürste nachziehen, wobei Sie den Glaskörper aus der Kammer ziehen, anstatt ihn zu drücken.
      HINWEIS: Die Entfernung des Glaskörpers erfordert eine besonders sorgfältige Behandlung, um Netzhautschäden zu vermeiden, die makroskopisch möglicherweise nicht sichtbar sind. Ratschläge zum Erkennen und Vermeiden dieser Schäden finden Sie in den Abschnitten "Erkennen und Beheben von mechanischen Verletzungen" und "Stoffwechselschäden" in den repräsentativen Ergebnissen.
  8. Sobald die Glaskammer von Schmutz befreit wurde und nur minimale Glaskörperreste zurückbleiben, trennen Sie vorsichtig die äußere Netzhaut von der Augenmuschel, während Sie die Probe weiterhin mit einer abgewinkelten Pinzette stabilisieren. Vermeiden Sie eine Beschädigung des Sehnervenkopfes und lassen Sie diese Struktur intakt, um die Netzhaut zu verankern.
    1. Nehmen Sie eine Pinzette, halten Sie sie in geschlossener Position, wobei sich die Spitzen berühren, und führen Sie sie vorsichtig zwischen Netzhaut und Aderhaut ein, wobei Sie, wenn möglich, einen bereits vorhandenen Abstand von der vorherigen Handhabung verwenden. Verwenden Sie die flachen Arme der Pinzette anstelle der Spitzen, um die Tasche zwischen Netzhaut und Aderhaut zu vergrößern, bis diese Strukturen vollständig getrennt werden können.
      HINWEIS: Betonen Sie seitliche Bewegungen, anstatt die Spitzen zu drücken, um den Spalt zwischen Netzhaut und Aderhaut zu vergrößern. Durch sanftes Drehen der Pinzette während dieser Bewegungen kann die Trennung verbessert und gleichzeitig die schiere Belastung durch Reibung zwischen Pinzette und Gewebe reduziert werden.
  9. Nachdem Sie die äußere Netzhaut von der Aderhaut getrennt haben, fahren Sie mit der Stabilisierung der Probe fort, während Sie mit einer zweiten Pinzette die Augenmuschel - Sklera, Aderhaut usw. - nach unten ziehen. Wenn die Netzhaut erfolgreich durchtrennt wurde, sollte sie an Ort und Stelle bleiben, am Kopf des Sehnervs festgebunden, während die Augenmuschel von einer einzigen Pinzette gehalten werden kann. Wenn die Netzhaut mit der Augenmuschel nach unten drückt, fahren Sie mit dem vorsichtigen Sondieren und Trennen anderer Verbindungspunkte als dem Sehnervenkopf fort.
  10. Wenn die Netzhaut am Sehnervenkopf verankert ist, fahren Sie mit der Immobilisierung des Gewebes fort und verwenden Sie die zweite Pinzette, um die Augenmuschel unter dem Sehnervenkopf zu bündeln.
    1. Prüfen Sie, ob keine der retinalen Peripherie in einer umgeklappten Position feststeckt, weil im Winkel zwischen der Netzhaut und einem eventuellen Ziliarrest überschüssiger Glaskörper überschüssiger Glaskörper vorhanden ist. Spülen Sie die Kammer bei Bedarf mit PBS mit der Transferpipette, um zusätzliche Ablagerungen zu entfernen, und verwenden Sie vorsichtig die Bürste, um das Gewebe zu entrollen und überschüssigen Glaskörper zu entfernen, wobei Sie darauf achten, das Gewebe nicht übermäßig zu zerren.
  11. Wenn die Netzhaut von beiden Seiten freigelegt ist, führen Sie mit der Federschere eine Reihe von Entlastungsschnitten im Abstand von etwa 90° aus, die sich in einer geraden Linie von der Peripherie zum Sehnervenkopf erstrecken und etwa 1 mm von der Mitte entfernt enden. Dies minimiert die Durchtrennung von retinalen Ganglienzellaxonen in der Netzhaut und verbessert die Qualität der kultivierten Explantate.
  12. Während Sie das untergetauchte Gewebe an Ort und Stelle halten, entfernen Sie das Labortuch vorsichtig mit einer Pinzette, um es seitlich vom Gewebe wegzuziehen, bevor Sie es aus der Schale nehmen. Vermeiden Sie den Kontakt mit der Netzhaut, um eine Anhaftung am Tuch und einen möglichen Probenverlust zu vermeiden.
  13. Halten Sie dann das Gewebe weiter fest und durchtrennen Sie mit der Federschere den Sehnerv direkt unter der Netzhaut, dann entfernen Sie den Rest der Augenmuschel aus der Schale.
  14. Sobald die Netzhaut vom Rest des Auges isoliert ist, füllen Sie eine 35-mm-Petrischale mit PBS und platzieren Sie mit einer Pinzette ein Filterquadrat am unteren Rand, wobei die rauere, matte Seite nach oben zeigt. Achten Sie darauf, dass der Filter nicht knittert, da dies die Verwendung des Filters als Substrat für die Bewegung der Netzhaut behindern kann.
  15. Aspirieren Sie die Netzhaut vorsichtig mit der Transferpipette und übertragen Sie sie vorsichtig in die 35-mm-Schale. Bewegen Sie die Netzhaut mit der Bürste, um sicherzustellen, dass die innere Oberfläche der Netzhaut aufrecht ist und das Gewebe direkt über dem Filterquadrat aufliegt.
  16. Saugen Sie PBS langsam mit der Transferpipette aus der Schale ab, um die Netzhaut auf den Filter abzusenken. Pausieren Sie gegebenenfalls, um das Gewebe neu anzupassen, bevor Sie fortfahren, bis sich die Netzhaut auf dem Filter abgesetzt hat.
    HINWEIS: Eine schnelle Aspiration kann zu einer plötzlichen seitlichen Bewegung der Netzhaut führen, was zu Schäden oder Gewebeverlust führt. Die gesamte Netzhaut muss auf dem Quadrat aufliegen, um Schäden zu vermeiden. Wenn sich die Netzhaut jedoch in einer problematischen Position einpendelt, kann PBS wieder zur Schale hinzugefügt werden, bis die Netzhaut wieder suspendiert ist, und die Montage kann erneut versucht werden.
  17. Sobald sich die Netzhaut auf dem Filter abgesetzt hat, rollen Sie mit der Bürste alle peripheren Netzhaut ab, die möglicherweise umgeklappt ist. Gleichen Sie den PBS-Gehalt sorgfältig aus, so dass sich die Netzhaut nicht leicht vom Filter löst, und stellen Sie gleichzeitig sicher, dass genügend übrig bleibt, damit die Probe nicht austrocknet und der Pinsel sich reibungslos bewegen kann, ohne die innere Netzhaut zu beschädigen.
  18. Untersuchen Sie die Netzhaut erneut auf Ablagerungen. Um Schäden zu vermeiden, reinigen Sie die Netzhaut ohne direkte Handhabung, indem Sie PBS mit der Transferpipette aus etwa 1 cm Höhe über dem Gewebe auf die Netzhaut tropfen. Dies sollte alle verbleibenden Ablagerungen wegspülen, aber wenn zu viel PBS in die Schale gegeben wird, kann die Netzhaut wieder nach oben schwimmen. Führen Sie in diesem Fall eine erneute Aspiration durch, um das Gewebe wieder zu mounten.
    HINWEIS: "Schein"-Proben können erzeugt werden, indem Netzhäute auf eine 24-Well-Platte zur Fixierung, Blockierung/Permeabilisierung und Antikörperfärbung übertragen werden, wie an anderer Stellebeschrieben 21. Diese Scheinkontrollen sind nützlich für die Behandlung mechanischer Verletzungen der Netzhaut, die während der Isolation auftreten können.

3. Überführung auf Nährmedien und Pflege

  1. Schließen Sie den Deckel der 35-mm-Schale für den Transport zur Biosicherheitswerkbank und halten Sie die Schale waagerecht, um ein Lösen der Netzhaut vom Filter zu vermeiden. In diesem Fall mounten Sie erneut wie oben.
  2. Legen Sie die geschlossene 35-mm-Schale mit der Netzhaut in die Biosicherheitswerkbank und achten Sie darauf, dass Sie vor der Desinfektion oder dem Handschuhwechsel keine Geräte oder Oberflächen im Schrank berühren.
  3. Dekontaminieren Sie die Handschuhe mit Ethanol und/oder tauschen Sie sie aus und bringen Sie dann die mit Explantatmedien vorgeladene 6-Well-Platte aus dem Inkubator in die Biosicherheitswerkbank. Führen Sie die Schritte 3.4 und 3.5 in der Biosicherheitswerkbank mit den Werkzeugen durch, die in Schritt 1.1 dort platziert wurden.
  4. Entfernen Sie den Deckel der 35-mm-Schale mit der Netzhaut und heben Sie das Filterquadrat mit einer abgewinkelten Pinzette vorsichtig an, ohne die Netzhaut direkt zu berühren. Entfernen Sie den Deckel der 6-Well-Platte, positionieren Sie den Filter über der Mitte des Einsatzes einer geeigneten Well, dann senken Sie ihn langsam in das Medium ab. Die Netzhaut löst sich während dieses Schritts vom Filter und schwebt knapp unter der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche.
  5. Sobald sich Netzhaut und Filter getrennt haben, bewegen Sie den Filter langsam von der Netzhaut weg und entfernen Sie ihn vom Medium. Entfernen Sie mit der 1-ml-Pipette 500 μl Medium aus dem Einsatz, um sicherzustellen, dass die Netzhaut flach liegt, indem Sie sie zwischen dem Boden des Einsatzes und der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche einschließen.
  6. Setzen Sie den Deckel wieder auf die Platte und stellen Sie ihn wieder bei 37 °C mit 5 % CO2 in den Inkubator, wobei Sie darauf achten müssen, dass die Netzhaut in der Nähe der Mitte der Vertiefung bleibt. Bis zu 6 Netzhäute können in einer einzigen Platte aufbewahrt werden.
    HINWEIS: Wenn Explantate 24 Stunden oder weniger aufbewahrt werden, können sie bis zum Ende des Experiments im Inkubator belassen werden. Bei längerer Lagerung wird ein Medienwechsel von 50 % nach 1 Tag in vitro und an abwechselnden Tagen danach empfohlen.

4. Fixierung für die Immunfärbung (fakultativ)

  1. Wenn Sie eine Immunfärbung durchführen, befolgen Sie die folgenden Schritte zur Fixierung; Während die Immunfärbung unter Verwendung von Parametern durchgeführt werden kann, die zuvor für flach sitzende Netzhäute beschrieben wurden21, erfordert die Fixierung der explantierten Netzhaut besondere Überlegungen.
  2. Entfernen Sie Zellkultureinsätze mit Explantaten und Medien von der 6-Well-Kulturplatte und legen Sie sie auf eine nicht poröse Oberfläche (z. B. den Kunststoffdeckel der Kulturplatte), die nach der Fixierung ordnungsgemäß entsorgt werden kann, da die Einsätze leicht porös sind und geringe Mengen an Fixiermittel auf diese darunter liegende Oberfläche gelangen.
  3. Entfernen Sie vorsichtig die Nährmedien von den Einsätzen und fügen Sie dann jeweils 1 ml 4 % Paraformaldehyd (PFA) hinzu. Lassen Sie die Netzhäute 15 Minuten lang in einem Abzug fixieren, entfernen Sie dann PFA und entsorgen Sie es gemäß den institutionellen Richtlinien.
    ACHTUNG: Paraformaldehyd ist gefährlich und eine Vorstufe von Formaldehyd, einem bekannten Karzinogen. Seien Sie vorsichtig und führen Sie die Fixierung in einem Abzug mit geeigneten Vorsichtsmaßnahmen durch.
  4. Waschen Sie die Netzhaut 3 Mal (jeweils 5 Minuten lang) mit PBS, um PFA zu entfernen, und übertragen Sie dann mit einer modifizierten Transferpipette die Netzhaut in PBS in einzelne Vertiefungen in einer 24-Well-Platte zur Blockierung, Permeabilisierung und Immunfärbung, wie an anderer Stelle beschrieben21. Entsorgen Sie PFA-kontaminierte Kunststoffe (Pipettenspitzen, Einsätze und die bei der Fixierung verwendete nicht poröse Oberfläche) gemäß den institutionellen Richtlinien.
    HINWEIS: Die Transferpipette kann aufbewahrt werden, um fixierte und gefärbte Netzhäute zur Montage und Bildgebung auf einen Objektträger zu übertragen. Obwohl es keinen direkten Kontakt mit PFA hätte haben dürfen, wird empfohlen, verschiedene Transferpipetten für den Umgang mit lebendem und fixiertem Gewebe zu verwenden.

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Ergebnisse

Auf der makroskopischen Skala bleiben explantierte Netzhäute sowohl zum 1- als auch zum 3-Tage-Zeitpunkt im Wesentlichen unverändert, obwohl sie zu letzterem Zeitpunkt relativ fragil werden, was eine sorgfältige Handhabung vor der Fixierung oder anderen experimentellen Endpunkten erfordert. Die Netzhaut sollte relativ flach sein, ohne Falten (was zu einer lokalen Störung der Diffusion von Sauerstoff und Nährstoffen führen kann) und im Medium zwischen der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche und dem Zellkultureinsatz suspendiert...

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Diskussion

Organotypische Kulturansätze32 , wie z. B. Netzhautexplantate, nutzen die experimentelle Flexibilität und die schnelle Durchlaufzeit von Zellkulturen, während sie einen Großteil des In-situ-Kontexts von In-vivo-Studien beibehalten, was sie zu einem leistungsstarken Weg für die Untersuchung komplexer Wechselwirkungen zwischen Zelltypen macht. Wir stellen dieses Protokoll als Einstiegspunkt für Forscher vor, die möglicherweise über umfangreiche Erf...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

M.A.M. wurde unterstützt von NIH/NEI R01EY035312, dem Glaucoma Research Foundation Catalyst for a Cure Award, der Melza M. and Frank Theodore Barr Foundation, der Robert M. Sinskey, MD, Foundation, der Ruettgers Family Charitable Foundation und der B.L. Manger Foundation. P.F.C. wurde unterstützt durch NIH/NEI 2T32EY007145. Diese Arbeit wurde auch durch einen NIH Core Grant for Vision Research P30 EY003176 ermöglicht.  Abbildung 1 wurde mit Biorender erstellt. Die Autoren danken Dr. Nasir Uddin für das Feedback zum Manuskript und Dr. Qiurong Zhu für die Hilfe und Unterstützung.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
#11 SkalpellklingenBard-Parker3,71,311
1 mL Pipette ('Pipetman P1000')GilsonF144059M
100 mm PetrischaleFalcon351029
16% ParaformaldehydTed Pella Inc18.505Verdünnt auf 4% für die Fixierung
24 Well PlateFalcon353047Zum Fixieren, Blockieren und Antikörper-Inkubation
35 mm PetrischaleFalcon351008
6-Well-Platten- und EinsatzkitGreiner bio-one657641
Alexa Fluor 488-Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. 711-545-152:800 Verdünnung
Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Ratte IgG (H+L) Hochgradig kreuzadsorbiertesInvitrogenA-212091:800 Verdünnung
Alexa Fluor 594-F(ab')2 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. 715-586-1501:800 Verdünnung
Alexa Fluor 647-Esel Anti-Meerschweinchen IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. 706-605-1481:800 Verdünnung
Alexa Fluor 647-F(ab')2 Donkey Anti-Chicken IgY (IgG) (H+L) Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. 703-606-1551:800 Verdünnung
Abgewinkelte Pinzette ('5/45')FST / Dumont11251-35
Anti-Brn3a Antikörper (Maus)ChemiconMAB15851:200 Verdünnung
Anti-CD206 Antikörper (Ratte)BioradMCA22351:200 Verdünnung
Anti-GFAP Antikörper (Huhn)Abcamab46741:1000 Verdünnung
Anti-Iba1 Antikörper (Kaninchen)FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation019-197411:500 Verdünnung
Anti-Tmem119 Antikörper (Meerschweinchen)Synaptic Systems400 0041:500 Verdünnung
B-27, 50xGibco (Thermofisher)17504044
Stumpf gebogene Pinzette ('Extra Fine Graefe)FST11152-10
RinderserumalbuminSigma-AldrichA9647Verwenden Sie 1 % w/v für die Blockierung und Antikörperinkubation
Filterkit (0,2 & Mikro; m aPES-Membran, 150 mL Flaschenaufsatzfilter)  FisherscientificFB12566508
feiner Pinsel, Größe 3/0Princeton Art & Brush Co.06435-1030
GlutaMaxGibco (Thermofisher)35050061
Labortücher (Kim-Tücher) KIMTECH34155
N-2, 100xGibco (Thermofisher)17502048
Neurobasal-A Medium, minus phenolrotGibco (Thermofisher)12349015
Normales EselserumJackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. 017-000-121Anwendung bei 10% zur Blockierung und Antikörperinkubation
Penicillin-StreptomycinGibco (Thermofisher)15140122
Pipettenspitzen, 1000 & Mikro; LTipOne1126-7810
Federschere ('Cohan-Vannas')FST15000-11
Steriles Wasser ('Dnase, Rnase frei')Invitrogen10977-015
Sterilfiltriert PBSGibco10010-023
Gerade Pinzette ('mini')FST / Dumont11200-14
Transferpipette, 5,8 mLfisherscientific13-711-9AMMD
Triton X-100Thermo Scientific ChemicalsA16046. AP-Anwendung bei 0,5 % zur Blockierung und Antikörperinkubation
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