Ein ex vivo Explantatmodell zur Untersuchung von glialen Wechselwirkungen in der Netzhaut der Maus

Die lichtempfindliche Netzhaut, eine Erweiterung des Zentralnervensystems (ZNS), die sich im hinteren Teil des Auges befindet, ist für das Sehvermögen unerlässlich, aber sowohl anfällig für akute Verletzungen als auch für chronische Krankheiten. Wie bei anderen ZNS-Regionen werden Neuronen in der adulten Netzhaut nicht ersetzt, wenn sie verloren gehen, und die retinalen Ganglienzellen (RGCs), die visuelle Informationen aggregieren und an das Gehirn weiterleiten, sind besonders anfällig für Funktionsstörungen und Tod beim Glaukom, was zu einem irreversiblen Sehverlust führt ^1,2. Das Glaukom ist weltweit eine der Hauptursachen für Erblindung³, doch trotz der verheerenden Auswirkungen auf die Betroffenen und der Gesamtkosten für die Gesellschaft ist noch viel darüber unbekannt, wie die frühen Stadien der Krankheit zum RGC-Verlust beitragen⁴. Die Rolle der Gliazellen ist ein wichtiges Forschungsgebiet in der Pathophysiologie des Glaukoms, da diese nicht-neuronalen Stützzellen für das Überleben von RGCs unerlässlich sind⁵, aber phänotypische Veränderungen in der Krankheit erfahren, die das vorteilhafte Verhalten verringern können⁶ oder sogar die Annahme schädlicher Phänotypen vorantreiben^{können 7}. Obwohl der Begriff Glia eine Reihe von spezialisierten Zelltypen im gesamten ZNS umfasst⁸, können diese grob in zwei Kategorien unterteilt werden - solche, die eine Entwicklungslinie mit Neuronen teilen und trophische, energetische und strukturelle Unterstützung bieten⁹, und solche mit myeloischem Ursprung, die spezialisierte Immunüberwachungs- und Reaktionsaufgaben ausführen¹⁰. Vertreter beider Kategorien - Astrozyten und Müller-Zellen in ersterem, Mikroglia in letzterem - bevölkern die Netzhaut⁵ und durchlaufen beim Glaukom große Veränderungen, die erhebliche Fragen über ihre Rolle beim Fortschreiten der Krankheit und beim Überleben von RGCs aufwerfen¹¹.

Die Bemühungen, diese Fragen zu beantworten, werden zum Teil durch intrinsische Eigenschaften der retinalen Gliazellen behindert, die sowohl für die In-vivo- als auch für die In-vitro-Untersuchung eine Herausforderung darstellen. Im Gegensatz zu Neuronen sind sie elektrisch relativ leise, so dass Ansätze wie ERG, die eine funktionelle Bewertung von RGCs und Photorezeptoren in vivo ermöglichen, ungeeignet sind, um Veränderungen der Gliafunktion und des Gliaverhaltens zu untersuchen. Und obwohl induzierbare¹²- und spontane^13-Modelle des Glaukoms verfügbar sind, ist noch viel unbekannt über Veränderungen der Gliazellen zu den frühesten Zeitpunkten der Krankheit, die einem nachweisbaren RGC-Verlust vorausgehen können, ein Problem, das durch die unterschiedliche Penetranz des Krankheitszustands in vielen dieser Modelle noch verschärft wird. Darüber hinaus deuten Hinweise sowohl aus klinischen als auch aus experimentellen Glaukomen darauf hin, dass periphere Immunzellen Beiträge leisten, die schwer von denen der Mikroglia zu unterscheiden sind, trotz Indikatoren, dass sie in unterschiedliche "Richtungen" wirken können, um das Fortschreiten der Krankheit zu beeinflussen^14,15.

Auch bei der Untersuchung von retinalen Gliazellen in vitro gibt es zahlreiche Herausforderungen. Obwohl die Isolierung und Kultur von Astrozyten^16,17 und Mikroglia¹⁸ aus dem Gehirn gut etabliert ist, zeigen neuere Arbeiten eine umfangreiche gliale Heterogenität zwischen ZNS-Regionen, insbesondere bei Astrozyten¹⁹, und Phänotypen, die in einer Region vorhanden sind, sind möglicherweise nicht in Gliazellen aus einer anderen, wie z. B. der Netzhaut, vorhanden^20,21. Die direkte Isolierung von retinalen Astrozyten und Mikroglia für die Studie ist jedoch eine besondere Herausforderung, da beide Zelltypen relativ selten sind - jeder macht weniger als 1% der geschätzten 6,5 Millionen Zellen in der Netzhaut der Maus aus 22,23,24. Darüber hinaus sind Gliazellen im Gegensatz zu Neuronen hochplastisch und passen sich schnell an dramatische Veränderungen in ihrer Umgebung an 16,18,25; Infolgedessen können Verhaltensweisen, die in diesen Zellen in vitro beobachtet werden, spezifische Anpassungen an ihre neue Umgebung darstellen und nicht phänotypische Muster, die typischerweise bei Gesundheit oder Krankheit zu beobachten sind. Angesichts der Einschränkungen sowohl bei In-vivo-Experimenten als auch bei der Primärkultur von retinalen Gliazellen haben wir nach einem Zwischenansatz gesucht - retinalen Explantaten -, bei dem Glia, RGCs und andere Elemente der Netzhaut in situ in einem ex vivo-Kontext konserviert werden. Im Vergleich zu In-vivo-Modellen bietet dieser Ansatz einen verkürzten experimentellen Zeitverlauf²⁶, ermöglicht eine direkte experimentelle Manipulation von retinalen Gliazellen²⁷ und vermeidet den potenziell verwirrenden Einfluss der peripheren Immunzellinfiltration¹⁴. Umgekehrt kommt es im Gegensatz zur primären Zellkultur zu einer minimalen Störung der extrazellulären Umgebung, und die Gliazellen bleiben intakt und morphologisch erkennbar, wodurch die Herausforderungen vermieden werden, die mit dem wesentlichen Nachwachsen und der Identifizierung dieser Zellen nach enzymatischer und mechanischer Zerstörung verbunden sind^16,25.

Im Vergleich zu den zuvor beschriebenen Methoden der retinalen Explantation liegt der Schwerpunkt bei diesem Ansatz auf der technischen Zuverlässigkeit, der Reproduzierbarkeit und der Maximierung der "Benutzerfreundlichkeit" des Ansatzes, um die Zugänglichkeit zu verbessern^26,28. In persönlichen Gesprächen mit anderen Forschern stellten wir fest, dass die technischen Herausforderungen, die mit der Handhabung der lebenden Netzhaut verbunden sind, eine große Hürde für viele darstellen, die Explantate verwenden möchten, während die Pflege der explantierten Netzhaut in Kultur für Gruppen mit geeigneten Zellkultureinrichtungen relativ einfach war. Daher enthält dieses Protokoll eine Reihe von Innovationen, die die mit der Netzhautisolierung verbundene Lernkurve verkürzen und es den Forschern ermöglichen sollen, schneller mit der Sammlung experimenteller Daten zu beginnen. Obwohl wir besonderen Wert auf das Potenzial dieses Explantatmodells für die Untersuchung des Verhaltens retinaler Gliazellen gelegt und es hauptsächlich mit Immunfluoreszenzmikroskopie charakterisiert haben, sind auch andere retinale Zelltypen und Strukturen weitgehend konserviert, und die explantierten Netzhäute bleiben für eine Vielzahl zusätzlicher Untersuchungstechniken zugänglich.

Alle Verfahren mit Tieren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Schepens Eye Research Institute genehmigt (Protokoll # 2022N000030, genehmigt am 3.4.2025). Die Tiere wurden in Übereinstimmung mit der Erklärung der Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) für die Verwendung von Tieren in der Augen- und Sehforschung behandelt.

HINWEIS: Abbildung 1 zeigt die wichtigsten Schritte bei der Isolierung von lebender Netzhaut aus dem enukleierten Mausauge.

Abbildung 1: Eine schematische Darstellung der wichtigsten Schritte bei der Isolierung von lebender Netzhaut aus dem enukleierten Mausauge. Die entsprechenden Schrittnummern der Schlüsselschritte sind in Kreisen angegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

1. Vorbereitung

1. Desinfizieren Sie eine 1-ml-Pipette und eine abgewinkelte Pinzette und legen Sie sie in die Biosicherheitswerkbank. Diese werden in Abschnitt 3 des Protokolls benötigt.
2. Modifizieren Sie eine Transferpipette, indem Sie senkrecht über den Schaft etwa 2 cm unterhalb des Reservoirs schneiden, wo die Bohrung am breitesten ist, um die Pipette zu verkürzen und die Öffnung zu verbreitern. Achten Sie auf einen sauberen Schnitt, an dem sich die Netzhaut nicht verfängt.
   HINWEIS: Dieses Werkzeug kann zur Wiederverwendung aufbewahrt werden, wenn es gereinigt und zwischen den Anwendungen mit sterilem Wasser gespült wird.
3. Bereiten Sie 50 ml Explantatmedien aseptisch in einer Biosicherheitswerkbank vor, indem Sie 47,5 ml Neurobasalmedien mit 500 μl N-2-Supplement, 1 mL B-27-Supplement, 500 μl Glutamax und 500 μl Penicillin-Streptomycin-Mix ergänzen (Endkonzentration von 100 U/ml Penicillin und 100 mg/ml Streptomycin).
   HINWEIS: Bereiten Sie frische Explantatmedien für jede Serie von Isolierungen vor. Überschüssige Medien können bis zu 1 Woche bei 4 °C gehalten und bei Bedarf für den Medienwechsel verwendet werden. Nach dem Öffnen unbenutztes Neurobasalmedium nach 1 Monat ersetzen. N-2 und B-27 sollten als Einmal-Aliquote eingefroren aufbewahrt werden, um Gefrier-Tau-Zyklen zu vermeiden.
4. Bereiten Sie in einer Biosicherheitswerkbank die Kulturplatte(n) aseptisch vor, indem Sie in jede zu verwendende Vertiefung einen Einsatz geben und dabei über die "Zinken" behandeln, die aus dem Einsatzrand austreten, um zu vermeiden, dass Oberflächen berührt werden, die mit Kulturmedien in Kontakt kommen.
   1. Geben Sie 1 ml Explantatmedium in den Einsatz, gefolgt von weiteren 3 mL, die in die Vertiefung selbst gegeben werden. Geben Sie 2-3 ml steriles Wasser in unbenutzte Vertiefungen, um die Verdunstung zu kontrollieren.
   2. Platte(n) bei 37 °C mit 5 % CO₂ in den Inkubator überführen, um sie ca. 30 min vor der Gewebeisolierung auszugleichen.
5. Bereiten Sie Filterquadrate vor, um ein Substrat für die Gewebestabilisierung und den Transfer zu schaffen. Entnehmen Sie den Filter aus einem Filtrationsset mit Flaschenaufsatz, indem Sie mit einem Rasiermesser oder Skalpell die Peripherie des Materials umschneiden. Achten Sie darauf, Verletzungen oder Beschädigungen des Filters durch Falten oder Reißen zu vermeiden.
   HINWEIS: Das Entfernen des durchsichtigen Kunststoffbehälters mit einem robusten Rasierer, um den formbareren, undurchsichtigen Kunststoff an der Stelle, an der der Gewindeadapter auf den Behälter trifft, zu schneiden, vereinfacht den Extraktionsvorgang, aber es ist zusätzliche Vorsicht geboten, um Verletzungen zu vermeiden.
   1. Nachdem sich der Filter durch Schneiden gelöst hat, verwenden Sie eine Pinzette, um ihn herauszuziehen. Beachten Sie die Ausrichtung des Filters während und nach der Extraktion; Die matte Seite (die dem Reservoir zugewandt ist) sollte aufrecht stehen, um die Netzhaut in Schritt 2.16 für den Transfer zu montieren.
   2. Schneiden Sie den Filter in kleine Quadrate von ca. 7 mm × 7 mm; Für jedes Netzhautexplantat wird ein Quadrat benötigt. Die Quadrate in sterilem Wasser in einer 100 mm Petrischale für mindestens 20 Minuten einweichen.
      HINWEIS: Filterquadrate können vor der Verwendung bis zu 1 Woche in sterilem Wasser eingetaucht bleiben. Aufgrund der Tendenz der Filterquadrate, vor dem Eintauchen eine hohe statische Aufladung zu entwickeln, sollten Sie nur so viele Quadrate wie nötig vorbereiten. Das restliche Trockenfiltermaterial kann für die spätere Verwendung auf unbestimmte Zeit in einer sterilen 100-mm-Petrischale aufbewahrt werden.

2. Isolierung und Montage

1. Euthanasieren Sie die Maus mit einer zugelassenen Methode, bevor Sie sie mit einem sekundären Ansatz bestätigen. In dieser Studie wurde CO2-Erstickung gefolgt von einer Gebärmutterhalsluxation verwendet. Entkernen Sie beide Augen mit einer gebogenen, stumpfen Pinzette und legen Sie sie in steriles PBS.
2. Bereiten Sie den Arbeitsbereich vor, indem Sie eine 100-mm-Petrischale mit sterilem PBS füllen und auf den Tisch des binokularen Dissektionszielfernrohrs stellen.
   1. Schneiden Sie einen 1 cm breiten Streifen Labortuch ab und tauchen Sie es in die Schale, um es als stabilisierendes Substrat zu verwenden.
   2. Übertragen Sie ein Auge in die Sezierschale, lassen Sie das andere in PBS und legen Sie es auf Eis oder in den Kühlschrank bei 4 °C.
      HINWEIS: Aufgrund der Empfindlichkeit der Netzhaut gegenüber einem verlängerten postmortalen Intervall wird empfohlen, jeweils eine Maus einzuschläfern.
3. Positionieren und fixieren Sie das Auge. Verwenden Sie eine Pinzette, um das Auge auf das untergetauchte Labortuch zu manövrieren, um die Stabilisierung zu unterstützen.
   1. Identifizieren Sie einen geeigneten Haltepunkt, fassen Sie ihn mit einer abgewinkelten Pinzette und rollen Sie das Auge sanft, so dass es von der Seite oder idealerweise von unten gehalten wird. Achten Sie darauf, dass die anterior-hintere Achse (d. h. von der Hornhaut bis zum Sehnerv) horizontal verläuft. Diese Ausrichtung verbessert die Sichtbarkeit und minimiert den Druck auf das Auge während der Dissektion.
      HINWEIS: Wenn möglich, greifen Sie nach extraorbitalem Gewebe, um ein Durchstechen oder Quetschen des Auges zu vermeiden, und bevorzugen Sie Muskeln oder Bindehaut gegenüber Sehnerv oder Fett.
4. Während Sie mit der abgewinkelten Pinzette einen Halt halten, stellen Sie sicher, dass das Auge vollständig untergetaucht und sicher immobilisiert ist. Machen Sie einen Schnitt mit der Spitze des Skalpells #11 parallel und etwa 0,5 mm hinter dem Limbus, wo die Hornhaut in die Sklera übergeht.
   HINWEIS: Dieser Schnitt sollte gerade groß genug sein, um die Spitze einer Klinge der Federschere aufzunehmen. Da die Schärfe der Skalpellspitze entscheidend ist, um den Globus sauber zu durchstechen, wechseln Sie die Klinge alle zwei Netzhauten.
   1. Führen Sie eine Klinge der Federschere in die Kugel ein und beginnen Sie, zirkumlimbal um das Auge herum zu schneiden, wobei Sie das Auge bei Bedarf mit einer Pinzette vorsichtig neu positionieren.
      HINWEIS: Dieser Schnitt sollte so gerade und parallel zum Limbus wie möglich sein; Die Neupositionierung des Auges kann erfordern, dass Sie die Schere ablegen und mit jeder Hand eine Pinzette verwenden. Lassen Sie die Netzhaut nach der Freilegung während der gesamten Dissektion unter Wasser.
5. Sobald der Schnitt das Auge umschrieben hat, entfernen Sie vorsichtig den vorderen Augenabschnitt und die Linse und drehen Sie dann die Augenmuschel nach oben, um die visuelle Inspektion und Glaskörperentfernung zu erleichtern. Wenn ein verlängertes Stück Sehnerv befestigt bleibt, kürzen Sie es auf eine kürzere Länge (1-2 mm), um dies zu erleichtern.
6. Untersuchen Sie die Netzhaut auf sichtbare Schäden und die Glaskörperkammer auf Ablagerungen, wie z. B. pigmentierte Zellen aus dem RPE oder der Aderhaut, die bei der Entfernung des vorderen Augenabschnitts eingedrungen sein könnten. Verwenden Sie eine abgewinkelte Pinzette, um die Augenmuschel in dieser Position ruhigzustellen.
   HINWEIS: Für ein optimales Ergebnis müssen Ablagerungen in der Glaskammer entfernt und verbleibende Glaskörper und anhaftende Reste des Ziliarkörpers an der Netzhautperipherie minimiert werden. Dies kann ein schwieriger Prozess sein, und zusätzliche Hinweise finden Sie in den Abschnitten "Erkennen und Beheben von mechanischen Verletzungen" und "Metabolische Verletzungen" in den repräsentativen Ergebnissen.
   1. Verwenden Sie die modifizierte Transferpipette, um die Glaskammer mit PBS zu spülen, um kleine Partikelrückstände zu entfernen, Luftblasen zu vermeiden, indem Sie die Pipettenspitze unter der Oberfläche der Flüssigkeit halten und eine ausreichende Menge PBS im Reservoirkolben halten.
   2. Entfernen Sie größere Ablagerungen mit einem feinen Aquarellpinsel und minimieren Sie so den Kontakt mit der Netzhautoberfläche. Entfernen Sie bei Bedarf hartnäckigere Ablagerungen mit einer Pinzette mit feiner Spitze; Vermeiden Sie jedoch den direkten Kontakt von Werkzeugspitzen aus Metall mit der Netzhaut, um Schäden zu vermeiden.
7. Nachdem Sie sichtbare Ablagerungen entfernt haben, spülen Sie die Glaskammer wiederholt (3-5 Mal) mit PBS aus der Transferpipette, wie oben beschrieben. Dadurch wird lose anhaftender Glaskörper entfernt, der nach der Entfernung von Ablagerungen zurückbleiben kann. Verwenden Sie die feine Bürste, um die Kammer vorsichtig zu sondieren, insbesondere in der Nähe der Peripherie, wenn Elemente des Ziliarkörpers übrig geblieben sind. Während der Glaskörper optisch transparent ist, wirkt er als Bremser auf die Bürstenfasern und kann auf diese Weise erkannt werden.
   HINWEIS: Eine dünne Restschicht des Glaskörpers auf der Netzhaut scheint sich nicht negativ auf die Isolierung oder die Haltbarkeit der Netzhaut ex vivo auszuwirken, aber das Vorhandensein signifikanter Mengen an der Netzhautperipherie, die oft mit Reststrukturen aus dem Ziliarkörper verbunden sind, kann zu Netzhautfalten und Probenverlust führen, wenn sie nicht entfernt werden.
   1. Wenn signifikante Glaskörpertaschen zurückbleiben, verwenden Sie die Bürste, um diese zu entfernen, indem Sie vorsichtig nach außen zur Peripherie streichen und darauf achten, dass die Fasern der Bürste, wenn sie die Netzhaut berühren, dies aus einem flachen Winkel tun und die Bürste nachziehen, wobei Sie den Glaskörper aus der Kammer ziehen, anstatt ihn zu drücken.
      HINWEIS: Die Entfernung des Glaskörpers erfordert eine besonders sorgfältige Behandlung, um Netzhautschäden zu vermeiden, die makroskopisch möglicherweise nicht sichtbar sind. Ratschläge zum Erkennen und Vermeiden dieser Schäden finden Sie in den Abschnitten "Erkennen und Beheben von mechanischen Verletzungen" und "Stoffwechselschäden" in den repräsentativen Ergebnissen.
8. Sobald die Glaskammer von Schmutz befreit wurde und nur minimale Glaskörperreste zurückbleiben, trennen Sie vorsichtig die äußere Netzhaut von der Augenmuschel, während Sie die Probe weiterhin mit einer abgewinkelten Pinzette stabilisieren. Vermeiden Sie eine Beschädigung des Sehnervenkopfes und lassen Sie diese Struktur intakt, um die Netzhaut zu verankern.
   1. Nehmen Sie eine Pinzette, halten Sie sie in geschlossener Position, wobei sich die Spitzen berühren, und führen Sie sie vorsichtig zwischen Netzhaut und Aderhaut ein, wobei Sie, wenn möglich, einen bereits vorhandenen Abstand von der vorherigen Handhabung verwenden. Verwenden Sie die flachen Arme der Pinzette anstelle der Spitzen, um die Tasche zwischen Netzhaut und Aderhaut zu vergrößern, bis diese Strukturen vollständig getrennt werden können.
      HINWEIS: Betonen Sie seitliche Bewegungen, anstatt die Spitzen zu drücken, um den Spalt zwischen Netzhaut und Aderhaut zu vergrößern. Durch sanftes Drehen der Pinzette während dieser Bewegungen kann die Trennung verbessert und gleichzeitig die schiere Belastung durch Reibung zwischen Pinzette und Gewebe reduziert werden.
9. Nachdem Sie die äußere Netzhaut von der Aderhaut getrennt haben, fahren Sie mit der Stabilisierung der Probe fort, während Sie mit einer zweiten Pinzette die Augenmuschel - Sklera, Aderhaut usw. - nach unten ziehen. Wenn die Netzhaut erfolgreich durchtrennt wurde, sollte sie an Ort und Stelle bleiben, am Kopf des Sehnervs festgebunden, während die Augenmuschel von einer einzigen Pinzette gehalten werden kann. Wenn die Netzhaut mit der Augenmuschel nach unten drückt, fahren Sie mit dem vorsichtigen Sondieren und Trennen anderer Verbindungspunkte als dem Sehnervenkopf fort.
10. Wenn die Netzhaut am Sehnervenkopf verankert ist, fahren Sie mit der Immobilisierung des Gewebes fort und verwenden Sie die zweite Pinzette, um die Augenmuschel unter dem Sehnervenkopf zu bündeln.
    1. Prüfen Sie, ob keine der retinalen Peripherie in einer umgeklappten Position feststeckt, weil im Winkel zwischen der Netzhaut und einem eventuellen Ziliarrest überschüssiger Glaskörper überschüssiger Glaskörper vorhanden ist. Spülen Sie die Kammer bei Bedarf mit PBS mit der Transferpipette, um zusätzliche Ablagerungen zu entfernen, und verwenden Sie vorsichtig die Bürste, um das Gewebe zu entrollen und überschüssigen Glaskörper zu entfernen, wobei Sie darauf achten, das Gewebe nicht übermäßig zu zerren.
11. Wenn die Netzhaut von beiden Seiten freigelegt ist, führen Sie mit der Federschere eine Reihe von Entlastungsschnitten im Abstand von etwa 90° aus, die sich in einer geraden Linie von der Peripherie zum Sehnervenkopf erstrecken und etwa 1 mm von der Mitte entfernt enden. Dies minimiert die Durchtrennung von retinalen Ganglienzellaxonen in der Netzhaut und verbessert die Qualität der kultivierten Explantate.
12. Während Sie das untergetauchte Gewebe an Ort und Stelle halten, entfernen Sie das Labortuch vorsichtig mit einer Pinzette, um es seitlich vom Gewebe wegzuziehen, bevor Sie es aus der Schale nehmen. Vermeiden Sie den Kontakt mit der Netzhaut, um eine Anhaftung am Tuch und einen möglichen Probenverlust zu vermeiden.
13. Halten Sie dann das Gewebe weiter fest und durchtrennen Sie mit der Federschere den Sehnerv direkt unter der Netzhaut, dann entfernen Sie den Rest der Augenmuschel aus der Schale.
14. Sobald die Netzhaut vom Rest des Auges isoliert ist, füllen Sie eine 35-mm-Petrischale mit PBS und platzieren Sie mit einer Pinzette ein Filterquadrat am unteren Rand, wobei die rauere, matte Seite nach oben zeigt. Achten Sie darauf, dass der Filter nicht knittert, da dies die Verwendung des Filters als Substrat für die Bewegung der Netzhaut behindern kann.
15. Aspirieren Sie die Netzhaut vorsichtig mit der Transferpipette und übertragen Sie sie vorsichtig in die 35-mm-Schale. Bewegen Sie die Netzhaut mit der Bürste, um sicherzustellen, dass die innere Oberfläche der Netzhaut aufrecht ist und das Gewebe direkt über dem Filterquadrat aufliegt.
16. Saugen Sie PBS langsam mit der Transferpipette aus der Schale ab, um die Netzhaut auf den Filter abzusenken. Pausieren Sie gegebenenfalls, um das Gewebe neu anzupassen, bevor Sie fortfahren, bis sich die Netzhaut auf dem Filter abgesetzt hat.
    HINWEIS: Eine schnelle Aspiration kann zu einer plötzlichen seitlichen Bewegung der Netzhaut führen, was zu Schäden oder Gewebeverlust führt. Die gesamte Netzhaut muss auf dem Quadrat aufliegen, um Schäden zu vermeiden. Wenn sich die Netzhaut jedoch in einer problematischen Position einpendelt, kann PBS wieder zur Schale hinzugefügt werden, bis die Netzhaut wieder suspendiert ist, und die Montage kann erneut versucht werden.
17. Sobald sich die Netzhaut auf dem Filter abgesetzt hat, rollen Sie mit der Bürste alle peripheren Netzhaut ab, die möglicherweise umgeklappt ist. Gleichen Sie den PBS-Gehalt sorgfältig aus, so dass sich die Netzhaut nicht leicht vom Filter löst, und stellen Sie gleichzeitig sicher, dass genügend übrig bleibt, damit die Probe nicht austrocknet und der Pinsel sich reibungslos bewegen kann, ohne die innere Netzhaut zu beschädigen.
18. Untersuchen Sie die Netzhaut erneut auf Ablagerungen. Um Schäden zu vermeiden, reinigen Sie die Netzhaut ohne direkte Handhabung, indem Sie PBS mit der Transferpipette aus etwa 1 cm Höhe über dem Gewebe auf die Netzhaut tropfen. Dies sollte alle verbleibenden Ablagerungen wegspülen, aber wenn zu viel PBS in die Schale gegeben wird, kann die Netzhaut wieder nach oben schwimmen. Führen Sie in diesem Fall eine erneute Aspiration durch, um das Gewebe wieder zu mounten.
    HINWEIS: "Schein"-Proben können erzeugt werden, indem Netzhäute auf eine 24-Well-Platte zur Fixierung, Blockierung/Permeabilisierung und Antikörperfärbung übertragen werden, wie an anderer Stelle^{beschrieben 21}. Diese Scheinkontrollen sind nützlich für die Behandlung mechanischer Verletzungen der Netzhaut, die während der Isolation auftreten können.

3. Überführung auf Nährmedien und Pflege

1. Schließen Sie den Deckel der 35-mm-Schale für den Transport zur Biosicherheitswerkbank und halten Sie die Schale waagerecht, um ein Lösen der Netzhaut vom Filter zu vermeiden. In diesem Fall mounten Sie erneut wie oben.
2. Legen Sie die geschlossene 35-mm-Schale mit der Netzhaut in die Biosicherheitswerkbank und achten Sie darauf, dass Sie vor der Desinfektion oder dem Handschuhwechsel keine Geräte oder Oberflächen im Schrank berühren.
3. Dekontaminieren Sie die Handschuhe mit Ethanol und/oder tauschen Sie sie aus und bringen Sie dann die mit Explantatmedien vorgeladene 6-Well-Platte aus dem Inkubator in die Biosicherheitswerkbank. Führen Sie die Schritte 3.4 und 3.5 in der Biosicherheitswerkbank mit den Werkzeugen durch, die in Schritt 1.1 dort platziert wurden.
4. Entfernen Sie den Deckel der 35-mm-Schale mit der Netzhaut und heben Sie das Filterquadrat mit einer abgewinkelten Pinzette vorsichtig an, ohne die Netzhaut direkt zu berühren. Entfernen Sie den Deckel der 6-Well-Platte, positionieren Sie den Filter über der Mitte des Einsatzes einer geeigneten Well, dann senken Sie ihn langsam in das Medium ab. Die Netzhaut löst sich während dieses Schritts vom Filter und schwebt knapp unter der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche.
5. Sobald sich Netzhaut und Filter getrennt haben, bewegen Sie den Filter langsam von der Netzhaut weg und entfernen Sie ihn vom Medium. Entfernen Sie mit der 1-ml-Pipette 500 μl Medium aus dem Einsatz, um sicherzustellen, dass die Netzhaut flach liegt, indem Sie sie zwischen dem Boden des Einsatzes und der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche einschließen.
6. Setzen Sie den Deckel wieder auf die Platte und stellen Sie ihn wieder bei 37 °C mit 5 % CO₂ in den Inkubator, wobei Sie darauf achten müssen, dass die Netzhaut in der Nähe der Mitte der Vertiefung bleibt. Bis zu 6 Netzhäute können in einer einzigen Platte aufbewahrt werden.
   HINWEIS: Wenn Explantate 24 Stunden oder weniger aufbewahrt werden, können sie bis zum Ende des Experiments im Inkubator belassen werden. Bei längerer Lagerung wird ein Medienwechsel von 50 % nach 1 Tag in vitro und an abwechselnden Tagen danach empfohlen.

4. Fixierung für die Immunfärbung (fakultativ)

1. Wenn Sie eine Immunfärbung durchführen, befolgen Sie die folgenden Schritte zur Fixierung; Während die Immunfärbung unter Verwendung von Parametern durchgeführt werden kann, die zuvor für flach sitzende Netzhäute beschrieben wurden²¹, erfordert die Fixierung der explantierten Netzhaut besondere Überlegungen.
2. Entfernen Sie Zellkultureinsätze mit Explantaten und Medien von der 6-Well-Kulturplatte und legen Sie sie auf eine nicht poröse Oberfläche (z. B. den Kunststoffdeckel der Kulturplatte), die nach der Fixierung ordnungsgemäß entsorgt werden kann, da die Einsätze leicht porös sind und geringe Mengen an Fixiermittel auf diese darunter liegende Oberfläche gelangen.
3. Entfernen Sie vorsichtig die Nährmedien von den Einsätzen und fügen Sie dann jeweils 1 ml 4 % Paraformaldehyd (PFA) hinzu. Lassen Sie die Netzhäute 15 Minuten lang in einem Abzug fixieren, entfernen Sie dann PFA und entsorgen Sie es gemäß den institutionellen Richtlinien.
   ACHTUNG: Paraformaldehyd ist gefährlich und eine Vorstufe von Formaldehyd, einem bekannten Karzinogen. Seien Sie vorsichtig und führen Sie die Fixierung in einem Abzug mit geeigneten Vorsichtsmaßnahmen durch.
4. Waschen Sie die Netzhaut 3 Mal (jeweils 5 Minuten lang) mit PBS, um PFA zu entfernen, und übertragen Sie dann mit einer modifizierten Transferpipette die Netzhaut in PBS in einzelne Vertiefungen in einer 24-Well-Platte zur Blockierung, Permeabilisierung und Immunfärbung, wie an anderer Stelle beschrieben²¹. Entsorgen Sie PFA-kontaminierte Kunststoffe (Pipettenspitzen, Einsätze und die bei der Fixierung verwendete nicht poröse Oberfläche) gemäß den institutionellen Richtlinien.
   HINWEIS: Die Transferpipette kann aufbewahrt werden, um fixierte und gefärbte Netzhäute zur Montage und Bildgebung auf einen Objektträger zu übertragen. Obwohl es keinen direkten Kontakt mit PFA hätte haben dürfen, wird empfohlen, verschiedene Transferpipetten für den Umgang mit lebendem und fixiertem Gewebe zu verwenden.

Auf der makroskopischen Skala bleiben explantierte Netzhäute sowohl zum 1- als auch zum 3-Tage-Zeitpunkt im Wesentlichen unverändert, obwohl sie zu letzterem Zeitpunkt relativ fragil werden, was eine sorgfältige Handhabung vor der Fixierung oder anderen experimentellen Endpunkten erfordert. Die Netzhaut sollte relativ flach sein, ohne Falten (was zu einer lokalen Störung der Diffusion von Sauerstoff und Nährstoffen führen kann) und im Medium zwischen der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche und dem Zellkultureinsatz suspendiert sein. Am 3. Tag kann sich ein schwacher Streifen auf der Unterseite des Einsatzes unter dem suspendierten Gewebe bilden. Die Untersuchung mit der Hellfeld-Phasenkontrastmikroskopie deutet auf eine moderate Menge an Zelltrümmern hin, wahrscheinlich die äußeren Segmente degenerierender Photorezeptoren, insbesondere zwischen dem 24-Stunden- und dem 72-Stunden-Zeitpunkt. Dies ist nicht überraschend, wenn man bedenkt, wie fragil Photorezeptoren sind und sie auf ein RPE-Substrat angewiesen sind, das während der retinalen Isolierung weitgehend verloren geht. Erscheint das Medium selbst jedoch trüb, sollte die Möglichkeit einer mikrobiellen Kontamination untersucht werden. Obwohl wir die Netzhaut während des anfänglichen Isolierungsprozesses außerhalb einer Biosicherheitswerkbank gehandhabt haben, konnten wir in keiner unserer Proben eine mikrobielle Kontamination nachweisen, was darauf hindeutet, dass die Verwendung von sterilen Puffern, die Aufnahme von Penicillin (100 U/ml) und Streptomycin (100 μg/ml) in Kulturmedien und eine sorgfältige aseptische Technik in der Gewebekulturumgebung ausreichend waren, um eine nachweisbare Kontamination innerhalb des untersuchten Zeitrahmens zu vermeiden.

Mikroskopische Beurteilung mittels Immunfluoreszenz
In der Netzhaut orientieren sowohl Astrozyten als auch Mikroglia (zusammen mit Ganglienzellen) ihre Zellkörper typischerweise parallel zur Netzhautoberfläche, wodurch sie sich gut für die Beurteilung mit Immunfluoreszenzmikroskopie eignen. Um großflächige Veränderungen in retinalen Gliazellen zu untersuchen, verglichen wir Netzhaut, die isoliert und 3 Tage lang als Explantate aufbewahrt worden war, mit naiven "Schein"-Explantaten, die bis Schritt 2.18 des Protokolls identischen Isolationsverfahren unterzogen wurden, woraufhin sie für die Färbung fixiert wurden (siehe Schritte 4.1-4.4) und nicht in vitro aufbewahrt wurden. Während einzelne Astrozyten und Mikroglia infolge von Veränderungen der explantierten Netzhaut phänotypische Veränderungen (Reaktivität in Astrozyten und Aktivierung in Mikroglia, siehe unten) erfahren, sind in diesen Populationen auch nach 3 Tagen in vitro großflächige Veränderungen sichtbar (Abbildung 2), wobei die Mikroglia Anzeichen einer Migration aus ihren typischerweise nicht überlappenden Domänen zeigen (Abbildung 2A,D) und Astrozyten, die die Nähe ihrer Assoziation mit dem oberflächlichen retinalen Gefäßsystem verringern (Abbildung 2B,E).

Obwohl die Untersuchung von RGCs nicht der Hauptfokus dieses Protokolls ist, haben wir ihre Dichte zusammen mit der Astrozyten- und Mikroglia-Reaktion nach 24 h und 72 h ex vivo bewertet (Abbildung 3A-L) und das RGC-Überleben zum 24-Stunden-Zeitpunkt quantifiziert (Abbildung 3M), da dies eine wertvolle Metrik ist, die bei der Bewertung von Veränderungen der Glia-Phänotypen berücksichtigt werden sollte. Darüber hinaus wurden bei der genaueren Untersuchung von Astrozyten und Mikroglia auch Veränderungen in Müller-Zellen (Abbildung 2B,E) - spezialisierten radialen Gliazellen der Netzhaut - und Hyalozyten (Abbildung 4) festgestellt, einer Klasse von grenzassoziierten Makrophagen, die auf der vitrealen Seite der retinovitrealen Grenzfläche zu finden sind. Sowohl für die qualitative als auch für die quantitative Bildgebung wurden die Proben fixiert und mit häufig verwendeten Markern von Astrozyten (GFAP), Mikroglia (Iba1) und RGCs (Brn3a) gefärbt. In dieser Studie wurden zusätzlich der homöostatische Mikroglia-Marker TMEM119 verwendet, um Veränderungen in den Mikroglia zu untersuchen (Abbildung 4C,G) und der Hyalozytenmarker CD206 (Abbildung 4B,F), um diese beiden Zelltypen zu unterscheiden, die beide Iba1 exprimieren (Abbildung 4A,E).

Überleben von retinalen Ganglienzellen
Nach 24 Stunden zeigte die RGC-Dichte einen bescheidenen, aber deutlichen Rückgang gegenüber Schein-Explantaten (Abbildung 3M). Sowohl für 24-Stunden- als auch für Schein-Netzhäute (n = 4 für jede Bedingung) wurden 9 interessierende Regionen der mittleren Peripherie pro Netzhaut (insgesamt 36) abgebildet, und Brn3a+- Zellen in jeder abgebildeten Region wurden manuell mit dem Zellzählermodul in ImageJ gezählt. Dieser Ansatz ergab eine Dichte von 3659 RGCs pro mm2 (SD +/- 490) in Scheinnetzhaut, was mit früheren Berichten über adulte Mäuse dieses Stammes (das weit verbreitete C57BL/6)24 übereinstimmt. Zählungen auf Netzhäuten nach 24 h in vitro zeigten eine Dichte von 2464 RGCs promm2 (SD +/- 907), was einem Rückgang von 32,7% im Vergleich zu Scheinknochen entspricht. Obwohl auch ein 72-Stunden-Zeitpunkt untersucht wurde, war es schwierig, das Überleben zu diesem Zeitpunkt aufgrund mehrerer Faktoren genau zu quantifizieren, darunter eine hohe regionale Variabilität innerhalb der einzelnen Netzhäute und eine signifikante Zunahme des Hintergrunds in der Brn3a-Färbung auf diesen Proben. Angesichts der Klarheit der Färbung für andere Marker, die zu diesem Zeitpunkt an Proben verwendet wurden - einschließlich GFAP, Iba1, CD206 und TMEM119 - vermuten wir, dass dies auf die Verwendung eines von der Maus abgeleiteten Anti-Brn3a-Antikörpers zurückzuführen ist, und würden die Verwendung eines Antikörpers empfehlen, der in einer anderen Wirtsspezies gezüchtet wurde, für Forscher, die das RGC-Überleben auf explantiertem Gewebe genauer quantifizieren möchten.

Mikroglia und Hyalozyten
Um die Veränderungen der Mikroglia qualitativ zu beurteilen, verwendeten wir den myeloischen Zellmarker Iba1, der von Mikroglia in der Netzhaut und anderswo stark exprimiert wird. Mikroglia zeigen dramatische morphologische Veränderungen, wenn sie durch Stress oder Verletzung aktiviert werden, die auch ohne zusätzliche Marker beurteilt werden können, und wir beobachteten ein moderates Maß an morphologischer Veränderung nach 24 h in vitro (Abbildung 3F), wobei sich die Anzahl der Mikrogliaprozesse verkürzte und abnahm. Bis zum 72-Stunden-Zeitpunkt war diese Transformation noch weiter fortgeschritten, wobei viele Mikroglia eine kompakte amöboide Morphologie mit wenigen oder gar keinen sichtbaren Prozessen annahmen (Abbildung 3J). Es wurde auch eine Veränderung der Mikrogliaverteilung festgestellt, als die Mikroglia von den regelmäßigen, nicht überlappenden Abständen, die in der Scheinnetzhaut zu sehen sind (Abbildung 2A), zu einer regionalen Aggregation übergingen, die zum 72-Stunden-Zeitpunkt zu sehen war (Abbildung 2D). Darüber hinaus TMEM119 die Expression des homöostatischen Mikroglia-Markers dramatisch von klaren und ubiquitären Werten, die in Scheinnetzhäuten beobachtet wurden (Abbildung 4C), auf eine nahezu völlige Abwesenheit von Immunreaktivität nach 3 Tagen in vitro zurückgegangen (Abbildung 4G). Zusammengenommen deuten diese Hinweise auf eine große Verschiebung hin zu einem aktivierten Phänotyp in retinalen Mikroglia hin, die auf Veränderungen der Netzhaut ex vivo zurückzuführen ist.

Bei der Entwicklung dieses Protokolls stellten wir auch fest, dass wir Hyalozyten erfassten, eine Population von grenzassoziierten Makrophagen (BAMs), die an der vitreoretinalen Oberfläche gefunden wurden29. Diese Zellen, die wie Mikroglia Iba1 exprimieren, neigen dazu, amöboider zu sein als nicht aktivierte Mikroglia und exprimieren keine TMEM119; Diese Unterscheidungen gehen jedoch in vitro typischerweise bei der 72-h-Marke verloren, wenn die Mikroglia amöboider werden und TMEM119 Expression herunterregulieren (Abbildung 4). Unter diesen Bedingungen können Hyalozyten (die viel weniger dicht sind als Mikroglia, wobei veröffentlichte Schätzungenvon 29 etwa 10 pro Quadratmillimeter berichten) jedoch durch ihre Expression von CD206 unterschieden werden, die über die untersuchten Zeitpunkte konserviert ist (Abbildung 4B,F). Das Vorhandensein von Hyalozyten in isolierten Proben hängt stark vom Ausmaß der Glaskörperentfernung während der Probenvorbereitung ab, und die aggressive Entfernung des Glaskörpers eliminiert diese Zellen vollständig in der mittleren Peripherie.

Astrozyten und Müller-Zellen
Im Gegensatz dazu zeigen Astrozyten relativ bescheidene Signaturen von Reaktivität und behalten zu den Zeitpunkten 24 h und 72 h ihre charakteristische Kachelung der inneren Netzhautoberfläche, den Kontakt mit dem retinalen Gefäßsystem und nur moderate Hinweise auf Hypertrophie und strukturelle Veränderungen bei (Abbildung 2B, E; Abbildung 3C,G,K). Umgekehrt ist die Müller-Zell-Expression von GFAP am ersten Tag zwar gering bis nicht nachweisbar (ähnlich wie bei Shams), aber am Tag 3 ist die Müller-Zell-Expression von GFAP zunehmend nachweisbar. Dies zeigt sich besonders deutlich in der Nähe der Geweberänder - sowohl an der Peripherie der Netzhaut als auch entlang der entlastenden Schnitte, die bei der Netzhautdissektion gemacht werden, damit das Gewebe in Kultur flach liegen kann (Abbildung 2E). Gruppen, die Explantate über einen längeren Zeitraum in Kultur untersucht haben, haben einen dramatischen Anstieg der Marker für die Astrozyten- und Müller-Zell-Reaktivität nach dem 3-Tage-Zeitpunkt30 beschrieben. Das Auftreten einer offensichtlichen Verzögerung zwischen der Reaktion von RGCs und Mikroglia und der von Astrozyten innerhalb dieses relativ kurzen Zeitrahmens ist jedoch an sich schon auffällig und könnte Hinweise auf die Phänomene geben, die die Veränderungen in diesen explantierten Netzhäuten bestimmen.

Das relativ homöostatische Aussehen von Astrozyten und Müller-Zellen macht sie auch zu hervorragenden Indikatoren für physische Schäden, die lebendes Gewebe erlitten hat. In Bereichen, in denen das Gewebe entweder absichtlich geschnitten (Schnittwunden entlastet) oder versehentlich beschädigt wurde, regulieren Astrozyten und Müller-Zellen GFAP stark hoch, wodurch Bereiche mit mechanischer Schädigung des Gewebes hervorgehoben werden, die sonst maskiert werden könnten (Abbildung 4J). Umgekehrt kann eine übermäßig aggressive Glaskörperentfernung, die die ILM schädigt, aufgrund ihrer engen Assoziation mit der inneren Grenzmembran (ILM) zu großen astrozytären Schäden innerhalb einer Region führen (Abbildung 4K), möglicherweise einschließlich des vollständigen Verlusts von Astrozyten darin. Es wurde beobachtet, dass solche Ereignisse mit schlechten experimentellen Ergebnissen verbunden sind.

Erkennen und Beheben von mechanischen Verletzungen
Als dünne Schicht aus Nervengewebe ist die Netzhaut sehr anfällig für mechanische Verletzungen und Stoffwechselstörungen, und die meisten Schwierigkeiten bei der erfolgreichen Isolierung der Netzhaut und ihrer Aufbewahrung als Explantat in Kultur sind auf diese Anfälligkeiten zurückzuführen. Mechanische Verletzungen treten hauptsächlich während der Isolation auf und sind oft leicht zu identifizieren, erfordern aber möglicherweise viel Übung, um sie zu minimieren. Einige Formen der Schädigung - wie z.B. das Einreißen der Netzhaut durch Adhäsion der Peripherie am Ziliarkörper - sind leicht erkennbar und ermöglichen den Ausschluss betroffener Proben. Auch subtilere Verletzungen sind möglich und können sich dennoch auf die Versuchsergebnisse auswirken, aber glücklicherweise können diese mit der Immunfluoreszenzmikroskopie, wie unten beschrieben, nachgewiesen werden.

Das Hauptrisiko für eine Schädigung während der Netzhautisolierung besteht bei der Entfernung von überschüssigem Glaskörper, der aufgrund seiner gallertartigen Konsistenz und optischen Transparenz selbst für diejenigen mit Erfahrung im Umgang mit lebenden Netzhäuten eine Herausforderung darstellen kann. Obwohl das Protokoll sorgfältig optimiert wurde, um die Risiken in diesem Stadium zu reduzieren, bleibt eine Schädigung der inneren Netzhaut, insbesondere des ILM, möglich. Während diese Art von Schädigung makroskopisch schwer zu erkennen sein kann, bedeutet die enge Assoziation der retinalen Astrozyten mit der Membran, dass eine größere Schädigung des ILM mit einer entsprechenden Schädigung oder Ablation von Astrozyten einhergeht, wie die Färbung des Astrozytenmarkers GFAP zeigte (Abbildung 4K). Glücklicherweise ist es nicht unbedingt erforderlich, den Glaskörper für Explantate vollständig zu entfernen, obwohl ein Überschuss die periphere Netzhaut in einem "umgeklappten" Zustand verankern kann, was zu Stoffwechselschäden durch blockierte Diffusion in vitro führt (siehe "Stoffwechselverletzung" unten). Um den Glaskörper zu visualisieren und sich mit seinen physikalischen Eigenschaften vertraut zu machen, kann man kleine Volumina eines vitalen Farbstoffs verwenden, z. B. 0,4 % Trypanblau31. Obwohl die von der Food and Drug Administration (FDA) zugelassenen Formulierungen von Trypanblau in der Augenchirurgie weit verbreitet sind, kann sich der Farbstoff auf nachgelagerte Anwendungen auswirken - insbesondere auf fluorometrische und kolorimetrische Assays - und wir empfehlen, seine Verwendung auf Trainingskontexte zu beschränken.

Die Trennung der äußeren Netzhaut von der Augenmuschel birgt auch ein erhebliches Risiko für ein Durchstechen oder Zerreißen der Netzhaut, was zu einem umfangreichen RGC-Verlust in benachbarten Regionen führen und die Aktivierung der Mikroglia und die Astrozytenreaktivität erhöhen kann, und betroffene Proben sollten von Experimenten ausgeschlossen werden. Während diese Form der Schädigung oft makroskopisch offensichtlich ist, wurden auch subtilere Verletzungen festgestellt, wie z. B. penetrierende Vorfälle, die die Netzhaut nicht vollständig durchbohrten, aber dennoch zu schlechten experimentellen Ergebnissen führten. Obwohl solche Vorfälle nicht sofort offensichtlich sind, ist ein Schlüsselmerkmal von Astrozyten in der Netzhaut und anderswo ihre Reaktion auf mechanische Verletzungen, zu denen auch eine Hochregulierung des intermediären Filaments GFAP gehört. Daher kann die Färbung mit GFAP ansonsten subtile mechanische Verletzungen aufdecken (Abbildung 4J).

Obwohl die Linderung von Schnitten entscheidend ist, damit die Netzhaut in flachen Medien flach liegen kann und eine gleichmäßige Diffusion von Sauerstoff und Nährstoffen gewährleistet ist, sind sie von Natur aus eine Form der Gewebeschädigung, wie sich in einer Zunahme der GFAP-Expression und einer Abnahme der RGC-Dichte entlang der Schnittkante zeigt. Wenn diese Grenzbereiche gegebenenfalls von der Analyse ausgeschlossen werden, können ihre Auswirkungen auf die experimentellen Messwerte minimiert werden. Allerdings sollte auch bei Schnitten darauf geachtet werden, dass sie relativ gleichmäßig große "Lappen" erzeugen, da wir festgestellt haben, dass besonders schmale Lappen durch abgeschwächte zentrale Regionen mit konstant geringer Gliaaktivierung/-reaktivität und relativ hohem RGC-Überleben gekennzeichnet sind und daher möglicherweise nicht für eine vergleichende Analyse geeignet sind.

Metabolische Schädigung
Da die Isolierung und Explantation der Netzhaut selbst eine Form schwerer mechanischer und metabolischer Verletzungen ist, kann es schwierig sein, zusätzliche Stoffwechselschäden zu identifizieren und zu beheben. Eine Ausnahme bildet das Kräuseln oder Falten der Netzhaut in Kultur, da dies makroskopisch sichtbar sein und lokalisierte Zonen mit übertriebener Schädigung hervorrufen kann, wahrscheinlich aufgrund einer verminderten Diffusion von Nährstoffen und Sauerstoff. Typischerweise ist diese Faltung mit einem Überschuss an Glaskörper in der Nähe des Netzhautrandes verbunden, der das Gewebe seitlich oder in Richtung des Sehnervenkopfes ziehen kann, und tritt häufig auf, wenn ein verbleibender Ziliarkörper an der Netzhautperipherie vorhanden ist. Daher muss trotz der inhärenten Risiken der Glaskörperablation (und der potenziell heilsamen Wirkung des Verbleibens von Hyalozyten beim Belassen eines Teils des Glaskörpers) die Menge des Glaskörpers reduziert werden, um sicherzustellen, dass die Netzhaut in vitro relativ flach liegt. Wir fanden heraus, dass, wenn der im Winkel zwischen Ziliarkörper und Netzhaut eingeschlossene Glaskörper erfolgreich entfernt wird (Schritt 2.7 des Protokolls), die Netzhaut montiert und kultiviert werden kann, auch wenn der Ziliarkörper verbleibt; In den meisten Fällen kann durch vorsichtiges Bürsten (oder außergewöhnlich vorsichtige Verwendung einer Pinzette) genug von diesem Glaskörper entfernt werden, um die Probe zu erhalten.

Aufgrund der Herausforderung, den Ursprung diffuserer metabolischer Verletzungen zu identifizieren, empfehlen wir dringend, das Risiko proaktiv zu minimieren, indem Sie sich auf frische Medien verlassen. Supplementierte Explantatmedien sollten nicht länger als 1 Woche aufbewahrt werden, und geöffnete neurobasale Medien sollten nach etwa 1 Monat ersetzt werden. Augen, bei denen verlängerte postmortale Intervalle aufgetreten sind - 1 h oder mehr bei 4 °C, 30 min oder mehr bei RT - sollten bei Experimenten, die eine Kultur erfordern, vermieden werden, obwohl Augen, die bei 4 °C gehalten werden, für Übungszwecke oder Betäubungen über einen etwas längeren Zeitraum verwendet werden können.

Abbildung 2: Veränderungen in der Organisation und Verteilung der retinalen Gliazellen nach 3 Tagen in vitro (DIV). (A) Iba1+ -Mikroglia im RGC und in den Nervenfaserschichten bilden in der naiven Mausnetzhaut nicht überlappende Domänen. (B) Retinale Astrozyten exprimieren GFAP und sind eng mit dem oberflächlichen Gefäßsystem assoziiert, während die häufiger vorkommenden Müller-Zellen typischerweise GFAP- in der naiven Netzhaut sind (sporadische Müller-Zell-GFAP ist in der unteren linken Ecke von B und C zu sehen). (C) Farbkomposit aus Iba1 (grün) und GFAP (rot) Färbung von der naiven Netzhaut in A und B. (D) Nach 3 DIV wird die Verteilung der Mikroglia in der explantierten Netzhaut unregelmäßig, was auf eine Migration und einen Übergang der Mikroglia von einer verzweigten Morphologie zu einem eher amöboiden Phänotyp hindeutet, der für die Aktivierung charakteristisch ist. (E) Retinale Astrozyten zeigen Anzeichen von Reaktivität (Hypertrophie, verminderte Orientierung zum retinalen Gefäßsystem), aber keine Migration nach 3 DIV, während Müller-Zellen eine stärkere GFAP-Expression zeigen, die in der unteren Ecke von E und F sichtbar ist. (F) Farbkomposit aus Iba1 (grün) und GFAP (rot) Färbung von der 3 DIV-Netzhaut in D und E. Maßstabsbalken = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Veränderungen der RGC-Dichte und der Gliamorphologie nach 1 und 3 Tagen 3 Tage in vitro (DIV). (A-C) Brn3a+ RGC-Dichte in der naiven Mausretina nach Scheinexplantat (A) mit verzweigten Iba1+-Mikroglia (B) und vaskulär assoziierten GFAP+-Astrozyten (C). (D) Farbkomposit aus Brn3a, Iba1 und GFAP von A-C. (E-H) Nach 1 DIV nehmen die Dichte der retinalen Ganglienzellen von Brn3a+ im Vergleich zu naiven Schein-Netzhäuten ab, während die zurückgezogenen Fortsätze der Iba1+-Mikroglia (F) auf eine anhaltende Aktivierung hinweisen; Im Vergleich dazu sind die Veränderungen der GFAP+ retinalen Astrozyten (G) weniger ausgeprägt und bestehen hauptsächlich aus einer moderaten Hypertrophie. (H) Farbkomposit aus Brn3a, Iba1 und GFAP von E-G. (I-L) Nach drei Tagen in vitro nimmt die Dichte der retinalen Ganglienzellen von Brn3a+ weiter ab (I), während die Iba1+-Mikroglia (J) weiterhin in eine aktivierte, amöboide Morphologie übergehen und GFAP+-retinale Astrozyten (K) Anzeichen einer weiteren Hypertrophie und Reaktivität zeigen, aber verzögerte Veränderungen, die bei RGCs und Mikroglia beobachtet werden. (L) Farbkomposit aus Brn3a, Iba1 und GFAP aus I-K. Maßstabsbalken = 100 μm für A - L. (M) Quantifizierung der Brn3a+ RGC-Dichte in Schein- und 1-Tages-In-vitro-Netzhaut. Die Dichte der Ganglienzellen wurde in 9 Regionen von Interesse pro Tier gemessen (n = 4 für jede Erkrankung); Die Zählung einzelner Tiere wird als gefüllte Kreise angezeigt, und Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Veränderungen der Mikroglia und Hyalozyten nach 3 Tagen in vitro (DIV) und Verwendung von GFAP-Färbung zum Nachweis lokalisierter Gewebeschäden in isolierten Netzhauten. (A-D) Iba1 markiert stark Mikroglia in der naiven Netzhaut (A), während es schwach Hyalozyten markiert (A', eingefügt), ein zusätzlicher myeloischer Zelltyp, der an der vitreoretinalen Grenzfläche vorkommt und den Zelloberflächenmarker CD206 exprimiert (B); naive Mikroglia exprimieren den homöostatischen Mikrogliamarker TMEM119 (C). (D) Farbkomposit von A-C mit Hervorhebung der Kolokalisation von Iba1 (grün) und TMEM119 (rot) in Mikroglia in naiver Netzhaut und Expression von CD206 (magenta) in einem amöboiden Hyalozyten (Pfeilspitze). (E-H) Nach 3 Tagen in vitro (DIV) ziehen Iba1+ retinale Mikroglia ihre verzweigten Fortsätze zurück und nehmen zunehmend amöboide Morphologien an (E). Die CD206-Expression bleibt auf die Hyalozyten (F) (Pfeilspitzen) beschränkt, TMEM119 ist in Mikroglia (G) nicht mehr nachweisbar. (H) Farbkomposit von E-G mit Iba1+ (grün) und Tmem119- (rot) Mikroglia in 3 DIV-Netzhaut und Expression von CD206 (magenta) in amöboiden Hyalozyten (Pfeilspitzen). Maßstabsleisten = 100 μm für A-H. (I-K) Die Reaktion der retinalen Astrozyten auf mechanische Verletzungen macht den astrozytären Marker GFAP zu einem hervorragenden Indikator für isolationsinduzierte Schäden. (I) GFAP+-Astrozyten durchlaufen nach 1 Tag in vitro eine leichte Hypertrophie, zeigen aber keine Anzeichen einer körperlichen Verletzung. (J) Die GFAP-Expression in Astrozyten und Müller-Zellen zeigt eine Stelle isolationsassoziierter Verletzungen in der Netzhaut, wahrscheinlich aufgrund einer teilweisen Durchdringung der Netzhaut durch ein Metallinstrument. Pfeile bezeichnen die Peripherie des Verletzungsbereichs. (K) Schwere Störung und Verlust von Astrozyten (Pfeile) infolge einer teilweisen Ablation der inneren Grenzmembran an der Netzhautoberfläche. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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